FR2691546A1 - Traceurs particulaires directs, utilisation pour la mesure et le dosage d'anticorps et d'antigène. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des traceurs particulaires directs, utilisables dans le domaine des dosages mettant en jeu une réaction anticorps/antigène, réunissant une substance immuno-réactive choisie parmi des anticorps ou des antigènes, incluant les haptènes, à un marqueur direct à l'état finement divisé, caractérisés en ce que: - la plus grande dimension dudit marqueur est d'au moins 0,2 micromètre; - la matière constituant ledit marqueur ne présente pas d'absorption vraie en lumière visible/proche infrarouge; - la matière constituant ledit marqueur est lyophobe ou amphilyophile; - ledit marqueur présente en surface un certain caractère hydrophile; et - les tracés des courbes spectrales en lumière visible/proche infrarouge desdits traceurs particulaires et de leurs agrégats en phase liquide aqueuse sont sensiblement identiques quelles que soient les dimensions développées par réaction d'agglutination anticorps/antigène. L'invention décrit également l'emploi de ces traceurs particulaires dans un procédé immunologique de micro-dosage photométrique d'anticorps et d'antigènes, incluant les haptènes.

Description

TRACEURS PARTICULAIRES DIRECTS, UTILISATION
POUR LA MESURE ET LE DOSAGE D'ANTICORPS ET
D ANTIGENES.

La présente invention en tant que produits industriels nouveaux, concerne des traceurs particulaires directs couplés à toute substance immuno-réactive; lesquels traceurs particulaires se caractérisent principalement par le fait qu'ils présentent en lumière visible/proche infrarouge des propriétés spectrales snîilaires quel que soit leur degré d'agglutination par réaction anticorps/antigène.

Cette invention décrit également l'emploi de ces traceurs particulaires dans un procédé immunologique en phase homogène de micro-dosage qualitatif, semiquantitatif ou quantitatif d'anticorps et d'antigènes, incluant les haptènes.

Par le terme traceur particalaire direct, on entend ici l'ensemble formé de l'association, covalente ou passive. de plusieurs molécules immuno-réactives à un même marqueur direct à l'état finement divisé.

Le terme marqueur direct recouvre alors toute entité à l'état particulaire susceptible de délivrer un signal optique quantitativement mesurable lié à sa structure propre, et, de permettre une fixation de surface, covalente ou passive, et l'insolubilisation de substances immuno-7 éactives.

Par substances ou molécules ùnniuno-réacti'es, on entend toutes les molécules préparées par synthèse chimique ou provenant de liquides biologiques, d'extraits cellulaires ou tissulaires obtenus in vivo ou in Ilirro ; notamment tout anticorps monoclonal et polyclonal obtenu par fusion cellulaire, ou immunisation naturelle ou provoquée, et tout antigène, incluant les haptènes, tel que des médiateurs, des hormones peptidiques et protéiques, des enzymes, des protéines de structure, des protéines respiratoires et plasmatiques, des nucléoprotéines, des protéines conjuguées, des drogues, des acides nucléiques incluant des produits d'amplification par PCR, des vitamines, des polysaccharides ou des lipoïdes.

Par l'expression propriétés spectrales similoires, on entend ici le fait que I'ànalysesp#ctrométrique des traceurs particulaires selon l'invention dans le domaine des radiations visibles/proches infrarouges fait apparaître quel que soit leur degré d'agglutination par réaction anticorps/antigène, des courbes spectrales de tracé sensiblement identique.

L'invention concerne plus précisément des traceurs particulaires dont la substance immuno-réactive est couplée par chimie covalente ou par simple adsorption physique à un marqueur particulaire dont la plus grande dimension est d'au moins 0,2 micromètre ( > m), constitué d'un matériau lyophobe ou amphilyophile, ne présentant pas d'absorption vraie en lumière visible/proche infrarouge ; de l'emploi de ces traceurs particulaires dans une technique photométrique de micro-dosage qualitatif, semi-quantitatif ou quantitatif de toute molécule réactive immunologiquement par réaction d'un anticorps ou d'un antigène avec l'antigène et/ou l'anticorps correspondant fixé, par chimie covalente ou par simple adsorption physique, audit marqueur particulaire, et, de la mesure dans le domaine des longueurs d'onde visibles/proches infrarouges, de l'intensité lumineuse transmise par le mélange réactionnel, proportionnellement au degré d'agglutination du traceur après réaction anticorps/antigène.

Avec le développement des analyses de laboratoire tant en biologie humaine que vétérinaire, le marché des tests d'immunodiagnostic est très demandeur de tout nouveau procédé de dosage quantitatif et semi-quantitatif, non radioactif, rapide, sensible et simple de mise en oeuvre. Cette demande intéresse en premier lieu la recherche et la mesure de toutes les molécules biologiques humaines et animales à faible concentration, e.g. anticorps, antigènes et plus généralement toute molécule naturellement ou artificiellement présente dans un organisme ou une partie de celui-ci, in vivo ou in vitro.Depuis peu, de nombreux secteurs en particulier agroalimentaires et toxicologiques se sont ouverts à ces techniques, et deviennent fortement demandeurs de ce type de test par exemple pour le dosage de drogues dans des liquides biologiques ou de pyrogènes et de contaminants dans diverses préparations.

La présente invention s inscrit dans le cadre de ces utilisations, dans des domaines aussi variés que le diagnostic médical humain et vétérinaire, L'analyse biochimique, la toxicologie, le contrôle de qualité, la recherche fondamentale et appliquée.

Parmi l'ensemble des méthodes analytiques de dosage mettant en jeu une réaction de type anticorps/antigène, les plus couramment utilisées en immunoanalyse font appel à des traceurs, généralement de nature radioactive, enzymatique, luminophore ou particulaire, qui permettent d'objectiver la liaison de l'antigène à l'anticorps.

Les plus anciennes, les techniques radioimmunologiques (RIA, IRMA) sont très compétitives par leur sensibilité, bien inférieure à 0,1 nanogramme par millilitre (ng.ml-1), et leur spécificité. Leur qualité essentielle est liée aux propriétés d'émission du marqueur radioactif, non modifiées par l'environnement physicochimique, et à sa détection aisée et sensible. Cependant de nombreuses contraintes d'utilisation limitent leur large diffusion auprès des laboratoires d'analyses, la principale étant liée à la nature même du marqueur. La détention et l'utilisation de radiosources sont en effet soumises à réglementation et ne sont accessibles qu'aux seuls laboratoires agréés, équipés d'enceintes fermées, d'une surveillance dosimétrique et radiotoxicologique du personnel, et d'une gestion des déchets radioactifs.Par ailleurs, la stabilité du traceur n'est que de quelques mois; la mise en oeuvre de ces techniques est peu adaptée au traitement des analyses au coup par coup et nécessite un appareillage spécifique et coûteux.

Comme alternative à l'utilisation des marqueurs radioactifs, le couplage de luminophores à des anticorps ou des antigènes a été appliqué à de nombreuses techniques d'immunodosage. De sensibilité proche de celle des méthodes radioimmunologiques, ces techniques sont néanmoins difficiles de mise en oeuvre du fait de domaines d'application limités, de la difficulté de mesure précise d'un signal lumineux souvent fugace (1 seconde), d'intensité maximale fluctuante, de nombreux lavages, d'une phase d'extraction des complexes anticorps/antigène. Pour ces raisons,
I'automatisation du procédé et la mesure intégrée du signal sont souvent nécessaires, imposant un appareillage spécifique complexe et toujours très coûteux.

Quant aux immunodosages utilisant des traceurs à marqueur enzymatique, ils ont connu un développement considérable au cours de ces dernières années. Ne nécessitant pas d'appareillage spécifique, leurs principaux avantages sont une accessibilité à l'ensemble des laboratoires d'analyses et des seuils de sensibilité inférieurs à 0,1 ng.ml-1. Toutefois ces enzymo-immunodosages nécessitant plusieurs étapes réactionnelles, immunologique puis enzymatique, séparées de plusieurs phases de lavage, les temps d'analyse sont difficilement inférieurs à deux heures et peuvent atteindre pour certaines molécules 24 à 48 heures. Les paramètres temps et manipulations sont les inconvénients majeurs de ces techniques, interdisant pratiquement toute analyse au coup par coup .

