CN108802399A - 一种检测过敏原的新型蛋白质芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测过敏患者体液中过敏原抗体的蛋白质芯片。还公开了制备所述蛋白质芯片的具体方法。其中，该芯片可包括使用过敏原组分蛋白Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4和Pru p 7。该芯片具有高灵敏度和特异性、血清用量少、成本低等优点。

Description

一种检测过敏原的新型蛋白质芯片
技术领域
本发明总体上涉及生命科学领域，具体涉及一种检测过敏原抗体的蛋白质芯片和检测方法。本发明还公开了制备该蛋白质芯片的方法。
基金支持
国家自然科学基金(3147106)；中国医学科学院创新工程(2016-I2M-1-007，2016-I2M-1-008)；国家重点基础研究发展规划(2013CB530503)；十三五国家科技重大专项课题(2016YFA0101001，2016YFC0903900)；中国医学科学院基本科研业务项目(2016ZX310182-3)；中国医学科学院创新工程(2016-I2M-1-007)。
背景技术
过敏原检测是过敏性疾病诊断和治疗的关键环节，可分为体内和体外试验两种。体外试验是用患者的血液或其它体液进行离体检测，过敏原并不直接应用于人体，更加安全，同时少量血清一次即可完成多种过敏原的检测，是目前临床检测的主要手段。
最初的过敏原的体外检测是以混合的过敏原提取物为目标。过敏原提取物中与致敏无关的蛋白含量远高于特定过敏原，同时用于提取的样品及方法难以标准化，均会影响提取物中过敏原的含量，因而影响检测结果(李宏、张宏誉、胡鸢雷，等。花生过敏原Ara hl的基因克隆与原核表达，中华微生物学和免疫学杂志，2001,21:7-11.)。近年来，过敏原体外检测已经逐渐细化到分子水平，发展为组分检测。通过确定过敏原内引发过敏反应的特定分子，能够解释引起交叉反应的潜在分子基础，帮助医生评估过敏反应风险，为针对性的治疗提供指导。
蛋白质芯片技术是一项在临床和科研工作中广泛应用并不断发展的技术，可用于过敏原检测。将过敏原准确、定量、有序地加载到经过特殊处理可以吸附蛋白质的载体(例如玻璃片)上制成过敏原检测芯片，待测血清中特异性IgE可识别并结合在过敏原上，经过荧光标记抗体进行信号放大，可通过激光扫描获得阳性检测结果。但是因为在点样、孵育、漂洗、信号检测及结果判定每一个环节均可能对结果产生较大的影响，因此有一定的难度(江晓玲、郭兆彪、陈泽良，等。蛋白质芯片制作条件的优化，第一军医大学学报，2004,24:1230-1232)。
目前，过敏原组分检测的主要方法为ImmunoCAP法，使用的试剂大多由国外研发，价格昂贵。鉴于此，本研究表达纯化了桃的几种常见过敏原组分蛋白，结合蛋白芯片技术，制备了一款可以用于血清多种桃过敏原组分检测的蛋白质芯片，希望能为桃过敏原组分临床检测提供新的方法，并为后期开发包含更多过敏原组分的检测芯片积累经验。
发明内容
本发明的一个方面，提供了一种检测过敏患者体液中过敏原抗体的蛋白质芯片，所述蛋白质芯片包含蛋白质Pru p 1、Pru p 3和Pru p 4。
在本发明的一个实施例中，所述蛋白质芯片还包含由Pru p 7、过敏原提取物、牛血清白蛋白、鼠IgG和人IgE所组成的组中至少一种以上的物质。
在本发明的一个具体实施例中，所述蛋白质Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4或Pru p 7为重组蛋白质。
在本发明的一个具体实施例中，所述蛋白质Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4或Pru p 7为带有标签的重组蛋白。
在本发明的实施例中，所述体液包括血液、尿液、唾液、精液。
在本发明的一个具体实施例中，所述血液为血清或血浆。
在本发明的另一方面，提供了一种制备如上所述的任一蛋白质芯片的方法，其中，所述蛋白质芯片包含蛋白质Pru p 1、Pru p 3和Pru p 4。
在一个实施例中，所述蛋白质芯片还包含Pru p 7。
在一个具体实施例中，所述蛋白质芯片还包含以下中的至少一种：
a.过敏原提取物；
b.牛血清白蛋白；
c.鼠IgG；
d.人IgE。
在一个实施例中，在所述蛋白质芯片中每一个组分点样2次以上。
在一个具体实施例中，在所述蛋白质芯片中每一个组分点样8次以上。
在另一方面，本发明还提供了一种体外检测过敏患者体液中过敏原抗体的方法，其中，使用了如上所述的任一蛋白质芯片。
