DE3412340A1

DE3412340A1 - Substrat zur fluoreszenzimmunanalyse von biologischen fluessigkeiten

Info

Publication number: DE3412340A1
Application number: DE3412340A
Authority: DE
Inventors: Anthony B. Hayward Calif. Chen; Richard A. Redwood City Calif. Harte; Nancy K. Belmont Calif. Kaufman
Original assignee: Daryl Laboratories Inc Santa Clara Calif; Daryl Laboratories Inc
Current assignee: Hitachi Chemical Diagnostics Inc
Priority date: 1983-04-07
Filing date: 1984-04-03
Publication date: 1984-10-11
Also published as: CA1229301A; DK159175B; SE8307004D0; IT8447933A1; DK159175C; JPH0614046B2; AU571476B2; DK105984D0; DE3412340C2; BR8400396A; GB2138131A; JPS59190664A; FR2544081A1; FR2544081B1; IT1179356B; GB2138131B; IT8447933A0; DK105984A; SE8307004L; US4540660A

Description

Substrat zur Fluor es ζ enz-Immun- Analyse von "biologischen Flüssigkeiten

Die Erfindung bezieht sich auf Fluoreszenz-Analyse biologischer Flüssigkeiten, Im besonderen betrifft die Erfindung ein Substrat zur Fluoreszenz-Immun-Analyse, das imstande ist, spezifische Proteine und andere biologische Wesen (z.B. DNA) zu binden. Das Substrat verbessert die Spezifität und Sensitivität der Fluoroimmunoassay (FIA) und ist somit nützlich bei der Diagnose von Krankheiten, die mit sepzifischen Antigenen und Antikörpern in Verbindung stehen. Die Erfindung ist äußerst wertvoll für die verterinarmedizinische Diagnose von Krankheiten, die Haustiere, Labortiere und den sonstigen Viehbestand umfassen, wie auch Krankheiten und Krankheitsstadien bdm Menschen.

Fluoroassay oder Fluoreszenzanalyse ist eine kraftvolle Technik zur Bestimmung kleiner Mengen von Substanzen in einer komplexen Mischung. Besonders zweckmäßig und vorteilhaft ist die Fluoreszenz-Immun-Analyse oder Fluoroimmunoassay (FIA) von Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut, in welchem geringe Mengen an Antigenen und Antikörpern enthalten sind, oder sein können, zu-bestimmen sind.

FIA ist nützlich bei der Diagnose einer Krankheit, wenn diese spezifisch ist für ein besonderes Antigen oder einen Antikörper, der für diese Krankheit charakteristisch ist. Für eine verläßliche Diagnose muß jedoch FIA nicht nur spezifisch sein, sondern auch höchst sensitiv, da die zu bestimmende Substanz oft in sehr kleinen Mengen in der zu analyierenden Flüssigkeit vorliegt.

Frühere Versuche zur Verbesserung der Sensitivität von FIA umfassen die Entwicklung oder den Einsatz von Substraten, die

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selektiv Proteine binden. Diese Substrate können auf einer festen Oberfläche immobilisiert werden, so daß die Immunreaktion zwischen Antigen und Antikörper leichter beobachtet werden kann.

Diese Substrate bestanden jedoch allgemein aus Polymeren, wie Polystyrol oder Polypropylen, die Proteine nicht stark binden, so daß ihr Einsatz stark eingeschränkt ist, hinsichtlich der Auswahl kleiner Mengen von proteinischen Immunogenen von komplexen biologischen Flüssigkeiten. Ein zweckdienlicher Diagnosetest erfordert ein Substrat, das wirkungsvoll besondere Antikörper oder Antigene zu absorbieren vermag.

Da 5¹IA die Aufnahme von Licht umfaßt, das von einem speziel·- len Fluorophor abgesandt wurde, hängt die Sensitivität auch von der Intensität des so emittierten Lichtes ab und dessen Beziehung zum Hintergrund oder dem gestreuten Licht. In der Auswahl einer eigenen Wellenlänge, die der Erregerfrequenz des Fluophor angepaßt ist, liegt ein wichtiger Faktor bei der Erhöhung der Sensitivität. Die US-JS 4,340,564 (Harte et al) beschreibt ein Festphasen-Immunsubstrat, das einen Überzug aus polymeren Perlen mit Licht Streuzentren umfaßt, sowie Bindern, die das gestreute Licht verstärken. Andere Möglichkeiten, die Substrate zu verbessern und die Menge an übertragenem Licht zu erhöhen, sind aktiv gesucht worden, wie z. B. gemäß der US-PS 4,258,002 (Pierce et al) vom 24. März 1981.

Gemäß der Erfindung besteht das Substrat zur Fluor-Immun-Analyse aus einem quellbaren; polymeres Protein bindenden, gelförmigen Material, das ein dreidimensionales kolloidales Rahmenwerk bildet, in welchem Lichtstreuzentren willkürlich verteilt sind.

Im besonderen wird gemäß der Erfindung ein Substrat zur Fluorimmunoassay geschaffen, das ein quellbares, polymeres

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Protein "bindendes Material umfaßt, das eine dreidimensionale Matrix bildet, unspezifische lichtstreuende Zentren, die in der polymeren Matrix verteilt und in der Lage sind, sichtbares Licht zu streuen, sowie spezifisches Licht streuende Zentren, die in der polymeren Matrix verteilt und in der Lage sind, fluoreszierendes Erregerlicht eines spezifisch engen Bandes zu reflektieren und unspezifisches Licht zu absorbieren.

