CN109554369B - 核酸适配体在识别并结合碱性磷酸酶异源二聚体中的应用 - Google Patents

核酸适配体在识别并结合碱性磷酸酶异源二聚体中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了核酸适配体在识别并结合碱性磷酸酶异源二聚体中的应用。本发明提供了一种核酸适配体或其衍生物，其核苷酸序列为序列表中序列1。发明首次发现核酸适配体BG2可以特异性识别并结合碱性磷酸酶异源二聚体，并利用核酸适配体BG2与碱性磷酸酶的特异性结合作用建立了检测碱性磷酸酶异源二聚体的方法。通过实验证明：本发明的核酸适配体BG2具有亲和力高、特异性强、无免疫原性和无毒性等特点，基于核酸适配体BG2建立的检测碱性磷酸酶异源二聚体的方法可用于碱性磷酸酶异源二聚体表达的检测和相关疾病的诊断的产品。

Description

核酸适配体在识别并结合碱性磷酸酶异源二聚体中的应用
技术领域
本发明属于生物技术与临床医学技术领域，具体涉及核酸适配体在识别并结合碱性磷酸酶异源二聚体的应用。
背景技术
核酸适配体(aptamer)是一类能与靶标物质特异性相互作用的单链DNA、RNA、肽核酸或化学修饰的核酸序列，通常由15-80个核苷酸组成。核酸适配体可以形成特定的三维结构与靶标分子高亲和力结合，如发卡、假结、G-四链体等结构，高特异性地结合作用是通过范德华力、氢键、静电作用和疏水作用等分子间相互作用实现的。由于核酸适配体具有亲和力高、特异性好、无免疫原性、易合成、改造与修饰、生物化学稳定性好、能可逆变性与复性等特性，所以被称之为“化学抗体”。
核酸适配体可被应用在一些疾病的诊断和检测、药物靶点定位、新药研发和运输相关药物分子等领域，目前，用于治疗癌症、艾滋病等疾病的核酸适配体也不断涌现。例如，由Eyetch/Pfizer开发的靶向VEGF的核酸适配体(商品名Macugen)2004年已获得FDA的批准，成功地用于治疗年龄相关的黄斑变性。近年提出的利用细胞-SELEX技术筛选特异性核酸适配体，进而发现肿瘤标志物的方法具有好的应用前景。但目前只有极少数成功的例子，其中的瓶颈问题就在于位于细胞膜上的核酸适配体靶分子的纯化/鉴定。
碱性磷酸酶(ALP或AKP)是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶，可直接参与磷代谢，在钙、磷的消化、吸收、分泌及骨化的过程发挥了重要作用。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已知人类同工酶包括：组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)，肠型碱性磷酸酶(IAP)，胎盘型碱性磷酸酶(PALP)和类胎盘型碱性磷酸酶(GCAP)。在临床医学上，测定血清中的碱性磷酸酶的活力已成为诊断和监测多种疾病的重要手段。血中肠型磷酸酶的异常可见于各类肠道疾病，也有文献报道某些消化系统疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤患者血中还可以出现免疫球蛋白复合物性碱性磷酸酶，其机理尚未清楚。碱性磷酸酶作为肿瘤组织的一个标志物也逐渐被人所认识。在免疫学研究方面，已广泛应用碱性磷酸酶标记抗体进行酶联荧光反应(ELISA)和Western印记分析。
发明内容
本发明一个目的是提供一种核酸适配体或其衍生物。
本发明提供的核酸适配体或其衍生物，为如下1)-7)中任一种：
1)序列1所示的单链DNA分子；
2)将1)所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
3)将1)所示的核酸适配体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
4)将1)所示的核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
5)由1)所示的核酸适配体编码的RNA分子，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物；
6)由1)所示的核酸适配体编码的肽核酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
7)将1)-6)任一所示的核酸适配体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团和/放射性核素，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物。
上述核酸适配体或其衍生物中，
所述核酸适配体的衍生物为去除或改变序列1所示的核酸适配体核苷酸序列自5’端第1个核苷酸起包括5’端第一个核苷酸残基的1-7个核苷酸；和/或，去除序列1所示的核酸适配体的核苷酸序列自3’端第1个核苷酸起包括3’端第一个核苷酸残基的1-7个核苷酸；或所述核酸适配体的衍生物为将序列1所示的核酸适配体核苷酸序列5’端或3’端增加若干个核苷酸或修饰基团且不影响序列1第10-36位形成的结构，保留的核苷酸残基组成的核酸适配体。
上述核酸适配体或其衍生物中，
所述核酸适配体的衍生物为如下1)-6)中任一种：
1)序列2所示的单链DNA分子；
2)序列3所示的单链DNA分子；
3)序列4所示的单链DNA分子；
4)序列5所示的单链DNA分子；
5)序列6所示的单链DNA分子。
6)序列7所示的单链DNA分子。
上述核酸适配体或其衍生物中，
核酸适配体衍生物为在1)-6)任一所示的核酸适配体的5’端或3’端标记荧光基团、生物素基团或放射性核素。
上述的核酸适配体或其衍生物在如下1)-18)至少一种中的应用也是本发明保护的范围：
1)富集提取碱性磷酸酶；
2)识别并结合或辅助识别并结合碱性磷酸酶；
3)识别并结合或辅助识别并结合表达碱性磷酸酶的细胞；
4)检测待测样品中碱性磷酸酶含量或活性；
5)检测待测样品中是否含有碱性磷酸酶；
6)检测与抗碱性磷酸酶的抗体结合的物质；
7)检测与碱性磷酸酶相互作用的蛋白；
8)制备富集提取碱性磷酸酶产品；
9)制备识别并结合或辅助识别并结合碱性磷酸酶产品；
10)制备检测待测样品中碱性磷酸酶含量或活性产品；
11)制备检测待测样品中是否含有碱性磷酸酶产品；
12)制备检测与抗碱性磷酸酶的抗体结合的物质产品；
13)制备检测与碱性磷酸酶相互作用的蛋白产品；
