CN104293794B - 一种与β‑淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与β‑淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子及其应用。所述的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的任意一种。核酸适配子或其化学修饰物作为BACE1抑制剂在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用。本研究通过SELEX技术成功筛选得到能以高亲和力结合BACE1的DNA适配子A1和A4，并证明该适配子具有抑制BACE1体外活性的作用。为新的强效特异的BACE1抑制剂的开发提供了研究基础，为AD治疗提供了新的方法和思路。

Description

一种与β-淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子 及其应用

技术领域：

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种与β-淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子及其应用。

背景技术：

阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)是一种渐进性的中枢神经系统退行性疾病，以认知功能障碍为主要临床表现，其他症状还包括执行功能障碍、精神障碍等。晚期病人生活不能自理，常死于肺部感染等并发症；给患者家庭及社会带来巨大的经济负担^[1]。据预测，全世界AD患者的发病人数将由2010年的三千六百万在2050年增至三倍^[2]。AD的发病原因尚不清楚。目前认为多种致病因子，诸如淀粉样前体蛋白/淀粉样蛋白(amyloidprecursor protein/amyloidβ,APP/Aβ)^[3]、载脂蛋白E4(ApolipoproteinE4,apoE4)^[4,5]、tau^[6,7]、α突触核蛋白(α-synuclein)^[8,9]、RNA结合蛋白(TDP-43)^[8,10]及组蛋白去乙酰化酶2(Histone deacetylase 2,HDAC2)^[11]等相互作用，参与AD的发病；其他如老龄^[12]、氧化应激^[13]、炎症^[14]、线粒体功能损害^[15]等也可能与AD发病有关。对于AD目前尚无有效的根治方法，临床常用的治疗AD的药物乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂只能暂时缓解症状。

AD的两大病理标志是神经元胞内的磷酸化tau形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles)及胞外的Aβ组成的淀粉样蛋白斑(amyloid plaques)。因此Aβ一直被认为是AD重要的致病因素。近年来许多研究重新肯定了Aβ在AD发病中的重要性^[16-22]。在Aβ产生过程中，β-分泌酶先水解APP生成可溶性APP氨基端产物β(solubleamyloid precursor protein beta,sAPPβ)和羧基端产物C99。继而γ-分泌酶在不同位点剪切C99，产生多种不同氨基酸长度的Aβ肽。此外在氨基肽酶、谷氨酰胺酰环化酶、异构酶等介导的酶作用过程及Aβ肽链细胞外磷酸化反应的作用下，产生由各种Aβ肽链组成的混合物。可以说Aβ是一群有不同长度、溶解度、稳定性、生物学及毒性特性的肽类混合物的总称。Aβ的生成增多、降解减少或清除减少可导致各种Aβ单体和它们组成的低聚物、纤维状物在脑内聚集、沉积，引起不同程度的神经毒性。其中可溶性Aβ低聚物的致病性较Aβ单体和Aβ纤维强^[3,16,19]。Aβ低聚物可能通过影响抑制性中间神经元和谷氨酸转运体来损害突触功能和相关的信号通路，改变神经元活性，诱发胶质细胞释放神经毒性介质。因此抑制过多的Aβ产生或其活性是AD治疗的根本策略。

β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(beta-site amyloid precursor protein cleavingenzyme 1,BACE1)，也称β-分泌酶1(β-secretase 1)，是最主要的β-分泌酶，是Aβ产生过程中的限速酶。因此抑制BACE1的表达或活性将减少Aβ产生。BACE1包含501个氨基酸，属跨膜的1型天冬氨酸蛋白酶。其在神经元中的表达水平最高。BACE1与AD的关系密切。在AD脑内，淀粉样斑块围绕的神经元内BACE1水平升高。2012年，研究者发现APP基因上临近BACE1蛋白水解位点的一个突变(A673T)在非AD人群与AD病人中的出现频率有显著的统计学差异，该突变可减少BACE1对APP的剪切，从而减少Aβ产生；这个发现为抑制BACE1可对抗AD的论点提供了有力的证据^[28]。除了APP，BACE1可作用于其它底物及调节因子。BACE1基因完全敲除的小鼠显示了因影响神经调节蛋白1(type III neuregulin 1,NRG1)信号而出现的外周神经系统髓鞘形成不足和精神分裂样行为，以及与电压门控钠通道β亚单位(β-subunits ofvoltage-gated sodium channels,Navβs)相关的癫痫样表现^[31]。但是目前还不清楚这些改变是否完全由BACE1抑制所引起的。有报道通过一种BACE1抑制剂治疗可增强APP转基因小鼠的α-分泌酶水解过程，减少脑内Aβ含量而不影响NRG1通路。α-分泌酶水解APP增强时，能够使其水解产物可溶性APP氨基端产物α(soluble amyloid precursor protein alpha,sAPPα)产生增加；而sAPPα具神经保护作用。当BACE1完全抑制或敲除时，其他蛋白酶可代偿对BACE1底物的水解过程。NRG1和Navβs信号通路也可能受其它一些未知的酶作用物所影响。近来一些研究提示部分抑制BACE1已足够减少Aβ含量、改善AD模型动物的认知功能而不产生明显的毒害效应，提示部分抑制BACE1活性将是一种有效的替代途径。目前，尚没有安全有效的BACE1抑制剂应用于临床。