Im Gegensatz zu den meisten Feststoffsubstraten handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Substrat um eine dreidimensionale Matrix eines quellbaren, rehydrierbaren Filmes mit kolloidalen, gelähnlichen Eigenschaften, der in der Lage ist, 5 bis 20 mal soviel Protein zu binden, wie dies bei vergleichbar großen Flächen, beispielsweise von Polystyrol, möglich ist. Charakteristisch für diesen Film ist seine Fähigkeit, wenn er wässrigen Materialien ausgesetzt ist, die Flüssigkeit rasch aufzunehmen, während des Hydrierungsprozesses zu quellen und somit es den Proteinen zu ermöglichen, innerhalb des Filmes zu wandern, so daß beispielsweise spezifische Antikörper ihre komplementären Antigene erreichen und binden können, oder umgekehrt können Enzyme ihre spezifischen Substrate erreichen.

Die teilchenförmigen, unspezifischen Lichtstreuzentren des . Substrats verbessern die Sensitivität der Fluoreszenz-Immun-Analyse mit dem Substrat gemäß der Erfindung, indem sowohl das eigene sichtbare Licht wie auch das emittierte fluoreszierende Licht gestreut wird.

Bei dem optischen Schema der Fluoreszenz-Immun-Analyse, bei welchem das eingeführte Antigen oder der Antikörper als zweites Reaktionsmittel in den Film hineingetragen werden, trägt, hieran gebunden, ein fluoreszierendes Farbmolekül als Identifizierungsetikett, wobei das Farbmolekül mit

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Lichtwellenlängen erregt ist, die dem Licht ab sorptionsspektrum der Farbe angepaßt sind. Wenn das Farbmolekül ein Lichtphoton absorbiert innerhalb seines spezifischen Errgerspektrums, wird ein ein Elektron auf einen höheren Energiestatus angehoben,und dann wird durch die Tripletstatusumsetzung ein Photon geringerer Energie (größerer Wellenlänge) wieder emittiert. Eine spezifische Lichtstreuung zusammen mit der Fluoreszenz verstärkt den (Sansfer eines solchen Lichtes auf einen Detektor. Solche Partikel wurden jedoch auch das ursprüngliche Erregerlicht absorbieren und damit auslöschen, womit eine Erregung der Farbe verhindert würde. Dementsprechend wurde die unspezifische Lichtstreuung gemäß der Erfindung so ausgewählt, daß sie nicht spezifisch ist, so daß sie nicht das Erregerlicht absorbiert und trotzdem in der Lage ist, das emittierte fluoreszierende Licht von der 3?arbe zu streuen.

Die spezifischen Lichtstreuzentren des Substrates streuen nur das enge Band des Lichtes, das den fluoreszierenden Eragerwellenlängen der Farbe entspricht. Diese spezifischen Lichtstreuer sind Pigmente, deren Lichtstreuspektrum dem Lichtabsorptionsspektrum der fluoreszierenden Farbe angepaßt ist. Der Übergang von eigenem Licht mit Wellenlängen innerhalb dieses Spektralbereiches, die^das fluoreszierende Etikett

25" erregen, ist somit verstärkt. Manchmal wird störendes Hintergrundlicht unterschiedlicher Wellenlänge absorbiert und somit durch diese spezifischen Lichtstreuer gelöscht. Da der Übergang von fluoreszierendem Licht verstärkt wird, während Hintergrundlicht vermindert wird, durch diese spezifischen Lichtstr'euer, wird die Sensitimtät von J¹IA durch das Substrat gemäß der Erfindung verbessert.

Dementsprechend bindet das Substrat gemäß der Erfindung wirkungsvoll Proteine und verstärkt das übertragene fluoreszierende Licht, wodurch die Sensitivität von Analysen ver-

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stärkt wird, in welchen Fluoreszenzmessungen eingesetzt werden.

Vorzugsweise ist das Protein bindende polymere Material gemaß der Erfindung eine -dreidimensionale polymere Matrix, j wobei es sich um einen mit Wasser quellbaren und rehydrierj baren Film handelt mit gelähnlichen kolloidalen Eigenschaften, beispielsweise ein Acrylpdymeres, und zwar vorzugsweise eine j Emulsion auf Wasserbasis eines Acryleopolymerharzes. Einge-• 10 bettet in den Eolloidfilm sind Iiichtstreuzantren zweier Typen: 1) unspezifische und 2) spezifische Lichtstreuer.