14)制备诊断和/或治疗与碱性磷酸酶异源二聚体相关疾病的产品；
15)捕获和/或检测碱性磷酸酶异源二聚体阳性表达细胞或外泌体；
16)制备捕获和/或检测碱性磷酸酶异源二聚体阳性表达细胞或外泌体的产品；
17)制备用于靶向碱性磷酸酶异源二聚体的动物成像的探针；
18)制备用于靶向碱性磷酸酶异源二聚体的治疗产品。
上述应用中，所述碱性磷酸酶为异源二聚体碱性磷酸酶；
所述碱性磷酸酶为PALP、IAP、GCAP或任意的异源二聚体。
上述应用中，所述待测样品为细胞、蛋白、培养基、血清或血液；
或，所述细胞为表达碱性磷酸酶异源二聚体的肿瘤细胞；
或，所述表达碱性磷酸酶异源二聚体的肿瘤细胞具体为人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、人结肠癌细胞或人肝细胞癌细胞；
或，所述待测样品为表达碱性磷酸酶异源二聚体的动物或人。
本发明另一个目的是提供一种具有如下功能的产品，其活性成分上述核酸适配体或其衍生物；
所述功能为如下1)-11)中至少一种：
1)富集提取碱性磷酸酶；
2)识别并结合或辅助识别并结合碱性磷酸酶；
3)识别并结合或辅助识别并结合表达碱性磷酸酶的细胞；
4)检测待测样品中碱性磷酸酶含量或活性；
5)检测待测样品中是否含有碱性磷酸酶；
6)检测与抗碱性磷酸酶的抗体结合的物质；
7)检测与碱性磷酸酶相互作用的蛋白；
8)诊断和/或治疗与碱性磷酸酶异源二聚体相关疾病；
9)捕获和/或检测碱性磷酸酶异源二聚体阳性表达细胞或外泌体；
10)检测碱性磷酸酶异源二聚体的动物成像探针；
11)靶向碱性磷酸酶异源二聚体的治疗药物。
上述碱性磷酸酶异源二聚体是指由组织特性碱性磷酸酶肠型碱性磷酸酶(IAP)与胎盘型碱性磷酸酶(PALP)或类胎盘型碱性磷酸酶(GCAP)形成的异源二聚体。
本发明首次发现核酸适配体BG2可以特异性识别并结合碱性磷酸酶异源二聚体，并利用核酸适配体BG2与碱性磷酸酶的特异性结合作用建立了检测碱性磷酸酶异源二聚体的方法。通过实验证明：本发明的核酸适配体BG2具有亲和力高、特异性强、无免疫原性和无毒性等特点，基于核酸适配体BG2建立的检测碱性磷酸酶异源二聚体的方法可用于碱性磷酸酶异源二聚体表达的检测和相关疾病的诊断的产品。
附图说明
图1为核酸适配体BG2的二级结构、核酸适配体BG2及其衍生物的表观结合常数、竞争实验。
图2为用核酸适配体检测细胞表面碱性磷酸酶异源二聚体的表达情况。
图3为胎盘型碱性磷酸酶(PALP)和肠型碱性磷酸酶(IAP)分别敲降后，核酸适配体BG2的结合情况。
图4为PC-3细胞表面分布表达胎盘型碱性磷酸酶(PALP)、肠型碱性磷酸酶(IAP)、生殖细胞碱性磷酸酶(GCAP)或其异源二聚体蛋白后，核酸适配体BG2的结合情况。
图5为核酸适配体BG2对碱性磷酸酶异源二聚体阳性细胞的捕获情况。
图6为核酸适配体BG2捕获含碱性磷酸酶异源二聚体外泌体的情况。
图7为利用用核酸适配体BG2提取的碱性磷酸酶活性测定。
图8为核酸适配体BG2实现LoVo细胞碱性磷酸酶异源二聚体表达的细胞成像。
图9为BG2适配体用于组织切片免疫染色(上图：对照序列L45；下图：适配体BG2)。
图10为BG2适配体用活体动物成像(左侧：活动物；右侧：离体肿瘤)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
结合缓冲溶液(pH＝7.4)：含137mM NaCl、5mM MgCl2、2.7mM KCl、2mM KH2PO4、10mMNa2HPO4，25mM葡萄糖，1μg/ml BSA，0.1μg/ml鲱鱼精DNA和0.01％(v/v)吐温-80，其余为水。
洗脱缓冲液(pH＝8.0)：含137mM NaCl、5mM MgCl2、2.7mM KCl、2mM KH2PO4、10mMNa2HPO4和25mM葡萄糖，其余为水。
实施例1、核酸适体的筛选和制备
一、细胞的培养
人结肠癌细胞LoVo、人乳腺癌细胞MCF-7、人宫颈癌细胞Hela用RPMI 1640(含10％胎牛血清、1％青/链霉素)培养。所有细胞均在培养箱中进行常规培养(37℃，5％CO2)，每两-三天传代一次。
二、随机核酸文库的设计
设计两端包括20个固定核苷酸、中间包括45个核苷酸的随机文库如下：5’-ACGCTCGGATGCCACTACAGtYRRRRRRnnGGGNNNGGNNNGGNNGGnnNNNNnnGGnYYYYYYRtCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’；N代表45个A、T、C或G的随机核苷酸序列。
三、核酸适体的筛选和表征
1、文库预处理
将10nmol随机核酸文库(步骤二中合成)溶于结合缓冲液，95℃变性5min，冰上冷却10min，室温复性放置30min。
2、正筛
将各1×106人结肠癌细胞LoVo、人乳腺癌细胞MCF-7和人宫颈癌细胞Hela用含5mMEDTA的PBS消化10min后，混匀，用洗涤缓冲溶液洗涤1次后，加入上述DNA文库孵育。孵育30min后离心去掉上清，用洗涤缓冲溶液洗涤2次，结合在细胞上的DNA分子直接用于PCR。PCR扩增的正向引物为：
5'-FAM-ACGCTCGGATGCC ACTACAG-3'；
反向引物：
5'-biotin-GTC ACC AGC ACG TCC ATG AG
PCR扩增程序：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，10个循环；72℃，5min。
用链霉亲和素琼脂糖球从PCR产物中分离得到FAM标记的单链DNA(ssDNA)序列。将得到的ssDNA用NAP-5柱子(通用电气医疗集团，瑞典)脱盐，真空干燥，用于下一轮的筛选。
为了提高核酸适体的亲和力和特异性，在筛选过程中逐步增加洗涤次数、减少正筛细胞数量，以增加筛选的压力。5轮筛选后，进行高通量测序。
去掉引物后得到的核酸适体BG2如下：
5'-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3'(序列1)。
3、核酸适配体亲和力表征
取一皿对数生长期的结肠癌细胞LoVo，用含0.2％EDTA的PBS消化成单分散细胞悬液后平均分成若干份，分别与标记荧光分子的核酸适配体探针溶液孵育30min后，用洗涤缓冲液洗涤两遍，用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。以细胞表面平均荧光强度和核酸适体浓度作图，利用公式Y＝BmaxX(Kd+X)计算核酸适体的平衡解离常数Kd。
