FR2857097A1 - Procede d'obtention d'un systeme d'etalonnage unique applique au dosage multiparametrique d'anticorps preferentiellement d'au moins les anticorps anti-gliadine et anti-transglutaminase. - Google Patents

Abstract

L'invention utilise différentes catégories de particules sensibilisées, chacune par un antigène spécifique de l'un des anticorps à doser notamment des anti-corps anti-Gliadine et des anticorps anti-Transglutaminase. On prépare un réactif immunologique constitué par un mélange de chacune desdites catégories de particules respectivement sensibilisées par une quantité sélectionnée d'antigènes donnés, notamment GLIA et tTG, mesure les signaux résultants de l'interaction entre ledit réactif immunologique et, d'une part, l'échantillon biologique, d'autre part, un standard d'étalonnage,détermine un facteur de correction à appliquer aux différents signaux résultants de manière à obtenir la titration, en unités biologiques, de chaque analyte de l'échantillon.

Description

Procédé d'obtention d'un système d'étalonnage unique appliqué aux dosage

multiparamétrique d'anticorps, préférentiellement d'au moins les anticorps anti-Gliadine et les anticorps anti-Transglutaminase.

La présente invention concerne, d'une manière générale, le domaine des dosages d'anticorps à partir d'échantillons biologiques et, plus particulièrement l'étalonnage de tels procédés de dosage. De manière spécifique, la présente invention a pour objet un nouveau procédé d'obtention d'un système d'étalonnage unique, permettant de quantifier simultanément plusieurs anticorps, notamment des anticorps anti-Gliadine (désignés ci-après par anti-GLIA) et des anticorps anti-Transglutaminase (désignés ci-après par anti-tTG), dans un même milieu réactionnel contenant au moins lesdites deux catégories de particules. Le procédé objet de l'invention trouve un intérêt particulier pour le diagnostic et le suivi thérapeutique de la maladie coeliaque.

Par système d'étalonnage "unique", on entend un système singulier constitué en une seule entité quel que soit le nombre d'anticorps recherchés simultanément.

La maladie coeliaque (MC) est associée à un syndrome de malabsorption, une perte de poids et de fréquentes douleurs abdominales. Elle constitue, à la fois une intolérance au gluten contre lequel sont dirigées des anticorps anti-GLIA (fraction protéique du gluten), et une maladie auto- immune par la présence d'auto-anticorps contre l'endomysium des fibres musculaires, la réticuline et, plus récemment découverte comme étant le principal antigène reconnu par les anti-endomysium, la transglutaminase tissulaire (tTG).

La recherche de ces anticorps est nécessaire au dépistage de la maladie et au suivi de son traitement: le régime sans gluten. Les anticorps antiGLIA de type IgG et IgA ont une spécificité moindre par rapport aux antiendomysium ou anti-tTG mais ils semblent cependant intéressants, d'une part chez les enfants de moins de deux ans chez lesquels les IgA antiGLIA pourraient apparaître avant les IgA anti-endomysium et, d'autre part, en cas de déficit sélectif en IgA. Les anticorps anti-réticuline sont considérés comme moins sensibles que les précédents. Enfin le titre des anti-GLIA et des anti-endomysium ou anti-tTG diminue en quelques mois au cours d'un régime sans gluten bien suivi, et augmente à nouveau en cas d'écart de régime.

Le dosage combiné des anticorps anti-GLIA et anti-tTG et, optionnellement anti-réticuline, chez l'adulte et/ou chez l'enfant représente une technique sérologique simple, rapide, sensible et spécifique de dépistage et de suivi de traitement.

La présence simultanée d'anticorps IgA anti-GLIA et anti-tTG accompagnée ou non d'IgG anti-GLIA et/ou anti-tTG permet un diagnostic quasi certain d'une MC et une indication à pratiquer une biopsie duodénojéjunale.

La présence d'IgA et d'IgG anti-GLIA constitue un diagnostic possible, en se référant à la clinique.

La présence d'anticorps uniquement IgG n'est pas en faveur d'une maladie coeliaque, il faut cependant tenir compte d'un éventuel déficit en IgA.

Les techniques classiques de dosage consistent à doser chaque anticorps séparément et, pour ce faire, à réaliser pour chacun desdits anticorps un étalonnage propre du système utilisé. Il en résulte un grand nombre de manipulations et une consommation importante en réactifs, ce qui a pour conséquence un prix relativement élevé.

Si une telle manière d'opérer reste envisageable dans le contexte de la recherche où la quantité de paramètres à doser est limitée et ciblée, elle pose un sérieux problème de coût dans le contexte de la médecine, où, en laboratoires d'analyse, l'on cherche à doser rapidement un grand nombre d'anticorps et ce à moindre coût.

Il a récemment été décrit, notamment dans les demandes de brevet internationales WO 99/36564 et WO 97/14028, une technique permettant de quantifier, de façon précise et reproductible, plusieurs analytes en un seul et même dosage à partir du même échantillon. Cette technique repose sur l'utilisation de différentes catégories de particules fluorescentes, chaque catégorie de particules étant sensibilisée par des ligands ayant des propriétés différentes, lesdits ligands étant adaptés à se lier de façon directe ou indirecte aux analytes et consistant généralement en des anticorps ou des antigènes. La quantification de la réaction entre ligand et analyte est réalisée par l'intermédiaire d'un composé fluorescent de longueurs d'onde d'excitation et d'émission différentes de celles des particules fluorescentes.

Ainsi, une simple lecture par cytométrie en flux permet de quantifier la réaction associée à chaque catégorie de particules et donc de déduire de ladite quantification les quantités des différents analytes présents dans un même échantillon.

Cependant, cette quantification nécessite au préalable 20 la construction d'autant de systèmes d'étalonnage que d'analytes à doser, c'est-à-dire de réaliser X*Y dosages réservés à l'étalonnage, X étant le nombre d'analytes à doser simultanément (ou le nombre de particules sensibilisées par des ligands ayant des propriétés différentes) et Y le nombre de points d'étalonnage. Cette méthode entraîne donc non seulement un surcoût de la manipulation, mais également un problème de gestion pratique, du fait de l'encombrement des puits des micro-plaques de titration, (les tests étant généralement réalisés sur des plaques de micro-titration ELISA de 96 puits), ainsi qu'une augmentation de la durée de la manipulation.

Par exemple, pour le dosage simultané de 10 analytes, ce système implique la constitution de 10 systèmes d'étalonnage différents, soit pour 100 échantillons testés, une consommation supplémentaire en réactifs allant de 10 à 40% selon le nombre de points d'étalonnage, et un problème évident d'encombrement.

La présente invention vise à remédier aux inconvénients de l'art antérieur en proposant un nouveau procédé d'étalonnage unique, rapide, simple et reproductible permettant de diminuer la consommation de réactifs consacrée à l'étalonnage, tout en diminuant également l'encombrement des plaques de titration.

