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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion eines
Immunglobulins, das in einer Probe an ein Allergen bindet, sowie
ein Verfahren zur in vitro-Diagnose von Allergien bei einem Patienten.
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Eine
Allergie ist eine vom Immunsystem des Körpers erzeugte Reaktion auf
eine Substanz, die man normalerweise als harmlos erachten würde. Es
ist diese Antwort, die die Symptome verursacht, die als allergische
Reaktionen klassifiziert werden. Eine Allergie ist daher kein Versagen
des Immunsystems, sondern dessen Überaktivität. Die Antwort einer allergischen
Person auf ein Allergen kann vielerlei Symptome erzeugen. Einige
Personen erleiden Symptome, wie Asthma, Ekzem, Ausschläge, Augenjucken,
Sinusitis, Nasenverstopfung oder Nasenrinnen und Heuschnupfen, es
können
jedoch ernstere Symptome auftreten. Bei Allergien, wie jenen auf
Gifte, Nüsse
und Schalentiere, kann beispielsweise ein potentiell lebensbedrohlicher
Zustand, anaphylaktischer Schock genannt, auftreten. Dies geschieht,
wenn der Körper
eine so starke Reaktion erzeugt, dass der Hals anschwillt, der Blutdruck
abfällt,
und die Person Schwierigkeiten beim Atmen hat. In einigen Fällen kann
diese Art von Reaktion tödlich
sein.
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Das
Auftreten von Allergien in den entwickelten Ländern (z.B. in Europa, Nordamerika
und Japan) ist im Zunehmen. Schätzungen
zufolge sind ein Bereich von 20–50%
der Bevölkerung
betroffen. Man weiß nun, dass
Allergien das Ergebnis eines Ungleichgewichts im T-Zellen-Kompartiment
des Immunsystems sind. Genauer gesagt sind Allergien von einer gesteigerten
Aktivität
der so genannten T-Helfer-2(Th2)-Zellen im Vergleich zu T-Helfer-1(Th1)-Zellen
begleitet, was zu einer gesteigerten IgE-Produktion führt.
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IgE
(Immunglobulin E) ist mindestens eine der Substanzen, die allergische
Reaktionen verursachen. IgE, das für ein Allergen spezifisch ist,
wird im Blut normalerweise nicht nachgewiesen und wird nur erzeugt, wenn
eine Person gegenüber
einer Substanz sensibilisiert wird. Substanzen, die eine Allergie
bewirken (Allergen genannt), erzeugen ein spezifisches IgE, das
für dieses
einzigartig ist und nur mit diesem reagiert. Diese Reaktion zwischen
IgE und dem Allergen ist wie ein Schloss und ein Schlüssel. Bei
Kombination mit dem Allergen bewirkt IgE, dass Zellen Chemikalien
(z.B. Histamine) freisetzen, die die Symptome der Allergie bewirken.
Eine Person kann spezifisches IgE für mehr als eine Substanz aufweisen
und daher auf mehr als eine Substanz allergisch sein. Die Ergebnisse
für den
IgE-Test sind als eine Stufe ausgedrückt, die anzeigt, wie viel für die. Substanz,
auf die getestet wurde, spezifisches IgE im Blut vorhanden ist.
Je höher
die Stufe, desto größer ist
die Wahrscheinlichkeit, dass der Patient allergisch ist. Im Laufe
der letzten Jahrzehnte wurden allergische Erkrankungen unter Verwendung
kaum gereinigter Extrakte, die aus den Haupt-Allergen-Quellen stammten,
diagnostiziert. Offensichtlich sind diese rohen Mischungen komplex
und in ihrer Zusammensetzung variabel. Infolgedessen kann das diagnostische
Potential dieser Extrakte unterschiedlich sein und zur Erzeugung falsch
negativer Ergebnisse führen.
Letztere wurden vor allem der Instabilität von Allergenen in Extrakten
zugeschrieben. Ein weiterer Nachteil der Verwendung von Extrakten
zur Diagnostizierung von Allergien ist die schlechte Standardisierung
von im Handel erhältlichen
Produkten im Hinblick auf ihre allergene Zusammensetzung. Einheiten,
die die Stärken
ausdrücken,
und die Methoden der Berechnung sind für jede Firma auf dem Markt
verschieden. Infolgedessen sind die diagnostischen Produkte verschiedener
Firmen kaum vergleichbar.
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Die
wichtigsten krankheitsbezogenen Komponenten, die Haupt-Allergene, wurden
im Laufe der letzten Jahrzehnte identifiziert, doch wird ihre Quantifizierung
nicht als Basis für
die Standardisierung von Allergen-Extrakten verwendet. Monoklonale
Antikörper
gegen die meisten der Haupt-Allergene sind jetzt verfügbar.
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Das
Testen auf Allergien gemäß bekannter
Verfahren ist kein geradliniges Verfahren. Diese Verfahren können nützliche
Vorgangsweisen sein, wenn eine Anamnese gemacht wird, um festzustellen,
welche Tests am geeignetsten wären.
Es gibt jedoch nur sehr wenige anerkannte medizinische Tests, mit
welchen Allergien identifiziert werden können, und im Allgemeinen sind
diese auf klinische Labors oder Spezialisten-Zentren beschränkt. Obgleich
die Diagnose einer Atopie oder einer Allergie durch einen qualifizierten
Arzt oder Allergie-Spezialisten relativ leicht durchführbar ist,
sind oft weitere Tests notwendig, um dies zu bestätigen.
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Es
gibt verschiedene Arten von Allergie-Tests:
- 1) „Skin Prick"-Testen
Vermutete
Allergene werden direkt unter die Hautoberfläche injiziert, und die Reaktion
wird von einer qualifizierten Krankenschwester oder einem Arzt beobachtet.
Während
sich die Reaktion entwickelt, gibt es eine Rötungszone, und je stärker die
Reaktion, desto größer ist
die Zone. Das Haut-Testen ist ziemlich empfindlich, obwohl nicht
alle Allergien mit dieser Methode identifiziert werden können.
- 2) Testen mit einem Pflaster („Patch"-Testen)
Das Patch-Testen kann
bei Fällen
von Kontakt-Dermatitis nützlich
sein. Die Testsubstanzen werden gewöhnlich auf die von einem Pflaster
bedeckte Haut aufgetragen und 48 Stunden dort belassen. Eine positive
Reaktion erzeugt eine kleine Ekzem-Fläche. Wiederum wird die Reaktion
von einer qualifizierten Krankenschwester oder einem Arzt beobachtet.
- 3) Alternatives Allergie-Testen
Es gibt viele alternative
Arten von Allergie-Tests, und leider sind nur wenige genau oder
von der Medizin anerkannt. Diese alternativen Tests sind oft irreführend und
auch kostspielig.
- 4) Vega-Test
Der Vega-Test ist ein elektrischer Test, der
als bioenergetisch regulierende Technik beschrieben wird. Die Maschine
misst die Leitfähigkeit
mit einem Wheatstone-Kreis. Elektroden werden mit Akupunktur-Punkten verbunden
oder in der Hand des Patienten gehalten. Verschiedene Lösungen werden
dann in eine Metall-Tasse gegeben. Die Maschine wird dann geeicht,
indem eine Glasphiole, die eine toxische Substanz enthält, in die
Tasse gegeben wird. Die Phiole bewirkt eine Verringerung der elektrischen
Leitfähigkeit.
Es werden dann andere Substanzen in die Tasse gegeben, und wenn
sie eine ähnliche
Ablesung ergeben, wird dies als allergische oder „sensible" Reaktion berichtet.
Diese Technik ist in Geschäften
für gesunde Nahrungsmittel
in weit verbreiteter Verwendung, ihr Wert ist jedoch unbewiesen,
und es gibt keine gültigen Versuche,
welche die Behauptungen untermauern.
- 5) Leukozytotoxischer Test
Beim leukozytotoxischen Test
werden die weißen
Blutkörperchen
des Patienten mit einem Extrakt eines speziellen Nahrungsmittels
gemischt, und danach werden die Zellen auf verschiedene Weisen gemessen, um
einen Nachweis für
irgendeine Art der Ver änderung
zu finden. Es gibt eine große
Anzahl falsch positiver und falsch negativer Reaktionen, und die
American Academy of Allergy kam zum Schluss, dass es keinen Beweis
dafür gibt,
dass der Test für
die Diagnose von Nahrungsmittel- oder Inhalationsallergie wirksam
ist.
- 6) Haaranalyse
Eine weitere Form von Test ist die Haaranalyse.
Das Haar kann auf das Vorhandensein toxischer Metalle, wie Blei,
Quecksilber und Cadmium oder geringe Mengen Selen, Zink, Chrom,
Mangan und Magnesium analysiert werden. In der Gerichtsmedizin ist
die Schwermetallvergiftung wohl anerkannt und dokumentiert, und
die Haaranalyse kann eine Einwirkung von Metallen aufzeigen. Die
Haaranalyse als Mittel zur Diagnostizierung einer Allergie durch
Methoden wie „Rutengehen" wurde jedoch niemals
für gültig erklärt.
- 7) Angewandte Kinesiologie
Proben von Nahrungsmittel werden
unter die Zunge gegeben oder in einem Glasbehälter in der Hand des Patienten
gehalten. Der Patient wird dann gebeten, seinen freien Arm gegen
den des Prüfers
zu stoßen. Wenn
eine allergische Reaktion nachgewiesen wird, so manifestiert sich
dies als eine verringerte Muskelreaktion, und es fällt dem
Patienten schwer, den Arm zu heben. Diese Technik hält einer
Doppelblind-Untersuchung nicht stand.