4、BG2核酸适体及其衍生物结合情况
经测定BG2核酸适配体表观解离常数为2.5±0.3nM。为了研究序列1延伸后对其结合的影响，进一步测定了加上引物序列的亲和力，其序列为：
5'-ACGCTCGGATGCCACTACAGt
CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG
tCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3'(序列2,BG2核酸适体衍生物)
经测定其仍然保持很好的结合力，其表观解离常数为2.9±0.4nM。
如图1所示，序列1经结构分析后，发现可以形成环-茎结构，设计并合成一系列经截短的核酸序列，通过荧光染料修饰，然后考察它们与LoVo的结合能力，挑选结合能力最强的序列用于进一步的应用，最终得到的截短核酸适体序列如下：
核酸适体BG2c:
GGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGG(序列3,BG2核酸适体衍生物)
由图1D所示，适配体截短，其亲和力有一定程度的降低(9.3±1.6nM)。
说明GGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGG是该适配体与靶标作用的核心区域。
保留环区序列，对序列1的茎进行了随机的替换，例如序列4：
5‘-TAAGAAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTTCTTA-3’(序列4,BG2核酸适体衍生物)；
序列5：
5‘-GATAACATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTGTTATC-3’(序列5,BG2核酸适体衍生物)
经测定序列4和序列5的表观解离常数分别为：5.7±0.4nM和3.0±0.5nM，说明仍然保持良好的亲和力。
为了提高核酸适配体的稳定性，对核酸适配体BG2进行了硫代修饰，序列如：
5'-
sCsAsAsGsGsAsATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCsTsTsCsCsTsTsG-3'(序列6,BG2核酸适体衍生物)，其中sA，sT,sG，sC分别为硫代修饰
经测定硫代修饰的核酸适配体仍然保持很好的亲和力，其表观解离常数为3.5±0.6nM。
5、BG2核酸适体衍生物与BG2核酸适配体的竞争
将荧光素标记的核酸适配体BG2(BG2-FAM，100nM)分别与未标记荧光分子的BG2核酸适配体及其衍生物(4μM)混合，分别加入约5×104个LoVo细胞数，分别得到混合液，将混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍，过400目筛网后，上流式细胞仪进行检测。除上述BG2衍生物外，还包括BG2环区序列：
序列7：5‘-TAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGC-3’(序列7)；
对照核酸序列L45的核苷酸序列：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。
结果如图1H所示，未标记荧光BG2核酸适体(序列1)及代表性其衍生物(序列2-7)都能够与荧光素标记的BG2核酸适配体结合，说明BG2的衍生物具有与BG2核酸适配体相同的功能。
实施例2、核酸适配体BG2与不同类型细胞结合情况的研究
一、核酸适配体BG2及其衍生物的制备
1、核酸适配体BG2的合成
通过DNA合成仪合成核酸适配体BG2，核酸适配体BG2的核苷酸序列如下：5’-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3’(序列1)，根据试验需要可以在核酸适配体BG2上标记不同的分子。
2、DNA脱保护：用冷氨水脱保护后，然后把DNA溶解在TEAA溶液当中；
3、DNA纯化：通过PAGE或高效液相色谱仪纯化；
4、DNA干燥：通过离心浓缩干燥；
5、溶解测定浓度备用。
二、荧光素标记的核酸适配体BG2溶液(BG2-FAM)的制备
1、荧光素标记的核酸适配体BG2-FAM
荧光素标记的核酸适配体BG2为在核酸适配体BG2的5’端偶联荧光素基团FAM得到的，用结合缓冲液溶解BG2-FAM，依据紫外吸收标定浓度(200nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
2、荧光素标记的对照核酸序列溶液(L45-FAM)(200nM)的制备
荧光素标记的对照核酸序列L45(L45-FAM)为在对照核酸序列L45的5’端偶联荧光素基团FAM得到的，用结合缓冲液溶解L45-FAM，依据紫外吸收标定浓度(100nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
对照核酸序列L45的核苷酸序列：TTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。
二、细胞株的预处理
分别取如下9种生长对数期的细胞株各一皿：人宫颈癌细胞(Hela)、人肝细胞癌细胞(SMMC7721)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人胚胎肾细胞(HEK-293)、和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)和人白血病细胞(Jurkat E6-1)购自中国医学科学院基础医学研究所；人结肠癌细胞(LoVo)、人肝细胞癌细胞(SMMC7721)、人肝细胞癌细胞(HepG2)、人结肠癌细胞(HCT116)、人前列腺癌细胞(PC3)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，用5mMEDTA的PBS消化成单分散细胞悬液后，用洗涤缓冲液洗涤2遍，分为若干份，每份细胞数为5×104个；分别将悬浮生长的人白血病细胞(Jurkat E6-1)直接吹散后用洗涤缓冲液洗涤2遍，平均分为若干份，每份细胞数为5×104个。
三、用抗体表征细胞系异源二聚体表达情况