Ce but est atteint en ce sens que la présente invention concerne un procédé d'étalonnage, ne nécessitant qu'un seul système d'étalonnage, permettant de quantifier simultanément plusieurs anticorps dans un même échantillon biologique, procédé qui repose sur la préparation et l'utilisation d'un réactif immunologique spécifique.

Plus particulièrement, un premier aspect de la présente invention concerne un procédé de préparation d'un réactif immunologique entrant dans la composition d'un système d'étalonnage appliqué au dosage des anticorps anti-GLIA et anti-tTG, dans un même échantillon biologique, ledit procédé mettant en oeuvre au moins deux catégories de particules, lesdites au moins deux catégories de particules étant respectivement sensibilisées par association avec un des antigènes GLIA et tTG, ledit procédé comprenant les étapes qui consistent à : a) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées et pour chacune de n quantités données d'antigènes, notamment GLIA et tTG, associées auxdites particules, la courbe de réponse en fonction de la concentration en composé homologue,sur une gamme de concentrations correspondant à la plage de mesure connue des anticorps à doser; b) sélectionner, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, la courbe correspondant à la plus petite quantité d'antigènequi donne un signal de réponse significatif et qui est compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon et d'un réactif de marquage communs aux anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, simultanément dosés; c) évaluer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, d'après la courbe retenue à l'étape b), le signal moyen correspondant au signal associé à un point caractéristique de chacune desdites courbes, obtenant ainsi autant de signaux moyens que de catégories de particules; d) ajuster, le cas échéant, les quantités d'antigène, notamment GLIA et/ou tTG, associé à chaque catégorie de particules de sorte que l'ensemble des signaux moyens évalués à l'étape c) soit compris dans un rapport de 1 à 5, et e) mélanger, dans un solvant approprié, les différentes catégories de particules sensibilisées qui 15 répondent au critère de l'étape d).

Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé de préparation d'un réactif immunologique entrant dans la composition d'un système d'étalonnage appliqué au dosage des anticorps anti-GLIA et antitTG dans un même échantillon biologique, ledit procédé mettant en oeuvre deux catégories de particules, chaque catégorie de particules étant respectivement sensibilisée par association avec les antigènes correspondants, à savoir la GLIA et la tTG, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à : a) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées et pour chacune de n quantités données de GLIA et tTG associées auxdites particules, la courbe de réponse en fonction de la concentration en composé homologue sur une gamme de concentrations correspondant à la plage de mesure connue des. anticorps à doser; b) sélectionner, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, la courbe correspondant à la plus petite quantité d'antigène qui donne un signal de réponse significatif et qui est compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon et d'un réactif de marquage communs aux anticorps anti-GLIA et anti-tTG simultanément dosés; c) évaluer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, d'après la courbe retenue à l'étape b), le signal moyen correspondant au signal associé à un point caractéristique de chacune desdites courbes, obtenant ainsi autant de signaux moyens que de catégories de particules; d) ajuster, le cas échéant, les et/ou tTG associée à chaque catégorie sorte que l'ensemble des signaux moyens c) soit compris dans un rapport de 1 à 5, e) mélanger, dans un solvant différentes catégories de particules répondent au critère de l'étape d).

Le procédé objet de la présente invention s'applique donc à des procédés de dosage mettant en oeuvre différentes catégories de particules sensibilisées. Plus particulièrement, de tels procédés consistent principalement en des immunodosages du type: - dosage direct, par une méthode immunométrique ou "sandwich", par exemple, d'un anticorps ayant réagi avec l'antigène spécifique fixé préalablement sur les particules, dosage direct, par une méthode immunométrique ou "sandwich", par exemple, d'un antigène ayant réagi avec l'anticorps spécifique fixé préalablement sur les particules, ou - dosage indirect, par une méthode dite "par compétition", d'un antigène entrant en compétition avec un antigène similaire marqué, pour sa réaction avec l'anticorps préalablement fixé sur lès particules, ou vice- versa.

Ces différents dosages seront décrits plus en détail 35 par la suite.

quantités de GLIA de particules de évalués à l'étape et approprié, sensibilisées les qui La réaction développée par mise en contact des différentes catégories de particules, sensibilisées respectivement par un antigène, notamment la GLIA et la tTG, avec les anticorps, notamment antiGLIA et anti-tTG, à doser est mesurée par cytométrie en flux selon différents modes d'identification des particules.

On peut citer, par exemple, des particules de couleurs différentes et de taille uniforme (identifiées selon leur couleur spécifique, avec quantification des réactions anticorps-antigène par adjonction d'un composé externe de longueurs d'excitation et d'émission différentes de celles des particules), des particules de tailles différentes et de couleur identique (identifiées selon leur taille, avec quantification des réactions anticorps-antigène par mesure de la taille des agrégats résultants) ou encore des particules de tailles différentes et de couleur identique (classées selon leur taille, avec quantification des réactions anticorps-antigène par adjonction d'un composé externe de longueurs d'onde d'excitation et d'émission différentes de celles des particules). Ces particules sont constituées généralement de polystyrène. Toutefois, elles peuvent être également constituées de tout polymère leur conférant des propriétés physico- chimiques spécifiques (fonctionnalité, densité ou encore solubilité) comme du styrène-acide maléique, du styrène-acide méthacrylique, du styrène-acrylamide ou du poly(méthacrylate de méthyle).

On entend par "antigène" toute substance à partir de laquelle peut être générée la production d'anticorps. Parmi ces substances, on peut citer les protéines, les haptènes, les allergènes, les peptides, les médicaments ou encore les drogues. Dans la présente invention, les antigènes préférés sont la GLIA et la tTG. D'autres antigènes peuvent également être additionnés aux deux antigènes précédemment cités.Par "composé homologue", il faut comprendre un anticorps, ou toute molécule capable de se fixer à un antigène donné, notamment la GLIA et/ou la tTG, et dont le site d'interaction avec ledit antigène, notamment la GLIA et/ou la tTG, est similaire au site d'interaction entre l'anticorps donné, notamment les anticorps anti-GLIA et/ou anti-tTG, à doser et ledit antigène, notamment la GLIA et/ou la tTG. Le composé homologue peut être l'anticorps lui-même.

La première étape du procédé consiste donc à déterminer pour chaque catégorie de particules sensibilisées, telles que décrites plus haut, la corrélation qui existe, pour une quantité donnée d'antigène, notamment de GLIA et de tTG, fixée aux particules, entre la quantité de composé homologue et la grandeur du signal émis, représentatif des interactions antigène/anticorps.

En pratique, pour chaque catégorie de particules, plusieurs essais sont effectués en fixant une quantité donnée, différente pour chaque essai, d'antigène, notamment de GLIA et de tTG, auxdites particules, en mettant ensuite en contact les particules ainsi sensibilisées avec différentes quantités de composé homologue, identiques pour l'ensemble des essais, et en mesurant le signal résultant de leur interaction.