Enfin il reste le vaste domaine des immunodosages par traceur particulaire, où l'on exploite les propriétés diffusiométriques de marqueurs insolubles à l'état finement divisé. Quelles que soient les variantes méthodologiques, leur principe repose toutes sur le fait que le signal optique produit par l'interaction d'une onde électromagnétique avec le marqueur est différent selon que le traceur est libre ou réticulé par réaction d'agglutination anticorps/antigène. Parmi l'ensemble des approches du phénomène diffusiométrique, deux techniques se sont imposées en immunoanalyse : la turbidimétrie (ou opacimétrie) et la néphélémétrie, qui se différencient l'une de l'autre par la méthode de mesure du signal optique, respectivement par photométrie d'absorbance et photométrie d'émission.Ces techniques sont très séduisantes par leur simplicité et leur rapidité, liées à la pratique de la réaction en phase homogène, mais présentent un certain nombre d'inconvénients qui ne sont pas tant liés au principe de lecture mis en oeuvre, mais davantage aux nombreuses contraintes d'exploitation des lois de diffusion de la lumière qui restreignent fortement les domaines d'utilisation de ces techniques (traitements préalables des réactifs) et la sensibilité des mesures (10 à 100 ng.ml-1). Par ailleurs, les dosages diffusiométriques peuvent nécessiter des appareillages laser ou infrarouges relativement sophistiqués et coûteux.

Parmi les quelques groupes de traceurs couramment utilisés en immunodosage, les traceurs particulaires sont ceux qui ont suscité le plus grand nombre de travaux, aboutissant à de multiples variantes méthodologiques plus ou moins sensibles et diversement appliquées en immunoanalyse. Mais quelle que soit l'approche envisagée, toutes ces techniques se heurtent aux inévitables limitations qu'imposent la mise en jeu des lois de MIE sur la diffusion de la lumière par les milieux troubles.

Dans ce domaine des traceurs particulaires, on connait en particulier les brevets
FR-A-2 642 174 et FR-A-2 645 967 qui décrivent des marqueurs en latex à l'état de particule submicronique (diamètre d inférieur à 200 nanomètres), dont les propriétés de diffusion de la lumière changent suivant le degré d'agglutination du traceur quand il est exposé à un rayonnement électromagnétique dans le domaine des longueurs d'onde (k) visibles/proches infrarouges (300-1000 nm), tel que le rapport k/d 2 5 : à la longueur d'onde de mesure, les traceurs libres ne sont pas visibles photométriquement, tandis que leurs agrégats le deviennent après agglutination anticorps/antigène.Suivant que ces traceurs sont utilisés dans un procédé turbidimétrique ou néphélémétrique, les sensibilités sont respectivement d'au moins 100 et 10 ng.ml-1.

On connait aussi les brevets FR-A-2 362 398 et FR-A-2 417 108 qui préconisent l'utilisation de marqueurs particulaires divers d'un diamètre d inférieur à 1,6 llm (de préférence entre 0,2 et 0,8 llm) dans une technique turbidimétrique en lumière infrarouge (600-2400 nm). Là encore les paramètres du procédé sont ajustés de façon que, à la longueur d'onde de mesure, le traceur libre n'absorbe pas la lumière quand il est irradié par un rayonnement (k) tel que X/d 2 1,5. Par contre, les agglutinats de ces traceurs à la même longueur d'onde provoquent une extinction du faisceau lumineux transmis par le mélange réactionnel. La sensibilité de cette technique est de l'ordre de 10-20 ng.ml-1.

Une approche un peu différente est celle des brevets FR-A-2 604 526 et FR
A-2 651 326 qui consiste non pas à suivre l'apparition du signal optique propre aux agrégats, mais à mesurer la diminution d'absorbance du milieu réactionnel à la longueur d'onde correspondant au maximum d'absorption vraie du traceur libre [FR A-2 651 326, p. 2, lignes 1-5]. Dans cette technique, il est très surprenant de constater que des marqueurs particulaires constitués de polymères aromatiques (polystyrène, polyvinyltoluène, styrène/butadiène) ou éthyléniques (polyvinylbutadiène), présentent un maximum d'absorption vraie entre 320 et 800 nm [FR-A-2 604 526, p. 19, lignes 20-32; Figure 2], alors qu'il est parfaitement reconnu que de tels systèmes conjugués ont une absorption vraie comprise entre 200 et 300 nm.C'est d'ailleurs le fait que ces marqueurs macromoléculaires n'ont aucune absorption vraie dans le spectre visible qui justifie leur large emploi dans de nombreuses techniques de calibration optique. Il est encore plus surprenant de constater qu'à matière constituante égale, par exemple du polystyrène, c'est uniquement l'enveloppe caractéristique (dimensions et formes) du traceur [FR-A-2 651 326, p. 8, lignes 1-6; p. 9, lignes 10-12] qui conditionne la longueur d'onde de maximum d'absorbance vraie [FR-A-2 651 326, revendication 8] alors que par définition l'allure d'un spectre d'absorption vraie est indépendante de la concentration et de l'organisation macromoléculaire du chromophore.En fait les observations décrites dans ces deux brevets sont plus à rapprocher des principes diffusiométriques que de tout autre phénomène, et expliquent en particulier les limites de sensibilité (10 ng.ml-1) et les problèmes rencontrés, analogues à ceux de la diffusiométrie.

D'une manière générale les techniques diffusiométriques à traceur particulaire, turbidimétrie et néphélémétrie en particulier, sont limitées par plusieurs facteurs:
1. obligation de choisir des marqueurs d'un diamètre inférieur à 0,2 ym pour
des techniques en lumière visible et 0,8,um en infrarouge. Ceci pour éviter que,
à la longueur d'onde de mesure, le bruit de fond optique dû au traceur libre ne
soit trop important, diminuant d'autant la dynamique du signal mesuré;
2. obligation de travailler généralement avec des dilutions importantes de traceur
pour éviter les interférences de signaux optiques entre centres diffusants
adjacents;
3. manque de sensibilité (10-100 ng.ml-1), lié à l'emploi de marqueurs de petit
diamètre et de faibles concentrations de traceur.Il faut alors des échantillons
suffisamment concentrés en analyte pour développer des agrégats optiquement
actifs à la longueur d'onde de mesure; agrégats dont la croissance est de toute
façon limitée par la dilution initiale du traceur libre;
4. manque de reproductibilité, lié à l'instabilité des marqueurs en suspens ion
trop diluée (facteur d'agglutination aspécifique du traceur) et au difficile contrôle
de l'agglutination même dans des conditions excessivement standardisées;
5. traitement éventuel des réactifs avant dosage; et
6. mise en oeuvre nécessitant parfois des appareils spécifiques et coûteux.

Par conséquent, I'objet essentiel de la présente invention est d'exploiter des principes optiques nouveaux qui suppriment les inconvénients inhérents aux lois de la diffusion simple (lois de MIE) mises en jeu dans les méthodes d'immunodosage turbidimétriques, néphélémétriques et dérivés, en proposant une solution technique basée sur des traceurs particulaires réunissant une substance immuno-réactive et un marqueur à l'état particulaire, utilisables dans le domaine des immunodosages photométriques, tels que::
1. ladite substance immuno-réactive est choisie parmi des anticorps ou des
antigènes, incluant les haptènes;
2. ledit marqueur est une particule dont la plus grande dimension est d'au moins
0,2 Fm, cependant que des dimensions comprises entre 0,5 et 4,0 m sont
préférables;
3. ledit marqueur est constitué d'un matériau ne présentant pas d'absorption
vraie dans le domaine des longueurs d'onde visibles/proches infrarouges;
4. ledit marqueur est constitué d'un matériau lyophobe ou amphilyophile et
présente en surface, de manière constitutive ou induite, un certain caractère
hydrophile nécessaire à la stabilité du traceur en phase liquide aqueuse; et
5. les tracés des courbes spectrales en lumière visible/proche infrarouge desdits
traceurs particulaires et de leurs agrégats en phase liquide aqueuse sont
sensiblement identiques quelles que soient les dimensions développées par
réaction d'agglutination anticorps/antigène.

Selon un autre aspect de Itinvention, on réalise un procédé d'immunodosage en phase homogène, simple, peu onéreux et nouveau, n utilisant que le minimum de réactif nécessaire à l'agglutination anticorps/antigène et qui met en oeuvre les propriétés optiques originales des traceurs particulaires susmentionnés pour la recherche quantitative d'anticorps et d'antigènes, incluant les haptènes, dans divers liquides d'épreuve.

Le troisième objet de la présente invention est de proposer un procédé de microdosage suffisamment simple de mise en oeuvre pour pouvoir être adapté facilement sur la plupart des instruments permettant une mesure photométrique, utilisables dans le domaine de l'analyse biologique et médicale, et plus particulièrement ceux permettant le dosage et l'analyse partiellement ou totalement automatisée d'une multiplicité d'échantillons, de manière à minimiser les temps de manipulation et de lecture de la mesure.

Un autre but de la présente invention est de proposer une micro-méthode de dosage immunologique suffisamment sensible, de l'ordre du nanogramme par millilitre, pour détecter des quantités extrêmement faibles d'anticorps et d'antigènes, dans tous les cas où la grande sensibilité des techniques radioimmunologiques (RIA) et enzymo-immunologiques (ELISA) n'est pas requise; ceci avec un gain de temps énorme par rapport au RIA et l'ELISA (pas de lavage, pas de phase d'extraction des complexes anticorps/antigène, temps d'incubation réduits) et sans les risques biologiques liés à la manipulation de radiosources (RIA).