用5mM EDTA的PBS消化细胞成单分散细胞悬液后，用洗涤缓冲液洗涤2遍。然后上述细胞分分别加入10ug/mL的anti-IAP抗体(货号：GTX60746，GeneTex公司)或10ug/mL的anti-PALP抗体(货号：MA1-20245孵育30min，洗涤一次后，加入4ug/mL抗小鼠m-IgGκBP-PE抗体(sc-516141)孵育30min，洗涤一次后重悬细胞，上流式细胞仪检测。
四、核酸适配体BG2检测细胞株
将实施例2的步骤一制备的荧光素标记的核酸适配体BG2(BG2-FAM)、荧光素标记的对照核酸序列L-45(L45-FAM)分别与10种不同来源的细胞系混合(每份细胞数为5×104个)，分别得到混合液，将混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍，过400目筛网后，上流式细胞仪进行检测。
用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪收集第一通道的荧光强度数据，作为细胞表面的荧光强度。每个样品的仪器测得荧光强度扣除细胞自发荧光，得到每个样品结合在细胞表面的核酸适体的荧光强度。
用anti-IAP抗体(货号：GTX60746，GeneTex公司)或anti-PALP抗体(货号：MA1-20245)分别证实人结肠癌细胞(LoVo)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人宫颈癌细胞(Hela)、人肝细胞癌细胞(SMMC7721)和人肝细胞癌细胞(HepG2)表达碱性磷酸酶异源二聚体，HCT116细胞低表达碱性磷酸酶异源二聚体，而PC-3细胞、Jurkat细胞、SH-SY5Y细胞和HEK293细胞则不表达碱性磷酸酶异源二聚体。
结果如图2所示，可以看出，荧光素标记的核酸适配体BG2与人结肠癌细胞(LoVo)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人宫颈癌细胞(Hela)、人肝细胞癌细胞(SMMC7721)和人肝细胞癌细胞(HepG2)结合，而与HCT116细胞弱结合，与PC-3细胞、Jurkat细胞、SH-SY5Y细胞和HEK293细胞等不结合。
实施例3、核酸适配体BG2与碱性磷酸酶异源二聚体结合的研究
一、核酸适配体BG2及其衍生物的制备
1、核酸适配体BG2的合成
通过DNA合成仪合成核酸适配体BG2，核酸适配体BG2的核苷酸序列如下：5’-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3’，根据试验需要可以在核酸适配体BG2上标记不同的分子。其中，本实施例中选择了荧光素(FAM)标记核酸适配体BG2。
2、DNA脱保护：用冷氨水脱保护后，然后把DNA溶解在TEAA溶液当中；
3、DNA纯化：通过PAGE或高效液相色谱仪纯化；
4、DNA干燥：通过离心浓缩干燥；
5、溶解测定浓度备用。
二、荧光素标记的核酸适配体BG2溶液(BG2-FAM)的制备
1、荧光素标记的核酸适配体BG2-FAM
荧光素标记的核酸适配体BG2为在核酸适配体BG2的5’端偶联荧光素基团FAM得到的，用结合缓冲液溶解BG2-FAM，依据紫外吸收标定浓度(200nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
2、荧光素标记的对照核酸序列溶液(L45-FAM)(200nM)的制备
荧光素标记的对照核酸序列L45(L45-FAM)为在对照核酸序列L45的5’端偶联荧光素基团FAM得到的，用结合缓冲液溶解L45-FAM，依据紫外吸收标定浓度(100nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
对照核酸序列L45的核苷酸序列：TTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。
二、碱性磷酸酶的敲降实验
1、转染前一天，约3×105个LoVo细胞接种在6孔板中，含有2mL的FBS和双抗的1640培养基。
2、待细胞生长至70-90％时，更换为2mL无双抗的1640完全培养基。
3、按照
Figure BDA0001567636360000091
RNAiMAX试剂(货号：13778-075)的相关说明，在125ul的无血清Opti-MEM培养基中加入40pmol的siRNA(其中ALPI的siRNA为：ALPI-homo-1288，正义序列(5‘-3’)：GCAAAGCCUACACGUCCAUTT，反义序列(5’-3’):AUGGACGUGUAGGCUUUGCTT；PALP的siRNA为：PALP-homo-947，正义序列(5‘-3’)：GAGACAUGAAAUACGAGAUTT，反义序列(5’-3’):AUCUCGUAUUUCAUGUCUCTT)混匀。
4、8uL
Figure BDA0001567636360000101
RNAiMAX试剂中加入125uL无血清Opti-MEM培养基稀释，混匀。
5、将上述稀释好的2种碱性磷酸酶siRNA分别与
Figure BDA0001567636360000102
RNAiMAX试剂1：1混合并混匀，室温放置5分钟。
6、将250uL的siRNA和
Figure BDA0001567636360000103
RNAiMAX混合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回摇晃细胞培养板。
7、细胞在CO2培养箱中37℃中培养72小时。
8、用5mM EDTA的PBS消化细胞成单分散细胞悬液后，用洗涤缓冲液洗涤2遍。然后上述细胞分别加入200nM BG2，将混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍，过400目筛网后，上流式细胞仪进行检测；取另一部分细胞分别加入10ug/mL的anti-IAP抗体(货号：GTX60746，GeneTex公司)或10ug/mL的anti-PALP抗体(货号：MA1-20245孵育30min，洗涤一次后，加入4ug/mL抗小鼠m-IgGκBP-PE抗体(sc-516141)孵育30min，洗涤一次后重悬细胞，上流式细胞仪检测。
结果如图3所示，分别用IAP蛋白的siRNA(siIAP)或PALP蛋白的siRNA(siPALP)蛋白敲降后，核酸适配体BG2与靶细胞LoVo的结合都降低。
