FR2544081A1 - Substrat pour l'analyse par immunofluorescence - Google Patents

Abstract

L'INVENTION A TRAIT AU DOMAINE DE LA CHIMIE MEDICALE. ELLE CONCERNE UN SUBSTRAT D'ANALYSE PAR IMMUNOFLUORESCENCE COMPRENANT UNE MATIERE POLYMERIQUE GONFLANTE ET REHYDRATABLE FIXANT LA PROTEINE, FORMANT UNE MATRICE TRIDIMENSIONNELLE; DES CENTRES PARTICULAIRES DIFFUSANT DE LA LUMIERE NON SPECIFIQUE, DISTRIBUES DANS LA MATRICE POLYMERIQUE ET CAPABLES DE DIFFUSER LA LUMIERE VISIBLE; ET DES CENTRES PARTICULAIRES DIFFUSANT LA LUMIERE SPECIFIQUE DANS LA MATRICE POLYMERIQUE, CAPABLES DE REFLECHIR UNE LUMIERE SPECIFIQUE D'EXCITATION FLUORESCENTE ET D'ABSORBER LA LUMIERE NON SPECIFIQUE. LE SUBSTRAT FIXE EFFICACEMENT LES PROTEINES AU PROFIT DE LA LUMIERE FLUORESCENTE TRANSMISE ET ACCROIT AINSI LA SENSIBILITE DE DOSAGES IMPLIQUANT DES MESURES DE FLUORESCENCE. APPLICATION AU DIAGNOSTIC DE MALADIES VIRALES, BACTERIENNES, PARASITAIRES OU FONGIQUES EN MEDECINE HUMAINE ET EN MEDECINE VETERINAIRE.

Description

La présente invention concerne le titrage

fluorimétrique de liquides biologiques Elle a plus par-

ticulièrement trait à un substrat pour épreuve d'immuno-

fluorescence qui est capable de fixer des protéines par-

ticulières et d'autres entités biologiques (par exemple 1 'ADN)> Le substrat exalte La spécificité et la sensibilité

de l'épreuve d'immunofluorescence (EIF) et est par consé-

quent utile auxdiagnostics de maladies associées à des antigènes et des anticorps spécifiques L'invention offre un intérêt pour des épreuves vétérinaires de détection de maladies affectant des animaux d'agrément, des animaux de laboratoire et le bétail, ainsi que des maladies et

des états pathologiques chez des êtres humains.

L'analyse fluorimétrique est une puissante technique de détection de petites quantités de substances dans un mélange complexe Elle est particulièrement utile dans l'épreuve d' immunofluorescence (EIF) concernant des liquides corporels tels que le sang, o de petites

quantités d'un antigène et d'anticorps qui le reconnais-

sent doivent être détectées.

L'épreuve EIF est utile au diagnostic d'une maladie lorsqu'elle est spécifique d'un antigène ou d'un anticorps particulier qui est caractéristique de cette maladie Toutefois, pour permettre un diagnostic fiable, l'épreuve EIF doit aussi non seulement être spécifique, mais également très sensible attendu que la substance à détecter est souvent présente en très petites quantités

dans le liquide en cours d'analyse.

Des tentatives antérieures d'amélioration de

la sensibilité de l'épreuve EIF comprennent le développe-

ment ou l'utilisation de substrats qui fixent sélective-

ment des protéines Ces substrats peuvent être immobi-

lisés sur des surfaces solides de manière que la réaction immunitaire entre antigène et anticorps puisse être

observée plus aisément.

Toutefois, ces substrats ont généralement été formés de polymères tels que polystyrène ou polypropylène qui ne fixent pas fortement des protéines et qui ont donc un usage limité dans le choix de petites quantités d'immunogènes protéiniques dans des liquides biologiques complexes Une épreuve diagnostique utile nécessite un substrat qui peut efficacement absorber des anticorps ou des antigènes particuliers. Etant donné que l'épreuve EIF implique la détection de lumière émise par un fluorophore particulier, la sensibilité dépend également de l'intensité de la lumière ainsi émise et de sa relation avec la lumière ambiante ou la lumière diffusée Le choix d'une longueur d'onde incidente pour équilibrer la fréquence d'excitation

du fluorophore est un facteur important dans l'accroisse-

ment de la sensibilité Le brevet des Etats-Unis d'Amé-

rique N O 4 340 564 fait connaître un substrat immunitaire en phase solide qui comprend un revêtement extérieur de perles de polymère avec des centres de diffusion de la lumière et des liants qui accentuent la lumière diffusée D'autres façorsd'améliorer les substrats et d'accroître la quantité de lumière transmise ont été recherchées activement (voir par exemple le brevet des

Etats-Unis d'Amérique N O 4 258 002).