Enfin le dernier but de cette invention est de proposer, suivant le type de molécule à rechercher, un procédé polyvalent permettant des dosages quantitatifs ou semi-quantitatifs d'anticorps et d'antigènes, incluant les haptènes, aussi bien sous forme de tests directs de détection (réaction d'agglutination) que de tests indirects de détection (réaction d'inhibition d'agglutination). Par extension, ce procédé peut aussi être utilisé pour des mesures qualitatives par simple comparaison de la valeur dosée à une valeur témoin, significative de la présence de l'anticorps et/ou de l'antigène à rechercher (en dépistage par exemple).

La manière dont la solution technique et le procédé suivant l'invention peuvent être réalisés et les autres buts et avantages qui en découlent, ressortiront mieux de la discussion et des exemples détaillés qui suivent, à l'appui des figures annexées dans lesquelles:
La Figure 1 est un diagramme illustrant les lois de MIE à travers la comparaison des courbes spectrophotométriques apparentes obtenues pour des suspens ions aqueuses de traceurs particulaires (à marqueur latex) dont les plus grandes dimensions sont respectivement de 0,1 Fm (Courbe 1A), 0,3 llm (Courbe 1B), 0,8 Zm (Courbe 1C) et 2,0 Fm (Courbe 1D).

La Figure 2 est un diagramme illustrant les courbes spectrophotométriques apparentes de différents niveaux d'agglutination, par réaction anticorps/antigène, d'un traceur latex toxoplasme ayant un diamètre moyen de 0,88 m au cours d'un titrage type d'un sérum Toxoplasme gondi positif: Blanc tampon (Courbe 2A), Sérum dilué au 1/16 (Courbe 2B), au 1/8 (Courbe 2D), au 1/4 (Courbe 2F), au 1/2 (Courbe 2E) et Sérum pur (Courbe 2C).

La Figure 3 est un diagramme illustrant les courbes spectrophotométriques apparentes de différents niveaux d'agglutination, par réaction anticorps/antigène, d'un traceur latex myoglobine ayant un diamètre moyen de 0,52 Fm au cours d'un dosage type de solutions étalons de myoglobine humaine titrées à 25 ng.ml-1 (Courbe 3A), 50 ng.ml-1 (Courbe 3B), 125 ng.ml-1 (Courbe 3C), 250 ng.ml-1 (Courbe 3D) et 550 ng.ml-1 (Courbe 3E).

La Figure 4 montre des courbes étalons de densité optique mesurées à des longueurs d'onde de 405 nm (Courbe 4A) et 540 nm (Courbe 4B) en utilisant d'une part un traceur latex myoglobine ayant un diamètre moyen de 0,52 ,um, et d'autre part différentes solutions étalons de myoglobine humaine.

La Figure 5 montre des courbes étalons de densité optique mesurées à des longueurs d'onde de 405 nm (Courbe SA) et 540 nm (Courbe 5B) en utilisant d'une part un traceur kaolin gentamicine ayant un diamètre variant entre 1,0 et 4,0 sum, et d'autre part différentes solutions étalons de sulfate de gentamicine.

Selon les recherches qui ont abouti à la mise au point de la présente invention, on a découvert que les propriétés optiques de traceurs particulaires réunissant une substance immuno-réactive et un marqueur à l'état particulaire, caractérisés en ce que:
1. ladite substance immuno-réactive est choisie parmi des anticorps ou des
antigènes, incluant les haptènes;
2. ledit marqueur est une particule dont la plus grande dimension est d'au moins
0,2 Clam ;
3. ledit marqueur est constitué d'un matériau ne présentant pas d'absorption
vraie dans le domaine des longueurs d'onde visibles/proches infrarouges ; et
4. ledit marqueur est constitué d'un matériau lyophobe ou amphilyophile et
présente en surface, de manière constitutive ou induite, un certain caractère
hydrophile; ne suivaient plus les lois de Mie ; les traceurs précités présentant alors avantageusement en lumière visible/proche infrarouge des courbes spectrales de tracé sensiblement identique, quel que soit leur degré d'agglutination par réaction anticorps/antigène.

Jusqu'à présent, les traceurs particulaires utilisés en immunoanalyse avaient un comportement optique décrit par les lois de la diffusion classique, comme illustré
Figure 1; à savoir que I'intensité diffusée aux grandes longueurs d'onde (radiations rouges) augmente avec la taille des traceurs tandis qu'elle diminue aux petites (radiations bleues). C'est ce phénomène qui a été maladroitement interprété comme une absorption vraie dans les brevets FR-A-2 604 526 [Figure 3, planche 2/4] et
FR-A-2 651 326.C'est aussi ce phénomène qui se cache derrière les termes visible et invisible utilisés dans les brevets FR-A-2 645 967 et FR-A-2 642 174, et plus généralement derrière toutes les techniques photométriques à traceur particulaire: dans la pratique, on se place à une longueur d'onde de mesure (X) telle que les traceurs libres ne sont pas photométriquement visibles alors que leurs agrégats le sont.Pour éviter un chevauchement trop important des spectres de diffusion des traceurs libres d'une part et de leurs agrégats d'autre part - facteur de perte de dynamique du signal optique et par conséquent de sensibilité - il faut soit se cantonner à n'utiliser que des marqueurs dont la plus grande dimension (d) est inférieure à 0,2 CLm si l'on travaille en lumière visible, soit recourir à des instruments optiques de mesure infrarouge pour pouvoir employer des marqueurs de plus grande taille (de toute façon inférieure à 0,8 ÇIm) ; ceci afin de maintenir un rapport X/d au moins supérieur à 2, garantissant que, à la longueur d'onde de mesure, le bruit de fond optique dû aux traceurs libres est minimum.Or si les traceurs sont de trop petite dimension, il faut alors des échantillons suffisamment concentrés en analyte pour développer des agrégats optiquement actifs à la longueur d'onde de mesure. Par ailleurs, la spécificité du signal engendré est médiocre compte tenu de l'hétérogénéité des agrégats développés par la réaction anticorps/antigène ; et ceci d'autant plus que le traceur est de petite taille. Il en résulte que les techniques turbidimétriques en lumière visible sont bien moins sensibles (100 ng.ml-1) que leurs équivalents en infrarouge (10-20 ng.ml-1).

L'autre alternative étant non pas de suivre l'apparition du signal optique dû aux agrégats comme en turbidimétrie classique et en néphélémétrie, mais d'observer l'extinction du signal engendré par les traceurs libres au cours de l'agglutination anticorps/antigène; ce que préconise par exemple les brevets FR-A-2 604 526 et
FR-A-2 651 326. C'est une approche a priori intéressante puisqu'elle lie le signal optique mesuré au seul paramètre qui n'évolue pas lors de l'agglutination: la dimension du traceur libre. Du fait de cette meilleure spécificité du signal, cette technique en lumière visible permet de gagner en sensibilité par rapport à la turbidimétrie classique, mais reste limitée par le fait qu'il faut quand même des échantillons assez concentrés en analyte pour déplacer suffisamment le signal optique dû aux agrégats et éviter toute interférence avec celui du traceur libre.

Conformément aux investigations menées dans le domaine des interactions matière/lumière, on a découvert que les traceurs particulaires suivant l'invention et leurs agrégats présentaient avantageusement des propriétés spectrales analogues sur tout le spectre visible/proche infrarouge. Par exemple, les spectres de transmission déterminés entre 200 à 670 nm de longueur d'onde, pour différents niveaux d'agglutination anticorps/antigène de suspensions liquides aqueuses de traceurs latex toxoplasme (0,88 Fm de diamètre) et latex myoglobine (0,52 Fm de diamètre) sont représentés respectivement Figures 2 & 3.De l'examen des Figures 2 & 3, il ressort clairement que, pour un traceur donné, les courbes spectrales (Courbes 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F ; Courbes 3A, 3B, 3C, 3D, 3E) dans l'intervalle de longueurs d'onde comprises entre 320 et 670 nm ont sensiblement le même tracé quel que soit le niveau d'agglutination du traceur par réaction anticorps/antigène. CeIa représente un fait nouveau nullement décrit dans l'art antérieur.

Conformément à un premier mode de réalisation de l'invention, des lumières de longueurs d'onde comprises entre 670 et 1000 nm sont égaIement utilisables pour la mesure photométrique à condition d'employer un instrument d'optique de haute sensibilité, cependant que de telles longueurs d'onde ne sont pas considérées comme avantageuses, leurs utilisations imposant un matérieI infrarouge spécifique.

