SK286541B6

SK286541B6 - Spôsob detekcie imunoglobulínov založený na alergénovom čipe

Info

Publication number: SK286541B6
Application number: SK537-2003A
Authority: SK
Inventors: Reinhard Hiller; Christian Harwanegg; Manfred W. M�LLER
Original assignee: Vbc-Genomics Bioscience Research Gmbh
Priority date: 2000-10-03
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2008-12-05
Also published as: EP1322960A1; DK1322960T4; CN1527943A; DE60108256T2; CA2424661C; CZ20031219A3; US20050101031A1; BRPI0114343B8; HU228066B1; DE60108256T3; SI1322960T2; AU1230602A; DE60108256D1; BRPI0114343B1; WO2002029415A1; CA2424661A1; EE05465B1; SI1322960T1; ATE286597T1; EP1195606A1

Abstract

Predkladaný vynález sa týka spôsobu detekcie imunoglobulínu, ktorý sa viaže na alergén vo vzorke, pričom spôsob spočíva v tom, že jeden alebo viacej alergénov je imobilizovaných na (mikro)maticovom čipe, vzorka sa inkubuje s alergénmi imobilizovanými na čipe tak, že imunoglobulíny špecifické pre alergény sa naviažu na špecifické alergény a potom sa detegujú imunoglobulíny naviazané na špecifické imobilizované alergény. Vynález sa ďalej týka spôsobu in vitro diagnostiky alergií u pacientov.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka spôsobu detekcie imunoglobulínu, ktorý sa viaže na alergén vo vzorke, a taktiež spôsobu in vitro diagnostiky alergií u pacientov.

Doterajší stav techniky

Alergia je reakcia vytváraná telesným imunitným systémom na látku, ktorá by bola normálne považovaná za neškodnú. Je to práve táto reakcia, ktorá spôsobuje symptómy, ktoré sú klasifikované ako alergické reakcie. Alergia teda nie je prejavom zlyhania imunitného systému, ale naopak jeho nadmernej aktivity. Reakcia alergickej osoby na alergén môže viesť k celému radu rozmanitých symptómov. Niektorí ľudia trpia symptómami, ako je napríklad astma, ekzém, vyrážka, svrbenie očí, sinusitída, upchatý alebo stále vlhký nos a senná nádcha, ale môžu sa objaviť aj vážnejšie symptómy. Pri alergiách ako napríklad alergiách na jedy, orechy a niektoré mäkkýše, môže napríklad nastať potenciálne život ohrozujúci stav nazývaný anafylaktický šok. K tomu dôjde, ak organizmus vytvára reakciu tak silnú, že dôjde k napuchnutiu hrdla, poklesne krvný tlak a postihnutá osoba má dýchacie ťažkosti. V niektorých prípadoch môže byť tento typ reakcie aj fatálny.

Výskyt alergií sa výrazne zvyšuje v rozvinutých krajinách (t. j. v Európe, Severnej Amerike a Japonsku). Odhaduje sa, že 20 až 50 % populácie je postihnutých alergiami. Teraz je už známe, že alergie sú výsledkom nerovnováhy v kompartmente T Iymfocytov imunitného systému. Presnejšie povedané, alergie sú sprevádzané zvýšením aktivity tzv. pomocných T Iymfocytov 2 (Th2) vzhľadom na aktivitu pomocných T Iymfocytov 1 (Thl), čo vedie k zvýšeniu tvorby IgE.

IgE (imunoglobulin E) je prinajmenšom jedna z látok, ktoré spôsobujú alergické reakcie. IgE špecifický pre alergén nie je normálne v krvi detegovaný a tvorí sa jedine vtedy, keď je osoba senzibilizovaná určitou látkou (stane sa citlivou na látku). Látky spôsobujúce alergie (nazývané alergény) vedú k tvorbe špecifického IgE, ktorý je unikátny a bude reagovať jedine s látkou, ktorá jeho tvorbu vyvolala. Táto reakcia medzi IgE a alergénom sa modelovo znázorňuje ako zámok a kľúč. Keď je IgE spojený s alergénom, pôsobí na bunky tak, že sa uvoľňujú chemické zlúčeniny (napr. histamín), ktoré spôsobujú symptómy alergie. Jedna osoba môže mať špecifické IgE pre viac ako jednu látku. Výsledky testovania na IgE sú vyjadrované ako stupeň, ktorý ukazuje, aké množstvo IgE špecifického pre testovanú látku je prítomné v krvi. Čím vyšší stupeň, tým viac je pravdepodobné, že pacient je alergický. V uplynulých desaťročiach sa alergické choroby diagnostikovali iba s použitím hrubo purifikovaných extraktov pochádzajúcich z hlavných zdrojov alergénov. Je však zrejmé, že tieto surové zmesi sú komplexné a z hľadiska zloženia značne variabilné. V dôsledku tohto diagnostický potenciál týchto extraktov je taktiež premenlivý a môže viesť aj k vzniku falošne negatívnych výsledkov. To sa pripisovalo najmä nestálosti alergénov v extraktoch. Ďalšou nevýhodou použitia takýchto extraktov pri diagnózach alergií je zlá štandardizácia komerčne dostupných produktov, pokiaľ ide o ich alergénové zloženie. Jednotky, ktorými sa vyjadruje sila alergénu a taktiež spôsoby výpočtu, sú rôzne pre rôzne komerčné spoločnosti. V dôsledku toho môžu byť diagnostické produkty od rôznych firiem iba ťažko porovnávané.

Najdôležitejšie zložky súvisiace s ochorením, t. j. hlavné alergény, boli identifikované v uplynulých desaťročiach, ale ich kvantifikácia nie je používaná ako východisko pre štandardizáciu alergénových extraktov. Monoklonálne protilátky sú teraz dostupné proti väčšine hlavných alergénov.

Testy na alergie metódami podľa známeho stavu techniky nie sú jednoduchým postupom. Tieto metódy môžu byť užitočné za predpokladu, že je uskutočnená anamnéza, aby bolo možné určiť, ktoré testy by boli najvhodnejšie. Ale doteraz existuje iba veľmi málo lekársky uznávaných testov, ktoré môžu identifikovať alergie, a ako všeobecné pravidlo platí, že tieto testy sú obmedzené na klinické laboratóriá alebo špecializované centrá. Zatiaľ čo diagnóza atopie alebo alergie u kvalifikovaného praktika alebo špecialistu na alergiu môže byť relatívne ľahko uskutočnená, na potvrdenie sú často vyžadované ďalšie testy.

Ďalej sú uvedené pre príklad rôzne typy testov na alergie.

1. Test podkožnou injekciou

Podozrivý alergén sa injikuje pod povrch kože a reakcia sa pozoruje kvalifikovanou ošetrovateľkou alebo lekárom. Ako sa reakcia vyvíja, vzniká zóna sčervenania, a čím silnejšia je reakcia, tým väčšia je táto zóna. Kožný test je pomerne citlivý, aj keď nie všetky alergie môžu byť identifikované týmto spôsobom.

2. Náplasťový test

Náplasťový test môže byť užitočný v prípade kontaktnej dermatitídy. Testovacie látky sú zvyčajne aplikované na kožu pokrytú náplasťou a ponechané na mieste počas 48 hodín. Kladná reakcia vytvára malú oblasť ekzému. Rovnako ako v predchádzajúcom prípade reakcia sa pozoruje kvalifikovanou ošetrovateľkou alebo lekárom.

3. Alternatívny test na alergiu

Existujú mnohé alternatívy testov na alergie a bohužiaľ iba máloktoré sú dostatočne presné alebo uznávané lekármi. Tieto alternatívne testy sú často klamné a veľakrát aj veľmi nákladné.

4. Testvega

Test vega je elektrický test opisovaný ako bioenergetická regulačná technika. Pristroj meria vodivosť Wheatstonovým obvodom. Elektródy sú pripojené na akupunktúrne body, alebo ich pacient drží v rukách. Rôzne roztoky sa potom umiestňujú na kovový podnos. Prístroj je potom kalibrovaný tým, že sa na podnos umiestni sklenená fľaštička obsahujúca toxickú látku. Fľaštička vyvolá zníženie elektrickej vodivosti. Ďalšie látky sú potom umiestňované na podnos a ak dávajú podobnú hodnotu, potom ide o alergickú reakciu alebo „citlivosť“ na látku. Táto technika je veľmi rozšírená, najmä v obchodoch s tzv. zdravými potravinami, ale jej hodnota doteraz nebola dokázaná a neboli uskutočnené žiadne platné klinické skúšky, ktoré by podložili tieto tvrdenia.

5. Test na toxicitu pre leukocyty (leukocytotoxicitu)

Tento test zahŕňa zmiešanie bielych krviniek pacienta s extraktmi so špecifických jedál a potom meranie bunky (rôznymi spôsobmi), aby sa zistila nejaká forma zmeny. Tu dochádza k vysokému počtu falošne pozitívnych a falošne negatívnych reakcií a Americká Akadémia Alergie došla k uzáveru, že doteraz neexistuje žiadny dôkaz, že by tento test bol účinný pre diagnózu alergie najedlo alebo inhalovanú látku.

6. Analýza vlasov

Ďalšou formou testovania je vlasová analýza. Vlasy môžu byť analyzované na prítomnosť toxických kovov, ako je napríklad olovo, ortuť a kadmium alebo nízke hladiny selénu, zinku, chrómu, mangánu a horčíka. Otravy ťažkými kovmi sú dobre známe a dokumentované v kriminalistickej vede a analýza vlasov môže skutočne indikovať expozíciu týmto kovom. Ale analýza vlasov ako prostriedok na diagnózu alergií, ani použitím metódy ako napríklad „prútikárčenie“, nebola nikdy potvrdená.