La présente invention propose un substrat pour épreuve d'immunofluorescence, comprenant une matière

polymérique gonflante analogue à un gel, fixant les pro-

téines, qui forme un réseau colloïdal tridimensionnel et renferme selon une distribution statistique des centres

de diffusion de la lumière.

La présente invention propose plus particulière-

ment un substrat pour épreuve d'immunofluorescence compre-

nant une matière polymérique gonflante fixant les protéines formant une matrice tridimensionnelle; des centres particulaires non spécifiques de diffusion de la lumière distribués dans la matrice polymérique et capables de diffuser la lumière visible; et des centres particulaires spécifiques de diffusion de la lumière distribués dans la matrice polymérique et capables de réfléchir la lumière spécifique d'excitation fluorescente à bande étroite

et d'absorber la lumière non spécifique.

Contrairement à la plupart des substrats

solides, le substrat de l'invention est une matrice tri-

dimensionnelle, un film gonflant réhydratable doué de propriétés colloidales:-analogues à celles d'un gel, capable de fixer 5 à 20 fois autant de protéine qu'une

aire de dimensions comparables par exemple de polystyrène.

La caractéristique de ce film est son aptitude, lorsqu'on l'expose à des matières aqueuses, à s'imbiber rapidement

de liquide, à gonfler pendant le processus de réhydrata-

tion et à permettre ainsi aux protéines de passer à tra-

vers le film de manière que, par exemple, des anticorps

spécifiques puissent atteindre leurs antigènes complémen-

taires et se lier à eux ou, inversement, que des enzymes

puissent atteindre leurs substrats spécifiques.

Les centres particulaires du substrat diffusant la lumière non spécifique exaltent la sensibilité de l'épreuve d'immunofluorescence avec le substrat de la présente invention par diffusion à la fois de la lumière

incidente visible et de la lumière fluorescente émise.

Dans le schéma optique de l'épreuve d'immuno-

fluorescence o l'antigène ou l'anticorps introduit comme second corps réactionnel transporté dans le film est en liaison avec une molécule de colorant fluorescent en tant que marque d'identification, ladite molécule de colorant est excitée avec des longueurs d'ondes de lumière correspondant au spectre d'absorption de lumière du colorant Lorsque la molécule de colorant absorbe un

photon de lumière dans son spectre d'excitation spécifi-

que, un électron est élevé à un niveau supérieur d'énergie puis par transformation à l'état de triplet, un photon de moindre énergie (plus grande longueur d'onde) est ré-émis Un diffuseur spécifique de lumière associé à la fluorescence favoriserait le transfert de cette lumière

vers un détecteur Toutefois, de telles particules absor-

beraient également et par conséquent effectueraient l'extinction de la lumière initiale d'excitation en empêchant ainsi l'excitation du colorant Par conséquent, les diffuseurs de lumière non spécifiques de la présente invention ont été choisis pour -tre non spécifiques de manière à ne pas absorber la lumière d'excitation tout en pouvant encore diffuser la lumière fluorescente

émise par le colorant.

Les centres spécifiques de diffusion de la lumière du substrat ne diffusent que la bande étroite de lumière correspondant aux longueurs d'ondes d'excitation de fluorescence du colorant Ces diffuseurs spécifiques de lumière sont des pigments dont le spectre de diffusion de la lumière correspond au spectre d'absorption de la lumière du colorant fluorescent Le transfert de lumière incidente ayant des longueurs d'ondes dans cette plage spectrale qui excitent le marqueur fluorescent est donc favorisé A un moment ou à un autre, de la lumière ambiante qui interfère et qui a une longueur d'onde différente est absorbée et par conséquent éteinte par ces diffuseurs spécifiques de lumière Etant donné que le transfert de lumière fluorescente est favorisé tandis que la

lumière ambiante est réduite par ces diffuseurs spécifi-

ques de lumière, la sensibilité de l'épreuve EIF avec

le substrat de la présente invention est améliorée.

Par conséquent, le substrat de la présente invention fixe efficacement des protéines et exalte

la lumière fluorescente transmise et accroît par consé-

quent la sensibilité d'épreuves impliquant des mesures

de fluorescence.

La matière polymérique fixant la protéine selon la présente invention est avantageusement une matrice polymérique tridimensionnelle qui est un film gonflant à l'eau et réhydratable doué de propriétés colloïdales analogues à celles d'un gel, un copolymère acrylique par exemple, avantageusement une émulsion

aqueuse d'une résine formée d'un copolymère acrylique.