- Weiters gibt es verschiedene in vitro-Methoden zur Diagnostizierung
von Allergien, welche das Vorhandensein von IgE- oder IgG-Antikörpern im
Blut eines Patienten nachweisen:
- 8) Herkömmliche
Methoden, wie ELISA oder Western Blots werden verwendet, um im Serum
eines Patienten vorhandene Antikörper
(IgE) mit Hilfe (rekombinanter) Allergene nachzuweisen.
- 9) Radio-Allergo-Sorbens-Test (RAST®):
Bei
dieser Vorgangsweise wird ein spezifisches Allergen mit einer Papier-Scheibe
gekoppelt; immunspezifisches IgE, soferne es im Test-Serum (des
Patienten) vorhanden ist, wird an die Scheibe binden; die Detektion
erfolgt mittels radioaktiv markiertem anti-IgE. Verschiedene Bewertungssysteme,
die die Testergebnisse mit der absoluten Bindung einer negativen
Kontrolle vergleichen, sind in Verwendung. Im Allgemeinen folgt
auf die modifizierte RAST®-Vorgangsweise eine Inkubation über Nacht
und führt
zu größerer Empfindlichkeit.
- 10) Quantitative IgE-Inhibierungs-Versuche auf RAST-Basis bei
welchen Allergen-Extrakt auf Nitrozellulose-Streifen punktförmig aufgetragen
wird. Aliquots der Seren werden mit einer Mischung aus spezifischen rekombinanten
Allergenen vorinkubiert, wonach diese Mischung auf den Nitrozellulose-Streifen
inkubiert wird. Gebundenes IgE wird mit anti-human-IgE-Antikörpern nachgewiesen.
In einem letzten Schritt wird der Prozentsatz der Hemmung der IgE-Bindung
der natürlichen
Extrakte nach einer Präabsorption
mit rekombinanten Allergenen berechnet.
- 11) Zellulärer
Antigen-Stimulations-Test (CAST), gemäß welchem basophile Zellen
des Patienten mit Interleukin-3 und Allergen stimuliert werden,
gefolgt von einer Messung der de novo erzeugten und freigesetzten Sulfidoleukotrien
(SLT) in einem ELISA.
- 12) UniCAP: Rekombinante Allergene werden auf einer Festphasen-Struktur
immobilisiert, wonach die Bindung von im Serum eines Patienten vorhandenen
Antikörpern
gegen die Allergene nachgewiesen wird.
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Diese
Verfahren erfordern jedoch eine Vielzahl einzelner Versuchsschritte,
um eine größere Anzahl (z.B.
100) verschiedene Allergene zu testen. Weiters zeigen diese oben
erwähnten
Tests keine ausreichend hohe Empfindlichkeit und Verlässlichkeit
auf und sind sehr zeitaufwändig.
Auch sind die Mengen an Probe (z.B. Serum eines Patienten) sowie
an gereinigten, gegebenenfalls rekombinanten, teuren Allergenen,
die benötigt werden,
um diese Tests durchzuführen,
groß.
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Die
US 4,444,879 betrifft Verfahren
und Vorrichtungen für
Immunoassays zur Bestimmung des gesamten Immunglobulins und IgE.
Hier werden Allergene extrahiert und in Polymer-beschichteten Vertiefungen
einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Die zu analysierende Probe
wird dann in die Vertiefung gegeben, und ein herkömmlicher
Immunoassay wird durchgeführt.
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In
der
EP 0 556 745 A1 wird
ein Verfahren zum Nachweis von Anti-Weizen-Protein-IgE-Antikörpern in Körperflüssigkeiten
beschrieben, wobei ein Weizenallergen-Extrakt an einer festen Phase
immobilisiert wird, die z.B. chromatographisches oder Kapillar-Material
oder Faser, Glas, Nylon, Zellulose oder Derivate davon in Form von
Glaskügelchen,
Mikropartikel, Blätter
oder Vertiefungen einer Mikrotiterplatte sind. Auch hier wird ein herkömmlicher
Immunoassay durchgeführt,
um Antikörper
in einer Probe eines Patienten nachzuweisen.
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Die
US 3 720 760 betrifft ein
Verfahren zum Analysieren einer Körperflüssigkeit auf Immunglobuline. Auch
hier werden Allergen-hältige
Extrakte, die im Handel erhältlich
sind, an einem wasserunlöslichen
Polymer befestigt, wonach ein herkömmlicher Immunoassay durchgeführt wird.
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Die
US 4 849 337 betrifft ebenfalls
ein Verfahren zum Identifizieren Allergen-spezifischer IgE-Mengen in
einem Patienten-Serum durch Konjugieren des IgEs im Serum mit Allergenen,
die an einem unlöslichen
Träger
anhaften. Hier kann wiederum das Allergen ein Extrakt oder ein direkt
von Pollen, Stäuben,
Tieren etc. stammendes Allergen sein.
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Die
Detektion Allergen-spezifischer Immunglobuline mittels ELISA mit
Extrakten von Allergenen, die an eine feste Oberfläche gebunden
sind, ist in der
US
4 444 879 A und in der
EP 0 556 745 A geoffenbart. Mendoza et al.
(Biotechniques 27(4) (1999) beschreiben einen ELISA auf Microarray-Basis
mit hohem Durchsatz.
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Diese
herkömmlichen
Immunoassay-Methoden sind jedoch nicht dazu geeignet, einen Patienten
auf das Vorliegen von Allergien zu testen, da die Menge der verschiedenen
Allergien auf über
ein paar Hundert angestiegen ist und ständig zunimmt. Die zum Analysieren
eines Patienten-Serums auf alle möglichen und seltenen Allergien
notwendige Zeit und Arbeit sind zu viel und werden nicht in Labors
durchgeführt,
in welchen täglich
die Proben von ein paar hundert Patienten analysiert werden müssen.
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Daher
ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Detektion
eines Immunglobulins vorzusehen, welches an ein Allergen in einer
Probe bindet, welches Verfahren die oben erwähnten Nachteile nicht aufweist
und welches in einer kurzen Zeit mit einer nur geringen Menge an
Probe und Allergenen durchgeführt
werden kann, sehr verlässlich
und empfindlich ist und, was von höchster Wichtigkeit ist, die
Detektion einer praktisch unbegrenzten Zahl von Allergenen in einem
einzigen Test ermöglicht.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur
in vitro-Diagnose von Allergien bei einem Patienten ohne die oben
erwähnten
Nachteile vorzusehen.
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Das
oben erwähnte
Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere gereinigte
Allergene auf einem Microarray-Chip immobilisiert werden, wonach
die Probe mit den immobilisierten Allergenen inkubiert wird, so
dass Immunglobuline, die für
die Allergene spezifisch sind, an das spezifische Allergen binden, wonach
die Immunglobuline, die an die spezifischen immobilisierten Allergene
gebunden sind, detektiert werden.
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Microarrays
wurden in jüngster
Zeit für
eine Anzahl von DNA-Manipulationstechniken
verwendet, die seit langem unter den Wissenschaftern etabliert sind.
Diese DNA-Chips sind in einer Anzahl verschiedener Formate verfügbar geworden
und werden letztendlich die Art und Weise, in welcher Versuche in
der üblichen Laborarbeit
entworfen werden, verändern.
Die in vitro-DNA-Diagnose
ist weniger zeit- und arbeitsaufwändig geworden, da diese neue
Technologie eine Test-Komplexität
bei hohem Durchsatz ermöglicht.
Infolgedessen werden auf dem Gebiet der Proteom-Forschung klassische
Festphasen-Substrate, wie Mikrotiter-Platten, Membran-Filter und
Mikroskop-Objektträger
in das Microarray-Format
mit hoher Dichte übergeführt. Die
neue und vielseitige Protein-Array-Technologie ermöglicht letztendlich
ein Screenen auf Gen-Expression und molekulare Wechselwirkungen
mit hohem Durchsatz (Walter et al., Curr. Opin. Microbiol. 2000
Jun; 3(3): 298–302; Emili & Cagney, Nat.
Biotechnol. 2000 Apr; 18(4) 393–7).
Kürzlich
wurde das Konzept der Protein-Arrays zur Verwendung bei immunologischen
Tests angenommen.
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Ein
Biochip wird als fähig
beschrieben, gemultiplexte Enzymverbundene Immunosorbens-Tests (ELISAs)
mit hohem Durchsatz (high throughput, HT) ermöglichen zu können. Diese
Biochips können
beispielsweise aus einer optisch flachen Glasplatte bestehen, die
96 Vertiefungen enthält,
die durch eine umschließende
hydrophobe Teflon-Maske gebildet werden, jedoch sind auch andere
Materialien und Formen von Biochips bekannt und in Verwendung. Versuche
zeigen, dass die spezifische Multiplex-Detektion von Protein-Antigenen,
die auf einem Glas-Substrat in Reihen angeordnet („arrayed") sind, möglich ist.