7. Aplikovaná kineziológia

Vzorky potravín sú umiestnené pod jazykom alebo držané v sklenenej nádobke v ruke pacienta. Pacient je potom požiadaný, aby tlačil svojou voľnou rukou proti ruke ošetrujúcej osoby examinátora. Ak je detegovaná alergická reakcia, tak sa prejaví ako redukovaná svalová reakcia a pacient má náhle problém zdvihnúť svoju pažu. Táto technika celkom prepadne pri uskutočnení dvojitej slepej klinickej štúdie.

Okrem toho existujú rôzne in vitro metódy diagnostiky alergií, kde sa deteguje prítomnosť TgE alebo IgG protilátok v krvi.

8. Zvyčajné metódy ako je ELISA alebo Westem blot

Tieto testy sa používajú na detekciu protilátok (IgE) prítomných v sére pacienta pomocou (rekombinantných) alergénov.

9. Rádioalergosorbentový test (RAST™)

V tomto postupe je špecifický alergén kondenzovaný na papierovom disku a imunošpecifický IgE, ak je prítomný v testovanom sére (t. j. v sére od pacienta), sa bude viazať na disk, pričom následne sa uskutoční detekcia pomocou rádioaktívne značenej anti-IgE. Používajú sa rôzne hodnotiace (skórovacie) systémy porovnávajúce výsledky testu s absolútnou väzbou negatívnej kontroly. Všeobecne modifikovaný postup RAST™ je nasledovaný inkubáciou cez noc a umožňuje detekciu s vyššou citlivosťou.

10. Kvantitatívne experimenty inhibície IgE založené na RAST

V tomto teste je extrakt alergénu „nabodkovaný“ (nanesený v malých škvrnkách) na prúžkoch nitrocelulózy. Alikvóty séra sú preinkubované so zmesou špecifických rekombinantných alergénov, a potom je táto zmes inkubovaná s nitrocelulózovými prúžkami. Naviazaný IgE je detegovaný pomocou protilátky antihumánnej IgE. V poslednom kroku sa vypočíta percento inhibície väzby IgE prírodnými extraktmi po preabsorpcii s rekombinantnými alergénmi.

11. Stimulačný test bunkových antigénovov (CAST)

Bazofilné bunky pacienta sú stimulované interleukínom-3 a alergénom a potom nasleduje meranie ELISA de novo vytvoreného a uvoľňovaného sulfidoleukotriénu (SLT).

12. Test UniCAP

Rekombinantné alergény sú imobilizované na pevnej fáze a potom sa deteguje väzba protilátok, ktoré sú prítomné v sére pacienta, na alergény.

Ale všetky tieto metódy vyžadujú množstvo jednotlivých experimentálnych krokov, aby bolo možné testovať väčší počet (napr. 100) rôznych alergénov. Okrem toho, uvedené testy neprejavujú dostatočne vysokú citlivosť a spoľahlivosť a sú veľmi náročné na čas. Taktiež množstvá vzoriek (napr. séra pacienta) a taktiež purifikovaných, často rekombinantných a nákladných alergénov, ktoré sú potrebné na uskutočňovanie týchto testov, sú veľké.

Patent US 4 444 879 sa týka metódy a zariadenia na imunotesty na určenie celkových imunoglobulinov a IgE. Tu sú alergény extrahované a tmobilizované v jamkách mikrotitračnej doštičky potiahnutej polymérom. Vzorka, ktorá má byť analyzovaná, je potom pridaná do jamiek, a je uskutočnený zvyčajný imunotest.

V patente EP 0 556 745 Al je opísaný spôsob detekcie IgE protilátok proti pšeničnému proteínu v telesných tekutinách, pričom extrakt pšeničného alergénu je imobilizovaný na pevnej fáze, ktorou je napríklad chromatografický alebo kapilárny materiál alebo vlákna, sklo, nylon, celulóza alebo jej deriváty vo forme perličiek, mikročastíc, listov alebo jamiek mikrotitračnej doštičky. Taktiež tu sa uskutočňuje zvyčajný imunotest na detekciu protilátok vo vzorke od pacienta.

Patent US 3 720 760 sa týka spôsobu analýzy telesných tekutín na imunoglobulíny. Taktiež tuje alergén obsahujúci extrakt, ktorý je komerčne dostupný, naviazaný na vo vode nerozpustný polymér, na ktorom je potom uskutočnený zvyčajný imunotest.

Patent US 4 849 337 sa taktiež týka spôsobu identifikácie hladiny IgE špecifického pre alergén v sére pacienta tým, že sa konjuguje IgE v sére s alergénmi naviazanými na nerozpustnom nosiči. Tu je alergénom opäť extrakt alebo alergén pochádzajúci priamo z peľu, prachu, zvierat a pod..

Tieto konvenčné imunotesty ale nie sú použiteľné na testovanie pacientov pokiaľ ide o prítomnosť alergií, pretože počet rôznych alergií presahuje mnoho stoviek alergií a stále sa zvyšuje. Čas a práca nutné na analýzu pacientovho séra na všetky možné a taktiež vzácne alergie sú príliš vysoké a preto takéto analýzy nemôžu byť uskutočňované v laboratóriách, kde musia byť denne analyzované vzorky z niekoľkých stoviek pacientov.

Podstata vynálezu

Cieľom predkladaného vynálezu je preto poskytnúť spôsob detekcie imunoglobulínu, ktorý sa viaže na alergén vo vzorke, takýto spôsob nemá uvedené nevýhody a môže byť uskutočňovaný v krátkom čase a iba s malým množstvom vzorky a alergénu, je veľmi spoľahlivý a citlivý a navyše, čo je najdôležitejšie, umožňuje detekciu prakticky neobmedzeného počtu alergénov v jednom jedinom teste.

Ďalej predkladaný vynález poskytuje spôsob in vitro diagnózy alergií u pacienta bez uvedených nevýhod.

Spôsob podľa vynálezu je charakterizovaný tým, že jeden alebo viacero alergénov sú imobilizované na čipe s mikromaticou, na ktorom je inkubovaná vzorka s imobilizovanými alergénmi, takže imunoglobulíny, ktoré sú špecifické pre alergény, sa viažu na špecifické alergény, a potom sú detegované imunoglobulínmi, ktoré sú naviazané na špecifické imobilizované alergény.

Mikromatice („microarrays“), príp. mikromaticové čipy, boli nedávno použité na celý rad postupov manipulácie s DNA, pričom tieto postupy boli už dávno používané vedeckou komunitou. Tieto čipy s mikromaticou DNA, tzv. DNA čipy, sa stali bežne dostupnými v mnohých rôznych formátoch a nakoniec viedli k podstatnej zmene spôsobov navrhovania a uskutočňovania v bežnej laboratórnej praxi. In vitro DNA diagnostika je teraz menej časovo náročná a menej prácna, pretože tieto nové technológie umožňujú komplexné testy vo vysokovýkonnom a vysokokapacitnom formáte („high-throughput“). V dôsledku toho aj v oblasti proteomického výskumu boli klasické substráty pevnej fázy, ako napríklad mikrotitračné doštičky, membránové filtre a mikroskopické sklíčka, nahradené formátom mikromatíc s vysokou hustotou. Nová a všestranná technológia proteínových matíc nakoniec umožňuje aj high-throughput skríning génovej expresie a molekulárnych interakcií (Walter a kol., Curr. Opin Microbiol 2000 Jun, 3(3):298-302, Emili & Cagney, Nat Biotechnol 2000 Apr, 18 (4) 393-7). Nedávno bol taktiež koncept proteínovej matice použitý na imunologické testy.

Biočip je opisovaný ako čip vhodný na vysokovýkonnú (HT, „high-throughput“), mnohopočetnú analýzu s enzýmom naviazaným na imunosorbent (ELISA). Takéto biočipy môžu pozostávať napríklad z opticky plochej sklenenej doštičky obsahujúcej 96 jamiek vytvorených vložením hydrofóbnej teflónovej masky, ale sú známe a používané aj iné látky a formy biočipov. Experimenty ukazujú, že špecifická mnohopočetná detekcia proteínových antigénov usporiadaných v matici na sklenenom nosiči je uskutočniteľná. Ďalšie možnosti použitia tohto nového vysokovýkonného testovacieho (HTS, „high-throughput sereening“) formátu zahrnujú priame stanovenie profilov expresie bunkových proteínov, mnohopočetné testy na detekciu infekčných agens a diagnostiku nádorov (Mendoza LG a kol., Biotechniques 1999 Oct, 27 (4):778-80).

Ale pri použití týchto známych čipov s mikromaticou na testovanie proteínov sú protilátky imobilizované na mikromaticový čip. Prekvapivo sa zistilo, že je možné naviazať na mikromaticový čip nielen protilátky, ale taktiež alergény, ktoré sú antigénmi zodpovedajúcimi špecifickým protilátkam, konkrétne IgE a IgE, v danom poradí. Tento fakt je zvlášť prekvapujúci, pretože funkčné alergény majú zvláštnu sekundárnu štruktúru, ktorá môže byť modifikovaná, keď sú naviazané k pevnej fáze v takej vysokej hustote ako na mikromaticový čip. Takáto modifikácia štruktúry alergénu by narušila väzbu protilátka-alergén, čo by viedlo k falošne negatívnym výsledkom. Protilátky, fragment protilátok alebo peptidy sú relatívne malé a majú vysokú stabilitu, preto protilátky majú väčšiu stabilitu v roztoku v porovnaní s im zodpovedajúcimi antigénmi. Ale keď sú imobilizované na pevnej fáze dokonca aj v prípade protilátok, iba malé percento ich ostáva neporušených a účinných.