长期以来，人们认为核酸的主要功能仅仅是携带遗传信息，但随后人们逐渐认识到单链核酸分子具有执行各种各样的细胞功能的能力。单链RNA分子能够形成迥然不同的三维结构，使它们可以特异识别各种分子靶标，甚至是执行类似于蛋白分子的催化作用。例如，tRNA和rRNA分子是蛋白质合成的关键物质。关于转录、剪接及翻译机制的研究分析显示蛋白质和某些RNA位点的特异相互作用对基因表达的调节非常重要。核酸的巨大的组合多样化及能够形成多种多样的二级和三级结构的能力使直接筛选出具特定性能的核酸序列成为可能。由此出现了在体外富集这些核酸分子的方法：指数富集的配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术^[38,39]。而这些筛选出来的能以高度亲和力(解离常数值在纳摩尔级至皮摩尔级之间)与靶分子特异结合的寡核苷酸分子(单链DNA或RNA)，被称为适配子^[38]。

SELEX技术通过数轮或数十轮重复筛选，得到特异结合靶分子的寡核苷酸序列。每一轮筛选包括三个主要步骤：(1)体外构建的库容量约为10¹³-10¹⁵的随机寡核苷酸文库与靶分子孵育；(2)寡核苷酸-靶标复合物与未结合的寡核苷酸分离；(3)结合的寡核苷酸序列经PCR扩增。随着筛选轮数的增加，可逐渐富集到与靶分子的结合亲和力逐步增加的序列。现在已证实运用SELEX技术可以对非常广泛的靶物质进行筛选得到相应的适配子；这些靶物质包括蛋白、多肽、核酸、多糖类、小分子有机物、病毒颗粒、细菌、活细胞及组织^[40]。SELEX技术也经过许多改进，出现了诸如消减SELEX^[41,42]、利用亲和层析和磁珠的SELEX^{[43 ,44]}、毛细管电泳SELEX^[45,46]、全细胞SELEX^[42,47]、微流体SELEX^[48,49]等方法。这些新方法或能增加筛选效率，或能减低对靶标的要求，或能改进获得的适配子的功能。

纯化蛋白质是最常用的SELEX筛选的靶标。以蛋白质为靶标筛选出的适配子，可用于核酸-蛋白质作用机制的研究^[51]；可高效特异地抑制靶蛋白^[52]或用于寻找针对其他蛋白质的新抑制剂^[53]；用来检测不同的靶分子^[54]。相比于抗体，适配子有如下优势：分子量小；对热稳定，经历变性/复性后能恢复天然构象及结合靶标^[55]；易于生产；易于通过各种化学反应进行修饰以提高其稳定性和对核酸酶的抵抗；易于结合荧光素等信号基团以增强适配子的功能；免疫原性低；靶物质广泛，对于一些抗体不能识别的物质如离子、小分子等也具特异亲和力^[56]。因此适配子可以在许多生物学应用中代替抗体。目前适配子已广泛地用于新药研发、疾病诊断及治疗、药物的体内运输、生物成像、试剂分析、食品检测等方面的研究^[57]。作用于中枢神经系统疾病的抗体类药物大多面临药物敏感性不高、体内毒性及不能有效穿透血脑屏障的问题；由于其独特的特性，适配子有望代替抗体作为药物运输载体、分子探针或抑制剂等在中枢神经系统疾病的诊治中发挥作用。一些针对朊病毒蛋白的致病亚型(proteinase K-resistant isoform,PrPSc)的适配子已经被筛选出来，这些适配子可以用于区别朊病毒的不同亚型，帮助诊断朊病毒病(Prion diseases)^[58,59]。胶质瘤是中枢神经系统最常见的实体瘤，研究者们分别利用不同的胶质瘤细胞株筛选出识别肿瘤细胞表面肌糖蛋白(tenascin-C)^[60]或表皮生长因子受体Ⅲ型突变体^[61]的适配子，在胶质瘤的靶向运输、分子成像方面展示了初步的应用。Cerchia等筛选出一组适配子可以从非致瘤的T98G细胞中识别胶质瘤的致瘤株，其中5个适配子可干扰细胞外信号调节蛋白激酶磷酸化，抑制恶性型瘤细胞增殖^[62]。此外还有针对AD的Aβ₄₀的适配子、针对帕金森病的酪氨酸激酶受体Ret的适配子^[64]，也有报道。虽然这些研究尚处于初步阶段，但显示了适配子在中枢神经系统疾病诊治中的潜能。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种与β-淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物。

本发明的与β-淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的任意一种。

所述的化学修饰物是在上述核酸适配子中包括的至少一个核苷酸的核糖2’位上的羟基被氢原子、氟原子、-O-酰基和氨基中任意一种所取代，以及在3’端或5’端加入FCM、FITC、biotin的任意修饰。

本发明的第二个目的是提供上述与β-淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物作为BACE1抑制剂在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用。

本研究利用SELEX技术，以纯化的人BACE1蛋白胞外段作为靶分子，从体外合成的含30个核苷酸(nucleotides,nt)随机片段的ssDNA文库中筛选出以高亲和力特异结合BACE1的适配子。利用基于生物素-链亲和素系统的间接ELISA法和pull-down实验来测定适配子对BACE1的结合亲和力及特异性。利用荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)实验以检测适配子对BACE1体外活性的抑制作用。将适配子作用于M17-APPsw细胞(一种AD细胞模型)，进行双抗夹心ELISA和western blot实验，检测适配子对AD细胞模型中BACE1活性的抑制效应。

