KR20190052522A

KR20190052522A - Gpc3 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190052522A
Application number: KR1020170148266A
Authority: KR
Inventors: 김양훈; 박대영; 안지영; 조성진
Original assignee: 주식회사 에이치피바이오
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2019-05-16

Abstract

본 발명은 GPC3(Glypican-3) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 의한 DNA 앱타머는 간암 바이오마커 단백질인 GPC3 단백질에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 의한 DNA 앱타머는 GPC3 단백질의 검출 또는 간암의 진단 및 예후 탐지에 사용될 수 있다.

Description

GPC3 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도 {DNA Aptamer Specifically Binding to GPC3 Protein and Its Use}

간암은 전 세계적으로 발생빈도가 높은 10대 암 중 하나로서, 매년 약 100만 명의 환자가 발생하고 있으며 사망률 3위를 기록하고 있는 질병이다. 특히, 간암은 간염 바이러스 보균율이 높은 우리나라를 포함한 중국, 일본 등의 아시아권에서 높은 발생 빈도를 나타내는 것으로 알려져 있다. 국가암정보센터에 따르면, 우리나라에서 간암은 16,463건이 발생하여 발생률 5위를 기록하였으며 (2011년 기준), 11,405명이 간암으로 사망하여 암 사망률 2위를 기록하여 (2013년 기준) 발생률에 비해 사망률이 높은 암으로 알려져 있다. 또한 국립암센터의 2007~2011년 암발생자의 5년 생존율 통계에 따르면, 간암의 5년 생존율은 28.6%로 다른 암에 비해 낮은 매우 낮은 편이며, 간암 1기 발견 시 생존율은 50%이지만 40-80%의 높은 재발률을 나타내기 때문에 조기 진단 및 예후 관리가 중요한 질환이다. 이와 같이 간암이 발생률에 비해 사망률이 높고 예후가 나쁜 원인으로는 간암은 조기에 혈관침습을 일으키고 성장속도가 빠르고, 대부분 만성 간염이나 간경변증을 동반하고 있어 적극적 암 치료에 장애가 되며, 간암 특이적 증세가 없어 주기적 검사를 시행하지 않으면 상당히 진행된 상태에서 발견되는 경우가 많기 때문이다. 간암은 대부분 만성 간염이나 간경변과 같은 만성 간질환을 가진 환자에서 발생하는데, 간암 환자의 80~90% 가량이 B형 또는 C형 간염 바이러스에 의한 간 질환을 앓고 있으며 이중 80% 이상이 간경변증을 가지고 있다. 이와 같이 간암의 주요 원인은 B형 및 C형 간염바이러스 감염으로, B형 간염 바이러스 감염은 간암을 100~200배 증가시키고, C형 간염 바이러스 감염은 간암을 10배 이상 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이외에도 술과 담배로 인한 다양한 유해화학물질 흡수, 비만, 경구 피임약, 음용수에 포함되어 있는 비소 섭취 등의 환경적 인자도 간암의 원인인 것으로 알려져 있다. 특히, B형 간염 바이러스 감염은 정상인보다 간암의 위험도가 100배 정도 높아 가장 중요한 원인으로 손꼽히고 있는데, 우리나라 간암환자의 약 75%가 B형 간염 바이러스에 감염되어 있어 밀접한 관련이 있다.

현재 간암의 가장 확실한 치료 방법은 간이식과 수술적 간절제로 알려져 있는데, 간이식의 경우 간암의 치료 방법 중 가장 높은 생존율을 보이지만 공여자를 구하기 힘들며, 비교적 긴 생존 기간을 기대할 수 있는 수술적 간절제는 간암 환자의 9~27%만이 수술을 받을 수 있다는 한계를 가지고 있다. 수술이 불가능한 경우, 간암에 혈액을 공급하는 혈관을 찾아 항암제를 투여하고 혈관을 막아 산소와 영양분의 공급을 끊어주는 경동맥화학색전술 (transarterial chemoembolization; TACE), 간암에 알코올을 주입하여 간암 세포를 죽이는 경피적 에탄올 주입법 (percutaneous ethanol injection therapy; PEIT), 고주파를 이용하여 간암을 태워 없애는 고주파 열치료법 (radiofrequency ablation; RFA) 등의 비수술적 치료가 이용되고 있다. 이와 같은 간암의 비수술적 치료 기법은 초기 간암 환자에서 높은 치료 효과를 보이지만, 각 치료법의 성공여부는 간조직의 상태에 따라 크게 좌우되고 진행된 암에서는 한계가 있다. 따라서 증상이 없고 예후가 나쁜 간암의 특징을 고려하였을 때, 간암에 대한 최선의 대책은 정기적인 검사를 통한 조기 발견과 함께 간암의 주요 원인인 간염 바이러스 감염을 막는 것이 중요하다.