三、碱性磷酸酶过表达实验
1、转染前一天，约4×105个PC-3细胞接种在6孔板中，含有2mL的FBS和双抗的1640培养基。
2、待细胞生长至80-90％时，更换为2mL无双抗的1640完全培养基。
3、按照
Figure BDA0001567636360000104
3000试剂(货号：L3000008)的相关说明，在125ul的无血清Opti-MEM培养基中分别加入3ug的IAP、PALP或GCAP质粒(将IAP(P09923，uniprot数据库基因的ID)和PALP(P05187，uniprot数据库基因的ID)序列插入pCMV-myc载体的Xho1andEcoR1酶切位点间；将GCAP(P10696，uniprot数据库基因的ID)序列插入pcDNA3.1(-)载体的Xho1和Bamh1酶切位点之间)，5ul P3000TM试剂混匀。
4、5uL
Figure BDA0001567636360000105
3000试剂试剂中加入125uL无血清Opti-MEM培养基稀释，混匀。
5、将上述稀释好的质粒和
Figure BDA0001567636360000106
3000试剂1：1混合并混匀，室温放置5分钟。
6、将250uL的质粒和
Figure BDA0001567636360000107
3000试剂混合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回摇晃细胞培养板。
7、细胞在CO2培养箱中37℃中培养48小时。
8、用5mM EDTA的PBS消化细胞成单分散细胞悬液后，用洗涤缓冲液洗涤2遍。然后上述细胞分别加入200nM BG2，将混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍，过400目筛网后，上流式细胞仪进行检测；取另一部分细胞分别加入10ug/mL的anti-IAP抗体(货号：GTX60746，GeneTex公司)或10ug/mL的anti-PALP抗体(货号：MA1-20245孵育30min，洗涤一次后，加入4ug/mL抗小鼠m-IgGκBP-PE抗体(sc-516141)孵育30min，洗涤一次后重悬细胞，上流式细胞仪检测。
结果如图4所示，将阴性细胞分别转染PALP质粒、IAP质粒或GCAP质粒后，用其抗体测得它们的蛋白在细胞膜表面都有所表达，但是适配体BG2仍不与细胞结合，只有其IAP蛋白和PALP蛋白或IAP蛋白和GCAP蛋白同时表达时，核酸适配体才能够与BG2结合。说明该核酸适配体BG2可以与IAP/PALP或IAP/GCAP异源二聚体结合。
实施例4、核酸适配体BG2对碱性磷酸酶异源二聚体阳性表达细胞或外泌体的捕获
一、核酸适配体BG2对碱性磷酸酶异源二聚体阳性表达细胞捕获
1、偶联核酸适配体BG2的磁球和偶联对照核酸序列L45磁球的制备
(1)偶联核酸适配体BG2的磁球制备
生物素标记的核酸适配体BG2(BG2-Bio)为在核酸适配体BG2的5’端偶联生物素基团得到的，用结合缓冲液溶解BG2-Bio，依据紫外吸收标定浓度(200nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。取100ul链霉亲和素修饰的磁球(货号：112.05D，Invitrogen Dynal AS,挪威)溶液，加入1mLPBS，震荡，置于磁力架，洗涤2次。然后将上述处理的核酸适配体磁微球在室温孵育30min，然后用PBS洗涤2次。
(2)生物素标记的对照核酸序列L45(L45-Bio)
生物素标记的对照核酸序列L45(L45-Bio)为在对照核酸序列L45的5’端偶联生物素基团Bio得到的，用结合缓冲液溶解L45-Bio，依据紫外吸收标定浓度(200nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
对照核酸序列L45的核苷酸序列：TTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。
取100ul链霉亲和素修饰的磁球(货号：112.05D，Invitrogen Dynal AS,挪威)溶液，加入1mLPBS，震荡，置于磁力架，洗涤2次。然后将上述处理的核酸适配体磁微球在室温孵育30min，然后用PBS洗涤2次。
2、功能化的微球捕获细胞
取1×105个指数生长期的LOVO细胞或PC-3细胞，用含5mM EDTA的PBS消化，PBS溶液洗涤2次，分别与BG2修饰的磁微球和对照核酸序列L45修饰的磁微球室温孵育30分钟。然置于磁力架洗涤3次X3分钟，去除没有与磁球结合的细胞，PBS重悬磁球-细胞复合物，重复分散，显微镜下观察并拍照。
结果如图5所示，BG2修饰的磁球可以捕获表达碱性磷酸酶异源二聚体的LoVo细胞，但不可以捕获碱性磷酸酶异源二聚体阴性表达的PC-3细胞；而对照序列修饰的磁球无法捕获任何一种细胞。这说明BG2核酸适配体可以用于碱性磷酸酶异源二聚体阳性表达细胞的捕获或富集。
二、核酸适配体BG2对碱性磷酸酶异源二聚体阳性表达的外泌体的捕获
1、生物素标记的核酸适配体BG2-biotin
生物素标记的核酸适配体BG2为在核酸适配体BG2的5’端偶联生物素基团得到的，用结合缓冲液溶解BG2-biotin，依据紫外吸收标定浓度(2μM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
2、生物素标记的核酸适配体L45-biotin
生物素标记的L45为在对照序列L45的5’端偶联生物素基团得到的，用结合缓冲液溶解L45-biotin，依据紫外吸收标定浓度(2μM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
对照核酸序列L45的核苷酸序列：TTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。
3、1×106/mL LOVO细胞或PC3细胞在含有10％FBS的RPMI 1640培养基中，在二氧化碳培养箱中培养72h，吸取培养基上清。
4、培养基3000r/min离心10min，去除细胞碎片和死细胞，取1ml培养基，加入终浓度为50nM L45-biotin或BG2-biotin序列(含0.1mg/mL鲱鱼精DNA)，孵育30min。
5、然后分别加入10μL链霉亲和素修饰的糖球(GE公司，货号：17-5113-01)，孵育30min.