Plus particulièrement, les quantités d'antigène notamment de GLIA et de tTG, utilisées varient par pas de 2 à 4.

Les différentes quantités de composé homologue sont sélectionnées de manière à être comprises dans la plage de mesure des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, que l'on cherche à doser. Ainsi, si l'on cherche à doser un anticorps dont la concentration peut varier entre 0 et 100 unités biologiques, on choisira, par exemple, six quantités données de composé homologue correspondant à 0, 20, 40, 60, et 100 unités biologiques. Dans la pratique, on utilise une population d'échantillons caractérisés et certifiés sur des critères clinico-biologiques, c'est-à- dire dont la présence ou l'absence en un anticorps donné est validée par un diagnostic clinique et/ou par l'estimation de l'anticorps par une ou plusieurs autre(s) méthode(s) de dosage.

Le résultat de cette opération se traduit par l'obtention d'une courbe dose/réponse entre la quantité de composé homologue et les signaux obtenus pour chacune des n quantités données d'antigène, notamment de GLIA et de tTG.

Le concept d'expression de la concentration en unités biologiques repose sur l'affectation, par exemple, d'une gamme 0-150 à la plage de mesure de chacun des anticorps à doser. On comprend que ces plages de mesure diffèrent, dans l'absolu, d'un anticorps à l'autre et que, par suite, une même concentration en différents anticorps exprimée en unités biologiques, par exemple 95 unités biologiques (en abrégé 95 UB) ne correspond pas à la même concentration, dans l'absolu, en ces mêmes anticorps. La concentration en composés homologues est exprimée, de même façon, en unités biologiques sur une gamme identique pour tous les anticorps.

A ce niveau, il faut noter que la sensibilisation des particules peut être effectuée de différentes manières, à savoir par covalence, par le biais d'une couche moléculaire intermédiaire biologiquement et/ou chimiquement réactive, ou encore par l'utilisation d'un système d'interaction par affinité.

Les particules sensibilisées, dans la mesure où elles comportent une fonctionnalité réactive, peuvent être sensibilisées par covalence. Ainsi, de nombreux protocoles d'immobilisation ont été décrits comme faisant intervenir de façon non limitative les groupements fonctionnels suivants entre les particules et l'antigène: - COOH/R-NH2 ou R-OH, CO-NH2/NH2-NH2, - C (=0) -O-CH3/NH2-NH2, - NH2CHO/RCOOH, ou encore - R-NH2 ou NH2-NH2.

Il est à noter que, lors de l'utilisation de la plupart des couples cités plus haut, il est nécessaire d'activer préalablement certaines fonctions, comme par exemple les fonctions COOH, afin qu'elles puissent réagir, par exemple, avec les groupements fonctionnels de l'antigène, tels que des groupements amines aliphatiques ou aromatiques.

Selon une autre forme d'exécution préférée, l'activation peut être réalisée par des carbodiimides hydrosolubles, et être effectuée en une seule étape ou, selon une forme d'exécution particulièrement préférée, en deux étapes, avec le carbodiimide seul ou en présence de Nhydroxysuccinimide. Elle est suivie de l'élimination de l'excès d'activateur avant fixation de l'antigène.

Selon encore une autre forme d'exécution, un bras espaceur homo- ou hétéro-bifonctionnel, présentant des fonctions chimiques réactives à chaque extrémité, respectivement identiques ou différentes, peut être fixé aux particules préalablement activées. Ces bras de longueur et de fonctionnalité variables peuvent être activés et couplés par covalence, dans un premier temps, aux particules par l'une des extrémités, et dans un deuxième temps, au composé à fixer, par l'autre extrémité.

Des intermédiaires chimiquement ou biologiquement actifs peuvent également être utilisés pour la sensibilisation. Ils créent à la surface des microparticules une couche moléculaire intermédiaire constituée par une protéine (telle que l'albumine), un mélange de protéines ou un polymère (tel que la polylysine). Ce procédé est particulièrement utilisé dans le cas de particules de petite taille qui peuvent ensuite être couplées par l'intermédiaire d'agents de liaison sur les fonctions de cette couche intermédiaire.

Une autre voie de sensibilisation, cette fois non 35 covalente, consiste à utiliser, de façon non limitative, des systèmes d'interaction par affinité : - le système biotine-avidine, en utilisant des particules couplées à l'avidine qui sont mises en présence de composés ayant été préalablement biotinylés, - la protéine A ou la protéine G, disposant d'un récepteur pour le fragment Fc des immunoglobulines, permettant l'immobilisation d'un anticorps et l'orientation vers l'extérieur de ses fragments Fab, responsables de la reconnaissance antigénique, ou encore l'immobilisation indirecte par l'intermédiaire d'un anticorps spécifique du composé à fixer.

Cette énumération n'est aucunement limitative et il est évident que tout procédé de sensibilisation similaire connu de l'homme du métier peut également être utilisé.

Pour chaque antigène à fixer, la sélection d'un des systèmes précités est réalisée initialement pendant la phase initiale de mise au point. Les conditions opératoires sont ensuite fixées et appliquées ultérieurement de façon systématique.

Dans une forme d'exécution préférée, le milieu de sensibilisation est constitué d'eau tamponnée ayant un pH compris entre 5 et 9 et une force ionique comprise entre 0,01 et 0,1. Afin de maintenir constant le milieu, l'antigène peut être mis en suspension dans le même milieu avant d'effectuer ladite sensibilisation.

L'intérêt d'un tel système réside dans sa simplicité d'utilisation, son faible coût et son indépendance réactionnelle par rapport aux autres réactions simultanées.

Cela est rendu possible par le fait que la réaction produite par chaque catégorie de particules sensibilisées est standardisée et reproductible, que le signal fourni par cette réaction est représentatif de l'ensemble des réactions antigène-anticorps se développant simultanément et que l'ensemble de ces réactions est maîtrisé au niveau du procédé de sensibilisation de chaque catégorie de particules de façon à ce qu'elles produisent toutes un signal similaire en présence d'échantillons de même degré de positivité, c'est-à-dire comprenant sensiblement la même quantité en l'anticorps dosé telle qu'exprimée sur sa gamme d'unités biologiques particulière.

Une fois les courbes dose/réponse obtenues, il est déterminé, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, comme décrit à l'étape b), la courbe correspondant à la plus petite quantité d'antigène, notamment de GLIA et de tTG, donnant, graphiquement, un signal de lecture significatif et compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon ainsi que d'un réactif de marquage communs pour les anticorps simultanément détectés.

Par "signal de réponse significatif", il faut comprendre un signal suffisamment élevé pour assurer une précision de lecture sur l'ensemble de la plage de mesure.

En pratique, la courbe sélectionnée doit être sensiblement linéaire et avoir une amplitude de mesure suffisamment élevée.

Chaque type de particule est donc sensibilisé par l'une des techniques décrites plus haut en employant la quantité d'antigène déterminée cidessus.