Článok Haab a kol. (Génom Biológie 2000,1 (6): pre-print 0001,1-0001,22) ktorý bol prijatý 9. septembra 2000, sa týka proteínových mikromatíc na detekciu a kvantifikáciu proteínov a protilátok v roztoku. Výsledky analýz uskutočňovaných podľa tejto publikácie ukázali, je iba 50 % antigénov v matici a 20 % protilátok v matici poskytlo špecifické a presné merania zodpovedajúcich alergénov.

Navyše rozmanitosť možných alergénov je samozrejme omnoho vyššia ako rozmanitosť protilátok, čo sa týka spracovania proteínov, najmä imobilizácie a značenia takejto série štrukturálne rôznorodých alergénov. Ale bolo prekvapivo ukázané, že alergény imobilizované na mikromaticový čip mali vysokú spoľahlivosť a senzitivitu pri detekcii imunoglobulínov vo vzorke.

Tento spôsob dovoľuje uskutočniť test na mnoho imunoglobulínov, ktoré viažu špecifický alergén, v jednom experimentálnom kroku, pričom test môže byť taktiež atomizovaný: viac ako 100 rôznych alergénov môže byť testovaných bez toho, aby sa uskutočňovalo mnoho individuálnych experimentálnych krokov, ako keď sa uskutočňuje test v zvyčajnej mikrotitračnej forme. Okrem toho, tento test má vysoký stupeň senzitivity a spoľahlivosti. Taktiež výsledky z testu uskutočňovaného týmto spôsobom sa môžu získať v krátkom časovom období, napr. približne za tri hodiny, čo skracuje čas potrebný na test v porovnaní so zvyčajnými testami RAST alebo ELISA.

Okrem toho, mikromaticový test je vysoko reprodukovateľný, keď sa uskutočňujú opakované experimenty s čipmi obsahujúcimi vzorky od rôznych osôb, napr. s maskou podobnou mikrotitračnej doštičke, keď každá jamka obsahuje niekoľko rôznych alergénov a vzorka jednej osoby je pridaná do jamky. Ďalej výhodou spôsobu podľa predkladaného vynálezu je skutočnosť, že veľký počet rôznych sond zaujíma relatívne malú plochu, ktorá je obsadená vysokou hustotou. Malá povrchová plocha matice umožňuje existenciu mimoriadne jednotných väzbových podmienok (teplotná regulácia, obsah solí a pod.), zatiaľ čo mimoriadne veľký počet sond umožňuje súbežné spracovanie veľkého počtu hybridizácií. Pretože matice s vysokou hustotou obsahujú tak veľký počet sond, je možné poskytnúť súčasne viaceré kontroly, a to vrátane napríklad kontroly pre variácie alebo mutácie konkrétneho alergénu, kontroly pre celkové hybridizačné podmienky, kontroly pre podmienky prípravy vzorky a zámenu kontroly pre nešpecifickú väzbu alebo skríženú hybridizáciu.

Ďalej spôsob testu podľa vynálezu vyžaduje iba minimálny zlomok látky (alergénu aj vzorky) v porovnaní so zvyčajnými testovacími systémami. To znamená, že s rovnakým množstvom východiskového materiálu je možné vyrobiť omnoho väčší počet testovacích súprav, keď sa použije mikromaticová forma, a taktiež môže byť odobraté menšie množstvo vzorky pre väčšie množstvo imunoglobulínov, ktoré viažu alergény. Taktiež vďaka malému objemu sa väzba uskutočni veľmi rýchlo.

Prírodné intaktné „imunoglobuliny“ alebo protilátky sú tvorené všeobecne tetramémou molekulou v tvare Y majúcou väzbové miesta pre antigén na konci každého horného ramena. Väzbové miesto pre antigén sa skladá z variabilnej domény ťažkého reťazca spojenej s variabilnou doménou ľahkého reťazca. Konkrétne protilátkové väzbové miesto pre antigén je v podstate tvorené 3 CDR (úsekmi určujúcimi komplementaritu) variabilnej domény ťažkého reťazca (V_H) a 3 CDR variabilnej domény ľahkého reťazca (V_L).

Všeobecne sa termín „antigén“ týka látky schopnej vyvolať imunitnú reakciu a bežne je to taktiež látka použitá na detekciu zodpovedajúcej protilátky v jednej z mnohých in vitro a in vivo imunologických metód na demonštráciu interakcie antigén - protilátka.

Podobne, termín „alergén“ označuje antigén, ktorý má schopnosť indukovať špecifickú protilátku (t. j. IgE), a taktiež sa na ňu viazať, pričom ide o protilátku zodpovednú za bežné alergie. Ale táto druhá definícia nevylučuje možnosť, že alergény môžu taktiež indukovať reaktívne protilátky, ku ktorým patria imunoglobulíny iných tried ako IgE.

„Imobilizácia“ v kontexte s proteínmi alebo peptidmi sa týka naviazania alebo napojenia proteínu/peptidu na pevný nosič zvyčajným známym spôsobom, buďto s dodatočnou spojkou („spacer“) medzi pevnou fázou a alergénom alebo bez nej. Imobilizácia peptidu/proteínu na nosič je v odbore dobre známa, do rozsahu predkladaného vynálezu spadá akýkoľvek spôsob imobilizácie, napr. kovalentnou alebo nekovalentnou väzbou, najmä hydrofóbnou interakciou, napríklad na membrány a syntetické povrchy, v danom poradí a pod.

„Mikromatica“ je matica určitých prvkov (napr. „bodov“ alebo „škvrniek“) majúca hustotu jednotlivých prvkov aspoň približne 16/cm², výhodne aspoň približne 64/cm², ešte výhodnejšie približne 96/cm² a najvýhodnejšie aspoň približne 1000/cm². Prvky mikromatice majú charakteristické rozmery, napr. priemery, v rozsahu medzi približne 10 až 2000 pm, výhodne približne 50 až 500 pm, ešte výhodnejšie približne 150 až 250 pm, a sú oddelené od iných prvkov v matici približne rovnakými vzdialenosťami. Preto mikromatica podľa predkladaného vynálezu použiteľná na rutinný skríning vo veľkom meradle môže obsahovať aspoň 500, výhodne aspoň 1000 individuálnych prvkov - bodov (škvŕn) obsahujúcich alergény, štandardy a kontroly„Čip“ podľa predkladaného vynálezu môže byť doslova akéhokoľvek tvaru, napr. sklíčko alebo jamka mikrotitračnej doštičky, alebo taktiež mnohopočetný povrch, aj keď rovinný typ čipu je výhodný.

Detekčný krok môže byť uskutočnený nejakým zvyčajným spôsobom, ktorý je odborníkom známy, napr. využitím fyzikálnej enzymatickej alebo chemickej reakcie a pod.

Podľa výhodného uskutočnenia predkladaného vynálezu sú IgE detegované ako imunoglobulíny. IgE je známy ako látka spôsobujúca alergické reakcie a je tvorená jedine vtedy, keď sa osoba stane citlivou na látku, t. j. vyvinie sa u nej alergia. Preto na testovanie toho, či je vzorka od pacienta, ktorý je alergický na špecifický alergén, je vzorka testovaná na IgE ako imunoglobulíny. Čím vyššie množstvo IgE je vo vzorke, tým je pravdepodobnejšie, že vzorka bola odobratá z pacienta alergického na špecifický alergén.

Výhodne sú detegované ako imunoglobulíny IgG imunoglobulíny. IgG je známy tým, že je prítomný vo vzorke od pacienta, ktorý' je alergický na jedlo, preto môže byť detekcia IgG použitá ako indikácia potravinovej neznášanlivosti.

Výhodne jeden alebo viac purifikovaných alergénov je imobilizovaných na mikromaticovom čipe. Tieto jednotlivé alergény sú napríklad purifikované z alergénového extraktu, napr. zo špecifickej potraviny alebo rastliny. Samozrejme jeden alebo viac alergénov špecifického druhu môže byť analyzovaných naraz.

Metódy purifikácie sú odborníkom známe, je to napr. chromatografická purifikácia, purifikácia separáciou podľa hmotnosti, purifikácia špecifickou väzbou alergénu na pevnú fázu, napr. prostredníctvom protilátky, a pod. Použitie vysoko purifikovaných alergénov na masovú výrobu testov na alergie nebolo zatiaľ navrhované.

„Purifikovaný“ alergén označuje, na rozdiel od extraktu, jednotlivý alergén, ktorý môže byť napríklad natívny, rekombinantný alebo synteticky pripravený alergén. Tieto purifikované alergény majú rad dôležitých výhod oproti alergénovým extraktom, keď sú imobilizované na pevnú fázu: vzhľadom na to, že ide o zmes rôznych proteínov, ktoré sú prítomné v akomkoľvek extrakte, je koncentrácia alergénu, ktorý má byť testovaný, veľmi nízka v porovnaní s purifikovaným preparátom jednotlivého alergénu. Purifikovaný jednotlivý alergén môže byť preto imobilizovaný na mikromatici vo veľmi vysokej koncentrácii. Vzhľadom na presné a definované molekuly prítomné v preparáte purifikovaného alergénu, iba definovaný alergén bude imobilizovaný na mikromatici. Preto mikromatica a spôsob detekcie protilátky pomocou purifikovaných alergénov môžu byť štandardizované a podrobené presným kontrolám kvality.

Okrem toho vzhľadom na vysokú koncentráciu purifikovaného alergénu v prípravku sú alergény na mikromatici imobilizované s vyššou hustotou a preto aj akýkoľvek detekčný spôsob založený na takej mikromatici je citlivejší ako zodpovedajúca mikromatica iba s extraktmi obsahujúcimi alergény. Ďalšia výhoda purifikovaných jednotlivých alergénov proti alergénovým extraktom spočíva v skutočnosti, že imobilizované purifikované alergény sú presne definované. Na rozdiel od purifikovaných alergénov zahŕňajú alergénové extrakty napríklad dva, tri alebo viac rôznych alergénov z jedného organizmu alebo predmetu. Napríklad v prípade jablka extrakt bude obsahovať zmes rôznych jablčných alergénov, zatiaľ čo prípravok podľa vynálezu obsahuje jeden z purifikovaných jablčných alergénov, alebo - v závislosti od použitia - definovanú zmes dvoch alebo viacerých jablčných alebo rôznych alergénov.