首先，体外构建合成两端为固定序列、中间为30nt的随机序列、全长为73nt的ssDNA文库(Gp30)。以纯化的人BACE1蛋白胞外段为靶标，在微孔板上进行筛选。每一轮筛选过程主要包括ssDNA文库与BACE1孵育结合、洗涤分离未结合的寡核苷酸序列、不对称PCR扩增结合的寡核苷酸序列、切胶回收目的ssDNA得到次级文库、再将次文库与BACE1结合进行下一轮筛选等重复步骤。从第四轮筛选开始，亚文库先与空白孔孵育进行反筛，以去除非特异结合的序列。共进行了七轮SELEX筛选。

将第七轮得到的ssDNA进行克隆、测序。用Primer 5.0软件分析测序结果，选择两端的固定序列与原库相同、中间含有30nt随机片段的序列为目的序列，通过MEME在线软件对所得序列进行同源性分析，用RNA STRUCTURE 5.5软件测算二级结构。共挑选出四个重复序列，命名为适配子A1、A2、A3、A4。其中序列A1的出现频率最高。序列同源性分析未发现四个序列均共有的模序。二级结构分析显示四个序列均以茎环结构为主。

为验证适配子的靶蛋白及对靶蛋白的亲和力，利用经典的ELISA法及生物素-链亲和素系统进行间接ELISA。将生物素标记的适配子呈两倍浓度梯度稀释，与BACE1孵育后再与辣根过氧化物酶标记的链亲和素孵育，TMB显色，测定450nm的吸光度值。将所测得的吸光度值与适配子的浓度通过Sigmaplot 12.0软件进行非线性回归分析得出解离常数(K_d)值。用anti-BACE1抗体与BACE1孵育作为对照比较结合亲和力；用无关适配子(U31)与BACE1孵育作为对照比较结合特异性。结果显示适配子A1(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)及A4(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的结合曲线拟合效果好，类似于BACE1抗体的拟合曲线(R值均达到0.99，P<0.01)。而U31的结合曲线则不能拟合(P>0.05)。适配子A1、A4对BACE1的结合亲和力分别为68.5655±8.1237nM、15.3497±2.0262nM，与BACE1抗体对BACE1的亲和力(2.7498±0.2785nM)几乎相近。说明A1及A4能以高亲和力特异结合BACE1。

利用链亲和素磁珠-pull down实验验证适配子是否能结合AD细胞模型(M17-APPsw细胞)中的BACE1。选择重复频率最高的生物素标记的A1与链亲和素磁珠孵育，再与M17-APPsw细胞蛋白提取液孵育。与适配子有相互作用的蛋白被固定在磁珠-适配子复合物上，经洗涤后复合物通过SDS-PAGE胶分离，在PVDF膜上用BACE1抗体显影。生物素标记的原文库Gp30、U31及不加适配子组作为对照。结果显示，A1组有明显的70KDa的BACE1蛋白条带；Gp30组中70KDa处的条带极细；U31及不加适配子组均未在70KDa处显现条带。说明A1能特异结合M17-APPsw细胞中的BACE1蛋白。

下一步进行荧光共振能量转移实验检测A1是否能抑制BACE1的体外活性。BACE1底物两端分别连接一个荧光供体和猝灭受体，随着供体能量转移至受体，供体发出的荧光可被受体所猝灭。BACE1裂解底物时，由于不能发生能量转移，来自于供体的荧光不能被猝灭，荧光信号增加。当加入抑制剂时由于底物裂解被抑制，荧光信号减低。利用这一原理，将不同浓度的适配子A1加入BACE1及其荧光底物的混合物中，检测荧光强度的变化。BACE1的一种特异抑制剂、Gp30及U31作为对照。随着浓度增加，标准抑制剂组中荧光值逐渐下降，至500nM时荧光值较阳性对照显著减低(P<0.01)。A1组在250nM的终浓度时荧光值急速下降(P<0.01)。Gp30及U31组荧光值无显著减低。按抑制率(％)＝100-(IF_i/IF₀×100)算出对BACE1活性的抑制率(IF_i为加入测试物后的荧光值，IF₀为不加测试物即阳性对照的荧光值)。将抑制率与测试物浓度的对数值进行线性回归分析，拟合曲线，估算出A1的半数抑制浓度(IC₅₀)为139.81nM，小于标准抑制剂的IC₅₀(242.50nM)。说明A1对BACE1体外活性的抑制作用强。

接着将不同浓度(200nM-10μM)的A1加入M17-APPsw细胞中培养24h后进行MTT实验以检测A1对细胞存活率的影响。结果显示A1终浓度在不超过3μM的范围内M17-APPsw细胞存活率不受影响。不同浓度(0.1μM-3μM)A1处理M17-APPsw细胞24h后收集细胞蛋白提取液，进行双抗夹心ELISA法检测Aβ₄₀及Aβ₄₂含量。在A1终浓度为3μM时，细胞内Aβ₄₀及Aβ₄₂浓度较空白组(未予任何处理组)均有显著下降(P<0.01)。因此用3μM的A1作用于细胞后，收集细胞蛋白提取液及培养基进行双抗夹心ELISA检测。3μM的Gp30、U31处理组和空白组作为对照。结果显示M17-APPsw的细胞内分泌的Aβ₄₀及培养基中分泌的Aβ₄₀浓度均较对照组显著下降(P<0.01)。同样，M17-APPwt的细胞内Aβ₄₀及培养基中Aβ₄₀浓度均较对照组显著下降(P<0.01)。与Aβ₄₀类似，M17-APPsw的细胞Aβ₄₂及细胞培养基中Aβ₄₂浓度均较对照组显著下降(P<0.01)。为检测A1对AD细胞模型中sAPPβ蛋白表达的影响，对A1、Gp30及U31处理后的M17-APPsw细胞裂解物进行western blot实验。孵育的一抗分别为针对APP氨基端的APP抗体及anti-BACE1抗体。结果显示A1组的sAPPβ蛋白表达水平较各对照组显著下降(P<0.01、P<0.05)，各组间sAPPα及BACE1的表达量无明显差异。上述结果提示A1能抑制AD细胞模型中BACE1活性。