Par contre, de I'examen de la Figure 2, il ressort que la région des longueurs d'onde ultraviolettes (200-320 nm) n'est pas exploitable selon l'invention du fait de la forte absorption parasite de bon nombre des composants constituant les milieux de base des suspensions de traceurs et des échantillons (Courbes 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F), de sorte que pratiquement seules les longueurs d'onde se trouvant dans le domaine visible/proche infrarouge sont utilisables en principe pour la mesure photométrique du degré d'agglutination du traceur.

Un autre intérêt non négligeable des traceurs selon l'invention est que le signal optique engendré par l'interaction matière/lumière n'est plus décrit en terme d' intensité et de déplacement optique comme en diffusiométrie, mais uniquement en intensité . L'indépendance du signal mesuré à la longueur d'onde offre à la solution technique selon l'invention une grande adaptabilité à tous les instruments d'optique aptes à la photométrie visible/proche infrarouge; ce qui est le cas de la majorité des appareils utilisés en immunoanalyse.

Mais beaucoup plus important encore, est la manière dont est associée l'intensité du signal optique mesuré à la variation du nombre et des dimensions des traceurs au cours de l'agglutination. Dans toutes les techniques diffusiométriques antérieurement connues, qui sont basées sur l'exploitation des lois de MIE, chaque agrégat ou traceur libre est assimilé à un centre diffusant qui présente en fonction de ses dimensions, un maximum d'absorption apparente (kmax ap) caractéristique.Comme le montre l'examen de la Figure 1, des centres diffusants de 0,1 Rm (Courbe 1A), 0,3 Fm (Courbe lB), 0,8 Fm (Courbe 1C) et 2,0 ,um (Courbe 1D) de diamètre sont caractérisés par des Bmax ap différents, respectivement de 226, 244, 389 et 850 nm (non représenté). Cette constatation est un inconvénient majeur des techniques diffusiométriques car l'agglutination, même dans des conditions extrêmement standardisées, est peu reproductible.Autrement dit, d'un essai à l'autre, il est difficile d'obtenir un degré d'agglutination constant dont le Bmax ap moyen est généralement choisi comme longueur d'onde de mesure, avec pour conséquence directe une mauvaise reproductibilité des mesures et une perte évidente de sensibilité. Par contre suivant la solution technique selon l'invention, les variations d'intensité relatives du signal optique mesuré entre différents niveaux d'agglutination des traceurs étant sensiblement identiques sur tout le spectre visible/proche infrarouge, la reproductibilité s'en trouve grandement améliorée, abaissant par la même les seuils de sensibilité.

Enfin l'indépendance du signal optique mesuré à la longueur d'onde, lève avantageusement la limitation imposée par la diffusiométrie dans le choix de la taille du marqueur. Dans la solution technique selon l'invention, la nature du signal optique mesuré n'étant définie que par sa composante intensité , on peut alors utiliser des marqueurs de forte dimension ce qui accroît la détectabilité des agrégats, et par conséquent la sensibilité de la mesure.

Par ailleurs, la solution technique selon l'invention permet aussi d'augmenter la précision des mesures en exploitant non plus un signal engendré par un phénomène négatif (diminution de la lumière transmise) comme en turbidimétrie, mais un signal analogue à un signal d'émission (augmentation de la lumière transmise), plus spécifique; et ceci sur un simple photomètre, sans nécessité d'avoir recours à un quelconque appareillage particulier de mesure.

Conformément à l'invention, il est essentiel pour Ia mise en oeuvre de telles propriétés optiques que la plus grande dimension des marqueurs soit d'au moins 0,2 clam, de préférence comprise entre 0,5 et 4,0 im.

Il est également important que la matière constituante du marqueur ne présente pas d'absorption vraie dans le domaine des longueurs d'onde visibles/proches infrarouges.

Indépendamment de ses propriétés optiques, l'autre caractéristique majeure du marqueur doit être sa capacité à pouvoir fixer par chimie covalente ou par simple adsorption physique les substances immuno-réactives précitées. Quel que soit le mode de couplage retenu, on préconise que le matériau constituant le marqueur soit lyophobe ou amphilyophile.

Eu égard à l'emploi de ces traceurs en immunodosage, il convient que l'agglutination suivie par photométrie soit spécifique de la réaction anticorps/antigène entre l'analyte et le partenaire immunologique couplé au marqueur. Or la nature lyophobe (totale ou partielle) des marqueurs selon l'invention peut entraîner une grande instabilité (floculation) du traceur en phase aqueuse, solvant le plus couramment utilisé pour constituer les milieux de base des traceurs et des analytes.

C'est pourquoi, conformément à l'invention, on préconise pour la préparation du traceur qu'au moins 10 % de la surface du marqueur soit occupée par des groupements hydrophiles, groupes polaires ou radicaux ionisés, constitutifs ou induits, notamment par peptisation avec un colloide hydrophile.

Ainsi, on diminue les tensions interfaciales liquide/solide entre le solvant aqueux d'une part et le marqueur d'autre part, et on augmente la barrière de potentiel de chaque traceur; ce qui prévient leur coalescence (floculation) et assure une grande stabilité (plusieurs mois) au réactif immunologique constitué du traceur en suspension liquide aqueuse.

Conformément à l'invention, lesdits groupements hydrophiles peuvent être de façon non limitative, de type aldéhyde (-CHO), amine aliphatique (-CH2-NH2), amide (-CO-NH2), amine aromatique (-4 > -NH2), acide carboxylique (-COOH), chlorométhyle (-CH2-Cl), hydrazide (NH-NH2), hydroxyle (-OH), thiol (-SH), sulfate (-S04) ou enfin sulfonate (-S03).

Ainsi les matériaux particulaires appropriés typiques utiles pour la réalisation de traceurs selon l'invention, sont des polymères organiques tels que des latex de polystyrène, de polyéthylène, de polyaminostyrène, de polyéthylméthacrylate, de polypropylène, de polychlorure de vinylbenzène, de polycarboxyvinyl, de polyvinyltoluène, de polyméthylméthacrylate, de polyacrylique, de polyacrylates, de styrène/butadiène, de styrène/divinylb enzène, de styrène/vinyltoluène, de styrène/acide acrylique et analogues ; des substances métalliques tels que l'or, l'argent et analogues; des substances minérales comme la silice, l'alumine, des silicates d'alumine et analogues.

La nouvelle solution technique suivant l'invention, qui repose notamment sur la similitude des propriétés spectrales de traceurs libres ou réticulés par réaction d'agglutination anticorps/antigène, se distingue de l'enseignement de toutes les techniques connues antérieurement.

Elle se différencie donc des brevets FR-A-2 362 398, FR-A-2 417 108,
FR-A-2 645 967 et FR-A-2 642 174 basés sur les propriétés d' invisibilité / visibilité de traceurs particulaires en fonction de leur degré d'agglutination, en ce sens que les traceurs présentent des propriétés spectrales différentes en fonction de leurs dimensions. En particulier, elle se différencie des brevets FR-A-2 362 398 et
FR-A-2 417 108 qui prévoient l'utilisation, en photométrique infrarouge, de traceurs à marqueurs minéraux ou synthétiques d'un diamètre n'excédant pas 1,6 Clam, en ce sens qu'il y est décrit comme un inconvénient majeur l'utilisation de rayons lumineux de longueurs d'onde inférieures à 600 nm pour le suivi de l'agglutination desdits traceurs.Elle se différencie en outre des brevets FR-A-2 645 967 et FR-A2 642 174 qui prévoient le suivi de l'agglutination de traceurs particulaires à marqueur latex par photométrie en lumière visible/proche infrarouge, en ce qu'il y est admis comme essentiel que les dimensions des marqueurs n'excèdent pas 200 nm.

La présente invention se différencie également des brevets FR-A-2 604 526 et
FR-A-2 651 326 qui reposent sur le suivi par photométrie ultraviolette/visible de la décroissance, au cours de la réaction d'agglutination, du signal optique engendré par des traceurs particulaires à marqueur latex d'un diamètre compris entre 0,01 et 5,0 clam, par le fait que lesdits traceurs ont une absorbance vraie dans le domaine des longueurs d'onde ultraviolettes/visibles, et que les agrégats desdits traceurs ont des propriétés spectrales différentes de celles des traceurs libres.

Le procédé d'immunodosage que l'on préconise selon l'invention, est une micro-méthode immunologique en phase homogène liquide/solide, de dosage qualitatif, semi-quantitatif ou quantitatif de solutions naturelles ou artificielles d'anticorps et/ou d'antigènes, caractérisée en ce qu'elle consiste essentiellement: à associer et insolubiliser, par chimie covalente ou par simple adsorption physique, une substance immuno-réactive choisie parmi des anticorps ou des antigènes, incluant les haptènes, à un marqueur particulaire lyophobe ou amphilyophile, ne présentant pas d'absorption vraie pour la lumière visible/proche infrarouge et dont la plus grande dimension est d'au moins 0,2 Clam ; à mettre en contact le réactif immunologique constitué dudit traceur en suspension dans un milieu liquide aqueux avec l'analyte de l'échantillon à doser; et à irradier le mélange réactionnel avec un rayonnement ayant une longueur d'onde comprise entre 320 et 1000 nm, pour mesurer l'intensité du flux lumineux transmis par ledit milieu réactionnel.