Ďalšou výhodou purifikovaných alergénov v porovnaní s nepurifikovanými alergénmi napríklad prítomnými v extrakte spočíva v skutočnosti, že kvôli ďalším nečistotám prítomným v extrakte nie je extrakt stabilný dlhšie ako iba obmedzený časový interval a potom môže byť napríklad plesnivý. To však ovplyvní detekciu alergií, pretože taktiež existuje aj alergia proti plesniam, a v tomto prípade sa potom získa falošne pozitívny výsledok.

Okrem toho kvôli prítomnosti proteáz v extraktoch sú extrakty nestále, čo neplatí pre purifikované alergény.

Taktiež vzhľadom na existujúce terapie pomocou purifikovaných alergénov, uskutočňovanie diagnózy s rovnakým purifikovaným alergénom je hlavná výhoda oproti diagnostike s nepurifikovanými alergénmi. Takéto diagnózy sú výhodné najmä, aby nasledovali po terapii purifikovanými alergénmi, a umožnili testovať individuálnu reakciu na špecifickú terapiu a dovolili tak poskytovať individuálnu, konkrétnemu pacientovi prispôsobenú terapiu.

Z uvedených dôvodov spôsoby detekcie imunoglobulínu, ktorý sa viaže na alergén vo vzorke, keď jeden alebo viac purifikovaných alergénov je imobilizovaných na mikromaticový čip, sú obzvlášť výhodné.

Výhodne je jeden alebo viac rekombinantných alergénov imobilizovaných na mikromaticovom čipe. V posledných niekoľkých rokoch bolo pripravených mnoho rekombinantných alergénov. Produkcia rekombinantných alergénov je taktiež v princípe známa v stave techniky, ale doteraz mala iba malý dopad na rutinné testy na alergie. Ale pomocou rekombinantných alergénov je možné pripraviť veľké množstvo jedného alebo viacerých špecifických alergénov a tak optimalizovať test. Ďalej je možné modifikovať rekombinantné alergény špecificky tak, aby sa získala akákoľvek mutácia alergénu na detekciu špecifického imunoglobulínu.

Okrem toho používanie hlavných alergénov ako rekombinantných proteínov poskytuje alternatívu k testom založeným na extraktoch, čo sa týka stability testu a taktiež keď ide o štandardizáciu diagnostiky.

Uvedené výhody purifikovaných alergénov v porovnaní s nepurifikovanými alergénmi (extraktmi) platia tým skôr pre rekombinantné alergény, ako pre purifikované natívne alergény: rekombinantné alergény môžu byť navrhnuté a pripravené ešte s väčšou špecifickosťou ako purifikované natívne alergény a preto je možné optimalizovať afinitu a špecifickosť testu s rekombinantnými alergénmi. Rekombinantné alergény sú taktiež lepšie na štandardizáciu čo sa týka spôsobu ich produkcie. Navyše rozdiely medzi jednotlivými výrobnými šaržami sú menšie pre rekombinantné alergény ako pre alergény pochádzajúce z prírodného zdroja. V predkladanom vynáleze bolo prekvapivo ukázané, že použitie týchto rekombinantných alergénov v rutinných in vitro diagnostických testoch podľa vynálezu je lepšie ako zvyčajné testovacie systémy založené na extraktoch. Na rozdiel od rutinného sériového testovania podľa stavu techniky, testovanie alergénov podľa vynálezu s použitím rekombinantných alergénov prináša celkom novú kvalitu čo sa týka štandardizácie, možnosti kontroly, senzitivitu, reprodukovateľnosť, schopnosť testu poskytnúť diagnosticky relevantné informácie a pod.

Rekombinantné alergény boli napríklad opísané v publikáciách Chapman a kol. Alergie, 52:374-379 (2997), Laffer a kol. J Alergie Clin Immunol Vol 98 No. 2, 652-658 (1996), Muller a kol. Clinical and Experimental Allergy Vol 27 9, 915-920 (1997), Niederberger a kol. J Alergie Clin Immunol Vol 102 No. 4, part 1, 579-591 (1998), Menz a kol. Clinical and Experimental Allergy Vol 26, 50-60 (1996), ktoré sú zahrnuté formou odkazu v tomto texte. Ďalšími príkladmi (rekombinantných) alergénov sú, bez toho, aby bol výpočet obmedzujúci, rBetvl, rBetv2, rBetv4, rJunO2, Cassl, rPhlpl, rPhlp2, rPhlp4, rPhlpSa, rPhlpó, rPhlp7, rPhlpll, rPhlpl2, rParj2, Artvla, Mugwort profilin, Apigl, Apigl,0201, Daucl,2, rArah2, rArah5, Maldl, Mald2, rPenal, recCarp, rDerpl, rDerp2,0101, rDerp2, rDerp2b, rDerp5, rDerp5a, rDerp7, rDerp8, rDerplO, rTyrp2, rLepd2,01, rLepdl3, rEurm2,0101, rFeldl, rFeldla, rBosd2, reprezentatívny alergén z mačky, reprezentatívny alergén zo psa, reprezentatívny alergén z BSA, reprezentatívny alergén z myši, reprezentatívny alergén z laboratórneho potkana, reprezentatívny alergén z ošípanej, reprezentatívny alergén z ovce, reprezentatívny alergén z kuraťa, reprezentatívny alergén z králika, reprezentatívny alergén zo škrečka, reprezentatívny alergén z koňa, reprezentatívny alergén z holuba, reprezentatívny alergén albumínu morčaťa, HSA, aNAC, rPenc3, Pennl3, rPencl9a, rPencl9b, rAspfl, rAspfla, rAspf3, rAspf3a, rAspf4, rAspf4a, rAspfó, rAspfóa, rAspfľ, rAspf8, rAltal, rAlta2, rMalfl, rMalf5, rMalfó, rMalfľ, rMalfE, rMalfí), rHevbl, rHevbl, rHevbla, rHevb3, rHevb8, rHevb9, rHevblO, rHevbl 1, rAK, eBlag2, rBlag4, rBlag5, fosfolipáza A, hyaluronidáza, rVesv5 a rVesg5.

V ďalšom výhodnom uskutočnení je jeden alebo viac synteticky pripravených alergénov imobilizovaných na mikromaticovom čipe. Tu platia rovnaké výhody proti alergénovým extraktom a taktiež proti purifikovaným natívnym alergénom, aké boli uvedené pre rekombinantné alergény. Spôsob syntetickej prípravy peptidov alebo proteínov je dobre známy v stave techniky, syntetickou prípravou alergénov je možné získať vysoko purifikované alergény vo veľkom množstve a pri nízkych nákladoch, pretože tieto metódy prípravy sú vysoko automatizované. Okrem toho presná sekvencia akéhokoľvek alergénu sa môže získať bez modifikácií alebo s modifikáciami, ktoré zvyšujú senzitivitu a spoľahlivosť spôsobu detekcie imunoglobulínov podľa vynálezu.

Taktiež je možné použitie iba alergénneho determinantu alebo alergénnej domény špecifického alergénu na testovanie podľa predkladaného vynálezu. Tým sa môžu vylúčiť riziká a nevýhody plynúce z práce s veľkými proteínmi, pretože s kratšími peptidovými štruktúrami sa ľahšie zachádza pri rutinnej príprave biočipov. To platí pre všetky purifikované natívne, rekombinantné a syntetické alergény. Toto by ďalej umožnilo detegovať jednopeptídové epitopy, čo by ešte viac zlepšilo diagnostický test a terapiu, najmä čo sa týka špecifickosti.

Výhodné je najmä poskytnúť natívnu formu alergénu a súčasne taktiež syntetickú alebo rekombinantnú formu alergénu na tom istom čipe. Zatiaľ čo je výhodné použiť hlavne rekombinantné alebo syntetické alergény, natívne formy alergénov môžu byť použité aspoň ako kontroly alebo ďalšie zdroje informácie o kvalite čipu. Výhodný čip podľa predkladaného vynálezu preto obsahuje natívnu a syntetickú alebo rekombinantnú formu aspoň jedného alergénu. To poskytuje taktiež zlepšenú kontrolu kvality a štandardizáciu rôznych šarží alergénov.

Výhodne je jeden alebo viac hapténov imobilizovaných ako alergény na mikromaticovom čipe. „Haptén“ je nizkomolekulárna (typicky s molekulovou hmotnosťou menšou ako približne 7000 Daltonov) látka, ktorá je všeobecne neschopná ako samotná vyvolať významnú tvorbu protilátok po podávaní do zvieracieho organizmu, vrátane človeka. To jc preto, že haptén je príliš malý na to, aby mohol byť rozpoznaný imunitným systémom organizmu. Ale keď je haptén kondenzovaný na väčšiu nosičovú molekulu, haptén získa antigénne vlastnosti. Inými slovami, väzba hapténu na nosičovú molekulu (čím vznikne kombinácia molekúl analytnosič) dovolí imunitnému systému organizmu rozpoznávať haptén. Imunoprecipitačná reakcia tak môže prebehnúť medzi hapténom (kondenzovaným na nosičovej molekule) a protilátkou proti hapténu. Prípravou hapténov, ktoré sú imobilizované na mikromaticovom čipe, sa môže dosiahnuť na čipe väčšia hustota.