Des centres diffusant la lumière de deux types: 1) des diffuseurs de lumière non spécifique et 2) des diffuseurs

de lumière spécifique sont incorporés au film colloïdal.

Chacun d'eux à des dimensions inférieures au

micromètre et est insoluble dans des milieux aqueux.

Les centres particulaires diffusant la lumière non spéci-

fiaue sont très avantageusement des particules d'oxyde de zinc ou de dioxyde de titane (sous sa forme de rutile) séparément ou en association Les particules diffusant la lumière non spécifique peuvent être de nature non organique, comme les formes anatase ou rutile du dioxyde de titane, l'oxyde de zinc, le carbonate de calcium; ou bien elles peuvent être d'origine argileuse comme le kaolin (argile de Chine), la bentonite ou la terre de Fuller; ou bien elles peuvent être d'origine organique, comme les matières amylacées Ces diffuseurs de lumière sont sous la forme de particules, ils sont uniformément distribués, ils diffusent toute la lumière efficacement et augmentent la probabilité selon laquelle un photon lumineux d'excitation atteindra un fluorophore après des

réflexions, sinon sur sa trajectoire originelle.

Les centres diffusant de la lumière spécifique sont également en particules, ils sont statistiquement distribués dans le latex polymérique fixant la protéine et ils consistent très avantageusement en un composé pigmenté doué d'une réflectance spectrale spécifique avantageuse On apprécie notamment un sel métallique de phtalocyanine, le sel de cuivre de la phtalocyanine par exemple Le composé de phtalocyanine (parfois appelé "pigment" dans le présent mémoire) est un absorbeur spécifique de lumière dont la distribution spectrale de diffusion correspond au spectre d'excitation du colorant fluorescent utilisé et réduit par conséquent toute lumière de longueur d'onde indésirable, qu'elle soit due à une autofluorescence ou à une diffusion ambiante Ainsi, lorsqu'on utilise l'isothiocyanate de fluoresceine (ITCF) comme colorant dont l'absorption spectrale a son maximum par la portion "bleue" du spectre à 470 nanomètres, on doit utiliser les particules de phtalocyanine de cuivre dont la réflectance spectrale ou la diffusion s'est montrée optimale à 470 nanomètres Si le colorant utilisé doit être un dérivé de la rhodamine qui absorbe dans la région spectrale du "vert" et émet une fluorescence dans la région spectrale de l'"orangé",on doit utiliser les pigments appropriés pour maximiser la diffusion à la longueur d'onde d'environ 530 nanomètres Dans les cas o l'on détermine un effet optique non fluorescent alors que l'excitation et l'émission sont identiques, comme dans des variations photométriques utilisées dans

des techniques de marquage par des enzymes, aucune parti-

cule de diffusion spectrale spécifique ne doit être

ajoutée à l'émulsion qui formera le film colloïdal.

Il est préconisé d'utiliser des centres de diffusion de lumière non spécifique dans un rapport en poids d'environ 30:1 vis-à-vis des centres de diffusion

de lumière spécifique.

Dans des formes appréciées de réalisation de la présente invention, le substrat immuno-adsorbant est en association avec un support solide Lesupport solide comprend notamment une surface essentiellement plane, par exemple celle d'une lame d'essai Toutefois,

le substrat immuno-adsorbant se présente très avantageu-

sement sous la forme d'une couche relativement épaisse ( 40 à 50 Hm d'épaisseur) sur le fond essentiellement plat d'alvéoles d'essai dans le support solide Les alvéoles d'essai sont avantageusement circulaires, avec des parois en pente accentuée comme décrit par exemple dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 399 855

déposée le 19 juillet 1982.

Le substrat immuno-adsorbant de la présente in-

vention peut comporter en outre un réactif immunogène antigène ou anticorps Le substrat dans ces formes de réalisation est particulièrement utile à l'analyse de sang ou d'autres liquides corporels pour des réactifs immunogènes caractéristiques d'une maladie, notamment

ceux qui sont provoqués par une maladie virale, bacté-

rienne ou parasitaire.

Le substrat peut être utilisé pour diagnosti-

quer par une épreuve immunogène portant sur des liquides biologiques de petits animaux d'agrément, du bétail et d'animaux de laboratoire, des maladies virales, parasitaires et bactériennes courantes par une épreuve immunogénique portant sur des liquides biologiques pour le virus de la leucémie du chat, la péritonite infectieuse du chat, la toxoplasmose, l'anémie infectieuse du chat, la filariose, la brucellose du chien, le parvovirus du chien, des anticorps antinucléaires, le facteur rhumatoide et la maladie de Carré; le diagnostic, chez les équidés, de l'anémie infectieuse, de la gestation, de la gourme, de la pneumonie, de la métrite et de l'influenza; les ensembles de virus pour souris et rats de laboratoire;

la brucellulose des bovidés; des maladies aviaires compre-

nant le virus de la maladie de Newcastles, la psittacose et la leucose, des maladies du porc telles que la trichinose, la gastroentérite, la pseudorage et la fièvre africaine

du porc.

