KR20180065747A

KR20180065747A - 히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀 산화물을 포함하는 나노그래핀센서

Info

Publication number: KR20180065747A
Application number: KR1020160166980A
Authority: KR
Inventors: 황도원; 이동수
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2016-12-08
Filing date: 2016-12-08
Publication date: 2018-06-18

Abstract

본 발명은 히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀 산화물을 포함함으로써, 기존 FISH 분석을 대체할 수 있어 기초생물학 전분야에 다양하게 적용될 수 있고, 높은 신뢰도 및 해상도의 결과물을 얻을 수 있고, 세포 또는 조직 내 존재하는 다양한 핵산을 동시에 또는 독립적으로 검출할 수 있고, 살아있는 조직 또는 세포에서 간편, 신속 및 정확하게 검출할 수 있고, 특정질환에 국한되지 않고 조직 또는 세포 내 특정 핵산 유무 및/또는 발현량으로 확인할 수 있는 모든 질환에 대해 활용이 가능하고, siRNA 치료 시 타겟물질의 억제효과를 쉽게 관찰할 수 있고, 신속한 치료방침을 결정하는 데 도움을 줄 수 있고, 저비용으로 타겟물질을 검출할 수 있는, 히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀 산화물을 포함하는 나노그래핀센서에 관한 것이다.

Description

히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀 산화물을 포함하는 나노그래핀센서 {Nano graphene bio-sensor comprising hyaluronic acid or cell penetrating peptide-loaded graphene oxide}

본 발명은 히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀 산화물을 포함하는 나노그래핀센서에 관한 것이다.

과거에는 주로 단백질을 이용한 분석을 위주로 하였으나, 점차 유전자 변형의 검출을 통해 질병의 진단뿐 아니라 예측, 회복되었는지를 진단할 수 있다는 점에서 유전자 변형을 검출하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다. 현재 환자의 조직을 통해 질환을 진단하는 기술로는 단백질에 존재하는 각종 항원들이나 바이오 마커 등을 타겟으로 면역 염색 등을 통해 단백질의 변형 정도를 측정하는 방법과 유전자의 일부인 RNA를 타겟으로 삼아 FISH(fluorescence in situ hybridization, 형광 동소 보합법)분석을 통해 유전자의 변형 정도를 측정하는 방법 등이 알려져 있다.

그러나, 현재 알려진 FISH의 방법은 타겟 물질을 검출하기 위해 거쳐야 하는 과정들이 번거로우며, 비용이 많이 요구되며, 숙련자에 의한 수행이 요구되고, 시간도 오래 소요되는 문제점이 있어, 간편하고, 저렴하며, 타겟의 탐지를 빠른시간 내 할 수 있는 기술의 개발이 절실히 필요하다.

한국공개특허공보 제2015-0028514호

본 발명은 기존 FISH 분석을 대체할 수 있어 기초생물학 전분야에 다양하게 적용될 수 있는 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 높은 신뢰도 및 해상도의 결과물을 얻을 수 있는 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 세포 또는 조직 내 존재하는 다양한 핵산을 동시에 또는 독립적으로 검출할 수 있는 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 살아있는 조직 또는 세포 내 핵산을 간편, 신속 및 정확하게 검출할 수 있는 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 특정 질환에 국한되지 않고 조직 또는 세포 내 핵산 유무 및/또는 발현량으로 확인할 수 있는 모든 질환에 대해 활용이 가능한 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 siRNA 치료 시 타겟물질의 억제효과를 쉽게 관찰할 수 있는 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 신속한 치료방침을 결정하는 데 도움을 줄 수 있는 나노그래핀센나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 저비용으로 타겟물질을 검출할 수 있는 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법의 제공을 목적으로 한다.

1. 히알루론산 및 세포 투과성 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 함유하는 그래핀; 및 형광물질을 함유하는 프로브를 포함하는, 나노그래핀센서.

2. 위 1에 있어서, 상기 그래핀은 그래핀 산화물 또는 환원형 그래핀 산화물인, 나노그래핀센서.

3. 위 1에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 TAT 펩타이드인, 나노그래핀센서.

4. 위 1에 있어서, 상기 프로브는 DNA, RNA 및 PNA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 나노그래핀센서.

5. 위 1에 있어서, 상기 프로브는 PNA인, 나노그래핀센서.

6. 위 1에 있어서, 상기 그래핀은 PEG가 더 결합된 것인, 나노그래핀센서.

7. 위 1의 나노그래핀센서와 시료를 혼합하는 단계를 포함하는 세포 내 핵산 검출 방법.

8. 위 7에 있어서, 상기 시료는 세포 및 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 세포 내 핵산 검출 방법.

9. 위 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 나노그래핀센서를 포함하는 진단키트.

본 발명의 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법은 기존 FISH 분석을 대체할 수 있어 기초생물학 전분야에 다양하게 적용될 수 있다.

본 발명의 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법은 높은 신뢰도 및 해상도의 결과물을 얻을 수 있다.

본 발명의 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법은 세포 또는 조직 내 존재하는 다양한 핵산을 동시에 또는 독립적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법은 살아있는 조직 또는 세포에서 타겟물질을 간편, 신속 및 정확하게 검출할 수 있다.

본 발명의 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법은 특정질환에 국한되지 않고 조직 또는 세포 내 특정 핵산 유무 및/또는 발현량으로 확인할 수 있는 모든 질환에 대해 활용이 가능하다.

본 발명의 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법은 siRNA 치료 시 타겟물질의 억제효과를 쉽게 관찰할 수 있다.