La mesure des variations de flux lumineux que l'on met en oeuvre selon l'invention, correspond en fait à la détermination de la densité optique (DO) ou de la transmittance (T) desdits milieux réactionnels, telle qu'on peut la réaliser sur tout photomètre.

La raison d'un telle efficacité du procédé selon l'invention, réside dans le fait qu'il existe dès lors une corrélation directe entre le degré d'agglutination des traceurs du système réactionnel et l'intensité du signal optique mesuré; il apparait aussi que le degré d'agglutination anticorps/antigène des traceurs est inversement proportionnel au logarithme de la concentration en analyte, anticorps et/ou antigènes, incluant les haptènes.Ainsi que cela ressort clairement de l'examen des Figures 4 & 5, quand un traceur selon l'invention est utilisé pour suivre photométriquement l'agglutination anticorps/antigène, une bonne corrélation se trouve établie entre la densité optique du mélange réactionnel et la concentration en analyte (Courbes 4A, 4B; Courbes 5A, 5B), et ceci quelle que soit la longueur d'onde de mesure dans le domaine des radiations visibles/proches infrarouges.

Conformément au procédé selon l'invention, on peut suivre par photométrie soit l'agglutination proprement dite (test direct), soit l'inhibition d'agglutination (test indirect) des traceurs.

Parmi les liquides d'épreuve, on peut doser selon l'invention du plasma, du sérum, de la lymphe, de l'urine, de la salive, du liquide céphalo-rachidien, des surnageants de cultures cellulaires et des extraits cellulaires ou tissulaires.

Par ailleurs, iI est considéré comme préférable que la température à laquelle est pratiquée la réaction d'agglutination anticorps/antigène soit comprise entre 10 et 40 "C, cependant qu'un intervalle de températures de 20-30 oC est plus particulièrement recommandé.

La réaction d'agglutination anticorps/antigène mise en oeuvre selon l'invention peut être menée directement en mettant en contact l'échantillon à doser éventuellement dilué dans une solution aqueuse appropriée, avec le réactif immunologique constitué du traceur en suspension liquide aqueuse. Néanmoins pour réaliser, conformément aux objectifs susmentionnés, une détermination très sensible de quantités infimes d'anticorps ou d'antigènes dans un liquide quel qu'il soit, on préconise pour favoriser la mise en contact des partenaires immunologiques, de pouvoir employer pendant au moins une partie de la réaction anticorps/antigène une forte densité de traceur sans pour autant que cela conduise à son agglutination aspécifique, par interactions faibles (liaisons de type hydrogène, ioniques, hydrophobes, Van der Waals) entre marqueurs ou protéines fixées sur ces derniers.

Dans ce sens, la présente invention se différencie également des procédés de l'art antérieur, qui prévoient un mode opératoire où la réaction d'agglutination est pratiquée en une seule étape (stationnaire ou non), en ce que, suivant l'invention, ladite réaction est réalisée sous agitation tourbillonnaire en deux étapes:
1. la première phase consiste à amorcer la réaction anticorps/antigène en mettant
en contact l'analyte avec le traceur à une concentration finale comprise entre 0,1
et 2,0 % (p/v), de façon à accroître la fréquence statistique des chocs efficaces
prévalant à l'agglutination spécifique des traceurs; et
2. la seconde phase consiste à poursuivre la réaction immunologique après avoir
dilué le mélange réactionnel initial par une solution saline d'un agent tensio-actif,
et privilégier ainsi l'agglutination spécifique du traceur par l'analyte du liquide
d'épreuve; après quoi, on mesure par photométrie l'intensité du flux lumineux transmis par le milieu réactionnel final dans le domaine des longueurs d'onde visibles/ proches infrarouges.

A titre de variante, seule la première phase de la réaction anticorps/antigène peut être réalisée sous agitation.

Dans la pratique de l'invention, un tel mode opératoire est particulièrement avantageux car il permet d'augmenter la concentration du traceur lors la phase d'amorçage de la réaction d'agglutination; on a ainsi découvert que pendant cette première étape de réaction au moins 80 % des combinaisons anticorps/antigène sont réalisées dans les 15 premières secondes. En effet la fréquence statistique des chocs entre traceurs est proportionnelle au carré de leur nombre et par suite de celui des agrégats du milieu réactionnel. Or ce nombre diminue au cube des dimensions développées par les agrégats. Ainsi des agglutinats dix fois plus gros que les traceurs monomériques qui les constituent, sont mille fois moins nombreux et se rencontrent par conséquent un million de fois moins souvent.Dans l'hypothèse où tous les chocs sont efficaces, la croissance des agrégats n'est limitée que par la fréquence de leur rencontre et donc de la concentration initiale en traceur du milieu réactionnel. Ainsi le mode opératoire selon l'invention, permet avantageusement de réduire les temps d'incubation nécessaires à la formation d'agrégats de traceurs optiquement actifs, et de développer, de toute façon, des agrégats de grandes dimensions, assurant une bonne dynamique au signal optique mesuré.

Néanmoins toute action qui tant à favoriser les rencontres entre traceurs au sein d'un mélange réactionnel augmente parallèlement la proportion d'agglutination aspécifique, simplement en fournissant aux particules l'énergie cinétique suffisante pour franchir les barrières de potentiel qui protègent chaque traceur de l'approche d'un voisin. La dichotomie du mode opératoire du procédé selon l'invention permet avantageusement d'exclure toute agglutination aspécifique par hydratation des protéines en solution et abaissement des tensions interfaciales solide/liquide, en diluant dans un second temps le milieu réactionnel initial par une solution saline d'un agent tensio-actif à une concentration qui, s'il était ajouté dès la phase initiale de la réaction d'agglutination, inhiberait ou tout du moins gênerait fortement la réaction anticorps/antigène.Parmi les agents tensio-actifs utilisables dans l'invention, les détergents non ioniques sont préférés car l'expérience montre que ce ne sont pas des compétiteurs des substances immunoréactives adsorbées à la surface des particules, dans le cas d'une fixation non covalente.

Conformément à l'invention, les agents tensio-actifs appropriés typiques sont le TRIToN
X-I00 et le TWEEN) 20 à des concentrations finales comprises entre 0,2 et 0,05 % (v/v).

Il est possible, bien entendu, d'appliquer la présente invention pour déterminer la cinétique de la réaction d'agglutination anticorps/antigène du traceur par l'analyte, par mesure à intervalle régulier pendant un temps déterminé de l intensité du flux lumineux transmis par le mélange réactionnel.

De préférence, le procédé de dosage selon Invention sera mis en oeuvre sur microplaque ou sur barrette. Dans la pratique, ce support offre l'avantage d'être d'une grande souplesse et permet à tout laboratoire équipé d'un photomètre du type de ceux utilisés pour l'enzymo-innnunoanalyse, de traiter aisément de petites comme de grandes séries d'échantillons (8 à 96 simultanément), avec un coût minimum.

Le dosage peut également être réalisé sur tout appareil automatique de type analyseur de biochimie, et tout spectrophotomètre avec, en contre-partie, une utilisation plus restrictive dans ce dernier cas, compte tenu du plus grand nombre de manipulations nécessaires à la mise en oeuvre du procédé pour le traitement de séries d'échantillons.

Compte tenu de la polyvalence de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, un nécessaire pour dosage immunologique par photométrie comprend au minimum les deux réactifs de base (réactif immunologique, diluant de la réaction) nécessaires à la réaction anticorps/antigène dans les conditions susmentionnées. Eventuellement ce nécessaire pourra comporter les divers accessoires propres à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention sur chaque instrument d'optique permettant une mesure photométrique.

Dans le procédé selon l'invention, la combinaison des nouveautés techniques liées à l'originalité du mode opératoire et des propriétés optiques des traceurs selon l'invention permet avantageusement d'atteindre:
1. des seuils de sensibilité de l'ordre du nanogramme par millilitre (ng.ml-1), de
sorte que ce procédé est parfaitement adapté aux principales applications
immunologiques actuelles;
2. une très bonne reproductibilité et répétabilité des mesures, variant
respectivement suivant les protocoles de mise en oeuvre (manuel ou automatique)
de 2,0 à 7,0 % et de 0,1 à2,0%;
3. une grande simplicité de mise en oeuvre, sans nécessité d'aucun traitement
préalable des réactifs, ni des liquides d'épreuve;
4. une grande adaptabilité à la plupart des instruments permettant une mesure
photométrique visible/proche infrarouge; et
5. une grande stabilité du réactif immunologique; et remédie aux nombreux inconvénients des méthodes diffusiométriques antérieurement connues qui sont imprécises et peu sensibles étant donné la faible spécificité du signal optique mesuré, le nombre important de facteurs pouvant interférer avec la mesure (poussières, impuretés quelconques), l'utilisation de marqueurs de faible diamètre et de suspensions de traceurs très diluées, l'instabilité des traceurs, le fait de mener généralement la réaction en état stationnaire ou enfin la difficile maîtrise de l'agglutination non spécifique au cours de temps d'incubation pouvant être très longs.

