CN109337909A - 一种检测肝癌耐药细胞株的核酸适体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测肝癌耐药株细胞的核酸适体及其应用。同现有技术相比，本发明的优点在于：制备的核酸适体能特异性识别肝癌耐药株细胞并具有较好的亲和力、低免疫原性、分子量小、能够体外化学合成、可以对核酸适体的不同部位进行修饰和取代。同时，具有序列稳定，便于保存，方便标记等优势。采用本发明的核酸适体进行肝癌耐药株细胞检测时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好。

Description

一种检测肝癌耐药细胞株的核酸适体及其应用
技术领域
本发明涉及一种可用于检测肝癌耐药株细胞的核酸适体及其在制备检测制剂中的应用。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的原发性肝肿瘤，是癌症死亡的第三大原因，其发病率增加主要与肝硬化丙型肝炎病毒(HCV)相关的高发病率有关。肝癌是恶性程度高、预后差的疾病，在我国是第二大恶性肿瘤，我国每年约11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45％。
随着医学科技的进步，我国原发性肝癌的治疗取得了长足的进步，形成“以手术为主综合治疗”的治疗原则，提高了肝癌的整体疗效，延长患者的生存时间，进一步改善患者的生活质量。其中化疗是重要的治疗方法之一，但由于化疗的严重副作用以及肿瘤多药耐药性(multiple drug resistance,MDR)的存在使肝癌的化疗效果受到严重影响。多药耐药性(MDR)定义为癌细胞对一种化学治疗药物产生耐药性的同时，伴有对其他具有不同结构和作用机制的化学治疗药物产生交叉的耐药性。具体而言，一旦癌细胞获得对结构和功能上无关的一些药物的抗性，无论癌细胞是否曾经暴露在这些药物中，那么它们就已经具有MDR表型。一旦癌细胞表现出多药耐药性，那么化疗药对癌细胞的抗癌作用就会降低。
发展识别多药耐药性肝癌的发生发展过程中关键蛋白的分子探针将有助于我们从分子水平上了解肿瘤多药耐药的机制，为实现多药耐药性肝癌的诊断和靶向治疗提供新的分子工具。利用核酸适体特异的靶向性，将治疗性药物递送至癌细胞甚至逆转肿瘤的多药耐药性，已经成为提高化疗疗效并减少或消除药物毒性的有前景的方法。
核酸适体(Aptamer)是短的、有着独特三维结构的单链寡核苷酸，其具有优于常规抗体的几个优势，例如制备简单、成本低、靶标广泛(从小分子、肽、蛋白质、到整个细胞都能进行高亲和力、高特异性识别与结合)、组织穿透能力强、分子量小、免疫原性低、毒性低以及易修饰等。靶向癌症相关受体的核酸适体可以选择性地将治疗性物质(抗癌药物、siRNA、miRNA和药物载体)递送至肿瘤内区室，进行肿瘤的杀伤。核酸适体通常是通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)在体外筛选所得。SELEX技术的基本步骤有：(1)文库的制备,一般是合成1012～1015数量的随机单链库；(2)与靶物质孵育，洗脱不结合的链，把与靶物质结合的链进行反筛，洗掉非特异性结合的链，如此反复筛选，直到筛选到亲和力最高特异性最强的寡核苷酸链；(3)收集与靶物质结合的链进行PCR扩增，然后纯化。
Cell-SELEX是指以活细胞为靶标，进行适配体的筛选的一种SELEX技术。cell-SELEX技术提供了鉴定针对已知生物标志物的适配体和细胞膜表面上的新生物标志物的机会。在cell-SELEX中，靶分子具有其自身的天然构象，这使得用于治疗和诊断应用的适配体开发更容易。它还减轻了处理靶分子构象的复杂性，并增加了找到有效适配体的可能性。另外，由于靶分子在cell-SELEX中锚定于细胞表面，因此不需要纯化靶标或将靶分子固定在固体支持物上。由于这些优势，cell-SELEX已广泛用于获得针对癌症细胞、肿瘤相关蛋白、寄生虫、病毒感染细胞和全细胞等靶标的高度特异性适配体。
因此我们利用cell-SELEX技术，进行了针对肝癌多药耐药株的核酸适体筛选。通过25轮的筛选过程，最终发现25轮的文库与人肝癌耐药细胞结合能力较好，同时特异性也较强。通过分析该文库的高通量测序结果进行分析和验证之后，最终挑选出了与人肝癌耐药细胞的高亲和性以及特异性的核酸适体，非常适合进行人肝癌耐药细胞的表征和检测，为克服肝癌的多药耐药性治疗提供了有效的工具。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种全新的高度特异性、高度稳定性、可用于肝癌耐药株细胞检测的核酸适体及其应用。该适体制备简单，成本低，对肝癌耐药株细胞选择性好，结合紧密，检测灵敏度高，检测过程操作简单，结果准确。
一种检测肝癌耐药株细胞的核酸适体，包含如下序列中的任一种：
(1)
5’-GCAAAAAAATAAAAGGGAGTTGAGGGGGTTTGTGGGATATCGATT-3’(SEQ NO.1)；
(2)5’-AGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAA-3’(SEQ NO.2)；
(3)以上述第(1)或第(2)种序列为核心序列，在其两端加上引物序列。