Eine weitere Anwendung dieses neuen Hochdurchsatz-Screening(HTS)-Formats
umfasst die direkte zelluläre
Protein-Expressions-Profilierung, gemultiplexte Tests zur Detektion
infektiöser
Agentien und die Krebs-Diagnostik (Mendoza LG et al., Biotechniques
1999 Oct; 27 (4): 778–80).
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Bei
diesen bekannten Microarray-Chip-Methoden zum Testen von Proteinen
sind jedoch die Antikörper
am Microarray-Chip immobilisiert. Überraschenderweise zeigte es
sich, dass es möglich ist,
nicht nur die Antikörper
an den Microarray-Chip zu binden, sondern sogar Allergene, die die
den spezifischen Antikörpern entsprechenden
Antigene sind, insbesondere IgE bzw. IgG. Diese Tatsache ist besonders überraschend,
da funktionelle Allergene eine besondere Sekundärstruktur aufweisen, die bei
Bindung in so hoher Dichte an eine feste Phase, wie den Microarray-Chip,
modifiziert werden kann. Diese Modifikation der Struktur des Allergens würde die
Antikörper-Allergen-Bindung
stören,
was zu falsch negativen Ergebnissen führen würde. Antikörper, Fragmente von Antikörpern oder
Peptide sind relativ klein und weisen eine hohe Stabilität auf, daher
weisen Antikörper
in Lösung
in Bezug auf ihre verwandten Antigene eine größere Stabilität auf. Bei
Immobilisierung an einem festen Träger bleibt jedoch selbst im
Fall von Antikörpern
nur ein geringer Prozentsatz intakt und aktiv.
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Der
Artikel von Haab et al. (Genom Biology 2000, I (6): Vorausdruck
0001,1–0001,22),
welcher am 9. November 2000 erhalten wurde, betrifft Protein-Microarrays
zur Detektion und Quantifizierung von Proteinen und Antikörpern in
Lösungen.
Die Ergebnisse der gemäß dieser
Publikation durchgeführten
Analyse zeigen, dass nur 50% der angeordneten („arrayed") Antigene und 20% der angeordneten
Antikörper
spezifische und genaue Messungen der verwandten Allergene vorsahen.
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Außerdem ist
die Diversität
möglicher
Allergene natürlich
viel größer als
die Antikörper-Diversitäten im Hinblick
auf die Handhabung der Proteine, insbesondere für das Immobilisieren und Färben einer
solchen Serie strukturell diverser Allergene. Es zeigte sich jedoch überraschenderweise,
dass auf einem Microarray-Chip immobilisierte Allergene bei einem
Verfahren zur Detektion von Immunglobulinen in einer Probe sehr
verlässlich
und empfindlich sind.
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Dieses
Verfahren ermöglicht
die Durchführung
eines Tests auf eine Vielzahl von Immunglobulinen, die an ein spezifisches
Allergen binden, in (nur) einem Versuchsschritt, wobei der Test
auch atomisiert sein kann: Mehr als 100 verschiedene Allergene können getestet
werden, ohne eine Vielzahl einzelner Versuchsschritte durchführen zu
müssen,
wie es bei Durchführung
in herkömmlicher
Mikrotiter-Form der Fall ist. Weiters ist dieser Test hochgradig
empfindlich und verlässlich.
Auch können
die Testergebnisse dieses Verfahrens innerhalb einer kurzen Zeit
erhalten werden, z.B. etwa drei Stunden, wodurch die Test-Zeit im Vergleich
zu herkömmlichen
RAST- oder ELISA-Tests verkürzt
wird. Weiters ist der Microarray-Test sehr reproduzierbar bei der
Durchführung
repetitiver Versuche mit Chips, die Proben verschiedener Personen
enthalten, z.B. mit einer Mikrotiterplattenartigen Maske, wobei
jede Vertiefung eine Anzahl von Spots verschiedener Allergene umfasst
und eine Probe einer Person pro Vertiefung zugegeben wird. Ein weiterer
Vorteil dieses Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass eine große Anzahl
verschiedener Sonden eine relativ kleine Fläche einnimmt, wodurch eine
hohe Dichte vorgesehen wird. Der kleine Oberflächenbereich des Arrays ermöglicht extrem
einheitliche Bindungsbedingungen (Temperaturregulierung, Salzgehalt
usw.), wogegen die extrem große
Anzahl von Sonden ein massives Parallel-Prozessieren von Hybridisierungen
ermöglicht.
Da die Arrays mit hoher Dichte eine so große Anzahl von Sonden enthalten,
ist es möglich,
zahlreiche Kontrollen vorzusehen, einschließlich beispielsweise Kontrollen
für Variationen
oder Mutationen bei einem bestimmten Allergen, Kontrollen für Gesamt-Hybridisierungsbedingungen,
Kontrollen für
Proben-Zubereitungsbedingungen, und Fehlpassungs-Kontrollen („mismatch
controls") für nicht-spezifische
Bindung oder Kreuz-Hybridisierung.
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Weiters
erfordert der Test nur einen minimalen Bruchteil an Material (Allergen
sowie Probe) im Vergleich zu herkömmlichen Testsystemen. Dies
bedeutet, dass mit einer gleichen Menge an Ausgangsmaterial eine
viel größere Anzahl
von Test-Kits erzeugt werden kann, wenn die Microarray-Form verwendet
wird, und eine kleinere Menge an Probe zum Testen auf eine größere Menge
an Immunglobulinen, die an Allergene binden, verwendet werden kann.
In kleinen Volumina kann die Bindung auch sehr rasch stattfinden.
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Natürliche intakte „Immunglobuline" oder Antikörper weisen
ein allgemein Y-förmiges
tetrameres Molekül
mit einer Antigen-Bindungsstelle
am Ende jedes oberen Armes auf. Eine Antigen-Bindungsstelle besteht aus der variablen
Domäne
einer schweren Kette, die mit der variablen Domäne einer leichten Kette assoziiert ist.
Insbesondere besteht die Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers im
Wesentlichen aus den 3 CDRs (complementarity determining regions
(Komplementäritäts-bestimmenden
Regionen) der variablen Domäne einer
schweren Kette (V.sub.H) und den 3 CDRs der variablen Domäne der leichten
Kette (V.sub.L).
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Im
Allgemeinen bezieht sich der Ausdruck „Antigen" auf eine Substanz, die eine Immunantwort
hervorrufen kann, und gewöhnlich
ist dies auch die Substanz, die für die Detektion der korrespondierenden
Antikörper
mittels eines der vielen immunologischen in vitro- und in vivo-Verfahren,
die für
den Nachweis von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen
zur Verfügung
stehen, verwendet wird.
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In ähnlicher
Weise wird der Ausdruck „Allergen" verwendet, um ein
Antigen zu bezeichnen, das die Fähigkeit
zur Induktion von und Kombination mit spezifischen (d.h., IgE) Antikörpern hat,
die für
allgemeine Allergien verantwortlich sind; diese letztere Definition
schließt
jedoch nicht die Möglichkeit
aus, dass Allergene auch reaktive Antikörper induzieren können, die
Immunglobuline anderer Klassen als IgE mit einschließen können.
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„Immobilisieren" im Zusammenhang
mit Proteinen oder Peptiden bezieht sich auf die Bindung oder das
Anhaften des Proteins/Peptids an festen Trägern mit herkömmlichen
Mitteln, mit oder ohne einen zusätzlichen
Abstandhalter („spacer") zwischen dem festen
Träger
und dem Allergen. Das Immobilisieren von Peptiden/Proteinen an einem
Träger
ist auf dem Gebiet wohl bekannt; im Rahmen der vorliegenden Erfindung
ist jegliche Immobilisierung umfasst, z.B. kovalent, nicht-kovalent,
insbesondere durch hydrophobe Wechselwirkungen mit beispielsweise
Membranen bzw. synthetischen Oberflächen usw.
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Ein „Microarray" ist eine Anordnung
(„array") von Merkmalen (z.B. „Spots") mit einer Dichte
einzelner Merkmale von etwa 16/cm2, vorzugsweise
mindestens etwa 64/cm2, noch mehr bevorzugt
etwa 96/cm2, und am meisten bevorzugt etwa
1000/cm2. Die Merkmale in einem Microarray
haben typische Dimensionen, z.B. Durchmesser, im Bereich von zwischen
etwa 10–2000 μm, vorzugsweise
etwa 50–500 μm, noch mehr
bevorzugt etwa 150–250 μm, und sind
von anderen Merkmalen im Array durch etwa den gleichen Abstand getrennt. Daher
kann ein erfindungsgemäßer Microarray
zur Verwendung für
routinemäßige Massen-Screenings
mindestens 500, vorzugsweise mindestens 1000 einzelne Spots aufweisen,
die Allergene, Standards und Kontrollen umfassen.
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Der „Chip" gemäß der vorliegenden
Erfindung kann praktisch jegliche Form haben, z.B. ein Objektträger oder
eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte sein, oder sogar eine Vielzahl
von Oberflächen,
obwohl eine plane Array-Oberfläche
bevorzugt ist.
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Der
Detektionsschritt kann mit jedem herkömmlichen Verfahren, das dem
Fachmann bekannt ist, durchgeführt
werden, z.B. mittels physikalischer, enzymatischer, chemischer Reaktion
usw..
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden IgEs als Immunglobuline detektiert.
IgE ist als Substanz bekannt, die allergische Reaktionen bewirkt
und nur erzeugt wird, wenn eine Person gegen eine Substanz sensibilisiert
wird, d.h. eine Allergie hat. Daher wird, um zu testen, ob die Probe
von einem Patienten stammt, der gegen das spezifische Allergen allergisch
ist, die Probe auf IgE als Immunglobuline getestet. Je höher die
Menge an IgE in der Probe, desto wahrscheinlicher ist der Patient,
von dem die Probe entnommen wurde, allergisch auf das spezifische
Allergen.