Jedes ist kleiner als ein Micron und unlöslich in einem wässrigen Medium. Die unspezifischen lichtstreuenden Teilchen-

<55 Zentren sind vorzugsweise Teilchen aus Zinkoxid oder Titandioxid (in seiner rutilen Form), entweder getrennt oder kombiniert. Die unspezifischen lichtstreuenden Partikel können anorganisch sein, wie etwa die Anatasen oder rutilen Formen von Titandioxid, Zinkoxid, Calciumcarbonat,oder sie können von Tonursprung sein, wie etwa Eaolin, Bentonit oder Bleicherde, oder sie können .organischen Ursprungs sein, wie etwa Stärken. Diese Lichtstreuer sind teilchenförmig, sind gleichförmig verteilt, streuen wirkungsvoll alles Licht und erhöhen die Wahrscheinlichkeit, daß ein erregtes Lichtphoton ein

25. Fluophor erreicht nach ReflekÜonen, wenn nicht schon auf —_. dem ursprünglichen Weg.

Die spezfisches Licht äreuenden Zentren sind ebenfalls teilchenförmig, willkürlich in dem Protein bindenden polymeren Latex verteilt und besonders bevorzugt eine pigmentierte Verbindung mit einem spezifisch angestrebten spektralen Reflektionsvermögen. Besonders bevorzugt ist ein metallisches Phtahlcyaninsalz, wie z. B. Sipferphthalcyanin. Die Ehthalcyaninverbxndung (mschmal auch hier als "Pigment" bezeichnet) ist ein spezifischer Absorber von Licht, dessen

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spektrale Streuverteilung dem Erregerspektrum der fluoreszierenden Farbe angepaßt ist, die eingesetzt wM;und vermindert dementsprechend das Licht unerwünschter Wellenlänge, unabhängig davon, ob es auf Autofluoreszenz oder Hintergrundstreuung beruht. Venn also jemand Fluoreszeinisothiocyanat (EITG) als Farbe einsetzt, deren spektrale dekadische Extinktion eine Spitze im "Blau"-Teil des Spektrums bei 4-70 Manometern besitzt, würde er die Partikel aus Kupferphthalcyanin einsetzen, dessen spektrales Reflexionsvermögen oder Streuung mit einem Optimum bei 4-70 Manometern nachgewiesen wurde. Sollte die eingesetzte Farbe ein Ehodaminderivat sein, das in dem ^wGrün^w~Bereich des Spektrums absorbiert und in dem "Orange¹¹-Bereich des Spektrums fluoresziert, sollte man das entsprechende Pigment einsetzen, um die Streuung bei etwa 530 Manometern Wellenlänge zu maximieren. Ei den Fällen, in welchen ein nicht fluoreszierender optischer Effekt bestimmt wird und sowohl die Erregung als auch die Emission identisch sind, wie bei photometrischen Änderungen, die bei Enymetikettierverfa.hr en eingesetzt werden, muß kein Spektralstreupartikel der Emulsion beigegeben werden, die den Kblloidfilm bildet.

Vorzugsweise werden unspezifisches Licht streuende Zentren in einem Gewichtsverhältnis von etwa dreißig zu eins in bezug auf spezifisches Licht streuende Zentren eingesetzt.

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung liegt das immunadsoptive Substrat in Kombination mit einem festen Träger vor. Besonders bevorzugt umfaßt der feste Träger eine im wesentlichen flache Oberfläche, wie z. B. diejenige eines Untersuchungsträgers. Am stärksten bevorzugt liegt jedoch das immunadsoptive Substrat als relativ dicke Schicht (40 bis 50 Micron Dicke) auf dem im wesedblichen flachen Boden der Testbehälter als festen Träger vor. Die Testbehälter sind vorzugsweise kreisförmig ausgebildet mit schräg abfallenden Wääen, wie dies beispielsweise in der US-Anmeldung vom 19· Juli 1982 mit dem Aktenzeichen 399»588 beschreiben ist, wo-

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rauf hier ausdrücklich Bezug genommen' wird.

Das immunadsorpfclve Substrat gemäß der Erfindung kann zusätzlich noch, ein immungenetisches Reaktionsmittel umfassen - entweder ein Antigen oder einen Antikörper. Das Substrat in diesen Ausführungsformen ist besonders vorteilhaft einsetzbar bei der Analyse von Blut oder anderen Körperflüssigkeiten, für immungenetische Reaktionsmittel, die für eine Krankheit charakteristisch sind, im besonderen solche die verursacht sind durch eine virale, bakterielle oder parasitäre Infektion.

Das Substrat ist geeignet für die Diagnose von immungenetischen Untersuchungen von biologischen Flüssigkeiten von Haustieren, den Viehbestand und Laboratoriumstieren im Hinblick auf übliche virale parasitäre und bakterielle Krankheiten durch die immungenetische Analyse von biologischen Flüssigkeiten im Hinblick auf Kataenleukämievimas, infektiöse Katzenperitonitis, Toxoplasmose,„infektiöse Katzenanämie, Herzwurm (heart-worm), Hundebrucellose, Hundeparvovirus, antinukleare Antikörper, Sheumafaktor und Hundestaupe. Die Diagnose von Pferden im Hinblick auf infektiöse Pferdeanämie, Pferdeträchtigkeit, Pferdedrusen, Pferdepneumonitis, Pferdemetritis und Pferde-influenza; virale Listen für Labormäuse- und -ratten; Rinderbrucellosej Vogelkrankheiten einschließlich des Newcastle Krankheitsvirus, Psittacose und Leukose, Krankheiten des Schweins, wie etwa Trichinose, Gastroenteritis, Pseudorabies und afrikanisches Schweinefieber.