加上引物之后的适配体包含如下序列：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAGCAAAAAAATAAAAGGGAGTTGAGGGGGTTTGTGGGATATCGATTTGGACACGGTGGCTTAGT-3’(SEQ NO.3)，命名为ZL-2；
或
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGACACGGTGGCTTAGT-3’(SEQ NO.4)，命名为ZL-7；。
所述的检测肝癌耐药株细胞的核酸适体，还可以是在保持所述的第(3)种序列的核心序列不变的情况下将核酸适体进行改造，包括：对所述核酸适体两端或一端的引物序列进行删减或者人工碱基替换，得到与其功能相同的核酸适体。
改造后的核酸适体包括：
ZL-7a：
5’-AGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAA-3’(SEQ NO.5)；ZL-7b：
5’-CGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGACACGGTGG-3’(SEQNO.6)；
ZL-7c：
5’-CGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGA-3’(SEQ NO.7)；
ZL-7d：
5’-GTGACGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGACACGGTGG-3’(SEQ NO.8)；
优选ZL-7c：
5’-CGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGA-3’。
所述的核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同结合肝癌耐药株细胞能力的核酸适体衍生物。
所述的肝癌耐药株细胞来源于人。
另一方面，本发明筛选上述核酸适体的方法，包括如下文库的制备、与细胞进行孵育、洗脱或收集、扩增，具体步骤如下：
首先进行文库的制备：合成单链DNA随机文库，两端为引物结合区域，总结为45nt个随机碱基区域：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA(45N)TGGACACGGTGGCTTAGT-3’(SEQ NO.9)
上游引物：5’-异硫氰酸荧光素-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’；(SEQ NO.10)
下游引物：5’-生物素-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’(SEQ NO.11)。
随后将合成的文库投入到cell-SELEX中，具体如下：
正筛：在特定的binding buffer体系中将上述随机核酸文库与HepG2/ADM细胞株细胞孵育；孵育完成后，用washing buffer对细胞表面结合的非特异性文库进行洗脱；灭菌水收集HepG2/ADM细胞株细胞；95℃，10min加热变性分离结合HepG2/ADM细胞株细胞的核酸适体，即为第一次筛选的核酸文库；
产物扩增：应用PCR仪分为三步扩增法，对上述步骤得到的核酸适体进行常规的数量扩增；
制备DNA单链：用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记上述PCR扩增产物；然后利用2M氢氧化钠使双链DNA变性解链，收集异硫氰酸荧光素标记的DNA单链文库；最后将产物加入到脱盐柱进行脱盐；
反筛：在特定的binding buffer体系中将上述所得到的单链DNA文库与非靶细胞(HL7702、HepG2)孵育，孵育完成后收集细胞上清投入下一步骤；
正筛：在特定的binding buffer体系中将上一步得到的上清液与靶细胞孵育，洗脱结合在靶细胞表面非特异性吸附的核酸文库，即为第二次筛选的核酸文库；任何进行扩增产物、制备单链DNA、反筛等步骤一直循环筛选，直到筛选得到与靶细胞HepG2/ADM细胞株结合能力强的核酸文库；
最后将筛选获得的最终核酸文库进行高通量测序，分析高通量测序的结果，选出的一些合适的候选链，将它们与正筛细胞HepG2/ADM进行流式细胞术的检测，淘汰不和正筛细胞结合的链，然后将剩下的候选链再与反筛细胞进行流式细胞仪的检测，最终挑出能与靶细胞高亲和力与特异性结合的核酸适体。
所述的检测肝癌耐药株细胞的核酸适体包括如下应用：
(1)在制备肝癌耐药株细胞检测试剂中的应用。
(2)在制备肝癌治疗载体试剂中的应用。
(3)在研究肝癌耐药株细胞与非耐药株细胞的差异性中的应用。
(4)在研究肝肿瘤活体成像中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：通过细胞筛选得到的核酸适体具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够体外化学合成，成本低，分子量小；易于修饰；易于保存；便于标记(不需要标记的二抗)等。
本发明适配体对肝癌耐药株细胞的识别与结合能力较强。利用本发明的核酸适体能更加方便的进行人肝癌耐药细胞的表征和检测，以及为今后寻找新的多药耐药性肝癌细胞株和克服肝癌的多药耐药性治疗提供有效的工具。