Je samozrejme možné kombinovať uvedené rôzne formy alergénov, napr. použiť súčasne rekombinantné a (purifikované) natívne alergény. Kombinácia týchto rôznych foriem umožňuje porovnávať ich a taktiež napr. použiť ako kontrolu rekombinantné alergény pre rôzne šarže natívneho alergénu, ktoré môžu byť odlišné v dôsledku rozdielov v biologických zdrojoch, spôsobu prípravy, čistote a pod.

Pre vysoko účinné testy je výhodné použiť alergény, ktoré majú optimálne vlastnosti, napr. vysokú väzbovú schopnosť. Ale použitie menej alebo odlišne účinných antigénov je výhodné pri detekcii variantov alergénov s neúčinnou väzbou, napr. na použitie pri hyposenzitizačnej terapii.

Vo výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu sú alergény imobilizované na mikromaticový čip do „bodu“ alebo „škvrnky“ („spot“) s priemerom 10 až 2000 pm, výhodne 50 až 500 pm, ešte výhodnejšie 150 až 250 pm. Pretože tieto nanesené body majú malý priemer, je možné imobilizovať veľké množstvo rôznych alergénov a rôzne koncentrácie určitého alergénu v samostatných „bodoch“ mikromaticového čipu, čo dovoľuje pripraviť jediný mikromaticový čip, ktorý môže byť v jednom - automatizovanom - kroku použitý na analýzu veľkého počtu alergénov a/alebo mnohých rôznych koncentrácií alergénu.

Výhodne sú alergény imobilizované na pevnej fáze, výhodne na sklenenom nosiči, syntetickom nosiči, kremíkovom čipe alebo membráne, v danom poradí. Takéto čipy môžu byť vyrábané napríklad postupom opísaným v Ge, H. (2000), Nucleic Acids Research 28, e3 (i-vii), Qian W. a kol. (2000), Clinical Chemistry 46 (1456-1463), MacBeath G a kol. (2000), Science 289, (1760-1763), ktoré sú zahrnuté v predkladanej prihláške formou odkazu. Každý z týchto uvedených materiálov má špecifické vlastnosti a výhody, ktorc sú odborníkom známe. Teda vhodný materiál pre mikromaticový čip bude vybratý podľa alergénu, ktorý má byť testovaný, spôsobu detekcie naviazaných imunoglobulínov a použitých pufrov. Okrem toho, voľba vhodného materiálu je taktiež závislá od financií.

Výhodne je mikromaticový čip chemicky modifikovaný, výhodne aminoreaktívnymi a karboxyreaktívnymi modifikáciami, v danom poradí. To umožni presne stanoviť spôsob, akým sa alergén viaže na mikromaticový čip.

Výhodne sú alergény kovalentne viazané na mikromaticovom čipe. To poskytuje stabilnú väzbu alergénov na mikromaticovom čipe, a preto je spôsob podľa vynálezu mimoriadne spoľahlivý.

Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia predkladaného vynálezu sú imunoglobulíny detegované vo vzorke krvného séra. U pacientov, ktorí sú alergický na alergén, sa imunoglobulíny vytvárajú hlavne v krvnom sére, takže analýza krvného séra poskytuje spoľahlivý spôsob detekcie imunoglobulínov. Okrem toho, krvné sérum môže byť ľahko odoberané pacientom veľmi jednoduchým spôsobom a odber vzorky sa môže uskutočniť dokonca u pacienta doma.

Výhodne sa krvné sérum nariedi 1 : 1 až 1 : 15, výhodnejšie 1 : 5. Riedenie môže byť uskutočňované akýmkoľvek vhodným roztokom, napr. Ix TBST (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 % TWEEN 20).

Výhodne je potom vzorka inkubovaná 1 minútu až 24 hodín, výhodnejšie 1 až 2 hodiny, s alergénmi. Samozrejme je možné inkubovať vzorku s alergénmi dokonca aj počas viacerých dní. Ale to už nevedie k zvýšeniu intenzity signálu alebo špecifickosti. Všeobecne piati, že inkubácia počas 1 hodiny je dostatočná na získanie spoľahlivého a citlivého výsledku.

Okrem toho, vzorky s alergénmi sú výhodne inkubované pri teplote medzi 0 až 60 °C, výhodnejšie pri 37 °C. Inkubácia pri nižšej teplote nevedie k zvýšeniu signálu, alebo skôr vedie k zvýšeniu nešpecifickej väzby a hladiny šumu (pozadie). Inkubácia pri 37 °C poskytuje presné a spoľahlivé výsledky pre testy alergénov u ľudí.

Výhodne je naviazaný imunoglobulín detegovaný aspoň jednou značenou špecifickou anti-imunoglobulínovou protilátkou. Termín „protilátka“, ako sa v tomto texte používa, sa týka tak intaktnej molekuly protilátky, ako aj jej fragmentov, ako sú napríklad Fa, F(ab)₂ a Fv, ktoré sú schopné viazať sa na epitopový determinant. Protilátky môžu byť pripravené použitím intaktného polypeptidu alebo fragmentov obsahujúcich požadovaný malý peptid ako očkovací antigén. Polypeptid alebo peptid použitý na očkovanie zvieraťa môže byť pripravený transláciou RNA alebo môže byť syntetizovaný chemicky a môže byť kondenzovaný na nosičový proteín, ak je to potrebné. Všeobecne používané nosiče, ktoré sú chemicky kondenzované s peptidmi, zahŕňajú bovinný sérový albumín a tyreoglobulín. Kondenzovaný peptid je potom použitý na očkovanie zvieraťa (napr. myši, laboratórneho potkana alebo králika).

V kontexte predkladaného vynálezu termín protilátka zahŕňa tak monoklonálne ako polyklonálne protilátky, pričom monoklonálne protilátky môžu byť pripravené použitím akejkoľvek známej techniky, ktorá umožňuje produkovať protilátkové molekuly v kontinuálnej bunkovej kultúre. Patrí sem, ale bez obmedzenia, technika hybridómov, technika humánnych B lymfocytových hybridómov a IBV hybridómov. Okrem toho môžu byť pripravené chimérické protilátky, jednoreťazcové protilátky, a taktiež synteticky pripravené protilátky.

Protilátka môže byť značená ktorýmkoľvek známym spôsobom, ktorý dovoľuje kvalifikovať a výhodne aj kvantifikovať naviazané protilátky. Detegovateľné značky vhodné na použitie v predkladanom vynáleze zahŕňajú akúkoľvek kompozíciu detegovateľnú spektroskopickým, fotochemickým, biochemickým, imuno chemickým, elektrickým, optickým alebo chemickým spôsobom. K užitočným značkám patrí biotín na značenie pomocou kondenzácie so streptavidínom, magnetické (mikro)perličky, fluorescenčné farbivá (napr. fluoresceín, texaská červeň, rodamín, zelený fluorescenčný proteín a pod.), rádioaktívne značky alebo rádioznačky (napr. ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C alebo ³²P), enzýmy (napr. chrenová peroxidáza, alkalická fosfatáza a ďalšie bežne používané v ELISA testoch) a kolorimetrické značky ako je napríklad koloidné zlato alebo perličky z farbeného skla alebo plastu (napr. polystyrén, polypropylén, latex a pod.).

Prostriedky na detekciu uvedených značiek sú odborníkom známe. Tak napríklad rádioznačky sa môžu detegovať s použitím fotografického filmu alebo scintilačného počítača, fluorescenčné značky môžu byť detegované s použitím fotodetektorov detegujúcich vyžarované svetlo. Enzymatické značky sú typicky detegované tým, že sa enzýmu poskytne substrát a deteguje sa reakčný produkt vytvorený pôsobením enzýmu na substrát a kolorimetrické značky sú detegované tým, že sa jednoducho vizualizuje farebná značka.

Výhodne sú naviazané imunoglobulíny detegované použitím aspoň jednou fluorescenčné a rádioaktívne, v danom poradí, značenou špecifickou anti-imunoglobulínovou protilátkou. To sú klasické metódy kvalitatívnej a kvantitatívnej analýzy naviazaných protilátok, ktoré sú veľmi špecifické a veľmi spoľahlivé.

Iné výhodné detekčné systémy pre mikromatice sú napríklad systémy opísané v publikáciách: Schult K. a kol, (1999), Anál Chem, 71 (5430-5435), Vo-dinh T. a kol. (1999), Anál Chem, 71 (358-363), Brignac SJ Jr. a kol. (1999), IEEE Eng Med Biol Joumal, 18 (120-122), Otamiri M. a kol. (1999), Int J Biol Macromol, 26 (263-268), Wright, G1 Jr. a kol. (2000), Prostate cancer and Prostatic deseases, 2 (264-276), Nelson RW. A kol. (2000), Electrophoresis 21 (1155-1163), Rich RL. A kol. (2000), Curr Opin Biotechnol 11 (54-61), Chen JJ. a kol. (1998), Genomics, 51 (313-324), ktoré sú zahrnuté v tomto texte formou odkazu.

Výhodne sa ako alergény imobilizuje jeden alebo viacej vnútorných (domácich) alergénov. To sú napr. alergény roztočov Tyr. Dan., Lep. dest. or. mayrei, Felis, Bos, Albumín, Pen. cit., Pen. not. Asp. Fumigatus, Alt. alt., Malassezia furfur, Latex, Plodia a Blatella, bez toho, aby toto vymenovanie bolo obmedzujúce.

Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia sa ako alergény imobilizuje jeden alebo viacej vonkajších alergénov. To sú napr. alergény z Betula, Juniperus, Phleum, Parietaria judicea atd’., bez toho, aby toto vymenovanie bolo obmedzujúce.

A ďalej môžu byť ako alergény imobilizované jeden alebo viac potravinových alergénov, napr. alergén zo zeleru, karotky, arašidov, jablka, kreviet a rýb.