간은 침묵의 장기로서 간암이 발생해도 별다른 증상이 없기 때문에 건강검진 등의 정기적인 검사를 통한 조기 검진이 중요하다. 현재 간암의 조기 검진은 초음파, CT, MRI, 혈관 촬영 등의 영상 검사와 AFP (alpha fetoprotein ; 알파태아단백질), PIVKA-Ⅱ (DCP ; des-carboxyprothrombin) 등 간암 특이적 종양 표지자의 혈청 내 증가를 확인하는 혈청 검사 (serological test)를 통해 이루어지고 있다. AFP는 태아의 간조직이나 소화기관에서 만들어지는 단백질로 출생 후 급격히 감소하여 혈액 내에 10 ng/㎖ 정도로 존재한다. 성인에서 AFP 수치가 증가하면 병적인 상태인 경우가 많은데, 주로 간염·간경변·간 종양·간 내 전이된 암 등 다양한 간 질환에서 상승하기 때문에 AFP는 간암의 진단을 위해 가장 많이 이용하는 종양표지자이다. 하지만 진행성 간암에서의 민감도는 50-60%, 3cm 이하의 소간암에서의 민감도는 20-30%로 낮을 뿐만 아니라, 알코올성 간염, 바이러스성 간염 및 간경변 등의 양성 간질환에서도 증가되는 경우가 있으므로 AFP 수치 단일 검사만으로는 간암 진단 방법으로 적절하지 않다 (김철 외 14명, 대한간학회지, 2001, 7, 467-474). AFP 양성 기준치를 20ng/㎖로 하였을 때 간암 진단의 민감도는 55-69%, 특이도는 83-92% 정도이며, 간암의 유병률을 5%로 가정할 경우 양성 예측도는 25%에 불과한 실정이다. PIVKA-Ⅱ는 간암 종양세포에서 프로트롬빈 전구 물질이 카르복실화되는 과정의 결함으로 생성되는 단백질로서, 사람 간암 종양세포의 면역염색에서 PIVKA-Ⅱ 발현이 관찰되고, 간암의 혈관침범이 심하고 종양의 행태가 나쁜 경우 PIVKA-Ⅱ가 발현되어 혈중에서 증가하기 때문에 간암의 진단과 예후를 예측하는 데 유용한 종양표지자로 알려져 있다. PIVKA-Ⅱ의 간암 진단 민감도는 48-62%, 특이도는 81-98%로 보고되고 있으며 치료효과를 판정하는 데에도 효과적인 종양 표지자로 보고되고 있지만, 진단 유용성은 AFP와 비슷한 수준이다. 이와 같이 기존 간암 종양표지자로 사용되고 있는 AFP와 PIVKA-Ⅱ 모두 단독으로 이상적인 종양표지자는 아니므로, 보다 높은 민감도와 특이도를 가지고 간암을 조기 진단할 수 있는 종양표지자와 이를 이용한 간암 조기 진단 기술의 개발이 필요하다. 본 연구에서는 간암의 진단 및 예후 확인에 활용할 수 있는 신규 간암 종양표지자인 GPC3 단백질을 활용하고자 한다.

글리피칸-3 (Glypican-3; GPC3)는 세포 표면에 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커 (glycosylphosphatidylinositol anchor)를 통해 세포 표면에 고정되어 있는 황산헤파란 프로테오글리칸글리피칸 패밀리의 하나이다. GPC3 단백질은 세포 생장, 분화 및 운동에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 또한, GPC3 단백질은 생장인자와 신호핵심적인 역할을 한다. 생물학적 상황에 따라, glypicans는 신호 활동을 자극하거나 억제 할 수 있다. Wnt signaling의 경우, 자극 메커니즘은 Wnt와 그들의 신호 수용체 인 Frizzled 단백질의 상호 작용을 촉진 및 / 또는 안정화시키는 글리 피칸 (glypicans)의 능력에 기초한다고 예측되어 왔다. 이 가설은 glypicans가 Wnts와 Frizzleds에 결합 할 수 있고, glypicans의 발현량이 증가한 세포의 Wnt 결합능력을 증가시킨다는 것을 발견했다. Hh signaling (Hedgehog signaling)의 경우, Ghp3가 Hh 결합에 대해 Hh 수용체와 경쟁함으로써 발달 동안 신호를 억제한다는 것이 보고되었다 (Capurro et al., Dev Cell, 2008, May;14 (5), 700-11). GPC3에 대한 Hh의 결합은 엔도사이토시스 및 분해를 유발한다. 또한, glypican 단백질은 자극 작용의 메커니즘이 알려지지 않았지만 Hh 신호를 자극하는 것으로 보고되고 있다. GPC3 단백질은 간암의 발병 시에 높은 발현량을 나타낸다. GPC3 단백질의 과발현에 대한 보고는 1997년에 처음으로 보고되었으며, 간암 환자 중 대략 75%의 환자에게서 GPC3 mRNA의 과발현 양상을 보고했다. GPC3 단백질은 HCC 세포인 HepG2, Hep3B, HT17, HuH6, HuH7 및 PLC / PRF / 5에서 고도로 발현되는 양상을 보인다.