6、用PBS洗涤上述步骤(5)孵育后的链霉亲和素修饰的琼脂糖微球，洗涤2次。
7、用碧云天生产的碱性磷酸酶检测试剂盒(P0321)测定BG2提取的含有碱性磷酸酶异源二聚体的外泌体的碱性磷酸酶的活性。
如图6所示，核酸适配体BG2可以直接在培养基中捕获含有碱性磷酸酶异源二聚体的外泌体，而对照序列则无法捕获；而碱性磷酸酶异源二聚体阴性表达细胞则无碱性磷酸酶异源二聚体阳性外泌体。
实施例5、核酸适配体BG2结合细胞的碱性磷酸酶的研究
一、核酸适配体BG2特异性提取碱性磷酸酶
1、生物素标记的核酸适配体BG2和生物素标记的对照核酸序列L45的制备
(1)生物素标记的BG2(BG2-Bio)
生物素标记的核酸适配体BG2(BG2-Bio)为在核酸适配体BG2的5’端偶联生物素Bio基团得到的，用结合缓冲液溶解BG2-Bio，依据紫外吸收标定浓度(200nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
(2)生物素标记的对照核酸序列L45(L45-Bio)
生物素标记的对照核酸序列L45(L45-Bio)为在对照核酸序列L45的5’端偶联生物素基团Bio得到的，用结合缓冲液溶解L45-Bio，依据紫外吸收标定浓度(200nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
对照核酸序列L45的核苷酸序列：TTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。
2、核酸适配体BG2提取碱性磷酸酶
(1)取2×108个指数生长期的LOVO细胞，PBS洗涤后，分别与200nM生物素标记的BG2(BG2-Bio)和200nM生物素标记的对照核酸序列L45(L45-Bio)(4℃)孵育30分钟，然后加入甲醛固定10分钟。
(2)PBS洗涤2遍，加入1mL的细胞裂解液(R0278-50ML，Sigma)，孵育1小时。
(3)2000rpm离心去除沉淀，收集上清，加入链霉亲和素修饰的琼脂糖微球(GE公司，货号：17-5113-01)，孵育1小时，提取靶标蛋白，得到孵育后的链霉亲和素修饰的琼脂糖微球。
(4)用PBS洗涤上述步骤(3)孵育后的链霉亲和素修饰的琼脂糖微球，洗涤5次，分别得到生物素标记的核酸适配体BG2提取的蛋白、对照核酸序列L45提取的蛋白。
(5)用碧云天生产的碱性磷酸酶检测试剂盒(P0321)测定生物素标记的核酸适配体BG2提取的蛋白、对照核酸序列L45提取的蛋白中碱性磷酸酶的活性。
结果如图7所示，上图为提取蛋白的磷酸酶活性显色照片，下图为显色液在405nm的吸收，可以看出，生物素标记的核酸适配体BG2提取的蛋白可以提取细胞蛋白中碱性磷酸酶，也就是证明生物素标记的核酸适配体BG2与细胞中的碱性磷酸酶结合。
二、核酸适配体BG2提取碱性磷酸酶以及与其相互作用蛋白
1、LoVo细胞的同位素标记
重型同位素标记的LoVo细胞：向不含赖氨酸和精氨酸的RPMI 1640的培养基中加入重型同位素标记的赖氨酸([13C6,15N2]-L-赖氨酸，货号：211604102)和重型同位素标记的精氨酸([13C6]-L-精氨酸，货号：201204102)(Silantes GmbH公司，德国)，使重型同位素标记的赖氨酸和重型同位素标记的精氨酸在培养基中的浓度分别为0.274mM和0.575mM；用该培养基培养LoVo细胞6-7代后备用，得到重型同位素标记的LoVo细胞。
轻型同位素标记的LoVo细胞：向不含赖氨酸和精氨酸的RPMI 1640的培养基分别加入轻型同位素标记的赖氨酸([12C6,14N2]-L-赖氨酸，货号：L8662)和轻型同位素标记的精氨酸([12C6]-L-精氨酸，货号：A8094)(sigma公司)，使轻型同位素标记的赖氨酸和轻型同位素标记的精氨酸在培养基中的浓度分别为0.274mM和0.575mM。用该培养基培养LoVo细胞6-7代后备用，得到轻型同位素标记的LoVo细胞。
2、生物素标记的核酸适配体BG2和生物素标记的对照核酸序列L45的制备
(1)生物素标记的BG2(BG2-Bio)
生物素标记的核酸适配体BG2(BG2-Bio)为在核酸适配体BG2的5’端偶联生物素基团得到的，用结合缓冲液溶解BG2-Bio，依据紫外吸收标定浓度(200nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
(2)生物素标记的对照核酸序列L45(L45-Bio)
生物素标记的对照核酸序列L45(L45-Bio)为在对照核酸序列L45的5’端偶联生物素Bio基团得到的，用结合缓冲液溶解L45-Bio，依据紫外吸收标定浓度(200nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
对照核酸序列L45的核苷酸序列：TTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。
3、用核酸适配体BG2碱性磷酸酶相互作用蛋白
(1)分别取2×108个指数生长期的重型同位素标记的LoVo细胞和轻型同位素标记的LoVo细胞，PBS洗涤后，分别与200nM生物素标记的BG2(BG2-Bio)和生物素标记的对照核酸序列L45(L45-Bio)孵育30分钟，然后加入甲醛固定10分钟。
(2)PBS洗涤2遍，加入1mL的细胞裂解液，孵育1小时。
(3)2000rpm离心去除沉淀，收集上清，加入链霉亲和素修饰的琼脂糖微球(GE公司，货号：17-5113-01)，孵育1小时，提取靶标蛋白。
(4)用PBS洗涤上述步骤(3)孵育后的链霉亲和素修饰的琼脂糖微球，洗涤5次，分别得到生物素标记的核酸适配体BG2提取的重型同位素标记的蛋白、对照核酸序列L45提取的轻型同位素标记的蛋白、生物素标记的核酸适配体BG2提取的轻型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的重型同位素标记的蛋白。
4、正向和反向实验
(1)正向实验：将生物素标记的核酸适配体BG2提取的重型同位素标记的蛋白与对照核酸序列L45提取的轻型同位素标记的蛋白混合，得到生物素标记的核酸适配体BG2提取的重型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的轻型同位素标记的混合体系。