本研究通过SELEX技术成功筛选得到能以高亲和力结合BACE1的DNA适配子A1和A4，并证明该适配子具有抑制BACE1体外活性的作用。为新的强效特异的BACE1抑制剂的开发提供了研究基础，为AD治疗提供了新的方法和思路。

附图说明

图1.目的ssDNA的获得。A.anti-BACE1抗体鉴定BACE1蛋白的免疫印迹实验。B.引物3的二级结构。C.引物3的由富含GC碱基的反向重复序列形成的茎环结构，能在扩增时阻止正链延伸。D.不对称PCR产物电泳图：1，pUC18 DNA/Msp l；2，ssDNA原库Gp30；3，不对称PCR获得的不同长度PCR产物；4，切胶回收后获得的目的ssDNA。

图2.RNA STRUCTURES 5.5软件测算四个适配子序列的二级结构。A、B、C、D分别为适配子A1、A2、A3、A4的二级结构。

图3.适配子A1、A4、anti-BACE1和无关对照适配子U31的结合曲线。

图4.A1、标准抑制剂、Gp30和U31的FRET实验结果。A.不同浓度标准抑制剂对荧光强度变化的影响。B.不同浓度适配子对荧光强度变化的影响。C.标准抑制剂的抑制曲线。D.A1的抑制曲线。^*与阳性对照组比较P<0.05；^**与阳性对照组比较P<0.01。

图5.生物素标记的适配子A1通过链亲和素磁珠与M17-APPsw细胞蛋白裂解物孵育钓取靶蛋白。1,生物素标记的A1与细胞蛋白提取液孵育；2,生物素标记的原库GP30与细胞蛋白提取液孵育；3,生物素标记的无关对照适配子U31与细胞蛋白提取液孵育；4，空白对照(不加适配子)组。

图6.不同浓度A1对M17-APPsw细胞存活率的影响。

图7.不同浓度A1对M17-APPsw细胞中Aβ₄₀及Aβ₄₂产量的影响。^**A1组与blank组比较P<0.01。

图8.A1、Gp30、U31终浓度分别为3μM时Aβ₄₀浓度的比较。A.M17-APPsw细胞内分泌的Aβ₄₀浓度在A1组、Gp30组、U31组和blank组中的比较。B.M17-APPsw细胞培养基中分泌的Aβ₄₀浓度在各组中的比较。C.M17-APPwt细胞内分泌的Aβ₄₀浓度在各组中的比较。D.M17-APPwt细胞培养基中分泌的Aβ₄₀浓度在各组中的比较。^**A1组与Gp30组、U31组、blank组比较P<0.01。^##Gp30组、U31组与blank组比较P<0.01。^#Gp30组与blank组比较P<0.05。

图9.A1、Gp30、U31终浓度分别为3μM时Aβ₄₂浓度的比较。A.荧光显微镜观察APPsred转染M17-APPsw细胞后的红色荧光。B.APPsred转染后M17-APPsw细胞内的Aβ₄₂产量上升。C.M17-APPsw细胞内分泌的Aβ₄₂浓度在A1组、Gp30组、U31组和blank组中的比较。D.M17-APPsw细胞培养基中分泌的Aβ₄₂浓度在各组中的比较。^**A1组与Gp30组、U31组、blank组比较P<0.01。^#Gp30组与blank组比较P<0.05。

图10.A1对M17-APPsw细胞内sAPPα、sAPPβ及BACE1蛋白表达量的影响。A.sAPPα、sAPPβ及BACE1在A1组、Gp30组、U31组和blank组中的蛋白免疫印迹图。B、C、D分别为sAPPβ、sAPPα及BACE1的显影条带在各组中的定量分析图。^**A1组与Gp30组、blank组比较P<0.01。^#A1组与U31组比较P<0.05。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：用微孔板法筛选针对结合BACE1胞外区并具有抑制活性的适配子

实验一、文库的构建及引物的合成

长度为73nt的随机ssDNA文库由Invitrogen公司合成，其两端为固定序列，中间为30nt的随机序列，库容量约为10^14-15。序列为：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC(30N)CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’。

根据文库两端固定序列分别设计相对应的引物序列为：

引物1：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-3’

引物2：5’-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’

引物3：5’-GCTAAGCGGGTGGGACTTCCTAGTCCCACCCGCTTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’

其中用于双链扩增PCR的是引物1和引物2；引物3的5’端还含有33个富含GC碱基的反向重复序列(下划线碱基)，用于与引物1进行PCR产生不同长度的单链DNA(不对称PCR)，以便形成亚文库。引物1和引物2的5’端可通过标记生物素(biotin)用于观察和测定适配子与BACE1蛋白的结合亲和力和特异性。