또한, GPC3 단백질 발현은 간암 종양의 70% 이상에서 발견되고 있고 GPC3 양성 간암 환자가 GPC3 음성 간암 환자보다 5년 생존율이 현저히 낮다는 사실을 발견 한 결과, GPC3 발현은 간암의 예후와도 밀접한 관련이 있는 것으로 보인다는 보고들이 있다. 간암의 조기 진단은 초기 간암 환자의 혈청에서 특이적으로 나타나는 단백질 마커를 확인하는 것으로 간단히 이루어질 수 있다. HCC 환자의 53 %의 혈청에서 GPC3이 발견 될 수 있지만 정상 혈청에서는 검출되지 않는다고 보고했다. 또한, 연구자들은 간염과 간경변 환자 20 명 중 1 명만이 GPC3 양성인 것으로 보고했다 (Capurro et al., Gastroenterology, 2003, Jul;125 (1), 89-97). 이에 GPC3은 양성 간세포 결절과 간암을 구별할 수 있는 간암 특이 단백질 마커로 활용될 수 있을 것으로 예상되고 있다. 따라서 GPC3 단백질은 간암의 진단 및 치료제 개발을 위한 바이오마커 단백질로 사용할 수 있을 것으로 예상된다. 이에 본 발명에서는 GPC3 단백질과 결합하는 DNA 앱타머를 제작하고, 이를 이용하여 간암의 진단 기술 및 치료제 개발에 응용하고자 하였다.

본 발명에서 활용하고자 하는 앱타머 (aptamer)는 짧은 길이의 올리고머 (oligomer)로서, 안정한 구조를 형성하여 표적 물질에 높은 결합력과 특이성을 가지고 결합하는 특징을 가지고 있다. 앱타머는 DNA나 RNA로 구성되어 있어 단백질로 이루어진 항체에 비해 안정성이 높으며, 화학적 합성을 통해 제작할 수 있기 때문에 경제성 또한 높은 장점을 지니고 있다. 또한, 항체와 달리 개발에 동물 실험이 필요하지 않을 뿐만 아니라 크기의 변화 및 소수성 변화를 통해 약물동력학적 성질을 쉽게 변형할 수 있으며 인체에서 면역반응 및 거부반응을 일으키지 않는다는 장점을 가지고 있어 표적 물질의 검출 및 질환 진단 기술 개발은 물론 다양한 질병에 대한 치료제 개발에서도 활용 가능성이 높이 평가되고 있다.

본 명세서에서는 상기한 바와 같이 각종 산업 및 의학 분야에서 높은 잠재성을 보이는 앱타머를 활용하여 간암의 발생 및 증식에 중요한 역할을 하는 기존의 항체 기반의 간암 진단 기술을 대체하고자 한다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

현재 간암의 조기 검진은 영상 검사와 함께 혈청 내에 존재하는 간암 종양표지자인 AFP나 PIVKA-II의 증가를 확인함으로써 이루어지고 있으며, 면역크로마토그래피법 (immunochromatographic assay), 효소결합 면역 흡착법 (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay; ELISA) 등을 이용한 측정 방법이 가장 널리 이용되고 있다. 하지만 기존의 간암 조기 검진을 위해 사용되는 간암 종양표지자는 간염, 간경변 등의 양성 간질환에서도 양성 반응이 나올 수 있을 뿐만 아니라, 낮은 민감도와 특이도를 가지고 있어 간암 진단에 있어서 유용성이 제한적이라는 한계를 가지고 있다. 또한 항체 기반의 검출 기술이 지닌 항체의 높은 생산 비용과 배치 간 변이 (batch to batch variation) 등의 한계를 극복하기 위한 새로운 진단 기술 개발이 필요하다.

이에 본 발명자들은 간암의 조기 진단 및 치료제 개발에 응용하기 위하여 새로운 간암 바이오마커인 GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 개발하기 위한 연구를 수행하였다. 그 결과, 간암에서 발현이 증가하고 간암의 증식에서 중요한 역할을 하는 GPC3 단백질을 표적으로 하여 GPC3 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하였으며, 선별한 DNA 앱타머를 활용하여 새로운 간암의 조기 진단 및 치료제 개발 기술을 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 간암 바이오마커인 GPC3 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머, 상기 앱타머를 포함하는 간암 진단 또는 GPC3 단백질 검출용 조성물 및 키트, 상기 앱타머를 이용한 시료 중 간암 세포 또는 GPC3 단백질의 검출 방법, 및 상기 앱타머를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

제1구현예에 따르면,

본 발명은 GPC3(Glypican-3) 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "앱타머(aptamer)"는 그 자체로 안정한 3차 구조를 형성하며 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 용어 "핵산(nucleic acid)"은 뉴클레오티드의 중합체로, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 동등한 의미로 사용될 수 있다. 상기 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA), 뉴클레오티드 유사체, 및/또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid: PNA) 분자를 포함할 수 있다. 상기 앱타머는 단일가닥 핵산으로 존재할 수 있다. 상기 앱타머는 3차 구조를 형성하여 GPC3 단백질에 결합할 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체 내 또는 시험관 내 선택 기술을 이용할 수 있다 (Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "특이적으로 결합(specifically binding)"은 상기 앱타머가 GPC3 단백질 이외의 다른 유기화학물질에 실질적으로 결합하지 않거나 친화도에서 큰 차이를 보여 GPC3 단백질과 다른 유기화학물질의 구별을 가능하게 하는 것을 의미 한다.