L'étape suivante c) consiste alors à déterminer le signal moyen (SM) associé à une concentration en unités 25 biologiques, identique pour les anticorps.

Pour ce faire, un point caractéristique de la courbe dose/réponse retenue à l'étape b) est sélectionné et le signal correspondant graphiquement audit point est pris comme signal moyen SM.

Le point caractéristique, autrement appelé point positif ou de forte positivité, est choisi arbitrairement dans le quart supérieur de la partie linéaire de la courbe.

Les signaux moyens SM obtenus pour les différentes catégories de particules sensibilisées sont ensuite comparés entre eux et, si nécessaire, réajustés de sorte qu'ils soient tous compris dans un rapport de 1 à 5. En pratique, pour les catégories de particules ayant un SM non compris dans ledit rapport, la réactivité est alors réajustée en sélectionnant dans la courbe dose/réponse une autre quantité d'antigène et en recommençant l'opération de sensibilisation desdites particules par cette nouvelle quantité d'antigène jusqu'à obtenir que le SM résultant entre dans le rapport de 1 à 5 précité.

Le fait que les SM des différentes particules sensibilisées constituant le réactif immunologique soient tous compris dans un rapport de 1 à 5 est déterminant pour assurer une réactivité immunologique relativement équivalente pour chaque type de particules sensibilisées utilisées et donc d'obtenir, dans une gamme de mesures compatible avec la réalité biologique, des valeurs suffisamment proches pour permettre l'utilisation d'un système d'étalonnage unique et commun à l'ensemble des anticorps.

Le réactif immunologique est alors constitué par mélange, dans un solvant, des différents types de particules sensibilisées ainsi obtenues.

On peut citer comme solvants possibles: des mélanges de protéines et d'acides aminés ou encore un mélange de protéines inertes vis-à-vis des anticorps à doser et permettant une stabilisation de particules.

En tout état de cause, les solvants utilisés sont sélectionnés de manière à permettre la conservation de l'ensemble des particules sensibilisées, et leur choix se trouve donc dicté par la nature des antigènes, notamment de la GLIA et de la tTG.

De ce fait, ledit solvant peut être défini de sorte 30 qu'il est adapté et commun à l'ensemble de ces deux antigènes.

Le solvant utilisé est tamponné à un pH compris entre 7 et 9 et a une force ionique comprise entre 0,01 et 0,1.

Selon un second aspect de la présente invention, celle-ci porte sur un réactif immunologique destiné au dosage d' anticorps multiples, notamment anti-GLIA et antitTG, dans des échantillons biologiques, ledit réactif comprenant un solvant et, mélangées au sein dudit solvant, différentes catégories de particules, dont chacune est sensibilisée par association avec respectivement une quantité donnée en antigène spécifique de l'un des anticorps à doser, notamment GLIA et tTG, avec, pour chacune des catégories de particules, et pour une concentration donnée en composé homologue de l'antigène, telle qu'exprimée en unités biologiques, ladite quantité donnée d'antigène débouchant sur un signal dit "signal moyen", qui est compris dans un rapport de 1 à 5 avec les signaux moyens obtenus pour les autres catégories de particules.

Selon un troisième aspect, la présente invention concerne un kit de dosage d'anticorps multiples, notamment anti-GLIA et anti-tTG, dans des échantillons biologiques mettant en oeuvre différentes catégories de particules, chaque catégorie de particules étant sensibilisée par un antigène spécifique de l'un des analytes à doser, notamment de la GLIA et de la tTG, qui comprend: i) un réactif immunologique issu du procédé tel que décrit plus haut, ii) au moins un standard d'étalonnage constitué d'un unique composé homologue réagissant avec l'une des catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, iii) une table de correspondance entre la concentration, exprimée en unités biologiques, du composé homologue constituant le standard d'étalonnage et celle de chacun des composés homologues aux autres antigènes fixés sur les autres catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, et iv) un réactif de marquage.

Plus particulièrement, ledit standard d'étalonnage comprend un composé homologue réagissant directement ou indirectement avec l'antigène fixé à la particule sensibilisée.

La fixation indirecte peut se faire, par exemple, par l'intermédiaire d'une protéine utilisée pour saturer les sites de fixation de la particule non occupés par l'antigène. Cette protéine doit être choisie de façon à ne pas interférer avec le système spécifique et être présente sur une seule catégorie de particule. Dans ce cas, le milieu de quantification devra contenir un réactif de marquage spécifique des anticorps à doser (constitué d'un ou de plusieurs composés) et un réactif de marquage spécifique de la protéine inerte.

Dans une première forme d'exécution, ledit composé homologue est de même origine que les anticorps, notamment anti-GLIA et/ou anti-tTG, à doser, par exemple, d'origine humaine.

Dans une seconde forme d'exécution, ledit composé homologue et les anticorps, notamment anti-GLIA et antitTG, à doser sont d'origines différentes.

Alors que, par exemple, l'anticorps à doser est d'origine humaine, tel que des autoanticorps présents dans des échantillons sanguins humains, le composé homologue peut être, par exemple, d'origine animale pour autant qu'il soit capable de réagir spécifiquement avec l'antigène, à savoir, notamment la GLIA ou la tTG. Le milieu de quantification devra, dans ce cas, contenir, à la fois un réactif de marquage spécifique des échantillons d'origine humaine et un réactif de marquage spécifique du standard d'origine animale.

La préparation du standard d'étalonnage implique une optimisationpréalable de sa concentration de façon à produire un SM compris dans un rapport de 1 à 5 par rapport aux SM obtenus pour chaque catégorie de particules sensibilisées lors de la préparation du réactif immunologique.

Pour ce qui est de la "table de correspondance", celle-ci consiste en un référentiel, pouvant se présenter sous la forme d'un tableau, d'un graphique, etc., qui donne les différentes concentrations, exprimées en unités biologiques, du composé homologue constituant le standard d'étalonnage et celle de chacun des composés homologues aux antigènes, notammentGLIA et tTG fixés sur les autres catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique.

La table de correspondance est réalisée empiriquement, préalablement à la préparation des kits, de la manière suivante.

On fait réagir plusieurs échantillons, comprenant des quantités différentes et connues d'antigène, notamment de GLIA et de tTG, à doser avec le réactif immunologique qui fera partie du kit. On mesure les signaux résultants et l'on trace, pour chaque anticorps, notamment antiGHLIA et anti-tTG, la droite de régression linéaire liant les signaux émis aux quantités connues, exprimées en unités biologiques, des anticorps dosés, selon une équation de type y=ax, avec y=signal et x=concentration en unités biologiques.

On mesure, de même, le signal obtenu lors de la réaction entre le standard d'étalonnage et le réactif immunologique et l'on relève, sur chaque courbe précédemment obtenue, la concentration, exprimée en unités biologiques, correspondant à cette même valeur de signal.