实验二、微孔板法筛选针对BACE1胞外区蛋白的适配子

1针对BACE1胞外区蛋白的适配子的SELEX筛选：

主要包括孵育结合、分离、扩增、分离ssDNA、得到次级文库、再结合等重复步骤，SELEX整个筛选过程如下：BACE1胞外区蛋白购自sigma公司。

筛选前一天，将BACE1胞外区蛋白溶于PBS后，包被于96孔板中，4℃过夜。筛选前弃去包被上清，加入封闭液(3％BSA)于37℃封闭2h后用200μL洗涤缓冲液洗孔。预先将一定浓度的上述随机ssDNA文库于95℃加热5min，冰上冷却10min，加入200μL结合缓冲液中混匀，室温放置30min，得到热变性处理过的DNA。洗孔后加入热变性处理过的DNA，37℃孵育2h。孵育后用洗涤缓冲液洗孔以洗去未结合的DNA。未洗脱的DNA-蛋白复合物中加入200μL PBS，于95℃加热器加热5min,冰上冷却5min后取适量上清为模板，用引物2和引物3进行不对称PCR扩增，将所得单链产物切胶回收放入1.5mL EP管中，加入400μL/管的凝胶洗脱液，37℃振摇6h后，在上清中将洗脱液转移至新EP管中，加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，1/100体积的1mol/L MgCl₂和2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀过夜。4℃离心14,000 rpm收集沉淀的ssDNA，然后用70％的预冷乙醇洗涤一次，待沉淀干燥后用适量dd H₂O溶解，用紫外分光光度计对ssDNA进行定量。此时得到的ssDNA作为次文库用于下一轮筛选。为增加筛选压力，提高筛选的DNA适配子的特异性与亲和力，在筛选过程中随着筛选轮数增加，逐渐减少文库及靶蛋白的投入量，减少孵育时间，增加鲑精DNA投入量，增加洗涤时间，并从第四轮开始设立反筛过程(筛选前一晚用200μL PBS单独包被一空白对照孔，3％BSA封闭，孵育时先将DNA与空白对照孔于37℃结合40min，反筛去除非特异结合的ssDNA，然后转移到BACE1包被孔与BACE1于37℃结合40min)。

2筛选的次级文库制备：

通过引物1和引物3进行不对称PCR扩增得到不同长度的ssDNA产物，并用尿素胶分离。尿素胶分离过程：将玻璃板洗净晾干，把玻璃板固定在灌胶支架上，称取尿素，按配方加入水后，在水浴锅中将尿素融化后在加入其它组分，将加好凝胶混匀后迅速倒入两玻璃板间隙，并迅速斜插入梳子，防止产生气泡。待胶聚合好后，取下胶板，安装在电泳槽中，在内外槽添加电泳缓冲液(1×TBE)。由于胶中含有尿素，尿素液会积聚在上样孔中，影响上样，故上样前需先用1mL注射器针头冲洗加样孔，将尿素液吸掉。不对称PCR产物或ssDNA样品加变性凝胶加样缓冲液混合，上样。连接电极(正极接下槽)，在100V-200V恒压下进行电泳。待条带电泳至凝胶的下部时中断电源，卸下玻璃板，将凝胶放置于溴化乙锭染色液(0.5μg/mL溴化乙锭，1×TBE)中染色10min。在凝胶成像仪上成像，观察检测条带并确定目的条带的位置。

3.切胶回收ssDNA次文库

将溴化乙锭染色后的胶片放在铺好保鲜膜的长波紫外灯上，打开紫外灯，在防护罩防护下观察DNA电泳条带，迅速用锐利刀片切取目的条带。将胶条切碎，放入1.5mL EP管中，加入400μL凝胶洗脱缓冲液，于37℃摇床上洗脱6h。将洗脱液吸到新的1.5mL离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，1/100体积的1mol/L MgCl2，于-20℃冰箱放置过夜后取出，4℃、14,000rpm离心30min，弃上清，沉淀用4℃预冷的70％乙醇冲洗后再离心弃上清，沉淀于室温干燥20min，将干燥好的DNA溶于50μL三蒸水中，震荡混匀用紫外分光光度计测定DNA量，-20℃保存备用。选择适量DNA作为下轮筛选用的次文库。

上述实验结果显示见图1。纯化的人BACE1胞外片段作为SELEX筛选的靶蛋白。蛋白免疫印迹实验检测到该蛋白于70KDa处呈现为一清晰的单一条带，与BACE1的分子量一致(图1A)。靶蛋白与DNA原库孵育后，结合的BACE1-DNA复合物通过加热分离，用引物1和引物3进行不对称PCR扩增，获得目的ssDNA单链。引物3的5’端引入富含GC碱基的反向重复序列，能够形成茎环二级结构，具有较高的Tm值，在Taq酶能较好发挥作用的温度范围之内(55℃-65℃)仍可保持稳定的二级结构，从而阻止正链的延伸(图1B-C)。因此，得到的PCR产物为两条长度不同的ssDNA单链，在尿素变性PAGE凝胶上分离，显示迁移速率不同的两条带，短链位置与单链模板相当，长链位置相当于引物3延伸产物，比短链长37个碱基(图1D)。对短链进行切胶回收后可获得73bp的目的ssDNA单链(图1D)，作为次级亚文库用于下一轮筛选。