附图说明
图1为本发明细胞筛选过程中核酸适体文库的富集过程：峰形代表HL7702、HepG2、HepG2/ADM细胞与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的初始文库、第17轮、25轮筛选的筛选产物结合后的荧光强度。
图2为本发明实施例中核酸适体(ZL-2、ZL-7)与靶细胞HepG2/ADM及非靶细胞HL7702、HepG2结合能力的流式检测结果。
图3为核酸适体ZL-7经过一系列的删减后与靶细胞HepG2/ADM及非靶细胞HL770、HepG2结合能力的流式检测结果。
图4为本发明实施例中核酸适体(ZL-7、ZL-7c)与靶细胞结合的拟合曲线及解离常数(Kd)。
图5为ZL-7、ZL-7c与HepG2/ADM细胞结合的激光共聚焦图。
图6为HepG2/ADM细胞在经过蛋白酶K以及胰酶处理之后，与ZL-7、ZL-7c结合情况。
图7为ZL-7、ZL-7c与其他细胞的结合情况图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得到的。
细胞来源
本实验筛选所用细胞来自湘雅医院细胞库。
本发明利用cell-SELEX技术，对随机合成的ssDNA序列进行筛选，以肝癌耐阿霉素药物(DOX)细胞HepG2/ADM为正筛细胞，以肝癌细胞HepG2以及人肝正常细胞HL7702为反筛细胞，筛选出对HepG2/ADM细胞有高亲和力与高特异性的核酸适体。
实施例1：cell-SELEX筛选过程
文库的制备、与细胞进行孵育、洗脱或收集、扩增：
首先进行文库的制备：合成单链DNA随机文库，两端为引物结合区域，总结为45nt个随机碱基区域：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA(45N)TGGACACGGTGGCTTAGT-3’
上游引物：5’-异硫氰酸荧光素-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’；
下游引物：5’-生物素-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’；
随后将合成的文库投入到cell-SELEX中，具体如下：
正筛：在特定的binding buffer体系中将上述随机核酸文库与HepG2/ADM细胞株细胞孵育；孵育完成后，用washing buffer对细胞表面结合的非特异性文库进行洗脱；灭菌水收集HepG2/ADM细胞株细胞；95℃，10min加热变性分离结合HepG2/ADM细胞株细胞的核酸适体，即为第一次筛选的核酸文库；
产物扩增：应用PCR仪分为三步扩增法，对上述步骤得到的核酸适体进行常规的数量扩增；
制备DNA单链：用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记上述PCR扩增产物；然后利用2M氢氧化钠使双链DNA变性解链，收集异硫氰酸荧光素标记的DNA单链文库；最后将产物加入到脱盐柱进行脱盐；
反筛：在特定的binding buffer体系中将上述所得到的单链DNA文库与非靶细胞(HL7702、HepG2)孵育，孵育完成后收集细胞上清投入下一步骤；
正筛：在特定的binding buffer体系中将上一步得到的上清液与靶细胞孵育，洗脱结合在靶细胞表面非特异性吸附的核酸文库，即为第二次筛选的核酸文库；任何进行扩增产物、制备单链DNA、反筛等步骤一直循环筛选，直到筛选得到与靶细胞HepG2/ADM细胞株结合能力强的核酸文库；
最后将筛选获得的最终核酸文库进行高通量测序，分析高通量测序的结果，选出的一些合适的候选链，将它们与正筛细胞HepG2/ADM进行流式细胞术的检测，淘汰不和正筛细胞结合的链，然后将剩下的候选链再与反筛细胞进行流式细胞仪的检测，将流式结果中位移最大的一轮核酸适体文库进行高通量测序，利用流式细胞术检测所得测序所得DNA序列与HepG2/ADM细胞株的结合选择性和亲和力，确定核酸适体(图1)。
实施例2：ZL-2、ZL-7特异性识别人肝癌耐阿霉素药物(DOX)细胞
高通量测序分析，挑选出一些核酸适体候选链，通过流式细胞术确定ZL-2、ZL-7序列是与HepG2/ADM细胞系特异性结合能力最强的序列，ZL-7相对结合力更强。
首先，用0.2％EDTA将贴壁状态的HepG2/ADM细胞从培养皿上消化下来，分别将细胞收集到离心管中，并用DPBS离心洗涤几次；其次，将终浓度为250nM序列1以及随机文库分别加入到结合缓冲液(D-PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA)浸泡的HepG2/ADM细胞中；然后放置于37℃摇床孵育40min；孵育完成之后并用洗涤缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM氯化镁)离心洗涤两次，并通过流式细胞仪进行荧光检测(图2)。
实施例3：ZL-7序列加上两边的引物全序列的删减方法
通过如下的删减方法来进行序列的优化：
(下划线部分为ZL-7的保守核苷酸序列)
ZL-7序列加上两边的引物全序列为：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGACACGGTGGCTTAGT-3’
ZL-7a：(左边引物区全部删减，右边引物区全部删减)
5’-AGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAA-3’
ZL-7b：(左边引物区删减11个碱基，右边引物区删减6个碱基)
5’-CGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGACACGGTGG-3’
ZL-7c：(左边引物区删减11个碱基，右边引物区删减14个碱基)
5’-CGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGA-3’
ZL-7d：(左边引物区删减7个碱基，右边引物区删减6个碱基)
5’-GTGACGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGACACGGTGG-3’
我们将上述一系列删减后的序列和加上两边的引物全序列与正筛细胞HepG2/ADM、反筛细胞HepG2、HL7702孵育后进行流式细胞仪检测(结果见图3)，发现ZL-7c亲和力与特异性最好。
实施例4：ZL-7、ZL-7c平衡解离常数的测定
将ZL-7核酸适体在5’端标记荧光分子制成分子探针，分别取0nM、20nM、40nM、80nM、100nM、150nM、160nM、200nM、250nM、300nM、400nM、500nM的分子探针溶液，与3×105个HepG2/ADM细胞进行37℃孵育40min，然后用洗涤缓冲液洗涤两次，用流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。如细胞能结合荧光标记的核酸适体，则以荧光强度对探针浓度作图，用公式Y＝BmaxX/(Kd+X)计算核酸适体的平衡解离常数Kd。结果表明，核酸适体的平衡解离常数均在纳摩尔范围内。
将ZL-7c核酸适体在5’端标记荧光分子制成分子探针，分别取0nM、50nM、100nM、120nM、140nM、160nM、180nM、200nM、220nM、240nM、260nM、280nM、300nM、400nM、500nM的分子探针溶液，与3×105个HepG2/ADM细胞进行37℃孵育40min，然后用洗涤缓冲液洗涤两次，用流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。如细胞能结合荧光标记的核酸适体，则以荧光强度对探针浓度作图，用公式Y＝BmaxX/(Kd+X)计算核酸适体的平衡解离常数Kd。结果表明，核酸适体的平衡解离常数均在纳摩尔范围内。(图4)。
实施例5：探究ZL-7、ZL-7c的靶标类型是否为膜蛋白
首先，将贴壁状态的HepG2/ADM细胞分别用0.2％EDTA、蛋白酶K、胰酶进行室温下消化10min。然后用DPBS进行离心洗涤，细胞进行分装，每3×105个HepG2/ADM细胞中加入200nm的随机文库以及ZL-7或者ZL-7c，放置在37℃摇床中孵育40min，孵育完毕后用洗涤缓冲液离心洗涤两次，最后用流式细胞仪进行荧光信号检测(图6)。流式细胞仪的结果显示，经过蛋白酶K以及胰酶处理之后ZL-7、ZL-7c与HepG2/ADM的结合量会有所下降，说明ZL-7或者ZL-7c有一部分是结合在HepG2/ADM细胞膜表面的蛋白上。并且通过激光共聚焦显微镜的结果(图5)也能够清晰的看到ZL-7、ZL-7c大部分是结合在HepG2/ADM细胞的表面。
实施例6：ZL-7、ZL-7c与其他肿瘤以及正常细胞的结合情况图。
选取人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞CCRF-CEM、人B淋巴瘤细胞Ramos、人前列腺癌细胞DU145与PC-3、人脑胶质细胞瘤细胞SGH44、人结肠癌细胞HCT116、人肾透明细胞系腺癌细胞786-O、人肾小管上皮细胞HK-2、人胃癌细胞MGC803、人肺癌细胞A549、人胚肺细胞MRC-5这11种细胞与ZL-7、ZL-7c进行流式细胞术检测(图7)，发现ZL-7、ZL-7c和这几种细胞都不结合。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 一种检测肝癌耐药细胞株的核酸适体及其应用
<130> 无
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
gcaaaaaaat aaaagggagt tgagggggtt tgtgggatat cgatt 45
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
aggagattcg agggggaagg tttgttatag gggttaa 37
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<211> 81
<212> DNA
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<400> 3
atccagagtg acgcagcagc aaaaaaataa aagggagttg agggggtttg tgggatatcg 60
atttggacac ggtggcttag t 81