C'est l'ensemble de ces concentrations en anticorps, exprimées en unités biologiques, qui constitue la table de correspondance.

La concentration du standard peut être ensuite vérifiée à partir de la table de correspondance et ajustée si nécessaire.

Dans une variante, il peut être souhaité de réaliser une gamme d'étalonnage, c'est-à-dire de partir de plusieurs standards d'étalonnage constitué chacun du même composé homologue, mais selon différentes concentrations.

Dans ce cas, le principe de réalisation de la table de correspondance reste le même, mis à part que l'on trace pour chaque anticorps, à partir des différents signaux obtenus, la droite de régression liant les signaux émis aux quantités connues, en unités biologiques, des anticorps à doser selon une équation de type log y=a(log x), avec y=signal et x=concentration en unités biologiques.

Cette équation est ensuite appliquée aux signaux correspondant aux différentes concentrations connues de standard d'étalonnage de façon à déduire la correspondance entre chacune desdites concentrations et la concentration de chaque anticorps, exprimée en unités biologiques.

Pour ce qui est du "réactif de marquage", celui-ci consiste en un composé immunologique susceptible de quantifier la réaction entre les anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG et le réactif immunologique, ledit composé immunologique étant couplé à un marqueur qui est, de préférence un fluorochrome.

Par "composé immunologique", il faut comprendre tout composé, naturel ou de synthèse, susceptible de se complexer spécifiquement avec un composé complémentaire, tels que les anticorps et les antigènes.

Selon une forme d'exécution préférée, ledit réactif de marquage réagit avec le complexe composé homologue ou l'anticorps, notamment anti-GLIA et/ou anti-tTG, à doser / antigène, notamment GLIA et/ou tTG, auquel cas le dosage est direct, ou avec l'antigène, notamment la GLIA et/ou la tTG, non complexé, auquel cas le dosage est indirect.

En outre, le réactif de marquage peut être préparé à partir d'un composé unique, réagissant avec, par exemple, une spécificité antigénique commune à l'ensemble des composés homologues, ou résulter du mélange de différents composés réagissant spécifiquement avec différents composés homologues.

Selon un dernier aspect de la présente invention, celle-ci porte sur un procédé de dosage d'anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG présents dans un échantillon biologique et, plus particulièrement, un procédé de mise en oeuvre du kit tel que décrit plus haut qui consiste à mesurer les signaux résultants de l'interaction entre le réactif immunologique et, d'une part, l'échantillon biologique, d'autre part, le standard d'étalonnage, et à déterminer et appliquer, aux différents signaux résultants, un facteur de correction de manière à obtenir la titration, exprimée en unités biologiques, des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, de l'échantillon, ledit facteur de correction étant le rapport entre le signal obtenu pour le standard d'étalonnage et les concentrations issues de la table de correspondance.

Le procédé de mise en oeuvre du kit selon la présente invention repose donc sur trois étapes, à savoir une première étape de détermination des différents signaux émis par cytométrie en flux, une seconde étape de calcul pour déterminer les différents facteurs de correction à partir du signal émis par le standard d'étalonnage et une troisième étape de calcul pour la titration des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, de l'échantillon à partir du facteur de correction précédemment obtenu et les signaux émis par les différents échantillons testés.

Plus particulièrement, le procédé objet de la présente invention comprend les étapes suivantes: a) incuber, d'une part, l'échantillon biologique et, d'autre part, le standard d'étalonnage, avec une quantité prédéterminée de réactif immunologique; b) ajouter le réactif de marquage; c) mesurer, par cytométrie en flux, les signaux émis, d'une part, par le standard d'étalonnage, d'autre part par l'échantillon; d) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, un facteur de correction qui correspond au rapport entre la concentration en unités biologiques de chacun des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, à doser telle que donnée par la table de correspondance et le signal correspondant au standard d'étalonnage et mesuré à l'étape c) ; e) multiplier par ledit facteur de correction, calculé pour chaque anticorps, le signal émis par chaque catégorie de particules et mesuré à l'étape c) pour en déduire la concentration en unités biologiques de chaque anticorps dans l'échantillon testé.

Dans une première variante, le procédé objet de la présente invention peut être appliqué à des dosages directs. Dans de tels dosages, le réactif de marquage est spécifique des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, que l'on cherche à doser et, de ce fait, la quantité d'anticorps compris dans un échantillon est directement proportionnelle au signal émis par ledit réactif de marquage.

Dans ce cas, le réactif immunologique est constitué de différentes catégories de particules sensibilisées chacune par les antigènes, notamment de la GLIA et de la tTG. Les anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, que l'on cherche à doser vont se complexer avec le ou lesdits antigène (s) fixé (s) aux particules. Le réactif de marquage, qui est constitué par un ou plusieurs second(s) anticorps marqué(s) par un fluorochrome et spécifique(s) des anticorps, notamment anti-GLIA et antitTG, que l'on cherche à doser, va se fixer auxdits anticorps préalablement complexés avec les antigènes, notamment GLIA et tTG, formant la couche de sensibilisation des particules. Ainsi, le signal émis par le fluorochrome associé à chaque catégorie de particules est proportionnel à la quantité d'anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, présents dans l'échantillon.

Par "seconds anticorps", il faut comprendre toute substance capable de se complexer avec les anticorps que l'on cherche à doser, c'est-à-dire capable de réagir avec un épitope desdits anticorps différent de celui mis en oeuvre pour assurer leur fixation à l'antigène.

Dans une seconde variante, le procédé objet de la présente invention peut être appliqué à des dosages dits indirects. De tels dosages sont non plus basés uniquement sur la complémentarité entre deux espèces immunologiques, mais sur la compétition entre deux espèces immunologiques proches à se complexer avec une troisième espèce immunologique.

Ainsi, selon une première possibilité, il est envisagé la quantification simultanée et indirecte de différents antigènes avec lesdits anticorps à doser qui consistent en des antigènes, lesdits antigènes en des anticorps et ledit réactif de marquage en un mélange d'antigènes marqués par un fluorochrome entrant en compétition avec les anticorps à doser pour se complexer avec les antigènes.

Dans ce cas, le réactif immunologique est constitué de différentes catégories de particules sensibilisées chacune par un anticorps spécifique. Les antigènes que l'on cherche à doser vont alors entrer en compétition avec le ou lesdits antigènes, marqués par un fluorochrome, constituant le réactif de marquage. Ainsi, l'augmentation de la concentration en antigène que l'on cherche à doser entraîne l'augmentation de la concentration en complexes antigène que l'on cherche à doser / anticorps fixé, au détriment de la formation de complexes antigène marqué / anticorps fixé, avec corrélativement une diminution du signal. Il en résulte que le signal émis par le fluorochrome associé à chaque catégorie de particules est inversement proportionnel à la quantité d'antigènes présente dans l'échantillon.