(2)反向实验：将生物素标记的核酸适配体BG2提取的轻型同位素标记的蛋白与对照核酸序列L45提取的重型同位素标记的蛋白混合，得到生物素标记的核酸适配体BG2提取的轻型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的重型同位素标记的混合体系。
5、蛋白的酶解和LC-MS鉴定
(1)DTT还原：分别向生物素标记的核酸适配体BG2提取的重型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的轻型同位素标记的混合体系、生物素标记的核酸适配体BG2提取的轻型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的重型同位素标记的混合体系中加入200μL 20mM二硫苏糖醇(DTT)，56℃反应45min。
(2)IAA烷基化：将步骤(1)的产物离心，弃上清(去除DTT)，向沉淀中分别加入200μL 55mM碘乙酰胺(IAA)，在37℃避光反应30min。
(3)将步骤(2)的产物离心，弃上清(去除IAA)，向沉淀中加入5μg质谱用胰蛋白酶(Promega公司，产品目录号：V5111)，37℃酶切过夜，得到酶切后的多肽。
(4)酶切后的多肽经过真空浓缩后，加入100ul水，利用Ziptip C18微柱脱盐。质谱分析前，放置-20℃冰箱。
(5)利用LTQ-OrbitrapVelos质谱仪(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)对步骤(4)的产物进行分析鉴定，得到原始的质谱数据。
(6)数据搜索分析
利用MaxQuant搜索引擎(版本号：1.5.5.1)将步骤(5)获得的原始的质谱数据在uniprot蛋白数据库中进行检索。数据库搜索的一些参数如下：固定化修饰为半胱氨酸上的烷基化修饰，可变修饰为甲硫氨酸上的氧化修饰和蛋白质N端的乙酰化修饰。允许2个漏切位点，母离子容错量为20ppm，MS/MS碎片离子质量误差为0.5Da。
结果如表1所示，可以看出，核酸适配体BG2能够结合表1所示的蛋白，其中包括碱性磷酸酶ALPI、ALPP和ALPPL2，以及与这些碱性磷酸酶相互作用的蛋白；这个实验也证明了，核酸适配体BG2能够用于检测碱性磷酸酶如ALPI、ALPP和ALPPL2。
表1、利用SILAC鉴定出的核酸适配体BG2靶蛋白与其相互作用蛋白。
Figure BDA0001567636360000151
Figure BDA0001567636360000161
实施例6、BG2在细胞荧光成像和组织切片免疫荧光中的应用
一、BG2在细胞荧光成像中的应用
1、生物素标记的核酸适配体BG2溶液(BG2-FAM)(200nM)的制备
荧光素标记的核酸适配体BG2为在核酸适配体BG2的5’端偶联生物素bio基团得到的，用结合缓冲液溶解BG2-bio，依据紫外吸收标定浓度(200nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
2、荧光素标记的对照核酸序列溶液(L45-bio)(200nM)的制备
荧光素标记的对照核酸序列L45(L45-bio)为在对照核酸序列L45的5’端偶联生物素bio基团得到的，用结合缓冲液溶解L45-bio，依据紫外吸收标定浓度(200nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。对照核酸序列L45的核苷酸序列：TTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。
3、细胞染色
1)将LoVo细胞(已检测表达碱性磷酸酶)在35mm的共聚焦培养皿上培养1天后，用洗涤缓冲溶液洗涤1次后，然后与400μl核酸适体BG2的结合缓冲溶液37℃孵育30min，对照序列染色方法相同，空白不染色；
2)用洗涤缓冲液洗涤2次；
3)加入200ul 10nmol/L的链霉亲和素修饰的量子点(Q1104/Q1104a，北京纳晶生物科技有限公司)，孵育20min；
4)用洗涤缓冲液洗涤2次；
3)利用激光共聚焦扫描显微镜或荧光纤维镜观察。
结果如图8所示，可以看出，BG2可以与LoVo细胞结合。
二、BG2在组织切片染色荧光的应用
应用荧光素(6-FAM)标记核酸适体BG2对结肠癌组织(已确诊含有碱性磷酸酶)切片染色。
1、组织切片脱蜡水化
1)烤片：切片于60℃烤箱中烘烤60min；
2)立刻置于第一缸二甲苯中15min，而后置入第二缸二甲苯中15分钟；
3)依次放置入无水乙醇中10min，95％乙醇5min，70％乙醇5min；
4)自来水冲洗5min(缓慢流动的水盆中)，蒸馏水润洗一遍。
2、切片染色抗原修复
利用微波热修复法修复抗原：取适量TE buffer(EDTA 0.292g,Tris-base 6.05g,溶于1000mL蒸馏水，pH＝8.0)，将切片放入盛有修复液的容器中，置微波炉内加热至沸腾，停止加热，使容器内液体温度下降，保持在95℃～98℃之间并持续15分钟。取出容器，自然冷却至室温，取出切片，蒸馏水冲洗后，再用洗涤缓冲液浸泡，5分钟×3次(保证第一次浸泡的是新配的洗涤缓冲液)。
(3)适配体孵育染色步骤
1.切片先与含20％FBS和1mg/ml鲱鱼精DNA的结合缓冲溶液室温孵育60min；
2.然后与200μl含200nM核酸适体BG2的结合缓冲溶液室温孵育60min，对照序列染色方法相同，空白不染色；
3.用洗涤缓冲液洗涤三次；
4.干燥，抗淬灭封片剂封片，利用激光共聚焦扫描显微镜观察。
在临床实际标本切片中，可以实现如图9所示染色，可以看出，BG2可以与结肠癌组织结合。
实施例7、BG2在活动物成像中的应用
1、Alexa Fluor 647荧光分子标记的核酸适配体BG2溶液(BG2-AF647)(3μM)的制备
Alexa Fluor 647标记的核酸适配体BG2为在核酸适配体BG2的5’端偶联AlexaFluor 647基团、5’端和3’端1-7的核苷酸硫代修饰(序列6)，为了用结合缓冲液溶解BG2-AF647，依据紫外吸收标定浓度(3μM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
2、Alexa Fluor 647荧光分子标记的核酸适配体BG2溶液(L45-AF647)(3μM)的制备
Alexa Fluor 647标记的对照核酸序L45为在核酸适配体BG2的5’端偶联AlexaFluor 647基团、5’端和3’端1-7的核苷酸硫代修饰，用结合缓冲液溶解L45-AF647，依据紫外吸收标定浓度(3μM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。