Ďalej môžu byť ako alergény imobilizované taktiež jeden alebo viac autoalergénov. Takýmito autoalergénmi sú napr. alergény pečeňovej membrány, ssDNA antigény v alebo na svalových bunkách kostrového svalstva bez toho, aby toto vymenovanie bolo obmedzujúce.

A ďalej môžu byť ako alergény imobilizované jeden alebo viacej jedových antigénov. To môžu byť napr. antigény z jedu včiel alebo ôs bez toho, aby toto vymenovanie bolo obmedzujúce.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu in vitro diagnózy alergií u pacienta, pričom spôsob spočíva v tom, že vzorka séra je odobratá od pacienta, potom je vzorka analyzovaná na imunoglobulíny, ktoré sa viažu na alergény spôsobom podľa predkladaného vynálezu, pričom je použitý mikromaticový čip, na ktorom je imobilizovaných aspoň 10, výhodne aspoň 50, ešte výhodnejšie aspoň 90 rôznych alergénov, potom sa deteguje kladná reakcia medzi vzorkou a imobilizovanými alergénmi a tá je diagnostikovaná ako alergia. Uvedené definície a výhody sa týkajú taktiež tohto spôsobu in vitro diagnózy alergií v porovnaní so známymi metódami diagnózy alergií. Spôsob podľa vynálezu má výhodu, že môže byť súčasne diagnostikovaný veľký počet alergií s iba jedinou vzorkou, pretože všetky alergény, ktoré majú byť testované, sú imobilizované na jednom jedinom mikromaticovom čipe. Každý krok je preto uskutočňovaný iba na jednom čipe, pričom čip môže ďalej obsahovať body, kde nie je imobilizovaný žiadny alergén, a tým poskytovať súčasnú negatívnu kontrolu detekcie. Počet alergénov, ktoré môžu byť testované, nie je nijako obmedzený, a v prípade potreby sa pripravia dva lebo viacej mikromaticových čipov.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka mikromaticového čipu, na ktorom je imobilizovaný jeden alebo viacej alergénov. Taktiež pre tento aspekt predkladaného vynálezu platia uvedené definície a výhody.

Výhodne sú alergény imobilizované v „bodoch“ s priemerom 100 až 500 pm, výhodnejšie s priemerom 200 až 300 pm.

Pre mikromaticový čip je výhodným nosičom sklo, syntetický nosič, kremíkový čip alebo membrána, v danom poradí.

Výhodne je mikromaticový čip chemicky modifikovaný, výhodne aminoreaktívnou a karboxyreaktívnou modifikáciou v danom poradí.

Výhodne sú alergény na mikromaticový čip kovalentne naviazané.

Ďalší aspekt podľa predkladaného vynálezu sa týka súpravy, ktorá obsahuje mikromaticový čip podľa predkladaného vynálezu, ako bol opísaný, a prvé činidlo obsahujúce aspoň detekčné činidlo najmenej jedného imunoglobulínu, výhodne anti-imunoglobulínovú protilátku, výhodne v známej koncentrácii, a prípadne druhé činidlo ako pozitívnu vzorku obsahujúcu aspoň jeden imunoglobulín, ktorý sa viaže na alergén. Prvé činidlo obsahujúce detekčné činidlo aspoň jedného imunoglobulínu, výhodne anti-imunoglobulínovú protilátku, môže byť použité na detekciu naviazaného imunoglobulínu, a v tomto prípade je anti-imunoglobu línová protilátka výhodne značená, ako bolo uvedené. Výhodne je protilátka prítomná v prvom činidle v známej koncentrácii, a preto umožňuje získavať v teste reprodukovateľné výsledky. Okrem toho, súprava výhodne obsahuje druhé činidlo ako pozitívnu vzorku obsahujúcu aspoň jeden imunoglobulín, ktorý sa viaže na alergén. Taktiež tuje výhodné, keď je imunoglobulín prítomný v známej koncentrácii v druhom činidle, a tak umožňuje kvantifikovať imunoglobulín prítomný vo vzorke tým, že sa porovnávajú výsledky zo vzorky od pacienta s výsledkami pozitívnej kontrolnej vzorky (t. j. druhého činidla).

Výhodne je súprava podľa vynálezu určená na uskutočnenie spôsobu podľa predkladaného vynálezu, ako bolo uvedené. Na tento účel sú prvé a druhé činidlo navrhnuté tak, aby umožnili detegovať jeden špecifický imunoglobulín, ktorý sa viaže na jeden špecifický alergén, alebo aby detegovali jednu špecifickú alergiu u pacienta. Ale, súprava môže byť taktiež navrhnutá tak, aby detegovala celý rad imunoglobulínov, ktoré viažu špecifické alergény, alebo detegovať tak celý rad alergií u pacienta.

Predkladaný vynález je ďalej podrobnejšie opísaný a vysvetlený v nasledujúcich príkladoch a pomocou obrázkov, ktoré v žiadnom prípade rozsah vynálezu nijako neobmedzujú.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje schému mikromatice alergénov.

Obr. 2 ukazuje snímok matice alergénov testovaných so sérom alergického jedinca.

Obr. 3a - 3c ukazujú test rozptylu (Scatterplot Test) z trojakého opakovania testu.

Obr. 4a - 4c ukazujú výsledky merania fluorescencie (v %) pre imobilizované extrakty a imobilizované rekombinantné alergény.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Nanášanie alergénov („spotting“)

Alergény boli nanesené do matice s použitím nanášacieho („spotovacieho“) zariadenia GMS 417 od firmy Genetic Microsystems. Proteíny boli nanesené na derivatizované podložky („sklíčka“). Individuálne alergény boli nanesené jediným dotykom jedného bodu a v troch opakovaniach (triplikáty). Body (t. j. škvrnky) mali priemer približne 200 pm.

Alergény sa usporiadali do funkčných skupín nasledujúcim spôsobom.

(A) Vonkajšie alergény (1. Stromy [l=rBetvl, 2=rBetv2, 3=rBetv4, 4=rJunO2, 5=Cassl], II. Trávy [6=rPhlp2, 7rPhlp4, 8rPhlp5a, 9rPhlpl, 10=rPhlp6, H=rPhlp7, 12rPhlpll, 13=rPhlpl2], III. Buriny [14=rParj2, 15=Artvla, 16=Mugwort profilin]).

(C) Potravinové alergény (X. Zeleniny [17=Apigl, 18=Apig1,0201, 19=Daucl,2, 20=rArah2, 21=rArah5], XI. Plody [22=Maldl, 23=Mald2], XII. Krevety [24=rPenal], XIII. Ryby (25=recCarpj).

(B) Vnútorné (domáce) alergény (IV. Roztoče [26rDerpl, 27rDerp2,0101, 28rDerp2, 29rDerp2b, 30rDerp5, 31=rDerp5a, 32=rDerp7, 33rDerp8, 34=rDerplO, 35=rTyrp2], V. Zvieratá [36=rLepd2,01, 37=rLepdl3, 38=rEurm2,0101, 39=rFeldl, 40=rFeldla, 41=rBosd2, 42=reprezentatívny alergén z mačky, 43=reprezentatívny alergén zo psa, 44=BSA, 45reprezentatívny alergén z myši, 46=reprezentatívny alergén z laboratórneho potkana, 47reprezentatívny alergén z ošípanej, 48=reprezentatívny alergén z ovce. 49-reprezentatívny alergén z kuraťa, 50=reprezentatívny alergén z králika, 51 reprezentatívny alergén zo škrečka, 52=reprezentatívny alergén z koňa, 53reprezentatívny alergén z holuba, 54=albumín z morčaťa], VI. Plesne [55=rPenc3, 56rPencl9a, 57=rPencl9b, 58=Pennl3, 59rAspfl, 60rAspf3, 61rAspf4, 62=rAspf6, 63rAspfla, 64rAspCa, 65=rAspf4a, 66=rAspf6a, 67=rAspf7, 68=rAspf8, 69rAltal, 70rAlta2], VII. Kvasinky [71rMalf7, 72rMalfl, 73rMalf5, 74=rMalf6, 75rMalf8, 76rMalf9], VIII. Latex [77=rHevbl, 78rHevbla, 79rHevb3, 80=rHevb8, 81rHevb9, 82=rHevbl0, 83rHevbll], IX. Hmyz [84=rAK, 85=rBlag2, 86rBlag4, 87rBlag5]).

(D) Jedy (XIV. Včela [88=Ag5, 89=Fosfolipáza, 90=Hyaluronidáza, 91=rVesv5, 92=rVesg5], XV. Osa [93=Ag5]).

(E) Autoalergény (94=HSA, 95=a-NAC).

Ďalej, body obsahujúce iba pufor boli rozmiestnené medzi podskupiny alergénov a slúžili ako kontrola pozadia, označené boli „X“, a ďalej „ab“ označuje protilátku, (pozri obr. 1: 1864x1182 pixlov, 1,86x1,18 cm, 1000 pixlov na cm, pixel hĺbka/farbiva 8/256/, 1 pixel zodpovedá 10 pm).

100 pm alikvóty alergénov boli rozdelené do jamiek 96 jamkovej mikrotitračnej doštičky v koncentrácii približne 200 ng/pl v nanášacom pufre (300 mM fosfátový pufor pH 8,5). Optimálna koncentrácia pre imobilizáciu alergénov bola určená titračným experimentom s niekoľkými alergénmi v rôznych pufrovacích roztokoch, a taktiež na rôznych sklíčkach. Testované proteíny mali saturačné chovanie v koncentrácii zhodnej ale10 bo vyššej ako 100 ng/μΐ, ako bolo zjavné z bieleho signálu konštantnej sily pri meraní GMS snímačom. Pri tejto koncentrácii bolo väzbové chovanie alergénov nezávislé od zloženia skladovacieho a nanášacieho pufra.