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Vorzugsweise
werden IgG als Immunglobuline nachgewiesen. Es ist bekannt, dass
IgG in der Probe eines Patienten, der auf Nahrungsmittel allergisch
ist, vorhanden ist, daher kann der Nachweis von IgG als Anzeichen
für eine
Nahrungsmittel-Unverträglichkeit
verwendet werden.
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Vorteilhaft
werden ein oder mehrere gereinigte Allergene auf dem Microarray-Chip
immobilisiert. Diese – einzelnen – Allergene
sind beispielsweise aus einem Allergen-Extrakt, z.B. aus einem spezifischen
Nahrungsmittel oder Pflanzen, gereinigt. Natürlich können ein oder mehrere Allergene
einer spezifischen Spezies auf einmal analysiert werden.
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Die
Reinigungsverfahren sind dem Fachmann bekannt, z.B. chromatographische
Reinigung, Reinigung mittels Massentrennung, Reinigung durch spezifische
Bindung des Allergens an eine feste Phase, z.B. über einen Antikörper, usw..
Die Anwendung hoch gereinigter Allergene für die Massenproduktion von
Allergie-Tests wurde bisher noch nicht vorgeschlagen.
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„Gereinigte" Allergene bezieht
sich – im
Gegensatz zu Extrakten – auf
einzelne Allergene, die beispielsweise native, rekombinante oder
synthetisch erzeugte Allergene sein können. Diese gereinigten Allergene
weisen bei der Immobilisation an einem festen Träger eine Anzahl wichtiger Vorteile
gegenüber
einem Allergen-Extrakt auf: Infolge der Mischung verschiedener Proteine,
die in jedem Extrakt vorhanden sind, ist die Konzentration der zu
testenden Allergene sehr gering im Vergleich zu gereinigten Einzelallergen-Präparaten. Gereinigte
einzelne Allergene können
daher auf dem Microarray in sehr hoher Kon zentration immobilisiert
werden. Infolge der exakten und definierten Moleküle, die
in einem gereinigte Allergene aufweisenden Präparat vorhanden sind, werden
nur definierte Allergene am Microarray immobilisiert. Daher kann
der Microarray und das Verfahren zur Detektion von Antikörpern mit
Hilfe gereinigter Allergene standardisiert und genauen Qualitätskontrollen
unterzogen werden.
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Weiters
sind die Allergene infolge der hohen Konzentration gereinigter Allergene
in der Zusammensetzung in einer größeren Dichte am Microarray
immobilisiert, und daher ist jedes Detektionsverfahren mit Hilfe eines
solchen Microarrays empfindlicher als entsprechende Microarrays
mit Extrakten, die Allergene umfassen. Ein weiterer Vorteil gereinigter
einzelner Allergene gegenüber
Allergen-Extrakten liegt in der Tatsache, dass die immobilisierten
gereinigten Allergene genau definiert sind. Im Gegensatz zu gereinigten
Allergenen umfassen Allergen-Extrakte beispielsweise zwei, drei
oder mehr verschiedene Allergene eines Organismus oder Objekts.
Beispielsweise umfasst im Falle eines Apfels ein Extrakt eine Mischung
von verschiedenen Apfel-Allergenen, wogegen die erfindungsgemäße Zusammensetzung
eines der gereinigten Apfel-Allergene oder – je nach Verwendung – eine definierte
Mischung aus zwei oder mehreren Apfel- oder anderen Allergenen aufweist.
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Ein
weiterer Vorteil gereinigter Allergene gegenüber nicht-gereinigten Allergenen, die beispielsweise in
einem Extrakt vorhanden sind, liegt darin, dass wegen der zusätzlichen
Verunreinigungen, die im Extrakt vorhanden sind, der Extrakt nicht
länger
als eine bestimmte Zeit lang stabil ist und beispielsweise schimmelig werden
kann. Das beeinflusst jedoch den Nachweis von Allergien, da es auch
Allergien gegen Schimmelpilz gibt, in welchem Fall es zu einem falsch
positiven Resultat kommen würde.
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Weiters
sind die Extrakte infolge des Vorhandenseins von Proteasen im Extrakt
instabil, was bei gereinigten Allergenen nicht der Fall ist.
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Außerdem wäre infolge
der derzeit bestehenden Therapien mit Hilfe gereinigter Allergene
eine Diagnose mit den selben gereinigten Allergen-Komponenten ein
großer
Vorteil gegenüber
einer Diagnose mit ungereinigten Allergenen. Solche Diagnosen sind
besonders vorteilhaft, um die Therapie mit gereinigten Al lergenen
zu befolgen und um die individuelle Reaktion auf eine spezifische
Therapie zu testen und dadurch eine „auf den Patienten zugeschnittene" Therapie vorzusehen.
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Aus
den obigen Gründen
ist ein Verfahren zur Detektion eines Immunglobulins, das an das
Allergen in einer Probe bindet, wobei ein oder mehrere gereinigte
Allergene am Microarray-Chip immobilisiert sind, besonders vorteilhaft.
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Vorzugsweise
sind ein oder mehrere rekombinante Allergene am Microarray-Chip
immobilisiert. Im Laufe der letzten paar Jahre wurde eine Anzahl
rekombinanter Allergene erzeugt. Die Produktion rekombinanter Allergene
gehört
im Prinzip auch zum Stand der Technik, hatte jedoch nur wenig Einfluss
auf routinemäßige Allergie-Tests.
Durch die Verwendung rekombinanter Allergene ist es möglich, eine
große
Anzahl eines oder mehrerer spezifischer Allergene vorzusehen und
daher die Empfindlichkeit des Tests zu optimieren. Es ist weiters
möglich,
die rekombinanten Allergene spezifisch zu modifizieren, um irgendwelche
Allergen-Mutationen zu erzeugen, um spezifische Immunglobuline nachzuweisen.
Weiters bietet die Benützung
der Haupt-Allergene als rekombinante Proteine eine Alternative zu
Tests auf Extrakt-Basis im Hinblick auf die Test-Stabilität sowie
auf die diagnostische Standardisierung. Die oben erwähnten Vorteile
gereinigter Allergene gegenüber
den ungereinigten (Extrakt-)Allergenen treffen sogar noch mehr für rekombinante
Allergene zu als für
gereinigte native Allergene: Rekombinante Allergene können noch
spezifischer entworfen werden als die gereinigten nativen Allergene,
und daher ist es möglich,
die Affinität
und Spezifität
eines Tests mit rekombinanten Allergenen zu optimieren. Rekombinante
Allergene sind auch hinsichtlich ihres Herstellungsverfahrens besser
standardisierbar. Außerdem
sind Unterschiede zwischen Produktions-Lots geringer bei rekombinanten Allergenen
als bei Allergenen, die aus natürlichen
Quellen stammen. Überraschenderweise
zeigte es sich bei der vorliegenden Erfindung, dass die Verwendung
dieser rekombinanten Allergene in den routinemäßigen in vitro-Diagnosetests gemäß der vorliegenden
Erfindung herkömmlichen
Test-Systemen auf Extrakt-Basis überlegen
ist. Im Gegensatz zu den routinemäßigen Serien-Tests gemäß dem Stand
der Technik bringt das vorliegende Allergen-Testen unter Verwendung
auch rekombinanter Allergene für
Standard-Allergen-Tests eine völlig
neue Qualität
in Bezug auf die Standardisierung, Steuerbarkeit, Empfindlichkeit,
Reproduzierbarkeit, die Möglichkeit,
auf diagnostisch relevante Informationen zu testen, usw..
-
Rekombinante
Allergene sind beispielsweise jene, die in den Publikationen von
Chapman et al., Allergy, 52: 374–379 (1997), Laffer et al.
J. Allergy Clin. Immunol. Bd. 98 Nummer 2, 652–658 (1996), Müller et
al. Clinical and Experimental Allergy Bd. 27 9. 915–920 (1997),
Niederberger et al. J. Allergy Clin. Immunol. Bd. 102 Nummer 4,
Teil 1 579–591
(1998), Menz et al. Clinical and Experimental Allergy Bd. 26, 50–60 (1996),
welche durch Bezugnahme hierin mit eingeschlossen sind. Weitere
Beispiele für
(rekombinante) Allergene sind, ohne auf diese eingeschränkt zu sein,
rBetv1, rBetv2, rBetv4, rJunO2, Cass1, rPhlp1, rPhlp2, rPhlp4, rPhlp5a, rPhlp6,
rPhlp7, rPhlp11, rPhlp12, rParj2, Art-v1a, Beifuß-(„mugwort")Profilin, Apig1, Apig1.0201, Dauc1.2, rArah2,
rArah5, Mald1, Mald2, rPena1, recCarp, rDerp1, rDerp2.0101, rDerp2,
rDerp2b, rDerp5, rDerp5a, rDerp7, rDerp8, rDerp10, rTyrp2, rLepd2.01,
rLepd13, rEurm2.0101, rFeld1, rFeld1a, rBosd2, ein repräsentatives
Allergen der Katze, ein repräsentatives
Allergen vom Hund, ein repräsentatives
Allergen von BSA, ein repräsentatives
Allergen. der Maus, ein repräsentatives
Allergen der Ratte, ein repräsentatives
Allergen vom Schwein, ein repräsentatives
Allergen vom Schaf, ein repräsentatives
Allergen vom Huhn, ein repräsentatives Allergen
vom Kaninchen, ein repräsentatives
Allergen vom Hamster, ein repräsentatives
Allergen vom Pferd, ein repräsentatives
Allergen der Taube, ein repräsentatives
Allergen von Guinea-Albumin, HSA, a-NAC, rPenc3, Penn13, rPenc19a,
rPenc19b, rAspf1, rAspf1a, rAspf3, rAspf3a, rAspf4, rAspf4a, rAspf6,
rAspf6a, rAspf7, rAspf8, rAlta1, rAlta2, rMalf1, rMalf5, rMalf6,
rMalf7, rMalf8, rMalf9, rHevb1, rHevb1a, rHevb3, rHevb8, rHevb9,
rHevb10, rHevb11, rAK, rBlag2, rBlag4, rBlag5, Phospholipase A,
Hyaluronidase, rVesv5, rVesg5.