본 발명의 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법은 신속한 치료방침을 결정하는 데 도움을 줄 수 있다.

본 발명의 나노그래핀센서, 진단키트 및 검출방법은 저비용으로 타겟물질을 검출할 수 있다.

도 1은 β-actin을 검출할 수 있는 FAM-β-actin PNA 100pmol과 히알루론산이 결합된 그래핀 산화물(HA-GO) 1㎍이 포함된 나노그래핀센서를 분리된 해마조직에 처리한 후 1시간 경과, 4시간 경과 후의 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 β-actin을 검출할 수 있는 FAM-β-actin PNA 100pmol과 그래핀 산화물(GO) 1㎍이 포함된 나노그래핀센서를 분리된 해마조직에 처리한 후 1시간 경과, 4시간 경과 후의 결과를 나타낸 것이다. 도 1 및 2의 결과는 도 3의 실험에 대한 대조군으로 사용되었다.
도 3은 miRNA-21을 검출할 수 있는 FAM-miR-21 PNA 100pmol과 HA-GO 1㎍이 포함된 나노그래핀센서를 분리된 해마조직에 처리한 후 1시간, 4시간 경과 후의 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 miRNA-21을 검출할 수 있는 FAM-miR-21 PNA 100pmol과 GO 1㎍이 포함된 나노그래핀센서를 분리된 해마조직에 처리한 후 1시간 경과, 4시간 경과 후의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 miR-124를 검출할 수 있는 TAMRA-miR-124 PNA 100pmol과 HA-GO 1㎍이 포함된 나노그래핀센서를 분리된 해마조직에 처리한 후 1시간 경과, 4시간 경과 후의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 miR-124를 검출할 수 있는 TAMRA-miR-124 PNA 100pmol과 GO 1㎍이 포함된 나노그래핀센서를 분리된 해마조직에 처리한 후 1시간 경과, 4시간 경과 후의 결과를 나타낸 것이다.
도 7는 환원형 그래핀 산화물의 소광 효율이 그래핀 산화물의 소광 효율에 비해 더 우수한 것을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본원 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로서 사용된다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.

본원 명세서 전체에서 "상보적"은 실질적으로 상보적이면 충분하다. "실질적으로 상보적이다"는 것은 핵산과 완전히 상보적일 필요는 없으나, 타겟 물질로서 핵산과 혼성화가 가능한 정도로 충분히 상보적인 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서 "핵"은 세포핵을 의미하며, "세포"는 어류, 파충류, 포유류 동물의 세포일 수 있으며, 또한, 척추 또는 무척추 동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 세포는 포유류 유래 바람직하게는 인간 유래 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명은 일 양태로 히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드를 함유하는 그래핀; 및 형광물질을 함유하는 프로브를 포함하는 나노그래핀센서를 제공한다.

또한, 본 발명은 다른 양태로 상기 나노그래핀센서와 시료를 혼합하는 단계를 포함하는 세포 내 핵산 검출방법을 제공한다.

히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 음이온성 뮤코다당류로서, 동물 유래의 유리체, 관절액, 연골, 피부 등에 존재하는 생체 유래 물질이며, (C₁₄H₂₁NO₁₁)n의 화학식을 가지는 물질이며, 히알루론산의 분자량에는 제한이 없으나, 중량평균분자량 범위가 10,000 내지 1,000,000일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 중량평균자량은 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000 및 1,000,000 중 어느 두 값 사이의 범위를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

그래핀에 히알루론산을 결합시킴으로써 그래핀의 분산성을 크게 향상시킬 수 있어 세포 내로의 진입이 보다 더 수월해져 타겟 물질(예컨대, 세포질 내 핵산, 세포핵 내 핵산, 조직 내 핵산 등)의 검출 속도를 크게 증가시킬 수 있으며, 이로 인하여, 질병의 유무, 질병의 경과, 세포 내 변화 등에 대해 빠른 진단이 가능하다. 예컨대, 히알루론산이 결합된 그래핀은 히알루론산이 결합되지 않은 그래핀에 비해 분산성이 크게 향상되며, 타겟 물질의 검출까지 걸리는 시간을 크게 감소시킬 수 있어, 빠른 진단이 가능하다.

세포 투과성 펩타이드는 일종의 신호 펩타이드(Signal Peptide)이며, 예로 TAT 단백질에 존재하는 11개 아미노산 서열의 b-galactosidase(120 kDa) 단백질, 초파리의 단백질에서 유래한 Antennapedia(Penetratin), HSV-1 바이러스로부터 유래된 VP22, Simian Virus 40 large antigen T로부터 유래한 Pep-1 등이 있을 수 있고, 또한, polyArginine, polyLysine과 같이 단순히 Arginine, Lysine 과 같은 양이온성 아미노산이 반복적으로 여러 개가 연결된 펩타이드 등을 들 수 있으나, 이제 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 세포투과성 펩타이드로 TAT, Hph-1, Vectocell, Lactoferrin, Sim-2, LPIN3, 2IL-1a, dNP2 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 세포투과성 펩타이드는 RKKRRQRR의 서열(서열번호 18)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

그래핀에 세포 투과성 펩타이드를 결합시킴으로써 세포막 투과도를 향상시킬 수 있어 타겟 물질(예컨대, 세포질 내 핵산, 세포핵 내 핵산, 조직 내 핵산 등)의 검출 속도를 크게 증가시킬 수 있으며, 이로 인하여, 질병의 유무, 질병의 경과, 세포 내 변화 등에 대해 빠른 진단이 가능하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포 투과성 펩타이드는 TAT 펩타이드일 수 있다. TAT 펩타이드가 결합된 그래핀의 세포 투과도는 TAT 펩타이트가 결합되지 않은 그래핀에 비해 크게 증가하여 타겟 물질의 검출에 소요되는 시간을 크게 감소시킬 수 있다.