ToxoplasEoee .Untersuchungen, für welche sich das Substrat der vorliegenden Erfindung eignet, sind beschrieben ins

Sabin , A.B., Eeldman, H.A., Dyes as Microchemical Indicators of a New Immunity Phenomenon Affecting Protozoan Parasite (Toxoplasma) science, 108 660-663 1948.

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Jacobs, L., Lunde, M.N., A hemagglutination Test for

Toxoplasmosis

J. Parasitol, 43 308-314- 1957-

Sulzer, A.J., Hall, E.C, Indirect fluorescent Antibody Tests· for Parasitic Diseases IV, Statistical Study of Variation in the Indirect !fluorescent Antibody (Ii¹A) for Toxoplasmosis Am. J. Epidemio, 86 401-407 1967-

Voller, A.D., Bidwell, G. Huldt, E. Engvall A. Micr'oplate Method of Enzyme Linked Immunoassay for Toxoplasma Antibody"
J. Clin. Patho. 29 150-153 1974.

Untersuchungen hinsichtlich von Katzeninfektionsperitonitis, für welche sich das Substrat gemäß der Erfindung eignet, sind beschrieben in:

Pederson, et al., "Antigenic Relationship of the Feline Infectious Peritonitis Virus to Coronaviruses of Other Species", Archives of Virology 58, 45-43 (1978)

Pederson, "Serologie Studies of Naturally Occurring Feline Infectious Peritonitis" Am. Journal of Vet. Res., 37 No. 12, 1449-1453 ^l

Horzinek, et al., "Virology and Pathogenesis of Feline Infectious Peritonitis", Archives of Virology (1979)

Untersuchungen hinsichtlich der Katzenleukämie, für welche

sich das Substrat gemäß der Erfindung eignet, sind beschrieben in: ■

Jarrett, et al., "A Comparison of Three Methods of -._n Feline Leukemia Virus Diagnosis", The Veterinary ^^u Record, 325-328 (1982)

Hirsch,.et al., "Comparison of ELISA and Immunofluorescence Assays for Detection of Feline Leukemia Virus Entigens in Blodd of Cats", Journal of the Amer. Animal Hospital Assoc. 18 933-938 (1982)

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So kann beispielsweise gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, bei welcher das P-2? Antigen des Katzenleukämievirus an das Substrat gebunden ist, eingesetzt werden zur Diagnose von Katzenblut im Hinblick auf die Anwesenheit des Bbzenleukämievirus. In einer ähnlichen Weise kann die Ausführungsform, bei welcher die TGE-Viren an das uhL in dem Substrat gebunden sind, zur Diagnose infektöser Xatzenperitonitis eingesetzt werden, während die bevorzugte Ausführungsform bei welcha? das Toxoplasmagondiiantigen gebunden ist, sich für die Untersuchung von Katzenblut im Hinblick auf Toxoplasmose-antikörper eignet.

Das Protein bindende Immunsubstrat kann hergestellt werden durch die Mischung eines Acrylcopolymeren, bestehend aus 50 % Harz und 50 Wasser, bei einem pH-Wert von etwa 8 bis 9 (Bestandteil A) mit einer Emulsion von Acrylharz und Wasser, gemischt mit einer Suspension aus Titandioxid und Zinkoxid (Bestandteil B) sowie einer Emulsion aus Acrylharz und Wasser, vermischt mit einer Suspension aus Titandioxid und Kupferphtha.lcy.anin (Bestandteil 0). Der Bestandteil B kann zusätzlich einen Fließverbesserer, wie etwa Tallesterharz enthalten. Vorzugsweise umfaßt der Bestandteil B etwa 3 bis 5 % Tallesterharz. Die Bestandteile werden vorzugsweise in dem Verhältnis A ! B ! C « 2,5 : 2,5 M miteinander vermischt und vor dem Einsatz in fünf Teilen destilliertem Wasser verdünnt.

Das Acrylcopd{ymere kann abgeleitet werden von einer Acrylemulsionsquelle, wie etwa Methacrylsäure oder Polymethylmethacrylat oder Copolymere der Kombinationen hiervon.

Das Substrat kann außerdem abgeleitet werden von Vinylacetaten und Derivaten oder von Butadienstyrol und Oopolymeren hiervon mit anderen Polymeren. Es können Epoxypolymermaterialien, Vinylchloridmaterialien und Copolymere von irgendeinem

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oder allen der often erwähnten Materialien sein.

Das Harz bei den Bestandteilen A, B und C liegt vorzugsweise in Perlenform vor, wobei die Perlen einen Durchmesser zwischen etwa 0,1 und 1,0 Moron und vorzugsweise etwa 0,2 Micron aufweisen. Die Oxide in den Bestandteilen B und 0 sind Partikel, die so ausgewählt sind, daß sie etwa die Größe der Hälfte der Wellenlänge des Lichtes ausmachen, das auf die Probe gerichtet wird. Für die STuoreszenzanalyse der vorliegenden Erfindung beispielsweise besitzen die Partikel eine bevorzugte Größe von 0,2 Micron. Die Phthalcyaninbestandteile, die unregelmäßig in der polymeren Matrix verteilt sind, besitzen eine Größe von weniger als 0,1 Micron, wobei deren Größe vorzugsweise zwischen 0,05 und 0,1 Micron liegt.