-
Gemäß einer
weiteren vorteilhaften Ausführungsform
werden ein oder mehrere synthetisch hergestellte Allergene auf dem
Microarray-Chip immobilisiert. Hier gelten wiederum dieselben Vorteile
gegenüber
einem Allergen-Extrakt und auch gegenüber gereinigten nativen Allergenen,
wie oben für
rekombinante Allergene erwähnt.
Das Verfahren zur synthetischen Erzeugung von Peptiden oder Proteinen
ist im Stand der Technik wohl bekannt; durch synthetische Erzeugung
von Allergenen ist es möglich, hoch-reine
Allergene in großer
Anzahl und mit geringen Kosten vorzusehen, da solche Produktionsmethoden
hoch automatisiert sind. Weiters kann die genaue Sequenz jedes Allergens
mit oder ohne Modifikationen vorgesehen werden, was die Empfindlichkeit
und Verlässlichkeit
des Verfahrens zur Detektion der Immunglobuline erhöht.
-
Es
ist auch möglich,
nur die allergene Determinante oder die allergene Domäne eines
spezifischen Allergens beim Test gemäß der vorliegenden Erfindung
zu verwenden. Damit können
die Risiken und Nachteile des Arbeitens mit großen Proteinen eliminiert werden,
weil kürzere
Peptid-Strukturen für
die routinemäßige Erzeugung
von Biochips leichter zu handhaben sind. Dies gilt für alle gereinigten
nativen, rekombinanten und synthetischen Allergene. Dies würde es weiter
ermöglichen,
einzelne Peptid-Epitope nachzuweisen, was den diagnostischen Test
und Therapien, insbesondere im Hinblick auf die Spezifität, noch
weiter verbessern würde.
-
Es
ist von besonderem Vorteil, die native Form des Allergens sowie
eine synthetische oder rekombinante Form des Allergens am selben
Chip vorzusehen. Während
es bevorzugt ist, hauptsächlich
rekombinante oder synthetische Allergene zu verwenden, kann die
native Form eines Allergens zumindest als Kontrolle oder als zusätzliche
Qualitätsinformation
auf dem Chip vorgesehen werden. Ein bevorzugter Chip gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst daher eine native und eine synthetische oder rekombinante
Form mindestens eines Allergens. Dies ergibt auch eine verbesserte
Qualitätskontrolle
und Standardisierung verschiedener Chargen von Allergenen.
-
Vorzugsweise
sind ein oder mehrere Haptene als Allergene auf dem Microarray-Chip
immobilisiert. Ein „Hapten" ist eine Substanz
mit niedrigem Molekulargewicht (die typischerweise weniger als etwa
7000 Dalton wiegt), die im Allgemeinen selbst keine signifikante
Produktion von Antikörpern
bei Verabreichung an den Körper
eines Tieres, einschließlich
an den Körper
eines Menschen, bewirken kann. Dies kann deshalb so sein, weil ein
Hapten zu klein ist, um vom Immunsystem des Körpers erkannt zu werden. Wenn
jedoch ein Hapten an ein größeres, ein
Träger-Molekül gekoppelt
wird, kann das Hapten antigene Eigenschaften erwerben. Anders gesagt,
das Binden des Haptens an das Trägermolekül (zur Herstellung
einer Analyten-Trägermolekül-Kombination)
ermöglicht es,
dass das gebundene Hapten vom Immunsystem eines Tieres erkannt wird. Eine
Immunpräzipitations-Reaktion
kann zwischen dem (an das Trägermolekül gekoppelten)
Hapten und einem Antikörper
gegen das Hapten stattfinden. Durch das Vorsehen von Haptenen, die
auf dem Microarray-Chip immobilisiert sind, kann eine höhere Dichte
am Chip erreicht werden.
-
Es
ist natürlich
möglich,
diese oben erwähnten
unterschiedlichen Formen von Allergenen zu kombinieren, z.B. gleichzeitig
rekombinante und (gereinigte) native Allergene zu verwenden. Die
Kombination dieser verschiedenen Formen ermöglicht es, sie zu vergleichen
und eine Kontrolle der z.B. rekombinanten Allergene durchzuführen, aber
auch als Kontrolle für
die verschiedenen nativen Lots der Allergene, die infolge von Unterschieden
in den biologischen Quellen, Herstellungsmethoden, Reinheit usw.,
verschieden sein können.
-
Für einen
hoch-effizienten Test ist es bevorzugt, Allergene zu verwenden,
die optimale Merkmale, z.B. eine hohe Bindungskapazität, aufweisen.
Die Verwendung weniger oder anders aktiver Antigene ist jedoch für die Detektion
ineffizient bindender Allergen-Varianten, z.B. für die Verwendung bei Hyposensibilisierungstherapien,
bevorzugt.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden die Allergene auf einem Spot mit
10 bis 2000 μm
Durchmesser, vorzugsweise mit 50–500 μm-Durchmesser, noch mehr bevorzugt mit
150–250 μm-Durchmesser,
am Microarray-Chip immobilisiert. Da die Spots einen kleinen Durchmesser
haben, ist es möglich,
eine große
Anzahl verschiedener Allergene und verschiedene Konzentrationen
spezifischer Allergene auf separaten Spots des Microarray-Chips
zu immobilisieren, womit das Vorsehen eines Microarray-Chips ermöglicht wird,
der in einem – automatisierten – Schritt
zum Analysieren einer großen
Anzahl von Allergenen oder Allergen-Konzentrationen verwendet werden
kann.
-
Vorzugsweise
werden die Allergene auf einem festen Träger, vorzugsweise einem Glas-Träger, einem Kunststoffträger, einem
Siliziumplättchen
bzw. einer Membran immobilisiert. Solche Chips können beispielsweise gemäß Verfahren
hergestellt werden, die in Ge, H. (2000), Nucleic Acids Research,
28, e3 (i-vii); Qian W. et al. (2000), Clinical Chemistry, 46 (1456–1463);
MacBeath G. et al. (2000), Science, 289, (1760–1763) beschrieben sind, welche
durch Hinweis darauf hierin mit eingeschlossen sind. Jedes dieser
Materialien weist spezifische Charakteristika und Vorteile auf,
die dem Fachmann wohl bekannt sind. Daher wird das Material für den Microarray-Chip
gemäß dem zu
testenden Allergen, dem Verfahren für die Detektion der gebundenen Immunglobuline,
den verwendeten Puffern gewählt
werden. Weiters ist die Wahl des Materials auch eine finanzielle
Frage.
-
Vorzugsweise
wird der Microarray-Chip chemisch modifiziert, vorzugsweise durch
eine Amino-reaktive bzw. Carboxy-reaktive Modifizierung. Dadurch
wird es möglich,
die Art, in welcher das Allergen an den Microarray-Chip gebunden
ist, genau zu bestimmen.
-
Vorteilhaft
werden die Allergene kovalent an den Microarray-Chip gebunden. Dies sieht eine stabile Bindung
der Allergene an den Microarray-Chip vor, wobei ein Verfahren vorgesehen
wird, welches besonders verlässlich
ist.
-
Gemäß einer
anderen vorteilhaften Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden die Immunglobuline in Blutserum
als Probe detektiert. Bei Patienten, die gegen ein Allergen allergisch
sind, werden Immunglobuline hauptsächlich im Blutserum erzeugt,
so dass das Analysieren des Blutserums ein verlässliches Verfahren zur Detektion
von Immunglobulinen vorsieht. Weiters kann Blutserum leicht dem
Patienten auf sehr einfache Weise entnommen werden, und die Entnahme
der Probe kann sogar beim Patienten daheim durchgeführt werden.
-
Vorzugsweise
wird das Blutserum 1:1–1:15,
vorzugsweise 1:5, verdünnt.
Die Verdünnung
kann mit jeder geeigneten Lösung,
z.B. 1 × TBST
(10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% TWEEN 20) durchgeführt werden.
-
Vorteilhaft
wird die Probe mit den Allergenen 1 min bis 29 Stunden, vorzugsweise
1 bis 2 Stunden lang, inkubiert. Natürlich ist es möglich, die
Probe mit den Allergenen selbst über
einen Zeitraum von Tagen zu inkubieren. Dies führt jedoch zu keiner Steigerung
der Signalintensität
oder -spezifität.
Im Allgemeinen reicht eine Inkubationszeit von 1 Stunde für ein verlässliches
und empfindliches Ergebnis aus.
-
Weiters
wird die Probe vorzugsweise mit den Allergenen bei einer Temperatur
zwischen 0 und 60°C, vorzugsweise
bei 37°C
inkubiert. Inkubationen bei niedrigeren Temperaturen führen zu
keiner Signalsteigerung, sondern sie führen eher zu einer Zunahme
von unspezifischer Bindung und Hintergrundgeräusch. Es zeigte sich, dass
eine Inkubation bei 37°C
exakte und verlässliche
Ergebnisse für
Allergen-Tests bei Menschen vorsieht.