본 발명에 따른 앱타머에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 98% 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 일부 뉴클레오티드가 치환, 삽입, 및/또는 결실된 것일 수 있다. 바람직하기는, 상기 앱타머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 앱타머에 있어서, 상기 앱타머는 검출가능한 표지 물질을 더욱 포함할 수 있다. 상기 표지 물질은 검출가능한 신호를 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 검출가능한 신호는 광학적 신호, 전기화학적 신호, 방사성 동위원소에 의한 신호, 효소에 의한 신호, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 광학적 신호를 발생시키는 물질은 형광 물질 또는 인광 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오레세인(fluorescein), 로다민, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, 또는 Cy5.5일 수 있다. 플루오레세인 염료의 예에는, 6-카르복실플루오레세인(6-FAM), 5-테트라클로로-플루오레세인 포스포라미디트(TET), 헥사클로로-플루오레세인(HEX), 및 4,5-디클로로-디메톡시-플루오레세인(JOE)이 포함될 수 있다. 또한, 상기 광학적 신호는 형광공명에너지전달(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍에 의해 발생되는 것일 수 있다. 상기 FRET 쌍으로서 당해 분야에 알려진 물질이 이용될 수 있다. 상기 전기화학적 신호를 발생시키는 물질은 메틸렌 블루일 수 있다. 상기 방사성 동위원소는 C¹⁴, I¹²⁵, P³², 또는 S³⁵일 수 있다. 상기 효소는 알칼라인 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 시토그롬 P450, 또는 글루코스 옥시다제일 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 3' 말단 또는 5' 말단에 결합할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 특정 부위에 결합될 수 있다. 상기 특정 부위는 예를 들면, 헤어핀-루프(hairpin-loop) 구조의 일부일 수 있다.

본 발명에 따른 앱타머에 있어서, 상기 앱타머는 뉴클레오타이드의 당 (sugar) 2번 탄소의 수산화기 (-OH)가 수소원자 (-H), 불소원자 (-F), 아미노기 (-NH2), 또는 메톡시기 (-CH3)로 치환될 수 있다.

제2구현예에 따르면,

본 발명은 GPC3 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 포함하는 간암 진단 또는 GPC3 단백질 검출용 조성물 또는 키트를 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 98% 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 일부 뉴클레오티드가 치환, 삽입, 및/또는 결실된 것일 수 있다. 바람직하기는, 상기 앱타머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 앱타머는 검출가능한 표지 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 3' 말단 또는 5' 말단에 결합할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 특정 부위에 결합될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 조성물 또는 키트는 HPLC, LC/MS, 또는 GC/MS와 같은 기기를 이용한 검출 또는 항체를 이용한 검출에 앞서, 시료 중 GPC3 단백질의 유무를 신속하게 스크리닝하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 조성물 또는 키트는 반응 완충액을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 키트는 시료 중 BDE-47을 검출하는 방법이 기재되어 있는 설명서를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 키트는 기판에 고정화된 앱타머를 포함할 수 있다. 용어 "기판"은 상기 앱타머가 고정화될 수 있는 고체 지지체를 의미한다. 상기 기판은 비드(bead), 막(membrane), 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate), 또는 칩(chip)일 수 있다. 상기 앱타머는 예를 들면, 자성비드에 고정화된 것일 수 있다. 이 경우, GPC3 단백질과 특이적으로 결합된 앱타머는 자석을 이용하여 분리될 수 있다. 상기 앱타머는 상기 기판에 직접 또는 링커에 의해 공유적으로 결합될 수 있다. 상기 앱타머는 공유적으로 결합가능한 관능기를 더 포함할 수 있다. 상기 관능기는 카르복실기, 히드록시기, 또는 아민기일 수 있다. 상기 앱타머는 예를 들면, 비오틴화된 것일 수 있다. 비오틴화된 앱타머는 기판에 코팅된 스트렙트아비딘에 의해 고정화될 수 있다.