在一个具体实施例中，该方法包括以下步骤：
a).用封闭液封闭所述蛋白质芯片；
b).洗涤上述蛋白质芯片；
c).向蛋白质芯片孔滴加稀释后的体液和由抗标签的抗体、抗鼠IgG的抗体和抗人IgE的抗体所组成的组中至少一种以上的抗体，然后孵育；
d).洗涤经过孵育后的蛋白质芯片；
e).扫描获得荧光图像。
在一个具体实施例中，所述封闭液为3％的牛血清白蛋白。
在一个实施例中，所述标签包括Myc、His、GST、FLAG或HA。
在一个具体实施例中，所述体液优选为1:5稀释的血清。
附图说明
图1示出pGAPZαA结构图。
图2示出pUC57-Amp及pGAPZαA双酶切后电泳图。
图3示出纯化后蛋白SDS-PAGE及WB鉴定的图。
图4示出蛋白芯片点阵分布及标签抗体孵育的图。
图5示出代表性的蛋白芯片检测荧光扫描结果。
具体实施方式
菌株和载体
分别克隆有Pru p 1、Pru p 2、Pru p 3、Pru p 4、Pru p 7及Pru p glucanase基因的6种重组pUC57-Amp质粒(苏州金唯智公司)，毕赤酵母SMD1168(InvitrogenCorporation)，酵母表达质粒pGAPZαA(本实验室自存)，该质粒多克隆区上游有α-因子，酵母表达时可帮助目的基因分泌到胞外并被切割掉，同时下游有Myc及6×His标签，可用于检测(图1)。
试剂及配液
Xho I、Not I及Avr II限制性内切酶(NEB公司),Zeocin(Invitrogen公司)，mouseanti-His-tag mAb(MBL公司)，HRP标记goat anti mouse IgG(中杉金桥生物技术有限公司)，anti mouse IgG Alexfluo555(CST公司),anti human IgE Alexfluo488(Novus公司),蛋白点样液(1×PBS，30％甘油，0.05％Triton X-100)，桃过敏原提取物冻干粉(北京协和医院变态反应科提供)，牛血清白蛋白(BSA)(Sigma公司)，鼠IgG(Proteintech公司)，人IgE(Abcam公司)。
标本
疑似桃过敏患者血清41例，由北京协和医院变态反应科提供。患者知情并同意血清用于研究，且获得伦理委员会批准。
如本文所用，“过敏原提取物”是指从过敏原例如桃子为原料，按照对提取的最终产品的用途的需要，经过物理化学提取分离过程，定向获取和浓集植物中的某一种或多种有效成分，而不改变其有效成分结构而形成的产品。在本发明中，“过敏原提取物”不包括利用基因工程克隆表达纯化过敏原蛋白。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明。提供实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1：过敏原蛋白基因序列合成
确定6种主要的桃过敏原组分：Pru p 1、Pru p 2、Pru p 3、Pru p 4、Pru p 7及Pru p glucanase(见表1)，在GenBank数据库中查得编码区参考序列，优化序列以适合在酵母中表达，同时在5，及3，端添加Xho I、Not I酶切位点，设计好的序列送公司合成并分别克隆至pUC57-Amp质粒。
表1关键桃过敏原简介
实施例2：含目的桃过敏原组分基因的重组酵母表达载体构建、桃过敏原组分的表达和纯化
pUC57-Amp(含有目的基因)及pGAPZ A双酶切后分别回收目的基因及载体大片段(图2)，连接后测序结果示序列正确，Pru p 1、Pru p 2、Pru p 3、Pru p 4、Pru p 7、Pru pglucanase重组酵母表达载体均构建成功。
克隆有Pru p 1、Pru p 2、Pru p 3、Pru p 4、Pru p 7及Pru p glucanase的6种重组pUC57-Amp质粒及pGAPZαA质粒小量提取，Xho I、Not I双酶切，分别回收6种目的基因及载体大片段，连接、热激转化E.coli Trans-5α，测序正确的克隆株提取质粒10μg，Avr II单酶切线性化后酚氯仿抽提回收(约7～8μg)，电转SMD1168毕赤酵母，铺板至100mg/L Zeocin的YPDS琼脂培养基上筛选阳性克隆。PCR及Western Blot(抗His标签)鉴定，从中挑选PCR及Western Blot结果正确且Western Blot条带最明显的酵母株,优化表达条件后用做蛋白表达。扩大培养，离心收集上清，用AKTA avant过柱纯化，将UV280吸收峰处洗脱液(约3mL)全部移入3ku超滤管中滤至管底剩余约500μL，加3mL蛋白点样液超滤3次，以使蛋白样品中洗脱缓冲液更换为蛋白点样夜，完成后分装冻存。