그래핀에 HA 또는 세포 투과성 펩타이드를 결합시킴으로써 타겟물질을 16시간 이내, 바람직하게는 4시간 이내, 더욱 바람직하게는 1시간 이내, 보다 더 바람직하게는 30분 이내, 가장 바람직하게는 10분 이내로 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

그래핀에 결합되는 HA 또는 세포 투과성 펩타이드는 그래핀의 가장자리에 결합되어 있거나, 및/또는 그래핀의 내부 표면에 결합되어 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 결합은 공유결합일 수 일 수 있으며, 예컨대, 링커에 의한 공유결합일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드는 그래핀과 공유결합될 수 있으며, 이러한 공유결합을 위해 히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드와 그래핀에 적절한 기능기를 도입시킬 수도 있고, 바람직하게, 이러한 기능기는 카르복실기 또는 아미노기 일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드와 그래핀을 서로 혼합 및/또는 용해시킨 후, 필요에 따라 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로 클로라이드(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Hydrochloride, EDC)와 같은 촉매를 첨가하여 아마이드 반응시키는 것에 의해 공유결합시킬 수 있다. 이 때, 상기 결합반응을 위해 히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드와 그래핀은 1:1 내지 100:1, 2:1 내지 50:1, 3:1 내지 25:1, 4:1 내지 15:1 (히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드 : 그래핀)등의 중량비로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 나아가, 필요에 따라 EDC와 같이 촉매로 사용되는 물질은 제거될 수 있다. 이러한 촉매의 제거는, 당해 업계에서 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들어, 투석, 여과 등을 들 수 있다. 또한, 바람직하게, 이러한 공유결합 반응은 암실에서 수행될 수 있다.

히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀은 탄소의 동소체 중 하나이며 탄소 원자들이 모여 2차원 평면을 이루고 있는 구조의 탄소 화합물로, 그래핀은 그래핀 산화물, 환원형 그래핀 산화물, 그래핀퀀텀닷, CVD 방식으로 제조한 그래핀 등일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 그래핀은 그래핀 산화물 또는 환원형 그래핀 산화물일 수 있으며, 바람직하게는 환원형 그래핀 산화물일 수 있다. 그래핀이 환원형 그래핀 산화물인 경우 그래핀 산화물보다 소광 효율이 더 우수하여, 형광을 대부분 소광시키기 위해 필요한 그래핀의 농도가 감소될 수 있어 비용을 절감할 수 있으며, 노이즈가 감소하여 정확한 검출이 가능해지며, 이와 더불어 해상도가 높아질 수 있다. 그래핀 산화물은 그라파이트를 산화시킨 후 소니케이션을 통해 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 환원형 그래핀 산화물은 그래핀 산화물을 환원시켜 얻은 것을 말하며, 환원은 당업계에 공지된 방법을 통해 이루어질 수 있다.

HA 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀은 단일층의 시트 형태인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 단일층의 시트 형태인 그래핀은 단일층의 시트 형태가 아닌 그래핀에 비하여 동일한 질량에서 표면적이 넓어 적은 양으로도 많은 프로브를 흡착할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 나노그래핀센서는 세포에 유해하지 않아 생체적합성을 가지고, 화학적 기능화 과정을 통해 세포에 도입할 수 있으며, 시그널 감지에 적합할 수 있다.

HA 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀은 약 10 nm 내지 약 1 μm의 크기를 가지는 입자 형태를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 상기 그래핀은 약 10 nm 내지 약 1 μm, 약 10 nm 내지 약 700 nm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 400 nm, 약 10 nm 내지 약 300 nm, 약 10 nm 내지 약 200 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 10 nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 1 μm, 약 100 nm 내지 약 1 μm, 약 200 nm 내지 약 1 μm, 약 300 nm 내지 약 1 μm, 약 400 nm 내지 약 1 μm, 약 500 nm 내지 약 1 μm, 약 700 nm 내지 약 1 μm, 약 200 nm 내지 약 300 nm, 또는 약 400 nm 이하인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 상기 그래핀은 작은 크기 때문에 표면에 흡착된 프로브와 함께 핵막 및/또는 세포막을 용이하게 통과하여 핵 내 및/또는 세포 내로 들어갈 수 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명은 히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀을 활용하여 질환을 가진 조직 또는 세포 내부에서 발현되는 핵산의 유무 및/또는 변화 정도를 감지하여 질환의 유무, 질환의 진행 정도를 진단할 수 있는 시간적, 비용적인 측면에서 효율적이면서도 정확한 진단 기술이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 그래핀은 PEG를 더 결합시킨 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. PEG는 Polyethylene glycol의 약자로, PEG가 함유된 그래핀은 면역원성 (immunogenicity) 감소, 용해성 (solubility) 증가, 생리활성용액에서 분산성 증가, 안정성 (stability) 향상, 핵산 검출의 민감도 증가 등의 효과를 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

형광물질이 함유된 프로브는 히알루론산 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀 상에 위치할 수 있다. "상에 위치"는 프로브가 그래핀에 접해 있는 경우뿐 아니라 프로브와 그래핀 사이에 전술한 프로브와 다른 프로브, 전술한 그래핀과 다른 그래핀이 존재하는 경우, 프로브 및 그래핀이 아닌 다른 물질이 존재하는 경우도 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