-
Vorteilhaft
wird das gebundene Immunglobulin mit zumindest einem markierten,
spezifischen anti-Immunglobulin-Antikörper detektiert. Wie hierin
verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Antikörper" auf intakte Moleküle sowie Fragmente davon, wie
Fa, F(ab).sub.2 und Fv, die die Epitop-Determinante binden können. Antikörper können unter
Verwendung von intakten Polypeptiden oder von Fragmenten, die kleine
Peptide, an denen ein Interesse besteht, enthalten, als immunisierendes
Antigen hergestellt werden. Das Polypeptid oder Peptid, das zum
Immunisieren eines Tieres verwendet wird, kann vom Übergang
der RNA abgeleitet sein oder chemisch synthetisiert werden, und
es kann gewünschtenfalls
mit einem Träger-Protein
konjugiert sein. Allgemein verwendete Träger, die chemisch an Peptide
gekoppelt werden, umfassen Rinderserumalbumin und Thyroglobulin.
Das gekoppelte Peptid wird dann verwendet, um das Tier zu immunisieren
(z.B. eine Maus, eine Ratte oder ein Kaninchen).
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Antikörper" auf monoklonale
oder polyklonale Antikörper,
wobei monoklonale Antikörper
unter Verwendung jeder Technik, die die Erzeugung von Antikörper-Molekülen durch
kontinuierliche Zelllinien in Kultur vorsieht, hergestellt werden
können.
Zu diesen zählen,
ohne darauf eingeschränkt
zu sein, die Hybridom-Technik,
die humane B-Zellen-Hybridom-Technik und die IBV-Hybridom-Technik.
-
Weiters
können
chimäre
Antikörper,
Einzelketten-Antikörper
sowie synthetisch erzeugte Antikörper hergestellt
werden.
-
Der
Antikörper
kann gemäß jeder
bekannten Methode, die die Qualifizierung und vorzugsweise die Quantifizierung
des gebundenen Antikörpers
ermöglicht,
markiert werden. Detektierbare Markierungen, die zur Verwendung
bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, inkludieren jede Zusammensetzung,
die mit spektroskopischen, photochemischen, biochemischen, immunochemischen,
elektrischen, optischen oder chemischen Mitteln nachweisbar ist.
Zweckmäßige Markierungen
umfassen Biotin zur Färbung
mit markiertem Streptavidin-Konjugat, magnetische Kügelchen,
fluoreszierende Farben (z.B. Fluoreszein, Texas-Rot, Rhodamin, grün fluoreszierendes
Protein und dgl.), radioaktive Markierungen (z.B. 3H, 125I, 35S, 14C oder 32P), Enzyme (z.B.
Meerrettich-Per oxidase, alkalische Phosphatase und andere, die allgemein
in ELISA verwendet werden), und kolorimetrische Markierungen, wie
kolloidales Gold oder gefärbte
Glas- oder Plastik-(z.B. Polystyrol-, Polypropylen-Latex-, usw.)-Kügelchen.
-
Mittel
zur Detektion solcher Markierungen sind dem Fachmann bekannt. So
können
z.B. radioaktive Markierungen unter Verwendung von photographischem
Film oder Szintillationszählern
detektiert werden, fluoreszierende Markierungen können unter
Verwendung eines Photodetektors zur Detektion von emittiertem Licht
detektiert werden. Enzymatische Markierungen werden typischerweise
detektiert, indem das Enzym mit einem Substrat versehen wird und
das Reaktionsprodukt, das durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat erzeugt
wird, detektiert wird, und kolorimetrische Markierungen werden durch
einfaches Sichtbarmachen der gefärbten
Markierung detektiert.
-
Vorzugsweise
werden die gebundenen Immunglobuline mit zumindest einem Fluoreszenz-
bzw. radioaktiv markierten, spezifischen anti-Immunglobulin-Antikörper detektiert.
Dies sind klassische Methoden für die
qualitative und quantitative Analyse von gebundenem Antikörper, die
sehr spezifisch und verlässlich
sind.
-
Andere
vorteilhafte Detektionssysteme für
Microarrays sind z.B. jene, die in Schult K. et al. (1999), Anal.
Chem., 71 (5430–5435);
Vo-Dinh T. et al. (1999), Anal. Chem., 71 (358–363); Brignac SJ Jr. et al.
(1999), IEEE Eng. Med. Biol. Mag., 18 (120–122); Otamiri M. et al. (1999),
Int. J. Biol. Macromol., 26 (263–268); Wright, GL Jr. et al.
(2000), Prostate Cancer and Prostatic Diseases, 2 (264–276); Nelson
RW. et al. (2000), Electrophoresis 21 (1155–1163); Rich RL. et al. (2000),
Curr. Opin. Biotechnol. 11 (54–61);
Chen JJ. et al. (1998), Genomics, 51 (313–324), geoffenbart sind, welche
Publikationen unter Bezugnahme darauf hierin mit eingeschlossen
sind.
-
Vorteilhaft
werden ein oder mehrere Indoor-Allergene als Allergene immobilisiert.
Diese können
ohne Einschränkung
darauf Milben, Tyr. put, Lep. dest. oder .mayrei, Felis, Bos, Albumin,
Pen. cit., Pen. not., Asp. fumigatus, Alt. alt., Malassezia fur-fur, Latex, Plodia,
Blatella sein.
-
Gemäß einer
weiter bevorzugten Ausführungsform
werden ein oder mehrere Outdoor-Allergene als Allergene immobilisiert.
Diese können,
ohne Einschränkung
darauf, Betula, Juniperus, Phleum, Parietaria judicea sein.
-
Weiters
können
ein oder mehrere Nahrungsmittel-Allergene als Allergene immobilisiert
werden. Beispiele sind Sellerie, Karotte, Erdnuss, Apfel, Garnele,
Fisch.
-
Weiters
sind ein oder mehrere Gift-Allergene als Allergene immobilisiert.
Diese können,
ohne Einschränkung
darauf, Biene oder Wespe sein.
-
Auch
ein oder mehrere Auto-Allergene können als Allergene immobilisiert
werden. Solche Auto-Allergene können
z.B. Lebermembran-Antigene, ssDNA-Antigene, Antigene in oder auf
Skelettmuskelzellen usw. sein.
-
Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren
zur in vitro-Diagnose von Allergien bei einem Patienten, wobei dem
Patienten eine Serumprobe entnommen wird, wonach die Probe auf an Allergene
bindende Immunglobuline gemäß einem
oben erwähnten
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung analysiert wird, wobei ein Microarray-Chip verwendet wird,
auf dem zumindest 10, vorzugsweise zumindest 50, mehr bevorzugt
zumindest 90, verschiedene Allergene immobilisiert sind, wonach
eine positive Reaktion zwischen der Probe und den immobilisierten
Allergenen als Allergie diagnostiziert wird. Die oben erwähnten Definitionen
und Vorteile beziehen sich auch auf dieses Verfahren zur in vitro-Diagnose
von Allergien, im Vergleich zu den bekannten Verfahren zur Diagnostizierung
von Allergien. Das vorliegende Verfahren weist den Vorteil auf,
dass eine große
Anzahl von Allergien mit nur einer Probe gleichzeitig diagnostiziert
werden kann, da alle Allergene, die getestet werden müssen, an
einem einzigen Microarray-Chip immobilisiert sind. Jeder Schritt
wird daher nur an einem Chip durchgeführt, wobei der Chip weiters
Spots mit keinen immobilisierten Allergenen aufweisen kann und daher
gleichzeitig eine negative Detektion ermöglicht. Die Menge der zu testenden
Allergene ist nicht eingeschränkt
und es ist natürlich
möglich,
zwei oder mehrere Microarray-Chips vorzusehen.
-
Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Microarray-Chip,
an welchem ein oder mehrere gereinigte Allergene immobilisiert sind.
Auch bei diesem Aspekt werden die oben erwähnten Definitionen und Vorteile
angewendet.
-
Vorzugsweise
werden die Allergene auf einem Spot mit einem Durchmesser von 100
bis 500 μm,
vorzugsweise mit einem Durch messer von 200–300 μm, immobilisiert.
-
Noch
mehr bevorzugt ist der Microarray-Chip ein Glasträger, ein
Kunststoffträger,
ein Siliziumplättchen bzw.
eine Membran.
-
Vorteilhaft
ist der Microarray-Chip chemisch modifiziert, vorzugsweise durch
Amino-reaktive bzw. Carboxy-reaktive Modifizierung.
-
Vorteilhaft
sind die Allergene kovalent an den Microarray-Chip gebunden.