表达载体单酶切线性化，电转SMD1168毕赤酵母，筛选到了可稳定表达Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4和Pru p 7的酵母株，未筛选到可表达Pru p 2和Pru p glucanase的酵母株。大量表达Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4和Pru p 7，纯化换液后，经SDS-PAGE灰度分析，4种桃过敏原组分蛋白纯度分别为68％、78％、90％、88％，WB结果显示可被抗His抗体识别(图3)。
实施例3：蛋白芯片制作、芯片质量控制
纯化换液后所得的过敏原蛋白Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4、Pru p 7及BSA(300mg/L,蛋白点样液稀释)、鼠IgG(300mg/L,蛋白点样液稀释)、人IgE(300mg/L,蛋白点样液稀释)和桃过敏原提取物(蛋白点样液溶解),共8种样品，用晶芯PersonalArrayer16个人点样仪依次点样，每个样品重复8个点，每张芯片重复以上点阵12个，排成2×6的阵列。点样完成后，室温干燥2h，抽真空后4℃保存，使用前粘贴多样品(2×6)围栏。
蛋白点阵分布如下示意图(图4A)，其中Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4、Pru p 7及桃提取物用于检测血清中是否有特异性IgE抗体，BSA为阴性质控点，鼠IgG和人IgE为阳性质控点。每张芯片按2×6的阵列重复点阵12个。质控芯片经His标签抗体孵育后扫描，可见蛋白点形状规整、圆润饱满、无拖尾现象，一致性良好，样品点(Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4和Pru p 7)荧光强度与阳性质控点(鼠IgG)相当，信号达到饱和(呈白色)，阴性质控点(BSA)信号弱(图4B)，结果符合预期，说明芯片可用于进一步的血清验证。
实施例4：临床样本检测
3％BSA,室温封闭芯片2h，0.1％PBST漂洗，甩干。质控组芯片每围栏孔中依次滴加30μL：anti-His-tag mAb(1ng/μL,孵育2h)和anti mouse IgG Alexfluo555(1ng/μL,孵育1h)；实验组芯片每围栏孔中依次滴加30μL：3％BSA 1:5稀释的血清(孵育2h)、anti humanIgE Alexfluo488(1ng/μL，孵育1h)、anti mouse IgG Alexfluo555(1ng/μL,孵育1h)，充分漂洗后300g离心5min，GenePix 4000B扫描(PMTgain650,power 10％)。计算41例血清样本Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4和Pru p 7的检测荧光强度均值。根据文献，Pru p 3为桃过敏主要过敏原，占到90％以上，Pru p 1、Pru p 4各在10％左右，Pru p 7无明确的统计结果报道。本实验中所用41例血清均来自于疑似桃过敏患者，故假定其过敏原分布与文献报道一致，则大多数血清为Pru p 3阳性，Pru p 1、Pru p 4及Pru p 7阴性，因此：以低于平均值-标准差定为Pru p 3检测阴性，以高于平均值+标准差定为Pru p 1、Pru p 4及Pru p 7检测阳性。
41例血清与芯片孵育后，扫描获得荧光图像，调整对比度及亮度，可见不同血清阵列间荧光强度存在差异(图5)。
以ImmunoCAP检测结果为标准，蛋白芯片法检测灵敏度＝蛋白芯片法检测正确判定为阳性的例数(即与ImmunoCAP结果一致)/ImmunoCAP检测阳性总例数，特异度＝蛋白芯片法检测正确判定为阴性的例数(即与ImmunoCAP结果一致)/ImmunoCAP检测阴性总例数。
41例血清样本Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4和Pru p 7的检测荧光强度分别为3728±2445、15958±10718、12537±12637和7888±4516。根据判断标准，蛋白芯片检测结果如表2所示。其中拿已有的用ImmunoCAP法对Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4的检测结果(表3)作为标准，计算出Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4蛋白芯片法检测灵敏度分别为：40％，100％，100％；特异度为：78％，50％，100％；综合Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4后总的灵敏度为86％，特异度为96％(表4)。而共有6例血清样本Pru p 7组分芯片检测为阳性，这些样品均来自桃过敏患者(表2)；而因为缺少ImmunoCAP法检测结果，没法计算其相应的灵敏度和特异性。