Eine bevorzugte Ausführungsform umfaßt E¹ITO als Parbetikett und Kupferphthalcyanin als Streupigmentpartikel. Die optimale Größe der Partikel beruht auf der Streutheorie und zeigt an, daß die optimale Streuung eintritt, wenn der Teilchendurchmesser etwa die Hälfte der Wellenlänge des Lichtes ausmacht. Da bei J¹ITC als Parbmolekül "blaues" Licht mit Wellenlängen von 420 bis 480 Nanometern auf den J¹IIm gerichtet wird, würde es ideal sein, wenn die Partikel einen Durchmesser von 0,2 bis 0,5 Micron aufweisen wurden. ^

Die Acrylpolymerperlen und das Titandioxid besitzen vorzugsweise Durchmesserverteilungen, die maximal bei 0,2 Micron liegen. Das Eupferphthaleyanin umfaßt vorzugsweise etwas kleinere Partikel, die aber nach wie vor einen wirkungsvollen Streuquerschnitt aufweisen.

Hach bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Substrat auf einen festen Träger immobilisiert. Der feste Träger besitzt vorzugsweise eine im wesentlichen flache Oberfläche, auf welcher das Substrat aufgebracht wird, in mindestens

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einem diskreten' Bereich. Besonders bevorzugt umfaßt der feste j Träger einen oder mehrere Testbehälter mit im wesentlichen j flachen Bodenflächen und geneigten Seitenwänden. Das Substrat j ist vorzugsweise auf den flachen Bodenflächen der Behälter j 5 immobilisiert. Die Behälter mit dem eingebrachten Substrat stellen somit einen Bereich dar, in welchem die Untersuchung eines Fluids durchgeführt werden kann. Bei einer Immobilisierung unter gesteuerten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen (beispielsweise 25,56° C und 70 % Feuchte) wird ein kolloidaler Film gebildet mit einer Dicke von 40 "bis 50 Micron, der wasserdurchlässig ist.

Bei gesteuerten Trocknungsgeschwindigkeiten (wenn die Temperatur und Feuchtigkeit nicht schwankt oder extrem ist und keine Zugluft gestattet wird) und bei der entsprechenden Verdünnung mit destilliertem Wasser, wie dies der Vorschrift entspricht, wird eine Flüssigkeit auf der Emulsion mit einer Schichtdicke von 75 Micron Höhe aufgebracht und verschmilzt zu einem dicken Film von etwa 40 bis 45 Micron, wie ein. Elektronenmikroschreiber zeigt.

Nach dem Trocknen beträgt ein typisches Filmgewicht 60 bis 65 mg. Nachdem der Film 10 Minuten einer wässrigen Lösung ausgesetzt war (beispielsweise nach_dem Vorweichen in Wasser

oder dem Aufbringen von Körperflüssigkeiten), steigt das — Filmgewicht an auf 115 mgi was einen 75 96-igen Anstieg aufgrund des Wassergehaltes bedeutet. Auch bei einem anschliessenden Trocknen während 1 1/2 Stunden beim Bäumtemperatur ist ein Restüberschuß von 6 bis 7 % Wasser vorhanden, der exponentiell verschwindet.

Das immobilisierte Substrat gemäß der Erfindung kann eingesetzt werden für die Immununtersuchung im Zusammenhang mit Testvorrichtungen, die die Lichtmenge einer besonderen Wellenlänge messen, die von. dem Substrat übertragen wird, sowie hierauf und hierin absorbierten Reaktionsmitteln. Die ameri-

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kanische Patentanmeldung Nr. 362,696 vom 29. März 1982 beschreibt eine solche Testvorrichtung, und es wird hiermit ausdrücklieh hierauf Bezug genommen. Beim Einsatz zusammen mit dieser Testvorrichtung und dem System, das von Daryl

ν 5 Laboratories unter dem Warenzeichen TRACK XI zur Verfügung steht, wird Licht mit einer Wellenlänge, die im wesentlichen dem Erregermodus des Fluorophor ähnlich ist, auf das Substrat gerichtet. Das Eigenlicht wird reflektiert, übertragen, oder absorbiert in Mengen, die der Menge des Reaktionsmittels auf und in dem Substrat proportional sind. Wenn das Eigenlicht eine Wellenlänge in dem fluoreszierenden Etiketterregerspektrum besitzt,' reflektiert das teilchenförmige Material in dem Substrat, vorzugsweise ein Ehthalcyaninpigment, wie z. B. Eupferphthalcyanin, dieses spezifische eigene Licht ■ und absorbiert irgendwelches nicht fluoreszierende aktivierende Licht. Die Sensitivität der Untersuchung wird stark erhöht, da das Hintergrundniveau des unerwünscht reflektierten Lichtes vermindert wird,und das Verhältnis des Signals zum Hintergrund ag s reflektierten fluoreszierenden Lichtes wird verbessert.