-
Ein
weiterer Aspekt gemäß der vorliegenden
Erfindung betrifft ein Kit, welches einen Microarray-Chip gemäß der vorliegenden
Erfindung, wie oben erwähnt,
und ein erstes Reagens umfassend zumindest ein Immunglobulin-detektierendes
Reagens, vorzugsweise einen anti-Immunglobulin-Antikörper, vorzugsweise
in einer bekannten Konzentration, sowie gegebenenfalls als positive
Probe ein zweites Reagens umfassend zumindest ein an ein Allergen
bindendes Immunglobulin, aufweist. Das erste Reagens, welches das
zumindest eine Immunglobulin-detektierende Reagens umfasst, vorzugsweise
einen anti-Immunglobulin-Antikörper, kann
zur Detektion von gebundenem Immunglobulin verwendet werden, in
welchem Fall der anti-Immunglobulin-Antikörper vorzugsweise wie oben
erwähnt
markiert ist. Vorzugsweise ist ein Antikörper im ersten Reagens in einer
bekannten Konzentration vorhanden, was ermöglicht, reproduzierbare Ergebnisse
vorzusehen. Weiters umfasst das Kit vorzugsweise ein zweites Reagens
als positive Probe, welche mindestens ein Immunglobulin umfasst,
das an ein Allergen bindet. Auch hier ist es vorzuziehen, dass das
Immunglobulin in einer bekannten Konzentration im zweiten Reagens
vorhanden ist, was ermöglicht,
das in der Probe vorhandene Immunglobulin zu quantifizieren durch
Vergleichen der Ergebnisse der Probe des Patienten mit den Ergebnissen
einer positiven Probe (dem zweiten Reagens).
-
Vorzugsweise
ist das Kit zur Durchführung
eines Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung, wie oben erwähnt,
vorgesehen. Dazu können
das erste und das zweite Reagens so ausgelegt sein, ein spezifisches
Immunglobulin, welches an ein spezifisches Allergen bindet, oder
eine spezifische Allergie bei einem Patienten zu detektieren. Das
Kit kann jedoch auch so ausgelegt sein, dass eine Vielfalt von Immunglobulinen, die
an spezifische Allergene binden, detektiert werden, oder zur Diagnose
einer Vielfalt von Allergien bei einem Patienten.
-
Die
vorliegende Erfindung wird nun mit den folgenden Beispielen und
Figuren, auf welche sie jedoch nicht eingeschränkt ist, genauer beschrieben.
-
1 zeigt
einen Plan eines Allergen-Microarray;
-
2 zeigt
ein Scan-Bild eines Allergen-Arrays, getestet mit Serum einer allergischen
Person;
-
3a–3c zeigen
einen Scatterplot-Test aus einem Dreifach-Test;
-
4a–4c zeigen
die für
immobilisierten Extrakt und immobilisierte rekombinante Allergene
gemessene % Fluoreszenz.
-
Beispiel 1:
-
Allergen-Spotting
-
Allergene
wurden unter Verwendung eines GMS 417-Spotters von Genetic Microsystems
angeordnet („arrayed"). Die Proteine wurden
auf derivatisierte Glas-Objektträger
punktweise aufgetragen. Einzelne Allergene wurden mit einem Treffer
pro Punkt als Triplikate gespottet. Die Punkte (Merkmale) zeigten
einen Durchmesser von etwa 200 μm.
-
Die
Allergene wurden in funktionellen Gruppen wie folgt zusammengestellt:
- (A) Outdoor (I. Bäume [1 = rBetv1, 2 = rBetv2,
3 = rBetv4, 4 = rJunO2, 5 = Cass1], II. Gräser [6 = rPhlp2, 7 = rPhlp4,
8 = rPhlp5a, 9 = rPhlp1, 10 = rPhlp6, 11 = rPhlp7, 12 = rPhlp11,
13 = rPhlp12], III. Unkraut [14 = rParj2, 15 = Artv1a, 16 = Beifuß-Profilin]),
- (C) Nahrungsmittel-Allergene (X. Gemüse [17 = Apig1, 18 = Apig1.0201,
19 = Dauc1.2, 20 = rArah2, 21 = rArah5], XI. Früchte [22 = Mald1, 23 = Mald2],
XII. Garnelen [24 = rPenal], XIII. Fisch [25 = recCarp]),
- (B) Indoor (IV. Milben [26 = rDerp1, 27 = rDerp2.0101, 28 =
rDerp2, 29 = rDerp2b, 30 = rDerp5, 31 = rDerp5a, 32 = rDerp7, 33
= rDerp8, 34 = rDerp10, 35 = rTyrp2], V. Tiere [36 = rLepd2.01,
37 = rLepd13, 38 = rEurm2.0101, 39 = rFeld1, 40 = rFeld1a, 41 =
rBosd2, 42 = ein repräsentatives
Allergen der Katze, 93 = ein repräsentatives Allergen vom Hund,
44 = BSA, 45 = ein repräsentatives
Allergen der Maus, 46 = ein repräsentatives
Allergen der Ratte, 47 = ein repräsentatives Allergen vom Schwein,
48 = ein repräsentatives
Allergen vom Schaf, 49 = ein repräsentatives Allergen vom Huhn,
50 = ein repräsentatives
Allergen vom Kaninchen, 51 = ein repräsentatives Allergen vom Hamster,
52 = ein repräsentatives
Allergen vom Pferd, 53 = ein repräsentatives Allergen der Taube,
54 = Guinea- Albumin],
VI. Schimmelpilze [55 = rPenc3, 56 = rPenc19a, 57 = rPenc19b, 58
= Penn13, 59 = rAspf1, 60 = rAspf3, 61 = rAspf4, 62 = rAspf6, 63
= rAspf1a, 64 = rAspf3a, 65 = rAspf4a, 66 = rAspf6a, 67 = rAspf7,
68 = rAspf8, 69 = rAlta1, 70 = rAlta2], VII. Hefe [71 = rMalf7,
72 = rMalf1, 73 = rMalf5, 74 = rMalf6, 75 = rMalf8, 76 = rMalf9],
VIII. Latex [77 = rHevb1, 78 = rHevb1a, 79 = rHevb3, 80 = rHevb8,
81 = rHevb9, 82 = rHevb10, 83 = rHevb11], IX. Insekten [84 = rAK,
85 = rBlag2, 86 = rBlag4, 87 = rBlag5]),
- (D) Gifte (XIV. Biene [88 = Ag5, 89 = Phospholipase A, 90 =
Hyaluronidase, 91 = rVesv5, 92 = rVesg5], XV. Wespe [93 = Ag5]),
- (E) Auto-Allergene (94 = HSA, 95 = a-NAC)
-
Zusätzlich wurden
Puffer-Punkte zwischen den Allergen-Untergruppen eingestreut, die
als Hintergrund-Kontrolle dienen, mit „X" bezeichnet, „ab" ist der markierte Antikörper. (1:
1864 × 1182
Pixel, 1,86 × 1,18
cm, 1000 Pixel pro cm, Pixeltiefe/Farben 8/256, wobei 1 Pixel 10 μm entspricht).
-
100 μl-Aliquots
der Allergene wurden in die Vertiefungen einer Mikrotiter-Platte
mit 96 Vertiefungen mit einer Konzentration von 200 ng/μl in Spotting-Puffer
verteilt (300 mM Natriumphosphat, pH 8,5). Die optimale Konzentration
für die
Immobilisierung der Allergene wurde aus Titrations-Versuchen mit
mehreren Allergenen in verschiedenen Pufferlösungen sowie auf verschiedenen
Objektträgern
berechnet. Die getesteten Proteine zeigten ein Sättigungsverhalten bei Konzentrationen
gleich oder größer als
100 ng/μl,
wie aus einem konstant starken weißen Signal beim Scannen mit
einem GMS-Scanner offenbar wurde. Bei dieser Konzentration war das
Bindungsverhalten der Allergene von der Zusammensetzung der Lagerung
sowie vom Spotting-Puffer unabhängig.
-
Beispiel 2:
-
SOPHIA („Solid
Phase Immunosorbent Assay",
Festphasen-Immunosorbens-Test)
-
Nach
Inkubation über
Nacht wurden die Objektträger,
die entweder von CEL Associates gekauft worden waren (Aldehyd-Objektträger) oder
firmenintern hergestellt worden waren, in 1 × TBST (10 mM Tris, pH 8,0/150
mM NaCl/0,5% Tween 20) unter heftigem Schütteln in einem Falcon-Röhrchen bei
Umgebungstemperatur gewaschen. Als Blockierschritt wurden die Objektträger in eine
1 × TBST-Lösung, enthaltend
0,01 BSA für
2 Stunden bei Umgebungstemperatur transferiert. Nacheinander wurden
die Objektträger
in 1 × TBST
15 min lang gewaschen und kurz in destilliertem Wasser gespült.
-
Die
Allergen-Anordnung wurde mit verdünntem Serum (1:5 in 1 × TBST)
(mindestens) 60 min lang bei 37°C
unter Schütteln
inkubiert. Verschiedene Grade der Serum-Verdünnung wurden getestet, die
im Bereich von 1:1–1:15
lagen. Gewöhnlich
ergab eine Verdünnung
von 1:5 die besten Ergebnisse. 30 μl verdünntes Serum wurden zu den Objektträgern in
Press Seal Chambers, käuflich
erworben von SIGMA Technologies, zugegeben. Die Kammern wurden gemäß den Vorschriften
des Herstellers verwendet. Verschiedene Inkubationszeiten, welche
von 60 min bis über
Nacht reichten, wurden für
das Serum getestet. Eine längere
Inkubation mit Serum führte
jedoch nicht zu einer Steigerung der Signalintensität oder -spezifität. Nach
der Inkubation mit Serum wurden die Objektträger in 1 × TBST (15 min, Umgebungstemperatur)
unter Schütteln
gewaschen.
-
Fünf verschiedene
Seren allergischer Patienten, die unter Verwendung herkömmlicher
Diagnose-Tests untersucht worden waren (Haut-Prick-Test, RAST, ELISA)
und ein Serum eines nicht-atopischen Patienten wurden als adäquat für eine Bewertung
(„benchmark
test") der Allergen-Anordnung
gewählt.