MATERIEL ET METHODE

Le procédé objet de la présente invention repose sur l'utilisation de microsphères de taille uniforme différemment colorées et d'un cytomètre de flux interfacé avec un système informatique de digitalisation et de traitement du signal. Une diode rouge du cytomètre de flux, en classant chaque catégorie de microsphères sur la base de sa fluorescence unique (du rouge à l'orange), permet l'identification du paramètre analysé. Parallèlement un laser excite la fluorescence d'un composé secondaire pour quantifier la réaction spécifique qui y est associée.

Chaque antigène (la gliadine et la transglutaminase tissulaire) nécessaire à la réalisation du test est couplé de façon covalente à une catégorie de microsphères colorées, support des réactions immunologiques spécifiques. Le mélange de particules sensibilisées obtenu peut être utilisé pour la détection des autoanticorps d'isotype IgA anti-gliadine et anti-transglutaminase IgA ou IgG.

Le test est réalisé dans une microplaque de 96 puits vierges disposant à leur base d'une membrane filtrante. Dans un premier temps, l'échantillon dilué est distribué dans un puits où a été préalablement déposé l'un des deux mélanges de microsphères.

S'il contient un ou plusieurs autoanticorps recherchés, ceux-ci vont se fixer au(x) antigène(s) correspondant(s) sur les différentes catégories de microsphères. Après incubation, un lavage par filtration permet d'éliminer les éléments non fixés.

Un conjugué spécifique de l'isotype recherché (qui peut être constitué d'anticorps anti-IgA ou anti-IgG humaines couplés à la phycoérythrine) est rajouté. Il se fixe aux autoanticorps précédemment capturés.

La réaction développée est ensuite directement analysée par le cytomètre de flux, qui classe chaque catégorie de particules colorées selon sa fluorescence en y mesurant simultanément la fluorescence émise par le conjugué. Un système de calibration permet, par interpolation, de définir le titre de l'échantillon pour chaque spécificité antigénique et isotype (IgA ou/et IgG) recherché.

Exemple de la détection des anticorps IgA 1- Préparation du réactif immunologique Activation des particules 2 catégories de particules de polystryrène colorées et fonctionnalisées par des groupements COOH sont sélectionnées. Préalablement à la sensibilisation, chaque catégorie de particules est activée par un procédé qui consiste en: -l'ajout de lml d'une solution de carbodiimide, dosée entre 10 et 40 mg/ml, à lml de particules (soit environ 10' particules), -l'incubation pendant 20 à 60 minutes à température ambiante, -trois lavages des particules à l'au distillée en centrifugeant à 1000xg pendant 2 minutes pour éliminer l'excès de carbodiimide.

Détermination de la quantité d'antigène optimale La quantité de chaque antigène a été déterminée dans le but d'utiliser un système d'étalonnage unique mais également de répondre à la réactivité nécessaire et représentative des dosages biologiques impliqués.

Le dosage simultanées des 2 types d'anticorps est réalisé dans un seul puits et utilise la même dilution d'échantillon et le même milieu de marquage (conjugué anti-IgA). Par conséquent la réaction produite par chaque catégorie de particules sensibilisées doit être standardisée, reproductible et représentative des 2 réactions antigène-anticorps. De plus, si l'on souhaite utiliser un étalonnage unique, le procédé de sensibilisation de chaque antigène doit conduire à l'obtention de signaux similaires pour les deux spécificités en présence d'échantillons de degrés de positivité équivalents en termes d'unités biologiques.

Les courbes doses/réponses ont donc été réalisées avec les deux antigènes GLIA et tTG. Les figures 1 et 2 présentent chacune 3 courbes dosesréponses exprimant le signal de fluorescence émis (axe des Y) en fonction du titre en anticorps spécifiques en unités biologiques (UA) (axe des X) ; respectivement figure 1 pour l'antigène tTG et figure 2 pour l'antigène GLIA. Ces courbes permettent de sélectionner la courbe correspondant à la plus petite quantité d'antigène sur une plage de mesure représentative de la zone de mesure (en termes de linéarité et d'amplitude).

Pour chaque antigène, quatre échantillons ont été sélectionnés en fonction de leur titre exprimé en UA et déterminé par technique ELISA (bmd). La dilution en échantillon, la concentration en réactif de marquage et les prises d'essais sont communs.

Pour l'antigène tTG, les trois courbes de la figure 1 correspondent à 3 concentrations en antigène. La courbe retenue est celle correspondant à une concentration en antigène de 25pg/ml de particules. Les concentrations supérieures se traduisent par une saturation de la réaction antigène-anticorps pour les valeurs élevées, conduisant à une perte de linéarité.

Pour l'antigène GLIA (figure 2), la courbe retenue est celle obtenue avec 100pg/ml de particules qui allie réactivité et linéarité. Les concentrations inférieures donnent une réactivité insuffisante.

Vérification du rapport de réactivité entre les 2 30 types de particules Le signal moyen associé à une concentration en unités biologiques identique pour les 2 types d'auto anticorps est déterminé en choisissant une concentration située dans le quart supérieur de chaque courbe retenue est en comparant le signal de fluorescence émis.

Par exemple, une concentration de 100U correspond respectivement à un signal de 675 pour tTG et de 498 pour GLIA. Le rapport entre ces deux signaux est égal à 1.35. La valeur de ce rapport (ente 1 et 5) est déterminante pour assurer une réactivité immunologique équivalente pour chaque type de particules sensibilisées et donc obtenir des valeurs suffisamment proches pour permettre un système d'étalonnage unique, tout en garantissant des gammes de mesure compatibles avec la réalité biologique.

Sensibilisation des particules activées Les particules activées précédemment sont ensuite sensibilisées selon les conditions définies cidessus, par suspension de chaque type de particules dans un volume de lml contenant respectivement 251ig de tTg et 100pg de GLIA suivie d'une incubation 4 à 6 H à température ambiante. Les particules sensibilisées sont ensuite lavées comme précédemment et mises en suspension dans un tampon pH8 contant un mélange de substances protéiques destinées à saturer les sites libres et à ramener les particules à une concentration de l'ordre de 10. à 5.106 particules par ml.

Le réactif immunologique est ensuite constitué par mélange volume à volume de chaque catégorie de particules sensibilisées et conservé à +5 C jusqu'à utilisation 2- Etalonnage Le standard d'étalonnage unique est constitué par un sérum humain anti-gliadine d'isotype IgA, dilué dans un tampon phosphate pH 7.4 qui va réagir spécifiquement avec les particules sensibilisées par l'antigène GLIA. La table de correspondance pour ce standard d'étalonnage est la suivante.

GLIA: 13OUA tTG: 9OUA Cette table a été obtenue comme suit: On fait réagir plusieurs échantillons, comprenant des concentrations différentes et connues d'auto anticorps anti-GLIA ou anti-tTG, avec le réactif immunologique dans des conditions identiques (conjugué, prises d'essais et dilution échantillons). On mesure les signaux résultants et on trace, pour chaque spécificité, la droite de régression linéaire liant les signaux émis aux quantités connues, exprimées en UA, selon une équation de type y=ax, avec y=signal et x= concentration en UA.