제3구현예에 따르면,

본 발명은 GPC3 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용한 시료 중 간암 세포 또는 GPC3 단백질의 검출 방법을 제공하고자 한다. 상기 방법은:

(A) 시료와 GPC3 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 접촉시키는 단계; 및

(B) GPC3 단백질과 상기 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “시료”는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 및 체액을 포함할 수 있으며, 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등도 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 간암 세포 또는 GPC3 단백질의 검출 방법에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 98% 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 일부 뉴클레오티드가 치환, 삽입, 및/또는 결실된 것일 수 있다. 바람직하기는, 상기 앱타머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 간암 세포 또는 GPC3 단백질의 검출 방법에 있어서, 상기 앱타머는 검출가능한 표지 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 3' 말단 또는 5' 말단에 결합할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 특정 부위에 결합될 수 있다.

본 발명에 따른 간암 세포 또는 GPC3 단백질의 검출 방법에 있어서, 상기 시료와 상기 앱타머 간의 접촉은 적절한 반응 조건, 예를 들면, 염의 조성 및 pH 하에서 일어날 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 이와 같은 반응 조건을 용이하게 설정할 수 있다. 적절한 pH는 예를 들면, 5 내지 8.5, 6 내지 8, 또는 7 내지 8일 수 있다. 반응 온도는 예를 들면, 15 내지 50℃, 20 내지 45℃, 또는 30 내지 40℃일 수 있다. 상기 앱타머는 전술된 조성물 또는 키트의 형태로 제공되는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 기판에 고정화되어 있는 것일 수 있다. 상기 기판은 비드, 막, 마이크로타이터 플레이트, 또는 칩일 수 있다.

본 발명에 따른 간암 세포 또는 GPC3 단백질의 검출 방법에 있어서, 상기 GPC3 단백질과 상기 앱타머의 결합 여부는 상기 앱타머가 연결된 센서를 통해 확인될 수 있다. 이를 위해 당해 분야에 알려져 있는 센서가 이용될 수 있다. 상기 결합 여부는 결합에 의해 발생하는 신호를 측정함으로써 확인될 수 있다. 상기 신호는 광학적 신호, 전기화학적 신호, 효소에 의한 신호, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합 여부는, 예를 들면, GPC3 단백질과 결합된 앱타머의 구조 변화에 의해 유발되는 광학적 신호의 변화 또는 전기화학적 신호의 변화를 검출함으로써 확인할 수 있다. 또는, 상기 앱타머가 고정된 지지체와 GPC3 단백질 간의 응집 혹은 반발력의 차이를 측정함으로써 결합 여부를 확인할 수 있다. 상기 방법에 의해 GPC3 단백질의 존재가 확인된 시료는 당해 분야에 알려진 분석 방법을 통해 추가로 분석될 수 있다.

제4구현예에 따르면,

본 발명은 GPC3 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 98% 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 일부 뉴클레오티드가 치환, 삽입, 및/또는 결실된 것일 수 있다. 바람직하기는, 상기 앱타머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 앱타머는 검출가능한 표지 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 3' 말단 또는 5' 말단에 결합할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 특정 부위에 결합될 수 있다.

본 발명에 따른 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 앱타머는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화 될 수 있다. 예를 들어, 상기 앱타머 자체 또는 이를 코딩하는 DNA 핵산 분자는 단독으로 또는 약제학적 제형의 성분으로서 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 앱타머는 생체 내에서의 안정성을 높이기 위해 다양한 화학적 변형이 가해질 수 있다. 예를 들어, RNase에 대한 저항성을 높이기 위해 DNA 핵산의 리보오스 (ribose) 내 2번 탄소의 수산화기 (-OH)가 수소원자 (-H), 불소원자 (-F), 아미노기 (-NH2), 또는 메톡시기 (-CH3)로 치환될 수 있다. 이와 같은 화학적 변형은 DNA 앱타머의 혈청 내 반감기를 증가시킬 수 있다. 또한, 혈액 내에서의 DNA 앱타머의 신속한 제거 (rapid clearance)를 줄이기 위해 PEG 또는 콜레스테롤과 같은 고분자 물질을 부착시킬 수 있다.

본 발명에 따른 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명에 따른 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg (체중)이다.

본 발명에 따른 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 신규 간암 바이오마커 단백질인 GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서 본 발명의 GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 간암의 조기진단 및 예후 판단 용도로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 간암 치료용 조성물의 첨가제 용도로도 사용될 수 있다. 본 발명의 GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 각종 질병의 진단에 사용되는 항체를 이용한 진단방법을 대체할 수 있으며, 나아가 다양한 난치성 질환에 대한 검출 및 치료제 기술 개발에 있어서 보다 신속하고 경제적인 기술 개발을 가능케 할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 GPC3 단백질의 크기를 SDS-PSGE 방법을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 랜덤 DNA 라이브러리를 만들기 위해 PCR을 이용하여 증폭하고 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 3는 Heating-Cooling 기법을 통해 획득한 ssDNA의 크기를 비교하기 위해 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 나노드랍을 이용하여 SELEX의 각 라운드에서 회수된 ssDNA 앱타머의 농도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머 후보군을 DNA mfold 프로그램을 이용하여 이미지화한 결과를 나타낸다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1. GPC3 유전자 선정 및 GPC3 단백질의 준비