La manière dont le procédé suivant l'invention peut être réalisé et les avantages qui en découlent, ressortiront mieux des exemples non limitatifs qui suivent.

EXEMPLE 1. Préparation d'un réactif latex anti-myoglobine adsorbé.

Dans un tube en verre, on place 4 millilitres (ml) d'une solution en tampon tris (hydroxym éthyl)-aminométhane H CI 0,10 Molaire pH=7,5 d'anticorps antimyoglobine humaine (SIGMA, France) à une concentration de 0,7 mg.ml-1, puis on ajoute, sous agitation, 0,5 ml d'une solution commerciale de latex de polystyrène carboxylé (0,52 clam) à une concentration de 10 % en poids (Réf. P0005070PN,
BANGS LABORATORIES, USA). Après agitation pendant 2 minutes, le mélange est laissé reposer 8 heures à température ambiante, puis 16 heures à +4 "C. Le mélange est ensuite centrifugé à 10 000 g, 20 minutes, +4 "C et le culot repris en tampon tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane HCI 0,1 0M pH=7,5. On pratique ainsi deux lavages successifs. Le dernier culot est repris et ajusté en tampon de stockage (tampon tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane HCI 0,10M pu=7,5 ; PEG 6000 3,0 % ; Azide de Sodium 19.1-1).

Dans ces conditions de préparation, le réactif latex anti-myoglobine adsorbé est stable pendant au moins 3 mois, et ne présente aucun phénomène de désorption.

EXEMPLE 2. Dosage quantitatif de la myoglobine sérique par test latex direct pour le diagnostic de lésions musculaires ef cardiaques (infarctus)
Dans les microcupules d'une microplaque ou d'une barrette de type ELISA, on dépose en doublet 20 microlitres ( > I) de différentes solutions étalons de myoglobine (25 50 ; 125 ; 250 ; 550 ng.ml-1 de myoglobine humaine ; SIGMA, France) que l'on fait réagir 1 minute sous agitation à température ambiante avec 10 FI du réactif latex anti-myoglobine adsorbé tel que préparé en (1). On dilue ensuite le volume réactionnel par 100 rI d'une solution saline à 0,25 % de TRITON49 X-100 et on agite 2 minutes.

La mesure de densité optique (DO) est faite à 405 et 540 nm sur un lecteur optique de microplaque ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS.

On obtient ainsi les résultats consignés dans le Tableau A.

Quand, à partir des données ci-dessous, on trace un graphique en portant en abscisse le logarithme de la concentration de myoglobine humaine et en ordonnée les valeurs de DO mesurées à 405 nm (Courbe 4A) et 540 nm (Courbe 4B), les courbes étalons ainsi établies ont l'aspect de lignes parallèles pratiquement droites, comme le montre la Figure 4, tout du moins pour les concentrations susspécifiées en myoglobine.

TABLEAU A. GAMME ETALON MYOGLOBINE/REACTIF LATEX

<tb> Concentration
<tb> de <SEP> myoglobine <SEP> D0405 <SEP> nm <SEP> DO540 <SEP> nm
<tb> <SEP> 25 <SEP> ng.ml-1 <SEP> 1,128 <SEP> 0,955
<tb> <SEP> 50 <SEP> 1,008 <SEP> 0,864
<tb> <SEP> 125 <SEP> 0,855 <SEP> 0,725
<tb> <SEP> 250 <SEP> 0,742 <SEP> 0,626
<tb> <SEP> 550 <SEP> 0,611 <SEP> 0,514
<tb>
Les valeurs de DO obtenues pour des liquides d'épreuve testés suivant le même protocole, sont comparées avec la courbe d'étalonnage semi-logarithmique établie à l'une des quelconques longueurs d'onde de mesure dans l'intervalle 320-670 nm, ce qui permet de déterminer la concentration en myoglobine humaine des échantillons dosés, avec des sensibilités identiques quelle que soit la longueur d'onde de mesure dans le domaine des radiations visibles/proches infrarouges.

EXEMPLE 3. Préparation d'un réactif kaolin gentamicine adsorbé.

a. Dans un tube en verre, on dissout 40 milligrammes (mg) d'albumine bovine (BSA; SIGMA, France) et 50 mg de sulfate de gentamicine (SIGMA, France) dans 2 ml d'une solution aqueuse pH=6,5 d'un carbodiimide hydrosoluble, le 1-(3diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (ALDRICH, France), à une concentration de 2 mg.ml-1, préparée extemporanément. Après 4 heures d'incubation à 37 G sous agitation, le mélange est dialysé 12 heures à +4 "C contre du tampon glycine 0,10 M pH=8,2.

b. Dans un tube en verre, on place 4 ml d'une solution en tampon glycine 0,10M pH=8,2 de conjugué gentamicine/BSA préparé en (a) à une concentration de 1,0 mg.ml-1 équivalent BSA, puis on ajoute, sous agitation, 30 mg de kaolin (Silicate d'alumine hydraté calibré ; 1,0-4,0 Fm; SIGMA, France). Après agitation pendant 2 minutes, le mélange est laissé reposer 8 heures à température ambiante, puis 16 heures à +4 C, Le mélange est ensuite centrifugé à 6 000 g, 30 minutes, +4 "C et le culot repris en tampon glycine 0,10M pH=8,2. On pratique ainsi deux lavages successifs. Le dernier culot est repris et ajusté en tampon de stockage (tampon glycine 0,10M pH=8,2 ; BSA 0,1 % ; Azide de Sodium 19.1-1).

Dans ces conditions de préparation, le réactif kaolin gentamicine adsorbé est stable pendant au moins 3 mois, et ne présente aucun phénomène de désorption.

EXEMPLE 4. Dosage quantitatif de la gentamicine par test kaolin indirect (inhibition d'agglutination).

Dans les microcupules d'une microplaque ou d'une barrette de type ELISA, on dépose en doublet 20 1ll des différents points d'une gamme étalon liquide (15 ; 30 ; 60 120 ; 240 ; 480 ng.ml-1 de gentamicine) que l'on fait réagir à température ambiante avec 20 iii d'un antisérum de lapin anti-gentamicine/BSA (SIGMA,
France) dilué au 1/200 en tampon glycine 0,10M pH=8,2. Après 1 minute d'agitation, on ajoute 10 il du réactif kaolin gentamicine adsorbé tel que préparé en (3) et on incube ce mélange dans les mêmes conditions d'agitation pendant 2 minutes. On dilue ensuite le volume réactionnel par 150 Crl d'une solution saline à 0,2 % de TRITONS X-100 et on agite 2 minutes.

La mesure de DO est faite à 405 et 540 nm sur un lecteur optique de microplaque
ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS.

On obtient ainsi les résultats consignés dans le Tableau B ci-après.

TABLEAU B. GAMME ETALON GENTAMICINE/REACTIF KAOLIN

<tb> <SEP> Concentration <SEP>
<tb> de <SEP> gentamicine <SEP> DO405 <SEP> nm <SEP> DO0 <SEP> nm
<tb> <SEP> 15 <SEP> ng.ml-l <SEP> 0,735 <SEP> 0,702
<tb> <SEP> 30 <SEP> 0,638 <SEP> 0,601
<tb> <SEP> 60 <SEP> 0,551 <SEP> 0,511
<tb> <SEP> 120 <SEP> 0,449 <SEP> 0,415
<tb> <SEP> 240 <SEP> 0,357 <SEP> 0,316
<tb> <SEP> 480 <SEP> 0,276 <SEP> 0,229
<tb>
Quand on établit pour des longueurs d'onde de 405 nm (Courbe 5A) et 540 nm (Courbe 5B) les courbes étalons semi-logarithmiques sur la base des données cidessus, comme illustré Figure 5, on constate l'existence d'une étroite corrélation entre la concentration en gentamicine et la valeur de DO, quelle que soit la longueur d'onde de mesure.

Par conséquent, les valeurs de DO obtenues pour des liquides d'épreuve testés suivant ie même protocole, peuvent être comparées avec l'une des courbes d'étalonnage semi-logarithmiques ainsi établies, permettant dès lors de déterminer la concentration en gentamicine dans n'importe quel échantillon.