Est également mesuré dans le même essai (au moins deux fois) le signal résultant de la réaction entre le standard d'étalonnage et l'on en déduit, à partir de chaque droite de régression précédente, la concentration en UA du standard d'étalonnage pour spécifcité.

-Détermination des facteurs de correction Afin de déterminer les facteurs de correction à attribuer à chaque spécificité, les concentrations en UA de la table de correspondance sont divisées par la valeur du signal mesuré ci-dessus pour le standard d'étalonnage réagissant avec les particules sensibilisées par l'antigène GLIA.

Pour un signal de 650 par exemple, les facteurs de correction suivants sont obtenus: Gliadine: 0.20 tTG: 0.14 Ces facteurs de correction seront utilisés lors du dosage d'anticorps anti-tTG et anti-GLIA dans les échantillons biologiques. Ainsi si l'on dose, au moyen du réactif immunologique ayant précédemment donné un signal de 650 avec le standard d'étalonnage, les anticorps anti-tTG dans un échantillon, et que l'on obtient un signal correspondant à 420, on pourra déterminer le titre en multipliant la valeur de ce signal par le facteur de correction associé à tTG. Le titre en anticorps anti-tTG de l'échantillon sera donc, dans cet exemple, égal à 0.14x 420 = 59UA Evaluation du réactif immunologique par comparaison 10 avec des méthodes de références.

Méthodes comparatives Afin d'évaluer les performances du réactif immunologique, associé à l'étalonnage ci-dessus, et permettant le dosage simultané des anticorps anti-GLIA et anti-tTG d'isotype IgA, la sensibilité et la spécificité ont été comparées par rapport aux méthodes suivantes: -coffret GLIA-LISA (bmd) basé sur une méthode ELISA pour la détection des anticorps anti-gliadine IgA -coffret de recherche TGA-LISA (bmd) basé sur une méthode ELISA pour la détection des anticorps anti-tTG IgA.

Méthodes de confirmation en cas de résultats 25 discordants: BINDAZYME (The Binding Site (TBS)) : Human Anti Gliadin IgA EIA et Human Anti Tissue Transglutaminase EIA.

Echantillons testés L'étude a porté sur 205 échantillons: -60 échantillons associés à la présence d'une maladie coeliaque -50 échantillons provenant d'individus sains -95 échantillons présentant des marqueurs biologiques susceptibles de provoquer des interférences (cryoglobulinémie, hypergammaglobulinémie, immunoglobulines monoclonales IgG et IgM, complément, complexes immuns, facteur rhumatoïde).

Protocole de dosage simultané Ce protocole consiste à prélever 50pl de réactif immunologique précédemment préparé et à le mélanger, d'une part à 100il de standard d'étalonnage (déposé en double) et, d'autre part, à lOOpl d'échantillons prédilués au 1/200 dans un tampon phosphate (type PBS pH 7.4). Les dépôts et mélange se font dans une microplaque de 96 puits disposant à leur base d'une membrane filtrante de 1.2pm. Un puits est réservé au mélange du réactif immunologique avec le tampon seul afin de constituer le blanc réactif , permettant d'évaluer le signal associé à chaque catégorie de particules qui sera ensuite soustrait systématiquement du signal obtenu pour les autres puits.

Les étapes suivantes consistent à : -incuber 30 minutes à température ambiante, -laver deux fois par filtration à travers la membrane filtrante de la microplaque -remettre le milieu en suspension dans 100pl de réactif de marquage, constitué d'un anticorps de chèvre réagissant spécifiquement avec les immunoglobulines A humaines et conjugué à la phycoerythrine. Sa concentration est adaptée aux réactions antigène-anticorps à détecter simultanément, -incuber 30 minutes à température ambiante, et -analyser par cytométrie de flux.

Ce faisant, au moins 200 particules de chaque catégorie sont analysées pendant une quinzaine de secondes.

Pendant ce temps, le système informatique classe chacune des particules selon sa couleur et détermine ensuite la le conjugué pour chaque fluorescence moyenne émise par spécificité anticorps.

Résultats GLIA IgA ELISA Positi Négati fs fs dosage Positi 55 0 simultané fs Négati 3 147 fs tTG IgA ELISA Positi Négati fs fs dosage positif 59 1 simultané s Négatif 2 143 s Sensibilité relative: 95.1% Spécificité relative: 100% Concordance: 98.5% Sensibilité relative: 96.8% Spécificité relative: 99.3% Concordance: 98.5% Analyse des résultats discordants (6/205) Spécificité Résultat ELISA bmd ELISA Spécificités antigénique dosage TBS associées simultané Glia IgA négatif faiblement négatif tTG IgA, positif Glia IgG Glia IgA négatif faiblement négatif IgG positif monoclonale Glia IgA négatif faiblement négatif complément positif tTG IgA négatif faiblement faiblement aucune positif positif tTG IgA négatif faiblement négatif donneur de positif sang tTG IgA faiblement négatif faiblement facteur positif positif rheumat.

b Résultats discordants pour Glia IgA: les résultats négatifs sont confirmés par TBS (2 correspondent à des interférences biologiques Résultats discordants pour tTG IgA: 2/3 sont confirmés par TBS Mode de détermination du seuil de positivité Estimé à partir des 145 échantillons issus des populations individus sains et interférences biologiques .

Le seuil de positivité (20UA) correspond au 99.5ème percentile de la distribution des valeurs pour les deux spécificités Le seuil de négativité (15UA) correspond au 96ème percentile pour les 2 spécificités.

Entre ces 2 seuils, les résultats sont considérés limites.

Fidélité du test Estimée sur 3 échantillons pour chaque spécificité : faiblement positif, positif et fortement positif Intra-essai même Interessais (10 tests dans le (5 tests dans 5 essais essai) différents) Spécificité CV (%) Valeur CV (%) Valeur antigénique moyenne moyenne Intraessai Inter-essais (10 tests dans le même (5 tests dans 5 essais essai) différents) tTG IgA 41 3.9 42 3.7 tTG IgA 151 4.6 152 5.3 tTG IgA 318 4.0 323 7.0 Glia IgA 41 3.4 42 2.8 Glia IgA 71 2.3 72 2.4 Glia IgA 474 5.5 493 3.1

Claims (15)

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation d'un réactif immunologique entrant dans la composition d'un système d'étalonnage appliqué au dosage d'anticorps multiples, notamment des anticorps anti-GLIA et anti-tTG, dans un même échantillon biologique, ledit procédé mettant en oeuvre différentes catégories de particules, chaque catégorie de particules étant respectivement sensibilisée par association avec un antigène spécifique des anti-corps à doser, notamment la GLIA et la tTG, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à : a) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées et pour chacune de n quantités données d'antigènes, notamment de GLIA et tTG, associées auxdites particules, la courbe de réponse en fonction de la concentration en composé homologue sur une gamme de concentrations correspondant à la plage de mesure connue des anticorps à doser; b) sélectionner, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, la courbe correspondant à la plus petite quantité d'antigène, notamment de GLIA et tTG, qui donne un signal de réponse significatif et qui est compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon et d'un réactif de marquage communs à tous les anticorps simultanément dosés, notamment anti-GLIA et anti-tTG; c) évaluer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, d'après la courbe retenue à l'étape b), le signal moyen correspondant au signal associé à un point caractéristique de chacune desdites courbes, obtenant ainsi autant de signaux moyens que de catégories de. particules; d) ajuster, le cas échéant, les quantités d'antigène, notamment GLIA et/ou tTG, associé à chaque catégorie de particules de sorte que l'ensemble des signaux moyens évalués à l'étape c) soit compris dans un rapport de 1 à 5, et e) mélanger, dans un solvant approprié, les différentes catégories de particules sensibilisées qui répondent au critère de l'étape d).