Des méthodesde recherche de la toxoplasmose aptes à être utilisées avec le substrat de la présente invention sont décrites dans: A.B Sabin, H A Feldman, Dyes as Microchemical Indicators of a New Immunity Phenomenon Affecting Protozoan Parasite (Toxoplasma) Science, 108,

660-663 1948.

L Jacobs, M N Lunde, A hemagglutination Test for Toxoplasmosis, J Parasitol, 43, 308-314

1957.

A.J Sulzer, E C Hall, Indirect Fluorescent Antibody Tests for Parasitic Diseases IV, Statistical Study of Variation in the Indirect Fluorescent Antibody (IFA) for Toxoplasmosis

Am J Epidemio, 86 401-407, 1967.

A.D Voller, G Bidwell, E Huldt, A Engvall Microplate Method of Enzyme Linked Immunoassay for Toxoplasma Antibody, J Clin Pathol 29

-153, 1974.

Des méthodes de recherche de la péritonite infectieuse du chat aptes à être utilisées avec le substrat de la présente invention sont décrites dans: Pederson et collaborateurs, "Antigenic Relationship of the Feline Infectious Peritonitis Virus to Coronaviruses of Other Species", Archives of Virology 58, 45-43 ( 1978) Pederson "Serologic Studies of Naturally Occuring Feline Infectious Peritonitis", Am. Journal of Vet Res, 37, n 12, 1449-1453 ( 1978) Horzinek et collaborateurs, "Virology and Pathogenesis of Feline Infectious Peritonitis", Archives of Virology 59 115 ( 1979) Des méthodes de recherche de la leucémie du chat aptes à être utilisées avec le substrat de la présente invention sont décrites dans: Jarrett et collaborateurs, "A Comparison of Three Methods of Feline Leukemia Virus Diagnosis", The Veterinary Record, 325-328 ( 1982) Hirsch et collaborateurs, "Comparison of ELISA and Immunofluorescence Assays for Detection of Feline Leukemia Virus Antigens in Blood of Cats", Journal of the Amer Animal Hospital

Assoc 18 933-938 ( 1982).

Ainsi, par exemple, la forme de réalisation

appréciée de la présente invention dans laquelle l'anti-

gène P-27 du virus de la leucémie du chat est lié au substrat peut être utilisée pour diagnostiquer la présence du virus de la leucémie dans le sang d'un chat De même, la forme de réalisation dans laquelle les virions de TGE sont liés au substrat et à l'intérieur de celui-ci peut être utilisée pour diagnostiquer la péritonite infectieuse du chat et une forme de réalisation appréciée dans laquelle l'antigène de Toxoplasma gondii est lié peut être utilisée pour rechercher les anticorps de la

toxoplasmose dans le sang de chats.

Le substrat immunitaire de liaison de la pro-

téine peut être préparé en mélangeant un copolymère acrylique formé de 50 % de résine et de 50 % d'eau à un p H d'environ 8 à 9 (Ingrédient A) avec une émulsion

de résine acrylique et d'eau en mélange avec une suspen-

sion de dioxyde de titane et d'oxyde de zinc (Ingrédient B) et une émulsion de résine acrylique et d'eau en mélange

avec une suspension de dioxyde de titane et de phtalocya-

nine de cuivre (Ingrédient C) L'ingrédient B peut ren-

fermer en outre une substance améliorant l'écoulement,

par exemple une résine du type d'un ester à longue chaîne.

L'Ingrédient B comprend par exemple environ 3 à 5 % de

résine à longue chaîne Les ingrédients sont avantageu-

sement associés dans la proportion A:B:C de 2,5:2,5:1 et dilués avant leur utilisation dans 5 parties d'eau distillée. La source du copolymère acrylique peut être une émulsion acrylique, par exemple d'acide méthacrylique ou de polyméthacrylate de méthyle ou de copolymères de ces matières. Le substrat peut aussi être obtenu à partir d'acétate de vinyle et de ses dérivés, ou à partir de butadiène-styrène et de copolymères de ces matières avec d'autres polymères Il peut s'agir de polymères de type époxy, de matières à base de chlorure de vinyle et de copolymères d'un nombre quelconque ou de la totalité

des matières indiquées ci-dessus.