프로브는 DNA, RNA 및/또는 PNA(peptide nucleic acid), 단백질일 수 있다. 예컨대, 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA, 안히드로헥시톨 DNA, 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신, 디아미노퓨린 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

프로브는 단일가닥일 수 있으며, 올리고디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오타이드 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 프로브가 단일가닥으로 존재할 때는 프로브의 노출된 소수성 염기부분이 pi-pi 상호작용으로 그래핀의 표면에 흡착될 수 있다. 프로브가 타겟물질인 핵산과 혼성화되어 이중가닥으로 존재할 때는 프로브의 소수성 염기부분이 프로브-핵산 사이의 수소 결합으로 인해 외부에 노출되지 않으므로 그래핀의 표면에 흡착이 되지 않는다.

프로브는 약 50 염기 이하의 길이를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브는 약 50 염기 이하, 약 5 염기 내지 약 50 염기, 약 10 염기 내지 약 50 염기, 약 15 염기 내지 약 50 염기, 약 20 염기 내지 약 50 염기, 약 25 염기 내지 약 50 염기, 약 30 염기 내지 약 50 염기, 약 40 염기 내지 약 50 염기, 약 5 염기 내지 약 40 염기, 약 5 염기 내지 약 30 염기, 약 5 염기 내지 약 20 염기, 약 15 염기 내지 약 25 염기의 길이를 가지는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브는 약 18 염기 또는 약 22 염기를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

프로브는 적절한 서열의 클로닝, 제한효소 분해 및 포스포트리에스테르 방법, 디메틸포스포라미다이트 방법 등과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

프로브의 염기 서열은 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 프로브는 PNA일 수 있다. PNA는 올리고핵산의 주사슬이 펩티드 결합으로 구성되어 있어 전기적으로 중성을 띠고 있으므로 소수성인 그래핀에의 흡착성이 전기적으로 음성을 띠는 DNA 또는 RNA에 비하여 우수하다. 또한 PNA-RNA 결합은 DNA-RNA, 또는 RNA-RNA 결합보다 강하며 Tm 값이 염기당 약 1℃씩 높다. 따라서 표적물질로서의 핵산과의 결합력은 DNA 또는 RNA 프로브에 비하여 PNA 프로브가 우수하다. 또한, PNA는 체내에 존재하는 핵산분해효소(nuclease) 또는 단백질분해효소(protease)에 대하여 매우 안정하기 때문에 세포 내로 PNA 프로브가 도입되었을 때 PNA 프로브의 소실 가능성이 DNA, RNA, 또는 단백질 프로브에 비하여 매우 낮다. 추가적으로, PNA는 구조적으로 강한 공유결합으로 이루어져 있이 때문에 다양한 pH 범위 및 온도 조건에서 안정성을 유지할 수 있어 프로브로 사용할 올리고핵산으로서 다른 종류의 핵산에 비하여 우수한 조건을 가진다.

프로브는 세포 내 또는 조직 내 핵산에 일부 또는 전부 상보적으로 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 타겟 핵산과 프로브의 결합은 타겟 핵산의 염기서열과 프로브의 염기서열이 서로 상보적이어서 혼성화될 수 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 프로브는 타겟 핵산의 길이와 동일한 길이를 가지거나, 타겟 핵산의 길이보다 짧은 길이 또는 긴 길이를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 프로브의 염기서열은 상기의 염기서열의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브의 염기서열과 타겟 핵산의 염기 서열 일부 또는 전부와의 상보성은 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100%인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 프로브는 서열이 정해져 상업적으로 판매되는 것, 구매자가 디자인한 서열로 제조되어 판매되는 것, 또는 비상업적으로 제조된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

프로브는 HA 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀에 흡착될 수 있으며, 상기 프로브는 각각 서로 상이한 형광물질을 함유하는 한 종류 이상의 프로브들을 포함할 수 있으며, 상기 프로브들은 한 종류 이상의 핵산과 각각 결합할 수 있어, 서로 상이한 핵산의 다중 검출이 가능할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 서로 상이한 형광물질은 서로 상이한 색상을 띠는 형광물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브는 각각 서로 상이한 형광물질을 함유하는 한 종류 또는 두 종류 이상의 프로브이고, 타겟 핵산은 각각의 프로브와 상보적 서열을 가지는 한 종류 또는 두 종류 이상의 핵산인 경우, 시료 내에 존재하는 핵산과 상보적 서열을 가지는 프로브만이 이중 가닥을 이루어 그래핀으로부터 유리되어 형광을 발하게 된다. 이에 따라 시료 내에 존재하는 핵산과 상보적인 프로브에 함유된 형광물질만이 형광을 발하게 되고, 발산되는 형광의 색상을 통하여 한 종류 또는 두 종류 이상의 핵산 중 어떤 핵산이 시료 내에 존재하는지 여부를 검출할 수 있게 된다.