Das immobilisierte Substrat verbessert auch die Sensitivität von Untersuchungen mit anderen Chromophorgruppen, wie z. B. der Enzymimmunanalyse (EIA). Bei der EIA läuft das Eigenlicht durch ein flüssiges Medium zum immobilisierten Substrat, auf welchem die Immunreaktion stattfindet, wobei, wenn es durch das flüssige Medium, das das Enzym-reaktionsmittel ist, zurückgeworfen wird, eine Farbänderung eintritt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Substrat zusätzlich eine erste Substanz enthalten, die in der Lage ist, mit einer oder mehreren FoIgesubstanzen zu reagieren, um ein fluoreszierendes Produkt zu bilden. So

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• kann beispielsweise das Substrat hieran oder hierin ein

Antigen oder einen Antikörper gebunden haben, die in der Lage sind, mit itcsn entsprechenden Liganden zu reagieren, die mit einem geeigneten iTuorphor behaftet sind. Die j 5 Ausführungsform des Substrats eignet sich für die Unter-

j suchung biologischer Flüssigkeiten, die Antigene oder Anti-

körper enthalten können, die charakteristisch sind für eine - bestimmte virale, parasitäre oder bakterielle Infektion, so

; daß sie ein nützliches Diagnosewerkzeug darstellen. Unter-' 10 suchungen mit einer großen Sensitivität können mit großer Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden, so daß sie für Routineuntersuchungen von großen Probenzahlen \on Tieren geeignet sind, bei welchen eine Infektion vermutet wird. Andere Beispiele von Substanzen, die an das Substrat der vorliegenden Erfindung gebunden werden können, sind Heptide, Hormone, Drogen oder Enzymsubstrate. Diese Substanzen können durch direkte Analyse ermittelt werden mit einem Reaktionsmittel, das an ein Pluophor angelagert werden kann, oder es kann eine indirekte Untersuchung vorgenommen werden, die beispielsweise nach der Sandwich-Technik verläuft.

Die folgenden Beispiele erläutern den Einsatz der Erfindung in der Immununtersuchung von JFluiden bei der Diagnose von 2$ Krankheiten. Es soll jedoch an dieaer Stelle ausdrücklich ■ herausgestellt werden, daß diese Beispiele die Erfindung nicht einschränken.

Beispiel 1
Katzenleukämietest

A. Antikörperabreicherungstest

Das Substrat wurde auf den Boden des Testbehälters in einem festen Träger immobilisiert, geliefert von der 3?irma Daryl Laboratories unter dem Warenzeichen COLLIMMUNE und vorbereitet, wie hierin beschrieben, unter Bezugnahme auf die

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Substratzusammensetzung und die Testanweisung der amerikanischen Patentanmeldung Nr. 399,920 vom 19· Juli 1982. P-27 .Antigen, eines der Eernantigene des Katzenleukämievirus, vnirde von einer wachsenden Zellinie ΈΊ-74- geerrtet und in einem ersten Testbehälter aufgebracht.

In einem Hilfstesfbehälter wurde eine Probe mit P-27 Antigen inkubiert mit Anti-P-27 Antikörper entwickelt in Kaninchen. Nach einer Inkubationszeit von -10 Minuten wurde ein Teil dieser Mischung auf den ersten TesEbehälter übertragen, um zu ermöglichen, daß irgendwelche freien Antikörper, die nicht schon an das Probenantigen gebunden waren, mit dem P-27 Antigen in dem Substrat zu kombinieren. Nach einer Inkubation von 15 Minuten und einer kurzen Waschung wurde Ziegen-Antikaninchen-Immunglobulin G (IgG-), das Pluoreszinisothiocyanat (PITG). etikettiert war, dem Substrat beigegeben. Nach einer Inkubation von 10 Minuten wurde das Substrat gewaschen und in eine Daryl-TEACE XI-Vorrichtung eingebracht, wie hier be schrieben, und hinsichtlich des übertragenen ITuoreszenzlichtes gemessen. Bei den Eichproben für den Leukämievirus handelte es sich um normale Katzensera mit einem bekannten Gehalt an P-27 Antigen.

Klinische Untersuchungen an 104 vorher gefrorenen Katzenserumproben zeigten eine Spezifität von 85 % und. eine Sensitivität ' von 95 % gegen einen Vergleichs ELISA Sandwichversuch, den

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Leukassay Έ von Pitman Moore, Inc.

Beispiel 2

JO Fluoreszenzimmunassay der infektiösen Katzenperitonitis (PIP)

Der Daryl TRAOK XI Systemassay für FIP-Antikörper ist eine Standard-"Sandwichtyp"-Untersuchung, wobei jedoch jede Probe ^c sowohl in einem Antigen überzogenen Gefäß als auch einem

Kontroll.überzogenen Gefäß untersucht wurde. Das COLLIMMUNE

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Substrat war das gleiche wie das in Beispiel 1 eingesetzte.

In unterschMliehe Gefäße wurden die Kontrollpräparation und die Intigenpräparation eingebracht. Die Kontrollpräparation war obenschwimmend, und man erhielt sie aus kultivierten Schweinenieren (PK) Zellen verdünnt 1 : 3 mit 0,1 M Bicarbonatpuffer, pH-Wert 9· Die Antigenpräparation waren TG-E Viren, die man erhielt (obenschwimmend) aus kultivierten PK Zellen, infiziert mit dem TGE Virus (Miller Strain). Infektionöse Katzenperitonitisantikörper wurden stark quer reagiert mit dem TGE Virus.