对照核酸序列L45的核苷酸序列：sNsNsNsNsNsNsNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNsNsNsNsNsNsNsN。(sN为为硫代修饰的A、T、G或C，N为随机的A、T、G或C)
3、荷瘤小鼠模型
1)4-6周的BALB/c nu/nu雄性小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
2)将指数生长期的1×107/mL LoVo细胞或PC-3细胞(100μL)用注射器注入右侧腋下皮下。
2)小鼠饲养3-4周，待肿瘤的直径长至0.8–1.2cm。
3)将100μl的BG2-AF647(3μM)或L45-AF647(3μM)通过尾静脉注射至小鼠静脉。
4)注射30min后，麻醉，小鼠在MaestroTM小动物成像系统(美国剑桥科研仪器公司)成像，激发波长586-601nm，用640nm长通滤光片采集发射光，图像用Maestrov2.10.0处理。将小鼠处死后，剥离肿瘤，用相同的方法成像。
结果如图10所示，可以看出，BG2-AF647可以实现LoVo荷瘤小鼠的活体成像，而且在活体具有很好的特异性，BG2-AF647无法与PC-3荷瘤小鼠结合。
序列表
<110> 中国科学院化学研究所
<120> 核酸适配体在识别并结合碱性磷酸酶异源二聚体中的应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caaggaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttg 44
<210> 2
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgctcggat gccactacag tcaaggaata ggggtcggtg tgggtggtta tgattggctt 60
ccttgtctca tggacgtgct ggtgac 86
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggggtcgg tgtgggtggt tatgattgg 27
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 4
taagaaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttt ctta 44
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gataacatag gggtcggtgt gggtggttat gattggctgt tatc 44
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 6
caaggaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttg 44
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
taggggtcgg tgtgggtggt tatgattggc 30

Claims (7)

1.一种核酸适配体，为如下1）-7）中任一种：
1）序列1所示的单链DNA分子；
2）序列2所示的单链DNA分子；
3）序列3所示的单链DNA分子；
4）序列4所示的单链DNA分子；
5）序列5所示的单链DNA分子；
6）序列6所示的单链DNA分子，且自5’末端第1-7位和第38-44位的碱基为硫代修饰碱基；
7）序列7所示的单链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于：
所述核酸适配体为在1)-7)任一所示的核酸适配体的5’端或3’端标记荧光基团、生物素基团或放射性核素。
3.权利要求1或2所述的核酸适配体在如下1）-11）至少一种中的应用：
1）富集提取碱性磷酸酶；
2）检测与碱性磷酸酶相互作用的蛋白；
3）制备富集提取碱性磷酸酶产品；
4）制备识别并结合或辅助识别并结合碱性磷酸酶产品；
5）制备检测待测样品中碱性磷酸酶含量或活性产品；
6）制备检测待测样品中是否含有碱性磷酸酶产品；
7）制备检测与抗碱性磷酸酶的抗体结合的物质产品；
8）制备检测与碱性磷酸酶相互作用的蛋白产品；
9）制备诊断与碱性磷酸酶异源二聚体相关疾病的产品；
10）制备捕获和∕或检测碱性磷酸酶异源二聚体阳性表达细胞或外泌体的产品；
11）制备用于靶向碱性磷酸酶异源二聚体的动物成像的探针；
所述碱性磷酸酶为PALP、IAP或GCAP的异源二聚体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述待测样品为细胞、蛋白、培养基、血清或血液；
或，所述待测样品为表达碱性磷酸酶异源二聚体的动物或人。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述细胞为表达碱性磷酸酶异源二聚体的肿瘤细胞。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述表达碱性磷酸酶异源二聚体的肿瘤细胞为人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、人结肠癌细胞或人肝细胞癌细胞。
7.一种具有如下功能的产品，其活性成分为权利要求1或2所述的核酸适配体；
所述功能为如下1）-10）中至少一种：
1）富集提取碱性磷酸酶；
2）识别并结合或辅助识别并结合碱性磷酸酶；
3）识别并结合或辅助识别并结合表达碱性磷酸酶的细胞；
4）检测待测样品中碱性磷酸酶含量或活性；
5）检测待测样品中是否含有碱性磷酸酶；
6）检测与抗碱性磷酸酶的抗体结合的物质；
7）检测与碱性磷酸酶相互作用的蛋白；
8）诊断与碱性磷酸酶异源二聚体相关疾病；
9）捕获和∕或检测碱性磷酸酶异源二聚体阳性表达细胞或外泌体；
10）检测碱性磷酸酶异源二聚体的动物成像探针；
所述碱性磷酸酶为PALP、IAP或GCAP的异源二聚体。
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