앱타머 선별에 사용하기 위해 재조합 GPC3 단백질 (R&D Systems, USA)을 구입하여 사용하였다. 구입한 GPC3 단백질의 분자량은 61.6 kDa이었으며, 이후에 수행할 실험에서 GPC3 단백질만을 선택적으로 정제할 수 있도록 C 말단에 His tagging system이 내재되어 있는 단백질을 사용하였다. 구입한 재조합 GPC3 단백질은 실험에 사용하기에 앞서 반투과성막을 이용한 용매 교환을 통해 용매를 1X PBS (pH 7.2)로 바꾸어 주었으며 단백질의 순도와 농도는 10% SDS-PAGE를 통해 확인하였다 (도 1).

실시예 2.　DNA 앱타머의 제작

2-1. Primer 및 DNA 앱타머 풀의 합성

GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제작하기 위한 랜덤 주형 DNA를 확보하기 위하여, 40개의 랜덤 서열을 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 포함하고 있는 100bp의 주형 DNA (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATA CCAGCTTATTCAATT-N40- AGATAGTAAGTGCAATCT-3')와 이를 100bp로 증폭할 수 있는 프라이머 한 쌍을 바이오니어 (Bioneer, Korea)로부터 합성하였다 [정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATAC CAGCTTATTCAATT-3'. 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'].

2-2. PCR 기법을 통한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭

임의의 DNA 라이브러리는 PCR 기법을 이용하여 증폭하였으며, 100 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성은 주형 DNA 1 ㎕, 10 X PCR 완충용액 5 ㎕, dNTP 혼합물 4 ㎕, 10 μM 정방향 프라이머 2 ㎕, 10 μM 역방향 프라이머 2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.3 ㎕ (1 unit/㎕)와 35.7 ㎕의 증류수로 구성하였다. PCR과정의 반응 조건은 94℃에서 5분간 변성시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 반응산물을 4㎕ 취하여, 2% 아가로오스 겔 전기영동을 통하여 100bp 증폭 산물을 확인한 뒤, PCR 정제 키트 (Qiagen, USA)를 이용하여 정제하여 증류수 50 ㎕에 회수하였다 (도 2).

2-3. 가열-냉각 (heating-cooling) 기법을 활용한 ssDNA 제작

PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 회수한 DNA 라이브러리 50 ㎕에 증류수 50 ㎕를 첨가하여 부피를 100 ㎕로 조정한 후, 가열-냉각 (heating-cooling) 기법을 이용하여 dsDNA를 ssDNA로 변성 (Denaturation)하였다. 상기한 PCR 기법과 PCR 정제 기트를 이용한 PCR 산물 정제를 통해 확보한 dsDNA를 85℃에서 5분 동안 반응하여 dsDNA를 ssDNA로 변성시킨 후, 반응 종료 후 즉시 반응액을 4℃로 냉각하여 ssDNA를 제작하였다.

2-4. ssDNA의 선별 및 회수

가열-냉각 기법을 이용하여 확보된 ssDNA 산물 중 비오틴 (Biotin)이 결합되어 있는 ssDNA와 primer를 제거하고 정방향의 ssDNA만을 순수하게 확보하기 위하여, 상기 실시 예에서 획득한 100 ㎕의 반응액에 스트렙트아비딘 아가로즈 레진 (streptavidin agarose resin, Thermo scientific, USA) 50 ㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액은 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 15분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 동일 부피의 PCI (phenol : chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24 : 1) 용액을 처리한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 상층액에 1/100 부피의 tRNA (sigma aldrich, USA), 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트 (sodium acetate, pH 4.5)와 3 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 ssDNA만을 회수하였다. 회수한 ssDNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 회수한 ssDNA 중 10 ㎕를 취하여 10% 아크릴아마이드 겔을 이용하여 100bp의 dsDNA와 비교하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다 (도 3).

실시예 3. Ni - NTA agarose resin 기반 SELEX 기법을 이용한 재조합 GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별

3-1. SELEX에 사용하기 위한 DNA 앱타머 구조 제작

상기 실시예 2-4를 통해 확보한 ssDNA 앱타머 40 ㎕에 증류수를 10 ㎕ 첨가하여 총 부피를 50 ㎕로 조정하고, 2X PBS 버퍼 50 ㎕를 첨가하여 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정 후, 85℃에서 5 분간 끓여 변성시킨 후 상온에서 1시간 이상 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성하였다.

3-2. Ni-NTA agarose resin 기반의 SELEX 기법을 이용한 GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머 선별

GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 선별하기 위하여 GPC3 단백질 159.7 ng (64.8 pmole)에 상기 실시예 3-1에서 확보한 ssDNA 앱타머 풀 (648 pmole)과 혼합한 후, 1X PBS 버퍼로 전체 반응 부피를 200 ㎕로 조정하였으며, 이후 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 선별하기 위하여 Ni-NTA agarose resin을 이용하여 SELEX를 수행하였다.