La résine dans les ingrédients A, B et C est avantageusement sous une forme ressemblant à des perles, les perles ayant des diamètres compris entre environ 0,1 et 1,0 micromètre, notamment des diamètres d'environ 0, 2 micromètre Les oxydes dans les ingrédients B et C sont des particules choisies de manière qu'elles mesurent la moitié de la longueur d'onde de la lumière dirigée sur l'échantillon Pour les épreuves de fluorescence de la présente invention par exemple, les particules

ont avantageusement des diamètres d'environ 0,2 micromètre.

Les composés de phtalocyanine à distribution statistique

dans la matrice polymérique ont avantageusement des dia-

mètres de moins de 0,1 micromètre et notamment compris

entre 0,05 et 0,1 micromètre.

Une forme de réalisation appréciée comprend de 1 'ITCF comme marqueur coloré et de la phtalocyanine de cuivre comme particule pigmentaire de diffusion Des dimensions optimales des particules sont basées sur la

théorie de la diffusion et elles indiquent que la diffu-

sion optimale apparaît lorsque le diamètre des particules est approximativement égal à la moitié de la longueur d'onde de la lumière Etant donné que lorsqu'on utilise 1 'ITCF comme molécule de colorant, une lumière "bleue" de longueurs d'ondesallant de 420 à 480 nanomètres est dirigée sur le film,-l'idéal serait que les particules

aient un diamètre de 0,2 à 0,3 micromètre.

Les perles de polymère acrylique et le dioxyde de titane ont avantageusement des distributions

diamétrales qui sont maximales à environ 0,2 micromètre.

La phtalocyanine de cuivre comprend avantageusement des particules un peu plus petites, mais représente encore

une section efficace de diffusion.

Dans des formes appréciées de réalisation de l'invention, le substrat est immobilisé sur un support solide Le support solide présente avantageusement une surface essentiellement plane sur laquelle le substrat

est déposé dans au moins une zone physiquement distincte.

Le support solide comprend en outre très avantageusement un ou plusieurs alvéoles d'essai dont le fond a une surface pratiquement plane et dont les parois latérales divergent Le substrat est avantageusement immobilisé sur les surfaces planes du fond des alvéoles Ces derniers après déposition du substrat, constituent donc une aire délimitée dans laquelle l'analyse d'un liquide peut être effectuée Lorsqu'ils sont immobilisés dans des conditions réglées de température et d'humidité (par exemple 20 'C et humidité de 70 %), il se forme un film colloïdal de à 50 micromètres d'épaisseur, qui est perméable à l'eau. A des vitesses réglées de séchage (éviter les fluctuations ou les extrêmes de température et d'humidité et ne pas tolérer d'exposition aux courants

d'air) et à la dilution appropriée avec de l'eau dis-

tillée comme indiqué dans la formulation, un dépôt liquide de l'émulsion d'environ 75 "m de hauteur se rassemble en un film d'environ 40 à 45 gm d'épaisseur, comme le

montrent des photographies au microscope électronique.

A l'état sec, le poids normal d'un film est de 60 à 65 mg Au bout de 10 minutes d'exposition à des solutions aqueuses (par exemple après des immersions préalables dans l'eau ou des dépôts de liquides corporels), le poids du film s'élève jusqu'à 115 mg, avec un gain de 75 % dû à la teneur en eau Même au bout d'une heure et demie de séchage subséquent à la température ambiante, un excès résiduel de 6 à 7 % d'eau est présent et disparait

de façon exponentielle.

Le substrat immobilisé de la présente invention

peut être utilisé dans une épreuve immunologique conjoin-

tement avec des dispositifs d'essai qui mesurent la quan-

tité de lumière d'une longueur d'onde particulière trans-

mise par le substrat et les corps réactionnels absorbés

sur et dans ce dernier La demande de brevet des Etats-

Unis d'Amérique no 362 696 déposée le 29 mars 1982 fait connaître un dispositif d'analyse de ce genre Lorsqu'on

l'utiliseavec ce dispositif et ce système d'essai, dis-

ponible sous la marque commerciale TRACK XI auprès de la firme Daryl Laboratories, de la lumière de longueur d'onde sensiblement semblable au mode d'excitation du

fluorophore est dirigée sur le substrat- La lumière inci-

dente est réfléchie, transmise ou absorbée en quantités proportionnelles à la quantité de corps réactionnels sur et dans le substrat Lorsque la lumière incidente a une longueur d'onde comprise dans le spectre d'excitation du marqueur fluorescent, la matière en particules se trouvant

dans le substrat, de préférence un pigment du type phtalo-

cyanine, la phtalocyanine de cuivre par exemple, réfléchit cette lumière incidente spécifique et absorbe toute lumière activatrice non fluorescente La sensibilité de l'épreuve est donc grandement améliorée, attendu que le niveau ambiant de lumière réfléchie non désirée est réduit et que le rapport signal:bruit de la lumière fluorescente

réfléchie est favorisé.