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<211> 73
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
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acggtggctt agt 73
<210> 5
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
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<211> 56
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
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<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
gtgacgcagc aaggagattc gagggggaag gtttgttata ggggttaatg gacacggtgg 60
<210> 9
<211> 81
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(63)
<223> n=a or t or c or g
<400> 9
atccagagtg acgcagcann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnntggacac ggtggcttag t 81
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
atccagagtg acgcagca 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
actaagccac cgtgtcca 18

Claims (10)

1.一种检测肝癌耐药株细胞的核酸适体，其特征在于，包含如下序列中的任一种：
(1)
5’-GCAAAAAAATAAAAGGGAGTTGAGGGGGTTTGTGGGATATCGATT-3’；
(2)5’-AGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAA-3’；
(3)以上述第(1)或第(2)种序列为核心序列，在其两端加上引物序列。
2.根据权利要求1所述的检测肝癌耐药株细胞的核酸适体，其特征在于，
加上引物序列之后的核酸适体:
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAGCAAAAAAATAAAAGGGAGTTGAGGGGGTTTGTGGGATATCGATTTGGACACGGTGGCTTAGT-3’；
或
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGACACGGTGGCTTAGT-3’。
3.根据权利要求1或2所述的检测肝癌耐药株细胞的核酸适体，其特征在于，是在保持所述的第(3)种序列的核心序列不变的情况下将核酸适体进行改造，包括：对所述核酸适体两端或一端的引物序列进行删减或者人工碱基替换，得到与其功能相同的核酸适体。
4.根据权利要求3所述的检测肝癌耐药株细胞的核酸适体，其特征在于，
改造后的核酸适体包括：
5’-AGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAA-3’；
5’-CGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGACACGGTGG-3’；
5’-CGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGA-3’；
5’-GTGACGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGACACGGTGG-3’；
优选：
5’-CGCAGCAAGGAGATTCGAGGGGGAAGGTTTGTTATAGGGGTTAATGGA-3’。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测肝癌耐药株细胞的核酸适体，其特征在于，所述的核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同结合肝癌耐药株细胞能力的核酸适体衍生物。
6.根据权利要求1-4任一项所述的检测肝癌耐药株细胞的核酸适体，其特征在于，所述的肝癌耐药株细胞来源于人。
7.权利要求1-5任一项所述的检测肝癌耐药株细胞的核酸适体在制备肝癌耐药株细胞检测试剂中的应用。
8.权利要求1-5任一项所述的检测肝癌耐药株细胞的核酸适体在制备肝癌治疗载体试剂中的应用。
9.权利要求1-5任一项所述的检测肝癌耐药株细胞的核酸适体在研究肝癌耐药株细胞与非耐药株细胞的差异性中的应用。
10.权利要求1-5任一项所述的检测肝癌耐药株细胞的核酸适体在研究肝肿瘤活体成像中的应用。
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