EXEMPLE 5. Préparation d'un réactif latex genfamicine adsorbé.

a. Le conjugué gentamicine/BSA est préparé comme au (3a), excepté la dialyse qui est effectuée contre un tampon phosphate 0,15M pH=7,8.

b. Dans un tube en verre, on place 4 ml d'une solution en tampon phosphate 0,15M pH=7,8 de conjugué gentamicine/BSA préparé en (a) à une concentration de 0,8 mg.ml-1 équivalent BSA, puis on ajoute, sous agitation, 0,5 ml d'une solution commerciale de latex de polystyrène carboxylé (0,52 im) à une concentration de 10 % en poids (Réf. P0005070PN, BANGS LABORATORIES, USA). Après agitation pendant 2 minutes, le mélange est laissé reposer 8 heures à température ambiante, puis 16 heures à +4 "C. Le mélange est ensuite centrifugé à 10 000 g, 20 minutes, +4 "C et le culot repris en même tampon phosphate. On pratique ainsi deux lavages successifs. Le dernier culot est repris et ajusté en tampon de stockage (tampon phosphate 0,15M pH=7,8; PEG 6000 3 % Azide de Sodium 19.1-1).

Dans ces conditions de préparation, le réactif latex gentamicine adsorbé est stable pendant au moins 3 mois, et ne présente aucun phénomène de désorption.

EXEMPLE 6. Dosage quantitatif de la gentamicine par test latex indirect (inhibition d'agglutination).

Dans les microcupules d'une microplaque ou d'une barrette de type ELISA, on dépose en doublet 20 1ll des différents points d'une gamme étalon liquide (15 ; 30 ; 60 120 ; 240 ; 480 ng.ml-1 de sulfate de gentamicine) que l'on fait réagir à température ambiante avec 20 yI d'un antisérum de lapin anti-gentamicine/BSA (SIGMA, France) dilué au 1/200 en tampon phosphate 0,15M pH=7,8. Après 1 minute d'agitation, on ajoute 10 pI du réactif latex gentamicine adsorbé tel que préparé en (5) et on incube ce mélange dans les mêmes conditions d'agitation pendant 2 minutes. On dilue ensuite le volume réactionnel par 50 21l d'une solution saline à 0,1 % de TRITON) X-100 et on agite 2 minutes.

La mesure de DO est faite à 405 et 540 nm sur un lecteur optique de microplaque ORUHO DIAGNOSTIC SYSTEMS.

Les valeurs de DO obtenues pour des liquides d'épreuve testés suivant le même protocole, sont comparées avec la courbe d'étalonnage semi-logarithmique établie à partir des données de la gamme étalon ci-dessous (Tableau C), ce qui permet de déterminer la concentration en gentamicine des échantillons dosés.

TABLEAU C. GAMME ETALON GENTAMîCINE/REACTîF LATEX

<tb> Concentration
<tb> de <SEP> gentamicine <SEP> DO405nm <SEP> DO540 <SEP> nm
<tb> <SEP> 15 <SEP> ng.ml-l <SEP> 1,243 <SEP> 1,123
<tb> <SEP> 30 <SEP> 1,108 <SEP> 0,991
<tb> <SEP> 60 <SEP> 0,968 <SEP> 0,860
<tb> <SEP> 120 <SEP> 0,835 <SEP> 0,735
<tb> <SEP> 240 <SEP> 0,698 <SEP> 0,601
<tb> <SEP> 480 <SEP> 0,581 <SEP> 0,478
<tb>
EXEMPLE 7. Préparation d'un réactif latex théophylline adsorbé.

a. Dans un tube en verre, on dissout 40 mg d'hémocyanine (KLH ; SIGMA, France) et 50 mg d'un dérivé carboxylé de la théophylline, la 8-(3-carboxypropyl)-1 ,3 diméthylxanthine (SIGMA, France) dans 2 ml d'une solution aqueuse pH=5,5 de 1 (3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (ALDRICH, France) à une concentration de 2 mg.ml-1, préparée extemporanément. Après 4 heures d'incubation à 37 "C sous agitation, le mélange est dialysé 12 heures à +4 "C contre du tampon phosphate 0,15M pH=7,8.

b. Dans un tube en verre, on place 4 ml d'une solution en tampon phosphate 0,15M pH=7,8 de conjugué théophylline/KLH préparé en (a) à une concentration de 0,8 mg.ml-1 équivalent BSA, puis on ajoute, sous agitation, 0,5 ml d'une solution commerciale de latex de polystyrène carboxylé (0,52 zm) à une concentration de 10 % en poids (Réf. P0005070PN, BANGS LABORATORIES, USA). Après agitation pendant 2 minutes, le mélange est laissé reposer 8 heures à température ambiante, puis 16 heures à +4 "C. Le mélange est ensuite centrifugé à 10 000 g, 20 minutes, +4 "C et le culot repris en même tampon phosphate. On pratique ainsi deux lavages successifs.Le dernier culot est repris et ajusté en tampon de stockage (tampon phosphate 0,15M pH=7,8; PEG 6000 3 % ; Azide de Sodium 19.1-1).

Dans ces conditions de préparation, le réactif latex théophylline adsorbé est stable pendant au moins 3 mois, et ne présente aucun phénomène de désorption.

EXEMPLE 8. Dosage quantitatif de la théophylline par test latex indirect (inhibition d'agglutination).

Dans les microcupules d'une microplaque ou d'une barrette de type ELISA, on dépose en doublet 20 yI des différents points d'une gamme étalon liquide (7,5 ; 15 ; 30 75 ; 150 ng.ml-1 de théophylline ; SIGMA, France) que l'on fait réagir à température ambiante avec 20 zI d'un antisérum de lapin anti-théophylline/KLH (SIGMA, France) dilué au 1/300 en tampon phosphate 0,15M pH=7,8. Après 1 minute d'agitation, on ajoute 10 1ll du réactif latex théophylline adsorbé tel que préparé en (7) et on incube ce mélange dans les mêmes conditions d'agitation pendant 2 minutes.On dilue ensuite le volume réactionnel par 50 1ll d'une solution saline à 0,1 % de TRITON(9 X-100 et on agite 2 minutes.

La mesure de DO est faite à 405 nm sur un lecteur optique de microplaque ORTHO
DIAGNOSTIC SYSTEMS.

Les valeurs de DO obtenues pour des liquides d'épreuve testés suivant le même protocole, sont comparées avec la courbe d'étalonnage semi-logarithmique établie à partir des données de la gamme étalon ci-après (Tableau D), ce qui permet de déterminer la concentration en théophylline des échantillons dosés.

TABLEAU D. GAMME ETALON THEOPHYLLINE/REACTIF LATEX

<tb> Concentratian
<tb> de <SEP> théophylline <SEP> D0405nm
<tb> <SEP> 7,5 <SEP> ng.ml-1 <SEP> 1,098
<tb> <SEP> 15 <SEP> 0,941
<tb> <SEP> 30 <SEP> 0,768
<tb> <SEP> 75 <SEP> 0,570
<tb> <SEP> 150 <SEP> 0,401
<tb>
EXEMPLE 9. Préparation dtun réactif latex TgAg covalent.

a. Dans un tube en verre, on active pendant 10 minutes à 50 "C 10 mg de latex de polystyrène carboxylé d'un diamètre de 0,88 iim (Réf. P0008801CN, BANGS
LABORATORIES, USA) lavé plusieurs fois à l'eau déionisée, par 1 mg de 1-(3diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (ALDRICH, France). Le latex activé est centrifugé, lavé et redispersé en tampon phosphate 0,15M pH=7,8. Le latex ainsi activé est à utiliser dans les deux heures qui suivent sa préparation.

b. On ajoute ensuite à la suspension aqueuse de latex activé préparée en (a) 1 ml d'un lysat de Toxoolasma aondii à une concentration de 3 mg.ml-1 équivalent BSA, en tampon phosphate 0,15M pH=7,8 et on incube le mélange 10 minutes à 50 "C. Le latex sensibilisé est alors centrifugé, lavé deux fois en tampon phosphate 0,15M pH=7,8 puis repris et ajusté en tampon de stockage (tampon phosphate 0,1su pH=7,8 ; PEG 6000 3 % ; Azide de Sodium 19.1-1).

Dans ces conditions de préparation, le réactif latex TgAg covalent est stable pendant au moins 3 mois.

EXEMPLE 10. Dosage semi-quantitatif par test latex direct des anticorps anfi
TgAg totaux dans le dépistage d'infection par Toxoolasma aondii.

Dans les microcupules d'une microplaque ou d'une barrette de type ELISA, on dépose en doublet 30 FI d'un sérum témoin négatif, d'un sérum témoin positif ajusté à deux fois le seuil de positivité et des sérums à doser dilués au dixième en tampon phosphate 0,1su pH=7,8. On ajoute ensuite dans les mêmes microcupules, 10 xli de réactif latex TgAg covalent tel que préparé en (9). Après 1 minute d'agitation, on dilue les volumes réactionnels par 100 pI d'une solution saline à 0,2 % de TRITONS
X-100 et on agite 2 minutes.