우선 Ni-NTA agarose resin을 활성화 시켜준 뒤, GPC3 단백질과 ssDNA 앱타머 반응액을 넣어주었다. 이후, GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 회수하기 위하여 1X PBS 버퍼 1 ㎖로 3회 세척한 Ni-NTA agarose resin에 1X PBS 버퍼 200 ㎕를 넣고 85℃에서 5 분간 반응시켰다. 반응액은 4℃에서 13,000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 회수한 뒤, 동일 볼륨의 PCI를 처리하여 GPC3 단백질을 제거하였다. PCI 추출을 통해 확보한 상층액은 용액의 1/100 부피의 tRNA, 1/10 부피의 3 M NaOAc (pH4.5)와 3배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 70℃에서 1시간 이상 반응한 뒤 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리 하여 ssDNA 앱타머 만을 회수하였다. 회수된 ssDNA 앱타머는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹여 회수하였다.

3-3. 비특이적 DNA 앱타머 제거를 위한 네가티브 선별 (Negative selection)

GPC3 단백질이 아닌 Ni-NTA agarose resin에 결합하는 비특이적인 ssDNA 앱타머를 제거하기 위하여, SELEX 7회와 8회 사이에 GPC3 단백질의 고정없이 Ni-NTA agarose resin에 ssDNA 앱타머만을 반응시켜주는 네가티브 선별 (negative selection)을 진행하였다. 활성화된 Ni-NTA agarose resin에 상온에서 구조를 형성한 ssDNA 앱타머 용액을 반응시킨 후, Ni-NTA agarose resin에 결합하지 않은 상층액의 ssDNA 앱타머 용액을 회수하여 SELEX 8회에 이용하였다. 이후, SELEX는 10회까지 진행하였으며, SELEX 라운드가 진행될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적 물질인 GPC3 단백질과 더욱 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 얻고자 하였다.

실시예 4. 나노드랍을 이용한 각 라운드의 친화성 테스트

SELEX를 10회까지 수행한 뒤, SELSEX의 추가 진행 여부 및 각 라운드에서 회수된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 회수된 ssDNA의 농도를 나노 드랍 (Nano drop)을 이용하여 측정하였다. 나노 드랍을 이용하여 각 라운드에서 회수된 ssDNA 앱타머의 농도를 측정한 결과, 네가티브 선별 이후에 9 라운드에서 회수된 ssDNA 농도가 491.9 ng/㎕로 가장 높았으며, 10 라운드의 농도는 405.9 ng/㎕로 9 라운드보다 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 네가티브 선별 이후 GPC3 단백질과 가장 특이적으로 결합하는 최적 앱타머 풀은 9 라운드인 것을 확인할 수 있었다 (도 4).

실시예 5. GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군을 확보하기 위한 최적 라운드의 T-벡터 클로닝

나노 드랍을 통하여 GPC3 단백질과 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단된 9 라운드의 ssDNA 앱타머 풀로부터 ssDNA 앱타머 후보군의 서열을 확보하기 위하여 9 라운드의 T-벡터 클로닝을 수행하였다. 이를 위하여 9 라운드의 ssDNA 앱타머 풀에 정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3' 와 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' 를 이용한 PCR을 수행하였다.

PCR을 통하여 확보한 dsDNA는 솔젠트사의 T-블런트 PCR 클로닝 키트를 이용하여 T-벡터 클로닝을 수행하였다. T-벡터 클로닝은 T-블런트 벡터 (10 ng/㎕) 1㎕와 PCR 산물 4㎕, 6 X T-블런트 버퍼 1㎕를 섞어서 25℃에서 5분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. T-블런트 클로닝 반응액 1㎕는 100㎕의 DH5α 형질전환 세포 (competent cell)와 섞은 후 얼음에서 10분 동안 반응시켰으며, 반응액을 42℃에서 30초 동안 열 충격 (heat shock)을 가한 후 얼음에서 2분 동안 반응시켰다. 반응액에 900㎕의 SOC 배지 (2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucose)를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 200 ㎕의 배양액을 취하여 암피실린 (ampicillin, 50 ㎍/㎖), 카나마이신 (kanamycin, 50 ㎍/㎖), X-gal (50 ㎍/㎖), IPTG (5 ㎍/㎖)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트 (LB plate)에 도말하고, 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후, 64개의 흰색 콜로니만을 선별하여 각 콜로니의 염기서열을 확인하였으며 (Solgent, Korea), 서열 분석을 통하여 비정상적이거나 중복되지 않는 GPC3 단백질 결합 ssDNA 앱타머 서열 14개를 확보할 수 있었다.

아래 표 1은 Ni-NTA agarose resin을 활용한 SELEX를 통해 획득환 GPC3 단백질 결합 ssDNA 앱타머 후보군 중 GPC3 단백질에 대해 최적의 결합력을 나타낸 1개의 DNA 앱타머에 대한 서열정보이다.