프로브에 함유된 형광물질은 프로브의 한쪽 말단에 연결되어 있거나, 또는 프로브 서열 내부에 연결되어 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브에 함유된 형광물질은 프로브의 5'-말단 또는 3'-말단에 공유결합으로 연결되어 있는 것을 포함할 수 있으며, 공유결합은 프로브의 5'-말단 또는 3'-말단에 연결된 링커와 형광물질 사이의 공유결합인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 공유결합은 링커의 아미노기와 형광물질 사이의 공유결합인 것을 포함할 수 있으며, 링커는 에틸렌 글리콜 링커인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 링커는 파나진 사의 O-링커 또는 AEEA 링커인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

프로브에 함유된 형광물질은 살아있는 세포에 적용하여 형광을 측정 가능한 형광물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 형광물질은, 로다민과 그의 유도체, 플루오레신과 그의 유도체, 쿠마린과 그의 유도체, 아크리딘과 그의 유도체, 피렌과 그의 유도체, 에리트로신과 그의 유도체, 에오신과 그의 유도체, 4-아세트아미도-4′-이소티오시아나토스틸벤-2,2′디설폰산, Cy5, Cy3, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 형광물질은 FAM(fluorescein amidite), HEX(Hexachloro-fluorescein), NED^TM, 텍사스 레드(Texas Red^TM) 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

그래핀에는 전술한 프로브 외 다양한 방향족 분자와 바이오 물질들이 흡착될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브는 형광물질 외 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 함유할 수 있다. 이러한 표지로 ³²P, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISAS 에 이용되는 것), 바이오틴, 합텐, 항혈청, 단일 클론성 항체 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

시료는 포유류의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨; 또는, 세균 또는 세포 배양물, 배양 상등액 등에서 선택될 수 있으나, 타겟 물질의 종류, 검출 목적 등에 따라 해당 기술분야의 통상의 기술자 수준에서 적절히 채택하여 사용할 수 있다. 바람직하게 시료는 조직 및/또는 세포일 수 있다. 세포는 기질에 고정되어 배양되고 있는 세포, 배지 내에 부유하며 배양되고 있는 세포, 생체 내의 세포, 생체에서 분리된 세포, 또는 분석을 위해 처리된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 또한, 세포는 살아있는 세포 또는 죽은 세포를 포함할 수 있으며, 고정액에 의해 고정된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 시료는 파라핀조직 또는 세포, 동결조직 또는 세포 등 공지된 방법으로 처리된 조직 및/또는 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기"세포 내"는 세포질 내 및/또는 핵 내를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

시료 내에서 프로브가 검출할 수 있는 타겟 물질로는 세포 또는 조직 내 핵산일 수 있으며, 타겟 핵산은 예컨대, DNA 및/또는 RNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, DNA는 단백질을 코딩하는 DNA 또는 단백질을 코딩하지 않는 DNA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, RNA는 mRNA, microRNA, long non-coding RNA, snRNA(small nuclear RNA), snoRNA(small nucleolar RNA), aRNA(antisense RNA), siRNA(small interfering RNA), piRNA(Piwi-interacting RNA), Gomafu RNA 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, RNA는 단백질로 번역되는 RNA, 단백질로 번역되지 않는 RNA, 5'-비번역 부위, 3'-비번역 부위, 또는 조절 RNA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, RNA는 long non-coding RNA일 수 있고, long non-coding RNA는 길이가 짧은 long non-coding RNA 및 길이가 긴 long non-coding RNA를 포함할 수 있고, 길이가 짧은 long non-coding RNA에는 short interfering RNAs(siRNAs), Piwi-interacting RNAs(piRNAs), 그리고 small nucleolar RNAs(snoRNAs), miRNA(microRNA) 등을 포함할 수 있고, 길이가 긴 long non-coding RNA는 XIST(X-inactive specific transcript), HOTAIR(HOX transcript antisense RNA) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 핵산은 miRNA일 수 있고, miRNA는 miRNA-21, miRNA-29a, miRNA-125b, miRNA-155, 또는 miRNA-159를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. miRNA-21, miRNA-29a, miRNA-125b, miRNA124, 또는 miRNA-155는 인간 세포에서 발현되는 miRNA인 것일 수 있으며, miRNA-159는 식물 세포에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. miRNA-21, miRNA-29a, miRNA-124 및 miRNA-125b는 유방암 세포에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, miRNA-21, miRNA-29a, miRNA-125b, 또는 miRNA-155는 모델질병 세포주인 유방암 세포주 MDA-MB-231, MDA-MB-435, 또는 MCF-7; 또는 기타 암세포 등에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

프로브는 DNA 및/또는 RNA가 2차원 이상의 구조를 형성하지 않은 부위와 상보적으로 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. DNA 및/또는 RNA가 2차원 이상의 구조를 형성하는 경우 프로브와 상기 DNA 및 RNA와의 상보적 결합이 어려워져 정확도가 떨어지는 문제가 발생하나, 상기 프로브는 DNA 및/또는 RNA가 2차원 이상의 구조를 형성하지 않은 부분과 상보적으로 결합할 수 있어 검출 정확도를 향상시킬 수 있다.

본 발명의 나노그래핀센서는 그래핀과 형광물질 사이에 일어나는 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET)현상을 이용한 것일 수 있다. 즉, 그래핀은 형광 공명 에너지 전달 현상을 통해 근처에 있는 형광물질의 형광신호를 소광시킬 수 있어, 형광물질을 함유하는 프로브가 그래핀에 흡착되면 형광물질의 형광은 소광될 수 있다. 그러나, 프로브가 타겟 핵산과 혼성화하여 이중 가닥을 이루면 그래핀에 흡착되지 못하고 유리될 수 있고, 이에 프로브에 함유된 형광물질의 형광이 형광 공명 에너지 전달 현상에서 벗어나 형광을 띠게 될 수 있다. 따라서 이러한 과정에서 시료의 형광 유무 및/또는 수준을 측정함으로써 시료 내에 있는 타겟의 검출 및/또는 정량이 빠르고 정확하게 이루어질 수 있다.