La mesure de DO est faite à 405 nm sur un lecteur optique de microplaque ORTHO
DIAGNOSTIC SYSTEMS.

Les valeurs de DO obtenues sont exprimées sous forme du rapport:
DO témoin négatif
DO échantillon et sont répertoriées dans le Tableau E ci-dessous, en comparaison d'une technique de référence, un ELISA Toxoplasme.

TABLEAU E

<tb> Patient <SEP> ELISA <SEP> Toxo <SEP> Latex <SEP> Toxo
<tb> S12-15 <SEP> < <SEP> 1/Négatif <SEP> ~ <SEP> 1/Négatif <SEP>
<tb> S15-121 <SEP> < <SEP> 1/Négatif <SEP> - <SEP> 1/Négatif
<tb> S15-179 <SEP> 2,29/Positif <SEP> 1,47/Positif
<tb> SI <SEP> 5-17 <SEP> 2,87/Positif <SEP> 1,35/Positif
<tb> S1 <SEP> 3-42 <SEP> 7,20/Positif <SEP> 1,36/Positif <SEP>
<tb> S16-22 <SEP> 1,43/Douteux <SEP> 1,62/Positif
<tb> Si <SEP> 2-17 <SEP> < <SEP> 1/Négatif <SEP> - <SEP> 1/Négatif
<tb> S1 <SEP> 5-1 <SEP> 51 <SEP> 5,33/Positif <SEP> 1,13/Positif <SEP>
<tb> S12-19 <SEP> < <SEP> 1/Négatif <SEP> ~ <SEP> 1/Négatif <SEP>
<tb> S12-81 <SEP> < <SEP> 1/Négatif <SEP> - <SEP> 1/Négatif
<tb> S1 <SEP> 5-1 <SEP> 00 <SEP> < <SEP> 1/Négatif <SEP> - <SEP> 1/Négatif
<tb> S1 <SEP> 5-1 <SEP> 01 <SEP> < <SEP> 1/Négatif <SEP> - <SEP> 1/Négatif
<tb> S15-95 <SEP> < <SEP> 1/Négatif <SEP> - <SEP> 1/Négatif
<tb> 515-18 <SEP> 2,07/Positif <SEP> 1,43/Positif
<tb> S23-48 <SEP> < <SEP> 1/Négatif <SEP> - <SEP> 1/Négatif
<tb> S23-89 <SEP> < <SEP> 1/Négatif <SEP> - <SEP> 1/Négatif
<tb> S23-11 <SEP> < <SEP> 1/Négatif <SEP> - <SEP> 1/Négatif
<tb> S77-15 <SEP> < <SEP> 1/Négatif <SEP> - <SEP> 1/Négatif
<tb>

Claims (23)

1. réaction d'agglutination anticorps/antigène.

   sensiblement identiques quelles que soient les dimensions développées par

   traceurs particulaires et de leurs agrégats en phase liquide aqueuse sont

   - les tracés des courbes spectrales en lumière visible/proche infrarouge desdits

   hydrophile; et

   présente en surface, de manière constitutive ou induite, un certain caractère

   - ledit marqueur est constitué d'un matériau lyophobe ou amphilyophile et

   dans le domaine des longueurs d'onde visibles/proches infrarouges;

   - ledit marqueur est constitué d'un matériau ne présentant pas d'absorption vraie

   0,2 micromètre;

   - ledit marqueur est une particule dont la plus grande dimension est d'au moins

   antigènes, incluant des haptènes;

   - ladite substance immuno-réactive est choisie parmi des anticorps ou des

   REVENDICATIONS 1. Traceurs particulaires réunissant une substance immuno-réactive et un marqueur à l'état particulaire, utilisables dans le domaine des dosages mettant enjeu une réaction anticorps/antigène, se caractérisant en ce que:
2. 2. Traceurs particulaires suivant la revendication 1, caractérisés en ce que les marqueurs sont choisis parmi les groupes constitués des particules d'un polymère synthétique, des particules d'une substance minérale ou des particules d'un métal.
3. 3. Traceurs particulaires suivant la revendication 2, caractérisés en ce que le polymère synthétique est choisi parmi les homopolymères de styrène, d'éthylène, de vinyltoluène, de méthylméthacrylate, d'éthylméthacrylate, de propylène, de chlorure de vinylbenzène, de vinyl carboxylé, d'acide acrylique, d'acrylates divers, d'aminostyrène ; parmi les copolymères de styrène/butadiène, de styrène/divinylbenzène, de styrène/vinyltoluène, de styrène/acide acrylique.
4. 4. Traceurs particulaires suivant la revendication 2, caractérisés en ce que les substances minérales utilisées sont la silice, de l'alumine, des silicates d'alumine.
5. 5. Traceurs particulaires suivant la revendication 2, caractérisés en ce que les métaux utilisés sont l'or ou l'argent.
6. 6. Traceurs selon la revendication 1, caractérisés en ce que plusieurs molécules de la ladite substance immuno-réactive sont fixées par covalence ou par simple adsorption physique à chaque marqueur particulaire.
7. 7. Traceurs selon la revendication 1, caractérisés en ce que la plus grande dimension du marqueur est comprise entre 0,5 et 4,0 micromètres.
8. 8. Traceurs selon la revendication 1, caractérisés en ce que le caractère hydrophile est porté par au moins 10 % de la surface du marqueur.
9. 9. Traceurs selon la revendication 1, caractérisés en ce que le caractère hydrophile de surface du marqueur est assuré par toute fonction chimique de type aldéhyde (-CHO), amine aliphatique (-CH2-NH2), amide (-CO-NH2), amine aromatique (-4 > -NH2), acide carboxylique (-CO OH), chlorométhyle (-CH2-Cl), hydrazide (NH-NH2), hydroxyle (-OH), thiol (-SH), sulfate (-S04) ou sulfonate (-S03).
10. 10. Traceurs selon la revendication 1, caractérisés en ce que le caractère hydrophile de surface du marqueur est assuré par peptisation avec un colloide hydrophile.
11. 11. Utilisation de traceurs suivant l'une des quelconques revendications 1 à 10 dans le domaine des immunodosages par photométrie.
12. 12. Procédé de mesure et d'immunodosage photométrique de toute substance immuno-réactive, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement : à associer et insolubiliser, par chimie covalente ou par simple adsorption physique, la substance immuno-réactive choisie parmi des anticorps ou des antigènes, incluant les haptènes, à un marqueur particulaire dont la plus grande dimension est d'au moins 0,20 micromètre; à mettre en contact ledit traceur avec l'analyte de l'échantillon dans un milieu liquide aqueux; et à irradier le mélange réactionnel avec une lumière ayant une longueur d'onde comprise entre 320 et 1000 nanomètres, pour mesurer l'intensité du flux lumineux transmis par le milieu réactionnel.
13. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre tout moyen favorisant l'agglutination spécifique du traceur par l'analyte.
14. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la réaction d'agglutination du traceur par l'analyte est menée sous agitation tourbillonnaire en deux phases : la première consiste à amorcer la réaction anticorps/antigène en mettant en contact l'analyte avec le traceur à une concentration finale comprise entre 0,1 et 2,0 % (p/v); puis à poursuivre la réaction immunologique après avoir dilué le mélange réactionnel initial par une solution saline d'un agent tensio-actif.
15. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisée en ce que l'agent tensio-actif est de type non ionique.
16. 16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif est utilisé dans le mélange réactionnel à une concentration comprise entre 0,2 et 0,05 % (v/v).
17. 17. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la réaction d'agglutination anticorps/antigène est réalisée dans la gamme de températures allant de 10 à 40 "C et de préférence entre 20 et 30 OC.
18. 18. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la lumière appliquée pour Ia mesure photométrique est choisie dans l'intervalle de longueurs d'onde comprises entre 340 et 620 nanomètres.
19. 19. Procédé selon l'une des quelconques revendications 12 à 18, caractérisé en ce que l'on mesure par photométrie soit l'agglutination, soit l'inhibition d'agglutination du traceur.
20. 20. Procédé selon l'une des quelconques revendications 12 à 19, caractérisé en ce que l'on mesure par photométrie la cinétique de la réaction d'agglutination anticorps/antigène du traceur par l'analyte.
21. 21. Procédé selon l'une des quelconques revendications 12 à 19, caractérisé en ce que l'on mesure par photométrie l'intensité du flux lumineux transmis par le mélange réactionnel après un temps de réaction d'une durée prescrite pour des conditions déterminées.
22. 22. Application du procédé selon l'une des quelconques revendications 12 à 21, à la détection de produits d'amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction).
23. 23. Nécessaire pour immunodosage par photométrie, caractérisé en ce qu'il comprend les divers réactifs et accessoires nécessaires à la mise en oeuvre du procédé selon les revendications 12 à 21.