클론명칭	서열번호	확인된 서열	크기 (bp)
GPC3-A1	서열번호1	ATAGGCGTATCGATGACCGGATTTAATCATGATTGATCG	39

실시예 6. GPC3 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조 결정

GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화하였다 (도 5).

< 실험예 >

실험예 1. SPR을 이용한 GPC3 단백질과 GPC3 결합 DNA 앱타머 후보군 간의 친화도 정량

1-1. GPC3 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들 간의 친화도를 정량하기 위한 GPC3 단백질 코팅 센서칩 제작

GPC3 단백질과 상기 실시예 5에서 획득한 GPC3 결합 ssDNA 앱타머 후보군들 간의 친화도를 정량하기 위하여, SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000 (BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다.

GPC3 단백질과 GPC3 결합 ssDNA 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여 표면이 카르복실기로 코팅된 센서칩 CM5 (GE Healthcare, UK)를 이용하였다. 우선 센서칩 CM5 표면의 카르복실기를 반응성이 더 좋은 N-히드록시석신이미드 에스테르 (N-Hydroxy-succinimide ester; NHS-에스테르)로 활성화시키기 위하여 0.1 M Nhydroxysuccinimide (NHS)와 0.4 M N-ethyl-N'- (dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 혼합액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려주었다. NHS-에스테르로 활성화된 센서칩 CM5 표면에 GPC3 단백질을 고정하기 위하여 10 mM 소듐 아세테이트 (pH 4.5) 완충액에 GPC3 단백질을 1/20로 희석하여 센서칩에 10 ㎕/min의 속도로 10분 동안 3회 처리하여 칩 표면을 GPC3 단백질로 코팅하였다.

이후 GPC3 단백질이 고정된 센서칩에 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드 (pH 8.5)를 10 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려줌으로써 센서칩 표면에 남아 있는 카르복실 반응기를 불활성화 시켰다. 이를 통하여 다른 시약 및 DNA 앱타머가 칩 표면에 직접 결합하는 것을 방지하였으며, 각 실험 후 센서칩은 1 M NaCl, 50 mM NaOH로 재생시켰다. 속도 변수는 BIA 평가프로그램 (BIACORE)으로 수득, 정량하였다.

1-2. GPC3 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화력 측정

GPC3 단백질과 가장 높은 친화력을 가지는 ssDNA 앱타머를 선별하기 위하여 확보된 GPC3 단백질 결합 ssDNA 앱타머 후보군을 HBS-EP 버퍼 (GE Healthcare, UK)에 각 100 nM, 300 nM, 500 nM, 700 nM, 1000 nM, 1200 nM, 1500 nM, 2000 nM의 농도로 녹여 준비하였다. 준비한 GPC3 결합 ssDNA 앱타머는 아무것도 결합시키지 않은 센서칩 (채널 1), GPC3 단백질이 고정된 센서칩 (채널 2)에 다양한 농도 (각 100 nM, 300 nM, 500 nM, 700 nM, 1000 nM, 1200 nM, 1500 nM, 2000nM)의 GPC3 단백질 결합 ssDNA 앱타머 후보군을 주입함으로써 GPC3 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머 후보군간의 친화도를 정량화하였다.

각 GPC3 단백질과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머 후보군의 해리상수 (Kd, dissociation constant) 수득 결과 GPC3 단백질 결합 ssDNA 앱타머 후보군 중 GPC3-A1 앱타머의 해리상수가 0.029 ± 0.001 pM으로 표적단백질인 GPC3에 대해 가장 높은 친화력을 가지고 있음을 확인할 수 있었다 (표 2).

클론 명칭	Kd (pM)
GPC3-A1	0.029 ± 0.001

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> DNA Aptamer Specifically Binding to GPC3 Protein and Its Use <130> DP-2017-0107 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPC3-A1 <400> 1 ataggcgtat cgatgaccgg atttaatcat gattgatcg 39

Claims

GPC3(Glypican-3) 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 뉴클레오티드로 이루어진 앱타머.
제1항에 있어서,
상기 앱타머는 Cell-SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)의 방법으로 선별되는 것을 특징으로 하는 앱타머.
제1항에 있어서,
상기 앱타머는 당(sugar) 2번 탄소의 수산화기가 수소원자, 불소원자, 아미노기, 또는 메톡시기로 치환된 것을 특징으로 하는 앱타머.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 앱타머를 포함하는 간암 진단 또는 GPC3 단백질 검출용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 앱타머를 포함하는 간암 진단 또는 GPC3 단백질 검출용 키트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 앱타머를 이용한 시료 중 간암 세포 또는 GPC3 단백질의 검출 방법으로, 상기 방법은:
(A) 시료와 GPC3 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
(B) GPC3 단백질과 상기 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 시료는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 또는 체액인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 앱타머를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.