나노그래핀센서에서 발생하는 형광 변화는 프로브와 타겟물질 간의 혼성화로 인한 그래핀과 형광물질이 함유된 프로브의 유리로 발생하는 것으로, 면역학적 방법, 예컨대, 효소 면역 측정법(EIA)(예, 직접 경합 ELISA, 간접 경합 ELISA, 샌드위치 ELISA), 방사 면역 측정법(RIA), 형광 면역 측정법(FIA), 웨스턴 블롯(blot)법(예, 웨스턴 블롯법에서의 2차 항체 대신에 사용), 면역조직 화학적 염색법, 셀 소팅(cell sorting)법 등에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 나노그래핀센서는 핵 내 핵산 검출, 세포질 내 핵산, 세포 내 또는 세포 밖 핵산의 검출에 활용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 형광물질을 함유하는 프로브의 농도는 약 30 pmol 이상일 수 있고, 예컨대, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 및 100 pmol 중 어느 두 값 사이의 범위를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브의 농도는 약 40 pmol일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 최대로 형광이 소광되는 그래핀의 농도는 프로브의 농도가 약 40 pmol일 때 약 0.35 ㎍ 이상일 수 있고 예컨대, 0.35, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9 및 10㎍ 중 어느 두 값 사이의 범위를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 최대로 형광이 소광되는 그래핀의 농도는 프로브의 농도가 40 pmol일 때 약 0.4 ㎍일 수 있다. 범위 내로 소광이 최대로 이루어지면 타겟 물질의 검출 시 노이즈의 발생이 최소화되고, 검출 정확도가 향상될 수 있다.

본 발명은 다른 양태로 본 발명의 나노그래핀센서를 포함하는 진단키트를 제공한다.

본 발명의 진단키트는 예컨대, 96-well plate의 형상을 가질 수 있으며, 이 경우 각각의 well이 진단키트로서 기능할 수 있다. 구체적으로, 각각의 well은 본 발명의 나노그래핀센서를 포함하고 있을 수 있으며, 조직 및/또는 세포를 각각의 well에 첨가하기만 하면 다른 추가적인 구성을 첨가하지 않아도 타겟 물질의 검출이 가능할 수 있다.

본 발명의 진단키트는 고체 형태일 수 있다. 예컨대, HA 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀과 형광물질을 함유하는 프로브가 각각 독립적으로 파라핀 형태로 굳어진 것일 수 있으며, 함께 혼합물 형태로 파라핀 형태로 굳어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 진단키트는 액체 형태일 수 있다. 예컨대, HA 또는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 그래핀과 형광물질을 함유하는 프로브가 액체 형태로 용기에 각각 독립적으로 담긴 것일 수 있고, 혼합물의 형태로 하나의 용기에 담긴 것일 수 있으며, 이 경우 냉동 또는 상온 보관될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 혼합물의 형태로 하나의 용기에 담아 냉동보관 하는 경우, 필요 시 해동하여 시료를 추가하는 것 외에는 별도의 혼합 과정이 필요하지 않으므로 핵 내 핵산 진단에 편의성 및 신속성이 증대될 수 있다.

본 발명의 진단키트는 상기 진단키트를 이루는 구성이 각각 독립적으로 용기(예컨대, 일회용 튜브 등)에 담겨있는 것일 수 있으며, 또한 같이 혼합되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 진단키트에 포함되는 프로브는 동결 건조된 것일 수 있다. 서로 다른 핵산 또는 하나의 핵산의 다른 영역에 일부 또는 전부 상보적으로 결합하는 프로브를 포함하는 경우에는, 프로브들이 혼합되어 용기에 담겨 있을 수도 있고 개별적으로 각각의 용기에 담겨 있을 수도 있다.

본 발명의 진단키트에는 Tris-HCl, KCl, (NH₄)₂SO₄, MgCl₂ 등의 성분 또는 이들을 변형한 화합물이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 상기 화합물은 그래핀을 보관하기 위한 용도로 진단키트에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 진단키트는 필요에 따라 완충용액 및 검출의 수행과 분석을 위한 용기들을 포함할 수 있는데, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.

본 발명의 나노그래핀센서, 진단키트 및 방법은 형광물질이 형광을 띠는 것을 실시간으로 측정할 수 있어 시료 내의 표적물질인 핵산을 실시간으로 검출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 나노그래핀센서, 진단키트 및 방법의 세포 내 핵산 검출 시간은 1시간 이하일 수 있으며, 바람직하게는 30분, 더욱 바람직하게는 10분 이하일 수 있어, 핵산 검출 시 일반적으로 3일 이상 걸리는 기존 FISH 방법에 비해 검출 시간을 크게 단축할 수 있어 빠른 진단이 가능하다.

예컨대, 프로브에 포함된 형광물질의 형광은, 유세포분석기(FACS), 형광 리더기, 형광 현미경, 또는 인비보(in vivo) 이미징 기기에 의하여 검출될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 형광 리더기는 형광 마이크로플레이트 리더로 약 230 nm 내지 약 999 nm에 이르는 형광을 측정할 수 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 형광 리더기는 형광 신호 사이의 cross-talk 현상이 최소화될 수 있도록 약 세 가지의 유기 형광물질을 선택하여 그에 대한 형광 신호를 관찰하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 유세포분석기는 단일 세포를 튜브로 흘려주며 세포의 형광 신호를 관찰할 수 있는 기기인 것을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 형광 현미경은 세포 내, 세포 외, 또는 시료의 형광을 관찰할 수 있는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 인 비보 이미징 기기는 Caliper Life Science 사의 Xenogen IVIS 100인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 인 비보 이미징 기기는 CCD(charge coupled device) 카메라를 이용하여 각 형광 파장에 맞는 이미지를 수득할 수 있는 기기인 것을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 나노그래핀센서, 진단키트 및 방법은 유방암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암, 대장암, 골암, 피부암, 혈액암, 당뇨, 또는 알츠하이머 등의 각종 질병의 진단, 치료, 또는 예후를 판단할 수 있고, 줄기 세포의 계통 특이적 분화 관찰할 수 있으며, 전술한 판단 대상에 제한되지 않고 다양한 관찰 및/또는 판단에 사용될 수 있다.