Katzenblutproben wurden sowohl in die Kontroll- als auch die Antigenbehälter eingegeben und 10 Minuten lang inkubiert. Uach einer Waschung wurde Kaninchen antikatz en-IgG mit S¹ITO Etikettierung den Behältern beigegeben. Bei einer Inkubation von 10 Minuten und einer endgültigen Waschung mit Wasser worden die Gefäße hinsichtlich ihrer Fluoreszenz in dem TRiOK XI Fluoreszenzlesegerät beobachtet. Bei der Analysierung der Ergebnisse wird die Kontrollfluoreszenz von der von dem Antigengefäßt abgeleiteten Fluoreszenz sowohl bei den geeichten Proben als auch den unbekannten Proben abgezogen, um zu einer Hettofluoreszenzablesung zu kommen. Die geeichten Proben sind koordinierte Sera mit bekanntem PIP Titer, bestimmt nach anderen Verfahren.

Klinische Tests an 124 Proben zuvor gefrorener Katzenserumproben zeigten eine Spezifität von 80 %, verglichen mit der bekannten kinetischen enzymgelinkten Untersuchung (KELA). Der TRACK XI Versuch zeigte eine 90 %-ige Sensitivität, verglichen mit dem KELA Versuch.

Beispiel 3

ffluoro immunci as say von Toxoplasma Gondii

Toxoplasma Gondii kann verschiedne Tiere befallen, wobei jedoch die Katze als das natürliche Reservoir dient. Hierin liegt eine ernsthafte klinische Bedeutung, da die Übertragung von

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der Haushaltskatze auf eine schwangere Besitzerin zu katastrophalen Geburtsschäden des Fötus führen kann. Dementsprechend sollten sowohl die schwangere Frau als auch ihre Eatze in periodischen Abständen serologisch während der Schwangerschaft untersucht werden.

Dem Substrat gemäß Beispiel 1 wurden lösliche Antigene beigegeben, die extrahiert waren von zersprengten Toxoplasma Gondii Organismen. Substrat und Antigen wurden in den Testgefäßen immobilisiert. Ein Tropf en Von ganzem unverdünntem Serum oder Blut wird in jedes Testgefäß eingebracht. Die Gefäße werden 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um eine Reaktion zwischen den Antikörpern zu T. Gondii und dem immobilisierten Antigen zu gestatten. Die Gefäße wurden gewaschen und dann mit Antikatζenantikörpern kontraktiert, die mit Fluoreszeinisothyisocyanat (FITC) etikettiert waren. Nach einer Ir-kubation von 10 Minuten wurden die Gefäße gewaschen und hinsichtlich der Fluoreszenz beobachtet. Ebntrollbeispiele mit bekanntem Titer wurden gleichzeitig gefahren, um eine Eichkurve aufzustellen.

Beispiel 4

Die folgenden Untersuchungen wurden ausgeführt unter Einsatz des.allgemeinen Verfahrens, des Substrats und der Ausrüstung gemäß dem Beispiel 1 bis 3· Katzen IgG wurde behandelt wie in Beispiel 3* jedoch kein Antikörper oder Antigen wurde zuvor dem Eölloidsubstrat beigegeben. Das Serum wurde 10 Minuten lange in Gefäße eingegeben. Alle Serumproteine wurden absorbiert. Nach dem Waschen wurde Antikatzen IgG Antikörper mit FITC Etikettierung aufgebracht. Es reagierte nur mit dem gebundenen IgG. Nach einer Inkubstion von 10 Minuten wurde das überschüssige Antikatzen IgG abgewaschen, und die Fluoreszenz wurde in dem TRACK XI Instrument abgelesen. Die Eichungen ergaben die Mengenbestimmung in mg von IgG pro 100 ml Blut.

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Pferde-IgG Untersuchung wurde ausgeführt in der gleichen Weise wie die Katzen-IgG Untersuchung, aber eine Eichung für niedrige Niveaus wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob ein neugeborenes Fohlen einen Immunschaden hatte,das noch keine Vormilch von" der Stute getrunken hatte.

Hundestaupenantikörper, Hundeparvorvierusantikörper und Hundeantikörper gegenüber Brucellose wurden alle Sandwichverfahren unterworfen, die in einer ähnlichen Weise ausgeführt wurden, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist und gegen die entsprechenden Antigene gerichtet. Es wurden bei allen zwei 10 minütige Inkubationen und zwei kurze Waschungen durchgeführt. Keinmal wurde der Einsatz eines Kontrollgefäßes erforderlich, wie dies bei dem FIP Test des Beispiels 2 der Fall war. Für einen Eheumafaktortest in Hunden war das Antigen ein "geändertes" Kaninchen-IgG, auf welches in einigen Hunden IgM Antikörper gerichtet wurden. Ein Antikund-IgM FITO etikettierter Antikörper wurde in der gleichen Weise eingesetzt wie in den Beispielen 1 bis 3· i*ür einen Hunde.antinuklearantikörpertest wurden doppelt und einfach verbundene DNA und Ribonuklearprotein als Antigen kombiniert. Der Test wurde durchgeführt, wie in den Beispielen 1 bis 3-

Immunologische Tests mit der Bestimmung von Antigenen oder 25- Antikörpern bezüglich viraler, bakterieller und parasitärer Krankheiten, die gemäß der Erfindung ausgeführt werden können, umfassen unter anderem die folgenden:

Katζenleukämievirus
Infektiöse Katzenperitonitis

Katzentoxoplasmose

Infektiöse Katzenanämie

Hundeherzwurm (heartworm)

Hundebrucellose
Hundeparvovirus

Hundeantinuklearantikörper

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I

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Pferde;

Hunderheumafaktor Hundestaupe

Infektiöse Pferdeanämie

PferdLeträchtigkeit

Pferdedruse

Pferdepneumonitis

Pferdenitritis

Pferdeinfluenza

Labor:

Vögel

Yirenlisten für Muse und Ratten Nahrungsmittel und Paser:

Einderbrucellose Trichinose

Schweinegastroenteritis Blaue Zungenviruskrankheit

Newcastles Viruskrankheit

Psittakose

Lsukose

Außerdem ist die Mengenbesti:mmung von IgG, IgA, IgM und IgE, Serumproteinkomponenten des Komplementärsystems und anderen Serumproteinen, wie C reagierenden Proteinen, möglich.

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Claims

J4 IZJ4U PATENTANWÄLTE HEGEL & DICKEL ZUGELASSEN BEIM EUROPAISCIIIiN ΡΛΊΤ-.ΝΤΛΜT HEGEL & DICKEL, JULIUS-KREIS-STR. 33, D-8000 MÜNCHEN 60 II. DOELLNKR (I900-W2) DR. KARL TH. HEGEL (1927-1<)82) DIPL.-ING. KLAUS DICKHL IHRZEICHEN: UNSERZEICHEN: H 33^9 JULIUS-KREIS-STR. 33 D-8000 MÜNCHEN 60 TELEFON: 089-885210 TELEX: 52 16739 dpaKl TELEGRAMMrDOELLNRR-PATHNT MÜNCHI-N DATUM: Daryl Laboratories, Inc. 2220 Martin Avenue Santa Clara, Kalifornien V. St. A. Substrat zur Eluoreszenz-Immun-Analyse von "biologischen Flüssigkeiten Patentansprücheί

1./Substrat zur Fluoreszenz-Immun-Analyse von "biologischen Flüssigkeiten, gekennzeichnet durch

(1) ein queirbares, rehydrierbares, polymeres Protein

bindendes Material, das eine dreidimensionale Matrix bildet,

(2) teilchenförmigen unspezifisches Licht streuende Zentren, die in der polymeren Matrix verteilt und in der Lage sind, sichtbares Licht zu streuen, sowie

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(3) teilchenförmige, spezifiscl3.es■ Licht streuende
Zentren, die in der polymeren Matrix verteilt
und in der Lage sind, spezifisches fluorezierendes Erregerlicht zu reflektieren und unspezifisches
Licht zu absorbieren.

2. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das polymere Protein bindende Material ein Acrylcopolymeres ist.
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3· Substrat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Acrylcopolymere aus Methacrylsäure und Polymethylmethacrylat besteht.

4. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die unspezifisches Licht streuende
Zentren Oxide von Titan und Zink, getrennt oder in Kombination sind.

5, Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das spezifische Licht streuende Zentrum eine Phthalcyaninverbindung ist.

6. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einem festen Träger immobilisiert ist.

7. Substrat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß der feste Träger eine im wesentlichen ebene Oberfläche umfaßt.

8. Substrat nach Anspruch y^d-aä-urch gekennzeichnet , daß ein oder mehrere Testbehälter im
wesentlichen flache Bodenflächen und divergierende Seitenwandungen umfassen, wobei das Substrat auf dem jeweiligen
Boden immobilisiert ist.

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9. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß hierin und hieran eine erste Substanz gebunden ist, die in der Lage ist, mit einer oder mehreren Uachfolgesubstanzen zu reagieren, zur Bildung eines fluoreszierenden Produktes.

10. Substrat nach Anspruch 9*cladurch gekennzeichnet , daß die erste Substanz ein Antigen oder ein Antikörper ist.

11. Substrat nach Anspruch 10,dadurch gekennzeichnet , daß das ganze Antigen oder eine Fraktion hiervon TGE-Viren, das P-27 Antigen des Katzenleukämie-Virus, Toxoplasmagondii, ein Hundestaupe-Virus, Hunde-Parvovirus, Hundebrucelloseorganismen, Brucellaabortusorganismen, Herzwurm (heartworm) oder Trichinella sind.

12. Verwendung des Substrats gemäß Anspruch 1 als Immunoassay für ein Fluid.

13. Immunoassay nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß es ein Fluoroimmunoassay ist.

14. Immunoassay nach Anspruch 12, "dadurch gekennzeichnet , daß es ein enzymgekoppeltes Immunoassay umfaßt.

15· Diagnose eines Säugetieres hinsichtlich einer Krankheit, die durch bakterielle, virale, parasitäre oder fungale Erankheit sinfektion verursacht wurde, gekennzeichnet durch die Fluoreszenzanalyse einer Körperflüssigkeit des Säugetieres mit dem Substrat gemäß Anspruch 1.

16. Diagnose nach Anspruch 15 in. Anwendung auf Katzenleukämie-Virus, Toxoplasmose beim Menschen und anderen Säugetieren, Katzen IgG, Hunde IgG, Hundestaupe, Hundeparvovirus oder Hundebrucella.

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