Die einzelnen Seren wurden mindestens zweimal an Allergen-Anordnungen
verschiedener erzeugter Chargen getestet.
-
Fluoreszenz-markierter α-IgE-Antikörper, markiert
mit AlexaFluor-Fluoreszenz-Farbe gemäß den Vorschriften des Herstellers
(Molecular Probes) wurde zur Allergen-Anordnung in einer Lösung, die
0,01 BSA/1 × TBST
enthielt, zugegeben und 60 min lang bei Umgebungstemperatur inkubiert.
Die Arbeitsverdünnungen
für den
Antikörper
waren im Bereich von 1:1000–1:5000,
je nach der Zeit und Effizienz der Markierung. Nach dem Immunoassay
wurden die Objektträger
mit 1 × TBST
(15 min, Umgebungstemperatur, Schütteln) gewaschen und kurz mit
destilliertem Wasser gespült.
-
Nach
dem Immunosorbens-Test wurden die Objektträger mit einem GMS-Zweifarben-Scanner
evaluiert. Im Allgemeinen waren die Signal-Intensitäten zwischen
den verschiedenen Tests und den verschiedenen Objektträgern nur
wenig verschieden. Die Hintergrundwerte waren jedoch je nach der
Art der verwendeten Objektträger
verschieden. Ein Beispiel für
ein gescanntes Bild einer Allergen-Anordnung, die mit dem Serum
eines an einer Allergie leidenden Patienten getestet wurde, ist
in 2 dargestellt. Dieser Patient zeigt eine starke
Reaktion mit Phleum, Milbe, Felis und Biene (vgl. 1).
Es wurden keine aus einer unspezifischen Wechselwirkung mit Puffer-Punkten
oder Auto-Allergenen stammenden Hintergrund-Signale beobachtet.
Nach der vollständigen
Evaluierung der Seren des allergischen Patienten wurden die Ergebnisse
mit Daten, die vorläufig für die identischen
Seren unter Verwendung von RAST-Tests erhalten worden waren, verglichen.
Die mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung erzielten Daten stimmten mit diesen Daten-Sätzen gut überein.
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Beispiel 3:
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Reproduzierbarkeits-Test
mit Untersuchung des Serums des Patienten C.
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Serum
des Patienten C wurde drei Mal an einzeln hergestellten Allergen-Microarrays
getestet. Die Vorgangsweise des Versuchs war im Wesentlichen wie
zuvor beschrieben.
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Nach
dem Test wurden die Objektträger
unter Verwendung identischer Hardware-Einstellungen gescannt. Die
Daten-Analyse wurde unter Verwendung der GenePix Software Package
durchgeführt.
Die errechneten Mittelwerte der Signal-Intensitäten für jedes Allergen-Triplikat
wurden nach drei Wiederholungen des Versuchs verglichen.
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Für die endgültige Analyse
wurden nur Werte, die Signalen entsprachen, die mindestens 1,5 × höher als
der Mittelwert der Puffer-Spot-Signale waren, ausgewählt. Der
Mittelwert, die Standard-Abweichung und der Prozentsatz der Standard-Abweichung
für die
relevanten Signale sind in Tabelle 1 gezeigt.
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Die
mittlere Standard-Abweichung, die aus den nach drei einzelnen Tests
erhaltenen Werten berechnet wurde, war 12,36%.
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Dies
bedeutet, dass der immunologische Test auf Chip-Basis, der nach
dem Vorhandensein von IgE in den Seren der Patienten fragt, hoch
reproduzierbar ist. Dies ist auch offensichtlich, wenn man die Scatter-Plots,
die aus dem Dreifach-Test 3 stammen, überprüft, s. 3a–3c,
worin 3a einen Scatterplot-Test 1
vs. Test 3, 3b einen Scatterplot-Test 2
vs. Test 3, und 3c einen Scatterplot-Test 1
vs. Test 2 zeigt; wobei A die Allergene zeigt und FI die Fluoreszenz-Intensität.
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Beispiel 4:
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Vergleich verschiedener
Microarrays
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Um
nach dem besten Objektträger
für die
vorliegende Erfindung zu testen, wurden einzeln hergestellte Objektträger nach
einer Anzahl von Kriterien, die nachstehend angeführt sind,
bewertet:
- – Herstellungsverfahren:
Objektträger,
die hergestellt wurden, wurden nach einer Anzahl von Parametern, wie
Bedarf an gefährlichen
Chemikalien und Produktionsdauer, bewertet.
- – Produktionskosten:
Betriebsintern erzeugte Objektträger
und im Handel erhältliche
Objektträger
wurden nach ihren Kosten verglichen.
- – Bindungskapazität: Verschiedene
Objektträger
wurden gemäß der Bindungskapazität eines
Fluoreszenz-markierten Proteins bewertet.
- – Reproduzierbarkeit:
Serienversuche wurden mit verschieden vorbehandelten Objektträgern durchgeführt und
nach der gesamten Test-Leistung bewertet.
- – Allgemeiner
Hintergrund: Alle Objektträger
wurden vor und nach einem Allergie-Test auf einen systematischen
Oberflächen-Hintergrund,
der das Signal/Rausch-Verhältnis
verringern könnte, bewertet.
- – Nachweisgrenze:
Alle Objektträger
wurden im Hinblick auf die minimale Protein-Konzentration, die pro Spot
in einem Allergie-Screening-Test
detektierbar war, bewertet.
- – Serum-Toleranz:
Im Allgemeinen ist ein Patienten-Serum eine komplexe Mischung aus
Proteinen, die sich oft negativ auf einen Immunoassay auf Microarray-Basis
mit verschiedenen Chargen des Patienten-Serums auswirkt.
- – Blockierung:
Alle Objektträger
wurden im Hinblick auf die Notwendigkeit eines Blockierungs-Schritts
vor dem Allergie-Test bewertet.
- – Lagerung:
Alle Objektträger
wurden im Hinblick auf Langzeit-Lagerung
nachdem ein Allergen-Chip erzeugt worden war, bewertet. Die Ergebnisse
der oben erwähnten
Evaluations-Studie sind in Tabelle 2 gezeigt:
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Tabelle
2: Gezeigt sind die Ergebnisse der in diesem Text beschriebenen
Evaluations-Studie. (++) bedeutet ausgezeichnetes Ergebnis, (+)
gut, (–)
weniger gut, (––) schlecht.
(/) bedeutet, dass der Objektträger
für diese
bestimmte Kategorie nicht getestet wurde. (1) Objektträger, die
eine funktionelle Oberfläche
mit Aldehyd-Gruppen enthalten. (2) Objektträger, die eine Aminreaktive
Oberfläche
enthalten, deren genaue chemische Eigenschaften nicht bekannt sind.
(3) Innerbetrieblich erzeugte Objektträger mit funktionellen Gruppen, wie
in Tabelle 2 erwähnt.
(4) Objektträger,
die eine Membran zur Immobilisierung von Proteinen enthalten. ProteoBind
ist der Arbeitstitel für
die Oberflächen-Derivatisierung,
die für
eine optimierte Leistung einer Allergie-Diagnose auf Microarray-Basis
adaptiert ist, und (1-[3''-[Trimethoxysilyl)-propyl]-1'-(4''-isothiocyanatphenyl)-thioharnstoff) umfasst,
welcher gemäß Chen et
al. (Nucleic Acids Research, 199, Bd. 27, Nr. 2) hergestellt wurde, welches
durch Bezugnahme darauf hierin mit eingeschlossen ist.
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Gemäß der oben
präsentierten
Evaluations-Studie wurde ProteoBind als überlegene Oberflächen-Derivatisierung
für die
Herstellung von Allergen-Microarrays ausgewählt.
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Beispiel 5
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Vergleich
der Detektion von Immunglobulin in einer Probe mit immobilisierten
rekombinanten Allergenen und mit immobilisiertem Extrakt
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Um
die Empfindlichkeit und die diagnostisch relevante Information von
an einem Microarray immobilisierten gereinigten rekombinanten Allergenen
und von an einem Microarray immobilisiertem Allergen-Extrakt zu
testen, wurden spezifische Allergene einer Quelle mit einem Allergen-Extrakt
derselben Quelle verglichen.
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Nach
der Immobilisierung von Allergen-Zusammensetzungen an einem Microarray,
wurden verschiedene Proben, die dasselbe spezifische Serum aufwiesen,
auf den Microarray gegeben, und die Fluroeszenz, die der Menge des
an die Allergene gebundenen Antikörpers entspricht, wurde gemessen.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3, 4 und 5 sowie in den 4a, 4b und 4c gezeigt,
worin „FL" für % Fluoreszenz steht.
Aus diesen Ergebnissen wird klar, dass im Fall der rekombinanten
Allergene die Detektion und Quantifizierung viel empfindlicher ist
als im Fall der Allergen-Extrakte.
Die Fluoreszenz-Intensität
eines einzelnen rekombi nanten Antigens ist deutlich größer als
die Fluoreszenz-Intensität
des Extrakts. Weiters kann im Fall des Extrakts nur die Quelle des
Extrakts getestet werden, und es ist – im Gegensatz zur Detektion
mit rekombinanten Allergenen – nicht
möglich,
zu testen, welches spezifische Antigen der Quelle für die Allergie
verantwortlich ist.
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Daher
ist das erfindungsgemäße Verfahren
unter Verwendung einzelner, gereinigter Allergene, insbesondere
rekombinanter Allergene, vorteilhaft gegenüber Extrakten, die Allergene
umfassen.
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