4.克隆测序：

T载体克隆反应体系如下：

按照上述配方将反应液于16℃连接过夜。从-80℃冰箱取出制备好的感受态E.coli.TOPO10菌落(100μL)，放置在冰上解冻。将10μL连接产物加入100μL冰浴的宿主菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克45sec，立即冰浴1min；加入890μL不含抗生素的LB培养基，37℃培养箱中振摇60min；取适量体积(分别为100μL、200μL)菌液涂布在LB/Amp/IPTG/X-gal平板上，37℃培养箱中倒置培养过夜。

隔日挑取白色单克隆。按1:1000比例配置含Amp的LB培养基，用10μL无菌枪头挑取白色菌斑放入4mL培养基中，置于37℃摇床中摇菌12h，取适量菌液进行菌落PCR鉴定(用引物1和2扩增)。PCR产物通过琼脂糖胶分离鉴定后，阳性克隆子送Invitrogen公司测序。

结果：经过七轮筛选后，将第七轮得到的ssDNA进行PCR扩增，通过T载体克隆，挑选出阳性克隆子送Invitrogen公司测序。用Primer 5.0软件分析测序结果，选择两端的固定序列与原库相同、中间含有30nt随机片段的序列为目的序列，共挑选出四个重复序列，分别为A1、A2、A3和A4，具体的核苷酸序列如表1所示。

表1

其中序列A1的出现频率最高，达95％。通过MEME在线软件对所得序列进行同源性分析，未发现四个序列均共有的模序。用RNA STRUCTURE 5.5软件测算该四个序列的二级结构(图2)。如图所示，茎环二级结构可能是适配子发挥功能所必需的。

5.寡核苷酸序列的结构分析

先用Primer premier 5.0软件从测序结果中挑选出两端的固定序列与原库相同、中间含有30 nt随机片段的克隆子序列，再用MEME在线软件http://meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi对测得序列进行一级结构分析，然后用RNASTRUCTURE 5.5软件测算序列的二级结构，得到可能的针对BACE1的适配子。

实验三、间接酶联免疫吸附试验(indirect ELISA)测定适配子与BACE1的结合亲和力

BACE1(50μM/孔，1xPBS稀释)包被于96孔板，4℃过夜。200μL 1xPBST洗孔(共5次，2min/次)。漂洗后用5％BSA(50μL/孔)于37℃封闭1h，PBST洗涤5次×2min。生物素标记的适配子(Invitrogen公司合成)经95℃加热5min、冰上10min处理后室温放置30min，用结合缓冲液从1000nM起呈两倍梯度稀释10个梯度，分别加入96孔板中置于37℃孵育1h，PBST洗涤5次×2min。然后与辣根过氧化物酶标记的链亲和素(1xPBS稀释至1：1000)37℃孵育30min，PBST洗涤5次×2min。洗孔后加入TMB显色液(50μL/孔)，37℃避光显色20min；加2M硫酸(25μL/孔)终止反应。在酶标仪上测定450nm的吸光度值，用Sigmaplot 12.0软件处理数据，采用非线性回归分析，求出解离常数K_d值。设置空白对照(不加适配子)；用anti-BACE1抗体与BACE1孵育作为对照比较结合亲和力；用无关适配子与BACE1孵育作为对照比较结合特异性。测定anti-BACE1与BACE1的亲和力时，用5％BSA两倍梯度稀释抗体，二抗为羊抗兔(1:5000)，检测方法同上。

结果：模拟BACE1抗体及相应二抗的反应原理，利用生物素-链亲和素系统，将筛选获得的四个适配子经生物素标记，与辣根过氧化物酶标记的链亲和素进行间接ELISA，以测定适配子是否能结合BACE1及其对BACE1的亲和力。将所测得的吸收度值与适配子的浓度通过Sigmaplot 12.0软件进行曲线拟合，非线性回归分析得出K_d值，回归方程为Y＝B_maxX/(K_d+X)。BACE1抗体对BACE1的亲和力作为对照。结果显示A1、A4的结合曲线拟合效果好，R值均达到0.99(P<0.01)，类似于BACE1抗体的拟合曲线(图3)。而另一个作为对照的无关适配子(U31，为本实验室筛选的一种针对胶质瘤细胞的适配子)的结合曲线则不能拟合(P>0.05)，提示其不能结合BACE1。表2显示适配子A1、A4对BACE1的结合亲和力均在nM级，与BACE1抗体对BACE1的亲和力几乎相近。

表2

实验四、荧光共振能量转移(FRET)检测适配子对BACE1活性的抑制作用

底物两端分别连接一个荧光供体和猝灭受体，随着供体能量转移至受体，供体基团发出的荧光可被受体基团所猝灭。当酶裂解底物时，由于不能发生能量转移，来自于供体基团的荧光不能被猝灭，荧光信号增加。利用这一原理进行FRET实验。适配子经95℃加热5min、冰上10min处理后室温放置30min，去离子水稀释成不同浓度。BACE1底物用荧光反应缓冲液稀释至50μM，BACE1酶用荧光反应缓冲液稀释至0.3unit/μL。各试剂平衡至室温，按表3加入96孔板中(BACE1溶液最后加入)，混匀，立即放置于多通道微孔板测量仪中测定荧光值(激发光320nm，发射光405nm)。然后用封口膜封板，于37℃避光孵育4h，再次测量荧光值。前后两次测量值相减即为所得荧光值。