본 발명의 나노그래핀센서, 진단키트 및 방법은 신경 질환에 적용될 수 있고, 예로 중추 신경계(뇌, 뇌간 및 소뇌), 말초 신경계(뇌신경을 포함함), 및 자율 신경계(이의 일부는 중추 및 말초 신경계 둘 모두에 위치함) 와 관련되는 장애를 포함한다. 특히 신경 질환은 신경 능선 세포 또는 슈반 세포의 기능이 손상, 변경 또는 방해되는 임의의 질환을 포함한다. 탈수초성 질환, 다발성 경화증, 척수장애, 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE), 급성 산재성 뇌척수염(ADEM), 감염후 또는 백신접종후 뇌척수염, 말초 신경장애, 신경초종증, 샤르코 마리 치아 질환, 길랭-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경증(CIDP) 등의 슈반 세포와 연결된 신경 질환, 뇌졸중(stroke), 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 외상성 중추 신경계 질환(traumatic central nervous system diseases) 및 척수 손상 질환(spinal cord injury disease)등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님은 당연하다.

실시예

1. 형광 프로브의 합성

표적 RNA에 결합하는 프로브는 화학적, 생물학적 안정성을 높이기 위하여 peptide nucleic acid(PNA) 형태로 Panagene Inc. (Republic of Korea)에서 합성하였다.

프로브는 BC1(NCBI Gene ID: 100568459), β-actin(NCBI Gene ID: 11461), miR-21 (NCBI Gene ID: 387140) 또는 miR-124(NCBI Gene ID: 268755)과 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 가지도록 제작하였으며, BC1, β-actin 및 miR-21 PNA 프로브는 N-말단에 O-linker spacer를 추가한 후 형광 dye인 FAM을, miR-124 PNA프로브는 TAMRA를 연결한 형태로 합성하였다. 각각의 프로브는 100pmol로 하기 GO 또는 HA-GO(1㎍)와 혼합한 후 시료에 처리되었다. 하기 표 1은 실시예에 사용된 서열 정보를 나타낸 것이다.

서열번호	RNA	PNA sequence
1	BC1	FAM-OO-GGTCTTTTTGTTATTTTGTCTT
2	BC1 scramble	FAM-OO-TTCTGTTTTATTGTTTTTCTGG
3	MiR-124a	TAMRA-OO-TGGCATTCACCGCGTGCCTTAA
4	R-21	M-OO-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA
5	R-21 (FAM4)	M-L35-K(FAM)-O-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-O-K(FAM)-L35-K(FAM)
6	R-scramble	M-OO-ATCGAATAGTCTGACTACAACT

2. 그래핀 산화물 ( Graphene oxide, GO)의 합성

그래핀 산화물은 50 내지 100 nm의 균일한 사이즈를 갖도록 선별과정을 거쳐 준비하였다. 구체적으로 흑연의 산 처리는 Hummers와 Offeman의 방법으로 실험을 하였다. 우선 0℃에서 흑연 1g를 황산(sulfuric acid)에 분산시킨 후 초산나트륨(sodium acetate) 2g을 10분간 녹였다. 황산 용액에 과망간산칼륨(potassium permanganate) 12g를 넣고 10분간 녹인 후 상온에서 12시간 동안 반응을 시켰다. 반응이 종결된 용액을 증류수 2L에 부어 교반시킨 후 과산화수소(hydroperoxide) 20 mL를 넣어 potassium permanganate를 제거하여 준다. 이 용액을 원심분리기를 이용하여 증류수와 GO를 분리시킨다. 여러 번의 세척에 걸쳐 pH 6 내지 7로 중화시킨 후 동결건조기를 사용하여 GO를 얻었다.

3. 환원형 그래핀 산화물 (Reduced graphene oxide, rGO )의 합성

앞서 만들어진 GO 1g를 1000mL의 증류수에 초음파 처리로 완전히 분산시킨다. 분산된 용액에 hydrazine hydrate 10mL를 첨가 후 100℃에서 24시간 동안 반응을 진행한다. 반응이 종결되면 걸러서 물과 에탄올 1:1 비율로 섞인 용매에 2, 3회 세척한다. 80℃에서 진공 건조하여 rGO를 얻는다.

4. 그래핀 산화물 및 환원형 그래핀 산화물의 소광능 비교

앞서 제조한 그래핀 산화물 또는 환원형 그래핀 산화물을 0, 10, 20, 40 또는 80ng의 농도로 표 1의 BC1 PNA 4㎍(40pmol)과 혼합하고, 형광 강도를 Fluorometer로 측정하여 비교하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 환원형 그래핀 산화물의 소광능이 더 우수한 것을 확인하였다.