Le substrat immobilisé favorise également la sensibilité d'épreuves qui impliquent d'autres groupes choromophores, l'épreuve immunitaire enzymatique (EIE) par exemple Dans l EIE, la lumière incidente traverse le milieu liquide jusqu'au substrat immobilisé sur lequel la réaction immunitaire a lieu, et elle est réfléchie de là à travers le milieu liquide qui est le réactif

enzymatique subissant un changement de couleur.

Dans une forme appréciée de mise en oeuvre de la présente invention, le substrat peut comporter en outre une première substance qui est capable de réagir avec une ou plusieurs autres substances pour former un produit fluorescent Ainsi, par exemple le substrat peut être lié en surface ou intérieurement avec un antigène ou un anticorps capable de réagir avec ses coordinats

respectifs, qui est marqué avec un fluorophore approprié.

Dans cette forme de réalisationle substrat est utilisé dans l'analyse des liquides biologiques qui peuvent contenir des antigènes ou un anticorps caractéristiques

d'une infection viraleparasitaire ou bactérienne parti-

culière et il constitue donc un outil diagnostique utile.

Des épreuves de grande sensibilité peuvent être effectuées rapidement et de façon reproductible et sont donc utiles dans l'examen systématique de dépistage de grands nombres

d'échantillons prélevés sur des animaux suspectés d'in-

fection D'autres exemples de substances qui peuvent être liées au substrat de la présente invention sont des peptides, des hormones, des médicaments ou des substrats d'enzymes Ces substances peuvent être détectées par une épreuve directe avec un réactif qui peut être marqué avec un fluorophore ou bien on peut les détecter par des épreuves indirectes, par exemple par la technique

dite sandwich.

Les exemples suivants illustrent l'utilisation de la présente invention dans l'analyse immunologique de liquides pour le diagnostic de maladies Toutefois, il y a lieu de remarquer que l'invention n'est pas limitée

à ces exemples.

Exemple 1

Détection de la leucémie du chat A Epreuve de déplétion des anticorps Un substrat a été immobilisé au fond d'alvéoles d'essai dans un support solide procuré par la firme Daryl Laboratories sous le nom commercial de COLLIMMUNE et préparé comme décrit dans le présent mémoire en ce qui concerne la composition de substrat et les "tracks" d'essai de la demande de brevet des Etats-Unis

d'Amérique N O 399 920 déposée le 19 juillet 1982.

L'antigène P-27, qui est l'un des antigènes du noyau du virus de la leucémie du chat, a été récolté de la lignée cellulaire FI-74 et déposé sur un premier

alvéole d'essai.

Dans un alvéole d'essai auxiliaire, on a fait incuber un échantillon contenant un antigène P-27 avec l'anticorps anti-P-27 développé dans des lapins Après une période d'incubation de 10 minutes, une portion de ce mélange a été transférée dans le premier alvéole d'essai pour permettre à tout anticorps non déjà fixé à l'antigène de l'échantillon de se combiner avec un antigène P-27 dans le substrat Après une période d'incubation de minutes et un bref lavage, de l'immunoglobuline G (Ig G)

de chèvre anti-lapin qui avait été marquée à l'isothio-

cyanate de fluorescéine (ITCF) a été ajoutée au substrat.

Après une période d'incubation de 10 minutes, le substrat a été lavé et inséré dans un dispositif TRACK XI Daryl comme décrit dans le présent mémoire et la fluorescence transmise a été mesurée Les échantillons d'étalonnage pour le virus de la leucémie étaient des sérums normaux de chat contenant des concentrations connues de l'antigène P-27. Des essais cliniques portant sur 104 échantillons de sérum de chat préalablement congelés ont démontré

une spécificité de 85 % et une sensibilité de 95 % vis-à-

vis d'une épreuve subjective comparative ELISA de type sandwich, à savoir l'épreuve Leukassay F (marque déposée) de la firme Pitman Moore, Inc.

Exemple 2

Recherche par immunofluorescence de la péritonite in-

fectieuse du chat (PIC) La recherche avec le système TRACK XI Daryl des anticorps de PIC est une épreuve classique "de type sandwich", toutefois chaque échantillon est testé sur

un alvéole revêtu d'antigène et sur un alvéole à revête-

ment témoin Le substrat COLLIMMUNE a été le même que

celui de l'exemple 1.

Une préparation témoin et une préparation

d'antigène ont été appliquées à des alvéoles alternés.