表3：荧光共振能量转移试验中的反应方案

结果：我们用一种BACE1的特异抑制剂([Asn⁶⁷⁰,Sta⁶⁷¹,Val⁶⁷²]-Amyloidβ/A4Precursor Protein 770 Fragment 662-675)与A1、Gp30、U31进行FRET实验。随着浓度增加，加入标准抑制剂的反应体系中荧光值逐渐下降，至100nM时荧光值较阳性对照组开始明显减低(P<0.05)，500nM时荧光值显著减低(P<0.01)(图4A)。而A1在250nM的终浓度时荧光值急速下降，与阴性对照组相当(P<0.01)。Gp30及U31组随着浓度增加，荧光值无显著减低(图4B)。按抑制率(％)＝100-(IF_i/IF₀×100)算出对BACE1活性的抑制率(IF_i为加入待测物后的荧光值，IF₀为不加待测物即阳性对照组的荧光值)。将抑制率与标准抑制剂及A1的不同浓度的对数值进行线性回归分析，拟合曲线得出三次函数模型，方程为Y＝b₀+b₁X+b₂X²+b₃X³。估算出A1的半数抑制浓度(IC₅₀)为139.81nM，标准抑制剂的IC₅₀为242.50nM。结果说明A1对BACE1体外活性的抑制效果好(图4C-D)。

实验五、链亲和素磁珠-pull down方法钓取适配子的靶蛋白

链亲和素包被的磁珠先用0.5×PBS洗涤3次，0.5mL/次。然后用1×PBS继续洗涤3次，0.5mL/次。250pmol 5’端生物素修饰的适配子稀释于1×PBS中，与磁珠室温下孵育30min。用1×PBS洗涤磁珠5遍，去除未结合的适配子。投入约600μg的M17-APPsw细胞蛋白提取物与已结合适配子的磁珠孵育30min。再用1×PBS洗涤磁珠6遍，然后加入50μL 2×SDS-loading buffer。将样品在100℃煮10min，用10％的PAGE分离胶分离样品，电压80-120V，进行Western blot实验，孵育的一抗为anti-BACE1抗体。

结果：于在序列分析时A1的重复率极高，因此选择A1进行下一步的结合及抑制功能实验。生物素标记的适配子A1与链亲和素磁珠孵育，然后与M17-APPsw细胞蛋白提取液孵育，经过严格洗涤，用anti-BACE1作为一抗进行western blot实验，以检测A1是否能结合M17-APPsw细胞蛋白提取液中的BACE1蛋白。生物素标记的原文库Gp30及无关适配子U31作为对照。结果如图5所示，A1组中能显出较明显的70KDa的BACE1蛋白条带，而Gp30位置的条带级细，可能由于非特异吸附，使得残留在磁珠上的BACE1蛋白显现条带。无关适配子U31及不加适配子组均未在70KDa处显现条带。说明A1能特异与M17-APPsw细胞中的BACE1蛋白结合。

实验六、四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验检测细胞存活率

细胞接种于96孔板，浓度为1×10⁴/孔，每孔100μL。生长至80-90％密度时弃去原培养基，换为不含血清的Opti-MEM，用不同浓度的适配子处理24h后再更换为无血清培养基，每孔加入10μL的5mg/mL的MTT，37℃孵育4h后弃上清，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，37℃孵育15min后振荡使之溶解。在酶标仪上检测570nm的吸光度(OD)值。计算细胞存活率。

MTT实验结果显示随A1浓度的增加，M17-APPsw细胞存活率呈下降趋势。A1终浓度为5μM、作用于细胞24h后细胞存活率开始下降，10μM终浓度时细胞存活率显著下降(P<0.01)，在不超过3μM的终浓度范围内细胞存活率不受影响(图6)

实验七、双抗夹心ELISA检测适配子对AD细胞模型内Aβ产量的影响

1.APPsred质粒提取纯化

由于在实际实验中用M17-APPsw细胞不能检测到Aβ₄₂，因此用带红色荧光的APPcDNA(APPsred)转染细胞以增加Aβ₄₂产量。首先按试剂盒说明书配制所需试剂。从-80℃冰箱中取出含APPsred的甘油菌，取5μL接种至2mL的含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养12-16h，12000rpm离心2min，弃上清。用250μL的Solution Ⅰ(含RNase A)充分悬浮细菌沉淀。加入250μL的SolutionⅡ轻轻上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。加入350μL的4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2min。室温12000rpm离心10min，取上清。将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作的上清液转移至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液。将500μL的Buffer WA加入Spin Column中，12000rpm离心30s，弃滤液。将700μL的BufferWB加入Spin Column中，12000rpm离心30s，弃滤液。重复一次。重新将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm离心1min，除尽残留洗液。将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μL的灭菌蒸馏水(预先加热至60℃)，室温静置1min。12000rpm离心1min洗脱DNA，紫外分光光度计测OD₂₆₀及OD₂₈₀值，计算DNA产量。收集的质粒DNA于-20℃保存。

2.Lipofectamine 2000介导APPsred质粒在M17-APPsw细胞中的转染

转染前一天将合适密度的M17-APPsw细胞接种于6孔板中，待细胞生长至80-90％密度时，弃去原培养基，更换为含2％FBS的Opti-MEM培养基。取出灭菌的EP管，将8μL/孔的脂质体加入至200μL Opti-MEM中，轻轻吹打数次，静置5min。将4μg/孔的APPsred质粒加入至200μL Opti-MEM中，轻轻吹打数次，静置5min。将稀释好的脂质体和APPsred质粒混匀，轻轻吹打数次，静置20min后加入细胞中。转染5-6h后，在显微镜下观察红色荧光强度，估计转染效率，并将培养基换成10％FBS+Opti-MEM培养基继续培养24h。