5. 히알루론산이 부착된 그래핀(HA-GO)의 제조

히알루론산을 EDC(1-ethyl-3,3-dimethylaminopropyl carbodiimide)와 1-HOBt(1-Hydroxybenzotriazole)의 존재하에서 adipic acid dihydrazide(ADH)로 화학적으로 변형시킨다. ADH-HA를 D₂O에 녹여 ¹H NMR 300MHz로 화학적 구조를 특정하였다. HA가 부착된 메틸렌 그룹과 마찬가지로 ADH의 메틸렌 그룹의 resonance peaks의 integration으로부터 20%의 ADH가 결합된 것을 측정하였다. 그리고 GO(10mg)을 탈이온화된 물(deionized water, 5ml)에 분산시키고, ADH-HA(100mg)과 혼합한다. 혼합의 결과물을 10분간 sonication한 후, EDC(48mg)과 NHS(58mg)을 첨가하여 그래핀 산화물과 HA를 결합시켰다.

6. 조직 적출 및 Section

마우스 마취 후 perfusion을 1xPBS로 수행한 다음, 각 조직을 적출한 뒤 4%의 PFA에 보관하였다. 그 다음 각 조직을 파라핀 블록으로 만든 다음 4μm 두께로 section하였으며, 이 때 각 section이 hippocampus를 포함하고 있는지 확인하는 작업을 거쳤다.

7. Deparaffinization

조직이 담긴 슬라이드를 55℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션한 다음, 파라핀 블록을 하기의 표에 기재된 순서대로 시약을 처리하여 녹였다(총 32분). 그 다음 DEPC(Diethylpyrocarbonate)가 처리된 증류수로 5분 동안 washing 작업을 2번 한 다음, DEPC가 처리된 PBS로 5분 동안 washing 작업을 3번 하였다.

1	Xylene 1	10분
2	Xylene 2	10분
3	Xylene : EtOH	3분
4	100% EtOH	3분
5	90% EtOH	2분
6	80% EtOH	2분
7	70% EtOH	2분

8. 염색

슬라이드에 β-actin, miR-21 또는 miR-124와 상보적으로 결합할 수 있는 PNA프로브를 포함하고 있는 그래핀 산화물 100μl를 분주 후 파라필름으로 덮고, 상온에서 1시간 또는 4시간동안 인큐베이션한다(습기 필요). 그 다음, 1xPBS로 5분간 washing을 3번 실시한다. 그리고 Mounting solution(DAPI 포함)으로 Mounting을 실시하고 커버 글라스로 덮는다. 그리고 -20℃에서 보관한다.

9. 결과

β-actin은 대부분의 세포에 존재하여 이을 탐지하는 프로브를 사용한 나노그래핀센서는 대조군을 사용하였다.

FAM-β-actin PNA 100pmol;과 HA-GO 1㎍ 또는 GO 1㎍를 혼합한 나노그래핀센서를 분리된 해마 조직에 처리하여 1시간 및 4시간 동안 인큐베인션한 결과, 도 1 및 2에 나타난 바와 같이, HA-GO를 사용한 경우 1시간 경과 시 β-actin의 검출이 완료된 것을 확인하였으나, GO를 사용한 경우 4시간이 경과하여도 β-actin이 검출되지 않았다.

FAM-miR-21 PNA 100pmol;과 HA-GO 1㎍ 또는 GO 1㎍를 혼합한 나노그래핀센서를 분리된 해마 조직에 처리하여 1시간 및 4시간 동안 인큐베인션 하였다. miR-21은 분리된 해마조직에서 존재하지 않는 것으로 알려져 있어 도 3 및 4에서 나타난 바와 같이, 형광이 나타나지 않았다. 이는 본 발명의 나노그래핀센서는 검출 대상 타겟이 시료 내 존재하지 않으면 검출되지 않는다는 것을 확인한 결과이다.

FAM-miR-124 PNA 100pmol;과 HA-GO 1㎍ 또는 GO 1㎍를 혼합한 나노그래핀센서를 분리된 해마 조직에 처리하여 1시간 및 4시간 동안 인큐베인션한 결과를 나타낸 것이다. 도 5 및 6에서 나타난 바와 같이, HA-GO를 사용한 경우 1시간 경과 시 miR-124의 검출이 완료된 것을 확인하였으나, GO를 사용한 경우 4시간이 경과하여도 HA-GO를 사용한 경우에 비해 형광 강도가 낮은 것으로 보이며, miR-124의 검출이 완료되지 않은 것을 나타내는 것이다. 즉, HA-GO를 사용한 경우가 GO를 사용한 경우에 비해 검출시간이 월등히 빠른 것을 확인하였다.

Claims

히알루론산 및 세포 투과성 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 함유하는 그래핀; 및
형광물질을 함유하는 프로브를 포함하는, 나노그래핀센서.
청구항 1에 있어서, 상기 그래핀은 그래핀 산화물 또는 환원형 그래핀 산화물인, 나노그래핀센서.
청구항 1에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 TAT 펩타이드인, 나노그래핀센서.
청구항 1에 있어서, 상기 프로브는 DNA, RNA 및 PNA(peptide nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 나노그래핀센서.
청구항 1에 있어서, 상기 프로브는 PNA(peptide nucleic acid)인, 나노그래핀센서.
청구항 1에 있어서, 상기 그래핀은 폴리에틸렌글리콜이 더 결합된 것인, 나노그래핀센서.
청구항 1의 나노그래핀센서와 시료를 혼합하는 단계를 포함하는 세포 내 핵산 검출 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 시료는 세포 및 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 세포 내 핵산 검출 방법.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 따른 나노그래핀센서를 포함하는 진단키트.