La préparation témoin consistait en liqueur surnageante provenant d'une culture de cellules de reins de porc (RP) diluée à 1:3 avec un tampon au bicarbonate 0,1 M à p H 9 La préparation d'antigène consistait en virions de TGE provenant de la liqueur surnageante d'une culture de cellules de RP infectées avec le virus TGE (souche Miller) Les anticorps de la péritonite infectieuse du chat présentent une réaction croisée accentuée avec le

virus TGE.

L'échantillon de sang de chat a été appliqué à des alvéoles témoins et à des alvéoles d'antigène et l'incubation a été conduite pendant 10 minutes Après un lavage, de l'Ig G de lapin anti-chat marqué à l'ITCF a étéappliqué aux alvéoles Après une période d'incubation de 10 minutes et un lavage final à l'eau, on a observé la fluorescence des alvéoles dans le lecteur de fluorescence TRACK XI Dans l'analyse des résultats, on soustrait la fluorescence du témoin de la fluorescence dérivée

de l'alvéole contenant l'antigène des échantillons étalon-

nés et des échantillons inconnus, pour obtenir une valeur nette de fluorescence Les échantillons étalonnés sont

des sérums rassemblés de titre en PIC connu, comme déter-

miné par d'autres techniques Des essais cliniques por-

tant sur 124 échantillons de sérum de chat prélablement congelé ont montré une spécificité de 80 % comparativement

à l'épreuve cinétique à liaison enzymatique (KELA) connue.

L'épreuve TRACK XI a montré une sensibilité de 90 %

comparativement à l'épreuve KELA.

Exemple 3

Recherche par immunofluorescence de Toxoplasma gondii Toxoplasma gondii peut affecter de nombreux

animaux différents, mais le chat constitue son hôte naturel.

Il revêt une grande importance clinique, attendu que la transmission à une femme enceinte par le chat domestique peut engendrer chez le foetus des défauts qui seront catastrophiques à la naissance En conséquence, la femme et son chat doivent être testés périodiquement par

sérologie au cours de la grossesse.

On ajoute au substrat comme dans l'exemple 1 des antigènes solubles extraits d'organismes désintégrés de l'espèce Toxoplasma gondii Le substrat et l'antigène sont immobilisés dans des alvéoles d'essai Une goutte de sérum ou de sang entier non dilué est placée dans chaque alvéole On fait incuber les alvéoles pendant 10 minutes à la température ambiante pour permettre la réaction entre les anticorps relatifs à T gondii et l'antigène immobilisé On lave les alvéoles puis on les fait entrer en contact avec des anticorps anti-chat marqués à l'isothiocyanate de fluorescéine (ITCF) Après une période d'incubation de 10 minutes, on a lavé les alvéoles et on les a observés pour détecter la fluorescence Des essais témoins portant sur des échantillons de titre connu ont été effectués en même temps pour obtenir une

courbe d'étalonnage.

Exemple 4

Les épreuves-suivantes ont été conduites en utilisant le mode opératoire, le substrat et l'appareillage

généraux des exemples 1 à 3 De l'Ig G de chat a été pré-

paré comme dans l'exemple 3 mais aucun anticorps ni antigène n'a été préalablement appliqué au substrat de colloide Du sérum a été maintenu dans les alvéoles pendant 10 minutes Toutes les protéines sériques ont été absorbées Après lavage, l'anticorps anti-Ig G de chat marqué à l'ITCF a été appliqué Il n'a réagi qu'avec l'Ig G liée Après une période d'incubation de 10 minutes, l'Ig G anti-chat en excès a été éliminée par lavage et

la fluorescence a été lue dans l'instrument TRACK XI.

Des systèmes d'étalonnage ont exprimé quantitativement

le résultat en mg d'Ig G par 100 ml de sang.

Le dosage de l'Ig G de cheval a été effectué de la même façon que le dosage de l'Ig G de chat, mais l'étalonnage a été effectué pour de faibles concentrations afin de déterminer si un poulain nouveau-né était immunodéficient sans avoir prélevé le colostrum de

la jument.

L'anticorps de la maladie de Carré, l'anticorps du Parvovirus du chien et l'anticorps de la brucellose du chien ont tous été soumis à des techniques de double site effectuées comme dans l'exemple 3 et dirigées contre les antigènes appropriés On a effectué dans tous les cas deux incubations d'une durée de 10 minutes et deux

brefs lavages Aucun des essais n'a nécessité l'utilisa-

tion d'alvéoles témoins comme dans l'essai PIC de l'exemple 2 Pour la recherche des facteurs rhumatoides chez le chien, l'antigène consistait en Ig G de lapin "modifiée" contre laquelle étaient dirigés chez certains chiens des anticorps Ig M Un anticorps Ig M anti-chien marqué à l'ITCF a été utilisé de la même façon que dans

les exemples 1-3 Pour la recherche d'anticorps anti-

nucléaires de chien, on a réuni comme antigène de l'ADN

picaténaire et monocaténaire plus la protéine ribonu-

cléaire Le test a été conduit comme dans les exemples 1-3.