3.双抗夹心ELISA检测适配子对AD细胞模型内Aβ产量的影响

检测Aβ₄₀产量时，细胞生长至合适密度(90％)时，弃去原培养基，更换为不含血清的Opti-MEM，加入不同浓度的抑制剂(100nM-3000nM适配子)或安慰剂(100nM-3000nM原库Gp30、无关对照适配子U31)继续培养，24h后收集细胞培养基及蛋白提取物。检测Aβ₄₂时，用APPsred质粒转染细胞24h后用抑制剂及安慰剂处理同上。同时按试剂盒说明书配制Aβ₄₀及Aβ₄₂标准品，并各稀释8个浓度梯度。将50μL/孔的标准品、50μL/孔的待测样品分别加入预先包被Aβ₄₀或Aβ₄₂抗体的96孔板中，预留一个空白孔。然后加入50μL/孔的Aβ₄₀或Aβ₄₂检测抗体，轻轻混匀(空白孔除外)，室温震荡孵育3h。孵育后弃去孔内液体，用配套的洗涤缓冲液洗孔4次，400μL/孔，每次30s。加入100μL/孔的HRP标记的抗兔二抗液(空白孔除外)，混匀，室温下孵育30min。洗孔4次，加入100μL/孔的TMB显色液，室温下避光孵育30min。加入100μL/孔的终止液终止反应。在酶标仪上测定450nm的吸光度值，绘出标准曲线，根据标准曲线读出样品浓度。

结果显示：不同浓度A1处理M17-APPsw细胞24h后收集细胞蛋白提取液，分别进行双抗夹心ELISA法检测Aβ₄₀及Aβ₄₂含量。如图7所示，在A1终浓度为3μM时，细胞内Aβ₄₀及Aβ₄₂浓度较空白组(未予任何处理组)均有显著下降(P<0.01)。结合MTT实验中A1终浓度为3μM时细胞存活率无显著影响，选取3μM为A1的合适作用浓度。

终浓度为3μM的A1、Gp30及U31分别作用于细胞，空白组为未予任何处理的细胞。检测细胞内分泌的Aβ，提取细胞蛋白后进行双抗夹心ELISA；对于细胞培养基中分泌的Aβ，直接收集细胞培养基进行ELISA检测。从图8中可看出，A1终浓度为3μM时，M17-APPsw的细胞内Aβ₄₀及培养基中Aβ₄₀浓度均较对照组显著下降(P<0.01)。但Gp30处理组中Aβ₄₀浓度较空白组亦有明显下降(P<0.01、P<0.05)。同样，M17-APPwt的细胞内Aβ₄₀及培养基中Aβ₄₀浓度均较对照组显著下降(P<0.01)。培养基中Aβ₄₀浓度在Gp30组较空白组也有明显下降(P<0.05)。

红色荧光标记的APP cDNA转染M17-APPsw细胞后Aβ₄₂产量上升(图9A-B)。用适配子处理转染后的细胞，进行双抗夹心ELISA检测Aβ₄₂浓度的变化。与Aβ₄₀类似，A1终浓度为3μM时M17-APPsw的细胞内Aβ₄₂及细胞培养基中Aβ₄₂浓度均较对照组显著下降(P<0.01)(图9C-D)

实验八、Western Blot检测sAPPβ、sAPPα、BACE1水平的变化

首先按照试剂配方配置10％分离胶和5％浓缩胶溶液。同时将适配子与安慰剂处理后的细胞裂解物中加2×SDS-loading buffer，100℃加热10min，离心2min。待胶凝好后，上样，电泳装置连接电源，调节电压至80V，待到溴酚蓝染料标记线到达分离胶后，调节电压至100V，溴酚蓝电泳至凝胶底部时停止电泳。

SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移至PVDF膜(恒流320mA，3h)。PVDF膜用5％脱脂奶粉封闭1h，用1×TBST将膜洗涤三次，每次5min。然后加入一抗(anti-APP、anti-BACE1)4℃孵育过夜。回收一抗，1×TBST将膜洗涤三次，每次5min。加入对应的抗兔或抗鼠二抗(1:5000)，于5％的脱脂奶粉中室温孵育1h。1×TBST将膜洗涤3次，每次5min，加入ECL显影液，在暗室用胶片曝光。用软件Fluorchem SA分析条带灰度值。

结果：用3μM的A1、Gp30及U31分别处理M17-APPsw细胞后，将细胞裂解物进行western blot实验。孵育的一抗分别为针对APP氨基端的APP抗体及anti-BACE1抗体。结果显示A1处理组的sAPPβ蛋白表达水平较各对照组显著下降(P<0.01、P<0.05)，各组间sAPPα及BACE1的表达量无明显差异(图10)。

Claims (3)

1.一种与β-淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的核酸适配子，其特征在于，所述的核酸适配子还具有化学修饰物，所述的化学修饰物是在核酸适配子中包括的至少一个核苷酸的核糖2’位上的羟基被氢原子、氟原子、-O-酰基和氨基中任意一种所取代，以及在3’端或5’端加入FCM、FITC、biotin的任意修饰。

3.权利要求1所述的与β-淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子作为BACE1抑制剂在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用。