Príklad 2

SOPHIA (Test na imunosorbente v pevnej fáze)

Následne po inkubácii cez noc boli nosičové doštičky („sklíčka“) bud’to kúpené od firmy CEL Associates (aldehydové nosiče) alebo pripravené v laboratóriu pôvodcov boli premyté v lx TBST (10 mM Tris pH 8,0/150 mM NaCl/0,5% Tween 20) za energického trepania v kyvete Falcon pri teplote miestnosti. Ako blokovací krok sa sklíčka preniesli do lx TBST roztoku obsahujúceho 0,01 % BSA počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Následne boli sklíčka premyté v lx TBST počas 15 minút a potom krátko opláchnuté destilovanou vodou.

Alergénové matice boli inkubované s nariedeným sérom (1 : 5 v lxTBST) počas (aspoň) 60 minút pri 37 °C za trepania. Testovali sa rôzne stupne riedenia séra, v rozmedzí od 1 : 1 až 1 : 15. Obvykle riedenie 1 : 5 poskytlo najlepšie výsledky. 30 μΐ nariedeného séra sa pridalo ku sklíčku v uzatvárateľných komôrkach od firmy SIGMA Technologies. Komôrky boli použité podľa návodu výrobcov. Testovali sa rôzne inkubačné časy pre sérum v rozmedzí od 60 minút až po inkubáciu cez noc. Ale predĺžená inkubácia so sérom neviedla k zvýšeniu intenzity signálu ani špecifickosti signálu. Po inkubácii so sérom boli sklíčka premyté v lx TBST (15 minút, teplota okolia) za trepania.

Päť rôznych sér alergických pacientov, ktorí boli vyšetrení bežnými diagnostickými testami (test injekciou pod kožu, RAST, ELISA) a sérum z neatopického pacienta boli vybrané ako vhodné pre laboratórnu skúšku alergénovej matice. Jednotlivé séra boli testované aspoň dvakrát na alergénových čipoch pripravených vo dvoch várkach.

Fluorescenčné značená α-IgE protilátka značená fluorescenčným farbivom AlexaFluor podľa protokolu výrobcu (Molexular Probex) sa pridala k alergénovému čipu v roztoku obsahujúcom 0,01 % BSA/1X TBST a všetko sa inkubovalo počas 60 minút pri teplote miestnosti. Pracovné riedenie protilátky bolo v rozmedzí 1 : 1000 až 1 : 5000 v závislosti od času a účinnosti značenia. Po imunoteste sa sklíčka premyli lx TBST (15 minút, teplota miestnosti, trepanie) a potom krátko opláchli destilovanou vodou.

Následne po imunosorbentovom teste sa sklíčka vyhodnotili pomocou GMS dvojfarebného snímača. Všeobecne intenzita signálu sa iba veľmi málo menila pre rôzne testy a rôzne čipy. Ale hodnoty pozadia sa líšili v závislosti od typu použitého čipu. Príklad zobrazenia (scan) alergénovej matice testovanej so sérom pacienta trpiaceho alergiou je ukázaný na obr. 2. Tento pacient má silnú reakciu s antigénmi z Phleum, roztočov, mačky a včely (porovnaj obr. 1). Žiadny signál pozadia nebol pozorovaný pre nešpecifickú interakciu s bodmi, kde je iba pufor alebo autoalergény. Po kompletnom vyhodnotení výsledkov séra alergického pacienta sa dáta porovnali s dátami predtým získanými pre totožné séra testami RAST. Dáta získané spôsobom podľa predkladaného vynálezu boli v dobrej zhode s týmito dátovými súbormi.

Príklad 3

Test reprodukovateľnosti na sére pacienta C

Sérum pacienta C sa testovalo trikrát na individuálne pripravenom alergénovom mikročipe. Experimentálny postup bol v podstate zhodný s tým, ako bol opísaný.

Po teste boli sklíčka skenované s použitím totožného hardvérového nastavenia. Analýza dát sa uskutočnila s použitím softvérového balíka GenePix. Vypočítané priemerné hodnoty intenzity signálu pre každý alergén v troch opakovaniach boli porovnávané po troch opakovaniach experimentu.

Jedine hodnoty zodpovedajúce signálom, ktoré boli aspoň l,5x vyššie ako priemerná hodnota pre samotný pufor, boli vybraté na konečnú analýzu. Priemerná hodnota, smerodajná odchýlka a percento smerodajnej odchýlky pre relevantné signály sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 1.

Tabuľka 1

Alergén	Test 1	Test 2	Test 3	Priemer	Smer, odchýlka	% priem.
rBet v 1	20731	21325	25060	22372.00	1916,11	8,56
rPhi p 2	17176	15529	14227	15644.00	1206.67	7,71
R Phi p 4	36134	33511	29328	32991,00	2802,76	8,50
rPhi p 5a	56600	53068	55594	55087.33	1485.77	2,70
rPhi p 6	56244	51359	37625	48409,33	7882,14	16,28
rPhip 12	6291	7003	12289	8527,67	2675,50	31,37
rPar i 2	7552	7678	9444	8224,67	863,73	10,50
Art v la	6997	7931	11258	8728,67	1828,70	20,95
Mugwort profilin	7901	7669	9260	8276,67	701,74	8,48
Mal d 1	9890	15295	8176	11120,33	3033.74	27,28

Alergén	Test 1	Test 2	Test 3	Priemer	Smer, odchýlka	% priem.
HSA	9868	8732	10708	9769,33	809,71	8,29
Ovčí albumín	9858	8295	10222	9458,33	835,92	8,84
Konský albumín	9602	9061	10559	9740,67	619,37	6,36
rAsp f 1 (b)	12216	10129	10781	11042,00	871.77	7,90
rMalf5	13459	11018	12035	12170,67	1001.14	8,23
rAK	20680	14202	19978	18286,67	2902.48	15,87

Priemerná smerodajná odchýlka vypočítaná z hodnôt získaných pre tri individuálne testy bola 12,36 %. To znamená, že imunologický test na čipe, skúmajúci prítomnosť IgE v sére pacientov, je vysoko reprodukovateľný. To je taktiež zrejmé, keď sa kontroluje vynesenie jednotlivých nameraných bodov (scatter-plots) pochádzajúcich z trojnásobného testu 3, pozri obr. 3a - 3c, kde obr. 3a ukazuje vynesenie bodov testu 1 proti testu 3, obr. 3b vynesenie bodov testu 2 proti testu 3 a obr. 3c ukazuje vynesenie bodov testu 1 proti testu 2, A znamená alcrgény a FI intenzitu fluorescencie.

Príklad 4

Porovnanie rôznych mikročipov

Na otestovanie optimálneho čipu pre predkladaný vynález boli hodnotené individuálne pripravené nosiče podľa kritérií, ktoré sú nasledovne uvedené:

- Výrobný postup: čipy boli vyrobené a hodnotené podľa množstva parametrov, ako napríklad potreba nebezpečných chemických látok a čas výroby.

- Cena výroby: čipy pripravené v laboratóriu a komerčne dostupné boli porovnávané podľa ich ceny.

- Väzbová kapacita: rôzne čipy boli hodnotené podľa väzbovej kapacity fluorescenčné značených proteínov.

- Reprodukovateľnosti: sériové experimenty boli uskutočňované s odlišne ošetrenými čipmi a vyhodnotené podľa celkovej výkonnosti testu.

- Všeobecné pozadie: všetky čipy boli hodnotené pred a po teste alergie na systematický signál pozadia (šum), ktorý by pri detekcii mohol zmenšovať pomer signál k šumu.

- Detekčný limit: všetky čipy boli hodnotené na minimálnu proteínovú koncentráciu detegovateľnú na jeden bod (spot) v skríningovom teste alergie.

- Tolerancia séra: všeobecne, sérum pacienta je zložitá zmes proteínov, ktorá často narúša záporne imunotesty na čipe s rôznymi odbermi pacientovho séra.

- Blokovanie: všetky čipy boli hodnotené na nutnosť použiť blokovací krok pred vlastným testom alergie.

- Skladovanie: všetky čipy boli hodnotené z hľadiska dlhodobého skladovania od výroby alergénového čipu.

Výsledky opísanej štúdie sú ukázané v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Chémia reaktívneho povrchu/typ čipu

Výroba

Náklady

Väzbová kapacita

Špecifickosť

Reprodukovateľnosť

Pozadie (šum)

Detekčný limit

Skríning alergie

Blokovanie/ naviazanie

Skladovanie

Proteo Bind

+

-H-

++

4-4-

-t 1

4-4-

NIE

CEL(l)

/

H-

++

4-+

-

4-

-H-

ÁNO

•H-

3D-Link (2)

/

++

4-4-

+

4-

ÁNO

Superaldehyd (Ί)

/

4-

+

4-4-

-

T

4-

ANO

-H-

Aminosilán (3)

+

1 1

+

-

4-

NIE

4-4·

Glyoxal (3)

-

+

4-4- ,

—

__

-

4-

...

ÁNO

-H-

H? i

EGS (3)

-

+

-H-

1-T

-

4-

NIE

SulfoKMUS (3)

+

l-H-

q-

/

-

/

NIE

/

Glutaraldehyd (3)

-

±

/

--

-

/

-+

Fotozosietenie (3)

-

±

+

4

/

-

/

PEI/EGS (3)

4-

/

FAST čip (4)

/

+

--

-

NIE

4-4-

CAST čip (4)

/

+

4-

--

ÁNO

Nemodifikované sklo

4-+

-

/

--

. i 4.4.