Des tests immunologiques impliquant la détection d'antigènes ou d'anticorps relativement à une maladie virale, bactérienne et parasitaire qui peuvent

être conduits conformément à la présente invention compren-

nent, entre autres, les suivants Petits animaux d'agrément: F Virus de la leucémie du chat F Péritonite infectieuse du chat F Toxoplasmose du chat F Anémie infectieuse du chat C Filariose du chien C Brucellose du chien C Parvovirus du chien C Anticorps anti-nucléaires du chien C Facteurs rhumatoides du chien C Maladie de Carré Cheval: E Anémie infectieuse équine E Gestation de la jument E Gourme du cheval E Pneumonie du cheval E Métrite équine E Influenza du cheval Laboratoire: Groupes de virus chez la souris et le rat Animaux de boucherie: Brucellose du boeuf Trichinose du porc Gastro-entérite du porc Fièvre catarrhale maligne du mouton Oiseaux: Virus de la maladie de Newcastle Psittacose Leucose En outre, le dosage quantitatif des composants protéiniques du sérum tels qu'Ig G, Ig A, Ig M et Ig E des systèmes complémentaires et d'autres protéines sériques

telles que les protéines réactives C sont possibles.

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Claims (8)

REVENDICATIONS

1 Substrat pour l'analyse par immunofluorescence, caractérisé en ce qu'il comprend ( 1) une matière polymérique de fixation de la protéine réhydratable et gonflante formant une matrice tridimensionnelle; ( 2) des centres particulaires de diffusion de la lumière non spécifique distribués dans la matrice polymérique et capables de diffuser la lumière visible; et ( 3) des centres particulaires de diffusion de la lumière spécifique distribués dans la matrice polymérique et capables de réfléchir la lumière spécifique d'excitation fluorescente

et d'absorber la lumière non spécifique.

2 Substrat suivant la revendication 1, caracté-

risé en ce que la matière polymérique de fixation de

la protéine est un copolymère acrylique qui est de préfé-

rence un copolymère d'acide méthacrylique et de poly-

méthacrylate de méthyle.

3 Substrat suivant la revendication 1, caracté-

risé en ce que les centres diffusant la lumière non spé-

cifique sont des oxydes de titane et de zinc, séparément

ou conjointement.

4 Substrat suivant la revendication 1, caracté-

risé en ce que ledit centre de diffusion de la lumière

spécifique est un composé de phtalocyanine.

Substrat suivant la revendication 1, caracté- risé en ce qu'il est immobilisé sur un support solide qui comprend de préférence une surface essentiellement plane et notamment un ou plusieurs alvéoles d'essai dont le fond présente une surface pratiquement plane et

dont la paroi latérale diverge, ledit substrat étant immo-

bilisé sur le fond en question.

6 Substrat suivant la revendication 1, caracté-

risé en ce qu'il porte une première substance, fixée intérieurement et extérieurement, capable de réagir avec une ou plusieurs substances successives pour former un

produit fluorescent.

7 Substrat suivant la revendication 6, carac-

térisé en ce que ladite première substance est un antigène

ou un anticorps.

8 Substrat suivant la revendication 7, caracté- risé en ce que l'antigène entier ou sa fraction est formé par des virions TGE, l'antigène P-27 du virus de la leucémie du chat, Toxoplasma gondii, le virus de la maladie de Carré, le Parvovirus du chien, les organismes du genre Brucella, pathogènes pour le chien, Brucella

abortusdes filaires ou des organismes du genre Trichinella.

9 Une méthode d'analyse immunologique d'un liquide avec un substrat suivant la revendication 1,

qui est avantageusement-une méthode d'analyse immunolo-

gique par fluorescence ou une méthode d'analyse immuno-

logique en liaison avec un enzyme.

Application du substrat suivant la reven-

dication 1 au diagnostic chez un mammifère, de maladies causées par des agents pathogènes bactériens,

viraux, parasitaires ou fongiques, par une épreuve immu-

nologique portant sur un liquide corporel dudit mammifère notamment pour la recherche du virus de la leucémie du chat, de la toxoplasmose chez des êtres humains et d'autres mammifères, de l'Ig G du chat, de l'Ig G du chien, de la maladie de Carré, de Parvovirus ou de Brucella chez

le chien.