表2 41例血清蛋白芯片法过敏原检测结果
表3 41例血清ImmunoCAP法过敏原检测结果
表4蛋白芯片法与ImmunoCAP检测结果比对
本研究是针对不同组分的判定标准也按照情况进行了调整。阳性结果的判定标准是后期芯片优化的重要内容。
目前，文献报道过的过敏原检测蛋白质芯片，大多采用过敏原提取物点制，我们是国内首次使用过敏原组分进行芯片检测。结果发现，相比重组表达的过敏原组分，桃过敏原提取物的信号极弱，无法满足分析需要。可见，过敏原组分相比提取物有较大的优势。
通过引用并入
本文引用的每个专利文献和科学文献的全部公开内容通过引用并入本文用于所有目的。
等效
本发明可以在不脱离其基本特征的情况下以其他具体形式实施。因此，前述实施例被认为是说明性的，而不是对本文所述的本发明的限制。本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述说明书表示，并且意在将落入权利要求书的等同物的含义和范围内的所有改变包括在其中。

Claims (16)

1.一种检测过敏患者体液中过敏原抗体的蛋白质芯片，其特征在于，所述蛋白质芯片包含蛋白质Pru p 1、Pru p 3和Pru p 4。
2.如权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于，所述蛋白质芯片还包含由Pru p 7、过敏原提取物、牛血清白蛋白、鼠IgG和人IgE所组成的组中至少一种以上的物质。
3.如权利要求1或2所述的蛋白质芯片，其特征在于，蛋白质Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4或Pru p 7为重组蛋白质。
4.如权利要求1或2所述的蛋白质芯片，其特征在于，所述Pru p 1、Pru p 3、Pru p 4或Pru p 7为带有标签的重组蛋白。
5.如权利要求1或2所述的蛋白质芯片，其特征在于，所述体液包括血液、尿液、唾液、精液。
6.如权利要求5所述的蛋白质芯片，其特征在于，所述血液为血清或血浆。
7.一种制备如权利要求1或2所述的蛋白质芯片的方法，其特征在于，所述蛋白质芯片包含蛋白质Pru p 1、Pru p 3和Pru p 4。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白质芯片还包含Pru p 7。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述蛋白质芯片还包含以下中的至少一种：
a.过敏原提取物；
b.牛血清白蛋白；
c.鼠IgG；
d.人IgE。
10.如权利要求7至9任一项所述的方法，其特征在于，在所述蛋白质芯片中每一个组分点样2次以上。
11.如权利要求7至9任一项所述的方法，其特征在于，在所述蛋白质芯片中每一个组分点样8次以上。
12.一种体外检测过敏患者体液中过敏原抗体的方法，其特征在于，使用如权利要求1至6任一项所述的蛋白质芯片。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a).用封闭液封闭所述蛋白质芯片；
b).洗涤上述蛋白质芯片；
c).向蛋白质芯片孔滴加稀释后的体液和由抗标签的抗体、抗鼠IgG的抗体和抗人IgE的抗体所组成的组中至少一种以上的抗体，然后孵育；
d).洗涤经过孵育后的蛋白质芯片；
e).扫描获得荧光图像。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述封闭液为3％的牛血清白蛋白。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述标签包括MyC、His、GST、FLAG或HA。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述体液优选为1:5稀释的血清。
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