--

/

Tabuľka 2 ukazuje výsledky vyhodnotenia štúdie opísanej v texte. (++) znamená vynikajúci výsledok, (+) dobrý, (-) slabší a (-) zlý. (/) znamená, že čip nebol testovaný pre túto konkrétnu kategóriu. (1) čipy obsahujúce funkčný povrch s aldehydovými skupinami. (2) čipy obsahujúce aminoreaktívny povrch, presné chémie ké vlastnosti nie sú známe. (3) čipy pripravené v laboratóriu s funkčnými skupinami, ako boli uvedené v tabuľke 2. (4) čipy obsahujúce membránu na imobilizáciu proteínov. ProteoBind je pracovný názov pre derivatizáciu povrchu prispôsobenú pre optimalizovaný výkon diagnostického testu na mikročipe obsahujúcom (1[3''-[trimetoxysilyl)propyl]-ľ(4-izotiokyanátofenyl)tiomočovinu), ktorý bol pripravený podľa Chen a kol. (Nucleic Acids Research, 199, vol. 27, č. 2, publikácia je zahrnutá formou odkazu v tomto texte).

Podľa prezentovaných výsledkov štúdie bol vybratý ProteoBind ako najlepšia povrchová derivatizácia na výrobu alergénových mikročipov.

Príklad 5

Porovnanie detekcie imunoglobulínu vo vzorke s imobilizovanými rekombinantnými alergénmi a s imobilizovaným extraktom.

Pre test citlivosti a diagnosticky relevantné informácie pomocou purifikovaných rekombinantných alergénov imobilizovaných na mikromaticovom čipe a alergénového extraktu imobilizovaného na mikromaticovom čipe, boli porovnané špecifické alergény jedného zdroja s alergénovým extraktom s rovnakým zdrojom.

Po imobilizácii preparátov alergénov na mikromaticový čip boli rôzne vzorky obsahujúce špecifické sérum pridané na mikročip a merala sa fluorescencia, ktorá zodpovedá množstvu protilátky viazanej na alergény. Výsledky sú ukázané v tabuľkách 3, 4 a 5 a taktiež na obrázkoch 4a, 4b a 4c, kde „FL“ znamená fluorescenciu. Z týchto výsledkov je jasné, že v prípade rekombinantných alergénov, detekcia a kvantitatívne vyhodnotenie sú omnoho citlivejšie ako v prípade alergénových extraktov. Fluorescenčná intenzita jednotlivého rekombinantného antigénu je významne vyššia ako fluorescenčná intenzita extraktu. Okrem toho, v prípade extraktu môže byť testovaný iba zdroj extraktu a nie je možné testovať, ktorý špecifický antigén zdroja je zodpovedný za alergiu, na rozdiel od detekcie s rekombinantnými alergénmi. Preto je spôsob diagnostiky podľa vynálezu s použitím jednotlivých purifikovaných alergénov, konkrétne rekombinantných alergénov, výhodnejší ako použitie extraktov obsahujúcich alergény.

Tabuľka 3

Grafl	Sérum 1-Sp	Sérum 4-Sp	Sérum 19-S	Sérum 30-S
Betv la	52028	62529	62932	18847
Bet v la Mut	6590	237	905	139
Betv ld	1576	14352	252	89
Bet v 2	2196	1408	273	1253
BP -Extrakt	21013	39438	11390	3174

Tabuľka 4

Graf 2	Sérum 5-Sp	Sérum 7-Sp .	Sérum 9-S	Sérum 17-S	Sérum 18-S	Sérum 40-S
Phl p 1	45611	12148	21588	5836	23497	23424
Phlpll	209	52043	814	2562	10984	14753
Phl p V	64005	63481	62953	40770	63530	62029
Phl - Extract	63987	40318	14504	10183	44405	19798

Tabuľka 5

(u;.f1 ' Sérum 11-Sp	Sérum 16-Sp	Sérum 39-S	Sérum 40-S
Hev b 3	416	387	108	235
Hcv b 5 Mal	350	519	30601	63897
Hev b 8	11146	7977	134	853
Hev b 9	460	631	105	188
IIcv b 10	360	429	73	152
Latex B - extrakt	264	202	80	3426
Latex C - extrakt	769	866	5343	30970

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Spôsob detekcie imunoglobulínu, ktorý sa viaže na alergén vo vzorke, vyznačujúci sa tým, že jeden alebo viac čistených alergénov je imobilizovaných na mikromaticovom čipe, na ktorom sa vzorka inkubuje s imobilizovanými alergénmi tak, že imunoglobulíny, ktoré sú špecifické pre alergény sa naviažu na špecifické alergény, a potom sú detegované imunoglobulíny, ktoré sú naviazané na špecifické imobilizované alergény t ý m , že ako imunoglobulíny sú detegované

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci IgE.

3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci IgG.

4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, tým, že ako imunoglobulíny sú detegované tým, že na mikromatiže na mikromatia tým tým, že alergény sú na tým, že alergény sú na tým, tým, tým, tým, tým, že alergény sú že alergény sú že alergény sú že alergény sú že mikromativyznačujúci sa tým, že imunoglobusa tým, že krvné sérum je nariedené 1 : 1 až vyznačujúci sa tým, že vzorka sa s v

covom čipe je imobilizovaný jeden alebo viacej rekombinantných alergénov.

5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, covom čipe je imobilizovaný jeden alebo viacej synteticky pripravených alergénov.

6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž5, vyznačujúci s viac hapténov je imobilizovaných ako alergény na mikromaticovom čipe.

7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa mikromaticovom čipe imobilizované ako škvrnky s priemerom 10 až 2000 pm.

8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa mikromaticovom čipe imobilizované ako škvrnky s priemerom 50 až 500 pm, výhodne 150 až 250 pm.

9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž8, vyznačujúci imobilizované ako mikromaticový čip na pevnej fáze.

10. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúci imobilizované ako mikromaticový čip na skle, respektíve syntetickom nosiči.

11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž8, vyznačujúci imobilizované ako mikromaticový čip na kremíkovej doštičke.

12. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúci imobilizované ako mikromaticový čip na membráne.

13. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, vyznačujúci cový čip je chemicky modifikovaný, výhodne aminoreaktívnou a karboxyreaktívnou modifikáciou.

14. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13, mikromaticovému čipu kovalentne naviazané.

15. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 14, líny sú detegované v krvnom sére ako vzorke.

16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci

1 : 15, výhodne 1 : 5.

17. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16, alergénmi inkubuje 1 minútu až 24 hodín, výhodne 1 až 2 hodiny.

18. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 17, vyznačujúci sa tým, že vzorka je inkubovaná s alergénmi pri teplote medzi 0 až 60 °C, výhodne pri 37 °C.

19. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 18, vyznačujúci sa tým, že naviazané imunoglobulíny sú detegované aspoň jednou značenou špecifickou anti-imunoglobulínovou protilátkou.

20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že naviazané imunoglobulíny sú detegované aspoň jednou fluorescenčné značenou špecifickou anti-imunoglobulínovou protilátkou.

21. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že naviazané imunoglobulíny sú detegované aspoň jednou rádioaktívne značenou špecifickou anti-imunoglobulínovou protilátkou.

z

22. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 21, vy sú imobilizované jeden alebo viacej vnútorných alergénov.

23. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 21, vy sú imobilizované jeden alebo viacej vonkajších alergénov.

24. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 21, vy n

n n

n

a č u j ú c i s a tým a č u j ú c i s a t ý m a č u j ú c i s a tým a č u j ú c i s a tým a č u j ú c i s a tým čujúci s a tým,

že ako alergény že ako alergény že ako alergény že ako alergény že ako alergény že sa vzorka séra z

sú imobilizované jeden alebo viacej potravinových alergénov.

25. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 21, v y z sú imobilizované jeden alebo viacej jedových alergénov.

26. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 21, v y z n sú imobilizované jeden alebo viac autoalergénov.

27. Spôsob in vitro diagnostiky alergií u pacienta, vyzná odobratá od pacienta analyzuje na imunoglobulíny, ktoré sa viažu na alergény spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 26, pričom je použitý mikromaticový čip, na ktoromje imobilizovaných aspoň 10, výhodne aspoň 50, ešte výhodnejšie aspoň 90 rôznych alergénov, a pozitívna reakcia medzi vzorkou a imobilizovaným alergénom je určená ako alergia.

28. Mikromaticový čip, vyznačujúci sa tým, že je na ňom imobilizovaný jeden alebo viacej čistených alergénov.

29. Mikromaticový čip podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že alergény sú imobilizované v škvrnkách s priemerom 100 až 500 pm, výhodne 200 až 300 pm.

30. Mikromaticový čip podľa nároku 28 alebo 29, vyznačujúci sa tým, že je ním sklo ako nosič.

31. Mikromaticový čip podľa nároku 28 alebo 29, tický nosič.

32. Mikromaticový čip podľa nároku 28 alebo 29, ková doštička.

33. Mikromaticový čip podľa nároku 28 alebo 29, brána.

vyznačujúci s a tým, že je ním synté- vyznačuj úci s a tým, ze je ním kremí- vyznačujúci s a tým, že je nim mem-

34. Mikromaticový čip podľa ktoréhokoľvek z nárokov 28 až 33, vyznačujúci sa tým, že je chemicky modifikovaný, výhodne aminoreaktívnou a karboxyreaktívnou modifikáciou.

35. Mikromaticový čip podľa ktoréhokoľvek z nárokov 28 až 34, vyznačujúci sa tým, že alergény sú k nemu kovalentné naviazané.

36. Súprava, vyznačujúca sa tým, že obsahuje mikromaticový čip podľa ktoréhokoľvek z nárokov 28 až 35, a prvé činidlo obsahujúce detekčné činidlo aspoň jedného imunoglobulínu, výhodne anti-imunoglobulínovú protilátku, výhodne v známej koncentrácii, a prípadne druhé činidlo ako pozitívna vzorka obsahujúce aspoň jeden imunoglobulín, ktorý sa viaže na alergén.