2. Procédé de préparation d'un réactif immunologique entrant dans la composition d'un système d'étalonnage appliqué au dosage des anticorps anti-GLIA et anti-tTG dans un même échantillon biologique, ledit procédé mettant en oeuvre deux catégories de particules, chaque catégorie de particules étant respectivement sensibilisée par association avec les antigènes correspondants, à savoir la GLIA et la tTG, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à : a) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées et pour chacune de n quantités données de GLIA et tTG associées auxdites particules, la courbe de réponse en fonction de la concentration en composé homologue sur une gamme de concentrations correspondant à la plage de mesure connue des anticorps à doser; b) sélectionner, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, la courbe correspondant à la plus petite quantité d'antigène qui donne un signal de réponse significatif et qui est compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon et d'un réactif de marquage communs aux anticorps anti-GLIA et anti-tTG simultanément dosés; c) évaluer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, d'après la courbe retenue à l'étape b), le signal moyen correspondant au signal associé à un point caractéristique de chacune desdites courbes, obtenant ainsi autant de signaux moyens que de catégories de particules; d) ajuster, le cas échéant, les quantités de GLIA et/ou tTG associée à chaque catégorie de particules de sorte que l'ensemble des signaux moyens évalués à l'étape c) soit compris dans un rapport de 1 à 5, et e) mélanger, dans un solvant approprié, les différentes catégories de particules sensibilisées qui répondent au critère de l'étape d).

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que, dans l'étape a), les quantités d'antigène, notamment de GLIA et/ou de tTG, utilisées varient par pas de 2 à 4.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la sensibilisation desdites particules par lesdits antigènes, notamment la GLIA et/ou la tTG, est effectuée par covalence, par le biais d'une couche moléculaire intermédiaire biologiquement et/ou chimiquement réactive, ou encore par l'utilisation d'un système d'interaction par affinité.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en composé homologue est exprimée en unités biologiques sur une gamme qui est identique pour tous les anticorps, notamment, anti- GLIA et anti-tTG.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le solvant utilisé à l'étape e) est adapté et commun à l'ensemble des antigènes, notamment la GLIA et la tTG.

7. Réactif immunologique destiné au dosage d' anticorps multiples, notamment anti-GLIA et anti-tTG, dans des échantillons biologiques, ledit réactif comprenant un solvant et, mélangées au sein dudit solvant, différentes catégories de particules, dont chacune est sensibilisée par association avec respectivement une quantité donnée en un antigène spécifique de l'un des anticorps à doser, notamment la GLIA et tTG, caractérisé en ce que, pour chacune des catégories de particules, et pour une concentration donnée en composé homologue de l'antigène, telle qu'exprimée en unités biologiques, ladite quantité donnée d'antigène débouche sur un signal dit "signal moyen", qui est compris dans un rapport de 1 à 5 avec les signaux moyens obtenus pour les autres catégories de particules.

8. Kit de dosage d'anticorps multiples, notamment des anticorps anti-GLIA et anti-tTG, dans des échantillons biologiques mettant en oeuvre différentes catégories de particules, chaque catégorie de particules étant respectivement sensibilisée par un antigène spécifique de l'anti-corps à doser, notamment de la GLIA et de la tTG, caractérisé en ce qu'il comprend: i) un réactif immunologique issu du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ii) au moins un standard d'étalonnage constitué d'un unique composé homologue réagissant avec l'une des catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, iii) une table de correspondance entre la concentration, exprimée en unités biologiques, du composé homologue constituant le standard d'étalonnage et celle de chacun des composés homologues aux antigènes fixés sur les autres catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, et iv) un réactif de marquage.

9. Kit selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit standard d'étalonnage comprend un composé homologue réagissant directement ou indirectement avec l'antigène fixé à la particule sensibilisée.

10. Kit selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que ledit composé homologue est de même origine que l'anticorps, notamment anti- GLIA et anti-tTG, à doser.

11. Kit selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que ledit composé homologue et les anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, à doser sont d'origines différentes.

12. Kit selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que ledit réactif de marquage consiste en un composé immunologique susceptible de quantifier la réaction entre les anticorps, notamment antiGLIA et anti-tTG, et le réactif immunologique, ledit composé immunologique étant couplé à un marqueur qui est, de préférence un fluorochrome.

13. Kit selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit réactif de marquage réagit avec le complexe composé homologue ou anticorps, notamment anti-GLIA et/ou anti-tTG, à doser / antigène notamment, GLIA et/ou tTG, auquel cas le dosage est direct, ou avec l'antigène, notamment la GLIA et/ou la tTG, non complexé, auquel cas le dosage est indirect.

14. Procédé de mise en oeuvre du kit selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisé en ce qu'il consiste à mesurer les signaux résultants de l'interaction entre le réactif immunologique et, d'une part, l'échantillon biologique, d'autre part, le standard d'étalonnage, et à déterminer et appliquer, aux différents signaux résultants, un facteur de correction de manière à obtenir la titration, exprimée en unités biologiques, des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, de l'échantillon, ledit facteur de correction étant le rapport entre le signal obtenu pour le standard d'étalonnage et les concentrations issues de la table de correspondance.

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à : a) incuber, d'une part, l'échantillon biologique et, d'autre part, le standard d'étalonnage, avec une quantité prédéterminée de réactif immunologique; b) ajouter le réactif de marquage; c) mesurer, par cytométrie en flux, les signaux émis, d'une part, par le standard d'étalonnage, d'autre part par l'échantillon; d) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, un facteur de correction qui correspond au rapport entre la concentration en unités biologiques de chacun des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, à doser telle que donnée par la table de correspondance et le signal mesuré à l'étape c) pour le standard d'étalonnage; e) multiplier par ledit facteur de correction, calculé pour chaque anticorps, le signal émis par chaque catégorie de particules et mesuré à l'étape c) pour en déduire la concentration en unités biologiques de chaque anticorps dans l'échantillon testé.