CN110423755A - 一种纤维蛋白核酸适配子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纤维蛋白适配子群的筛选、合成及其体内外的纤维蛋白靶向性应用，采用SELEX技术筛选出纤维蛋白配子群,以及上述适配子群各序列经截短、修饰等处理后的新适配子，以及所述的适配子在纤维蛋白靶向性应用，为后续抗凝、溶栓、示踪等药物用于血栓性疾病方面的研发奠定坚实基础。

Description

一种纤维蛋白核酸适配子及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种与纤维蛋白核酸适配子，及其筛选方法和应用。
背景技术
适配子是通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX)技术从单链随机寡核苷酸文库中筛选得到的单链寡核苷酸配体，其特性与抗体类似，具有高特异性、高亲和力，且易于化学修饰。纯化蛋白质是最常用的SELEX筛选的靶标。相比于抗体，适配子有如下优势:分子量小；对热稳定，经历变性/复性后能恢复天然构象及结合靶标；易于生产；易于通过各种化学反应进行修饰以提高其稳定性和对核酸酶的抵抗；易于结合荧光素等信号基团以增强适配子的功能；免疫原性低；靶物质广泛，对于一些抗体不能识别的物质如离子、小分子等也具特异亲和力。因此适配子可以在许多生物学应用中代替抗体。目前适配子已广泛地用于新药研发、疾病诊断及治疗、药物的体内运输、生物成像、试剂分析、食品检测等方面的研究。哌加他尼钠(pegaptanibsodium)注射液是第一个核酸适配体药，于2004年经FDA批准上市，在临床上取得了显著的疗效，肯定了适配子在靶向治疗方面的可行性与优越性。
因血栓形成导致的心脑血管疾病具有高发病率、高死亡率和高致残率等特点，在全球几乎所有国家人民预期寿命逐渐增加的情况下，全球25岁以后男性和女性的中风风险依然高达25％。尽管如肝素、华法林、阿司匹林等为代表的各种抗血栓药物广泛应用于血栓性疾病的预防和治疗，但因存在起效延迟、易出血等不足而影响临床使用。在社会竞争日趋加剧的全球化时代，心脑血管疾病造成的直接和间接劳动力损失以及治疗费用消耗了大量社会资源，因病致贫、因病返贫的案例不胜枚举。因此，针对心脑血管疾病的产生、变化阶段开展预防和治疗工作是医学研究的热点，更是新药研发的重要任务。
经典凝血瀑布学说的最后过程是纤维蛋白的形成，可溶性的纤维蛋白原在凝血酶的作用下转变为不溶的纤维蛋白，纤维蛋白单体彼此相互交织而形成多聚体并网络血细胞共同形成血栓。可见纤维蛋白是形成血栓的关键成分，有血栓形成的部位必定有纤维蛋白的存在。因此，基于适配子的靶向性特点，设计针对纤维蛋白的适配子，并从中筛选高特异性、稳定性好的适配子，将有助于血栓性疾病的治疗，目前纤维蛋白的适配子研究较少。
发明内容
本发明基于适配子的靶向性特点，以生物素-亲和素-碱性磷酸酶系统测定不同浓度适配子与靶蛋白的亲和力，从中筛选出活性最强的命名为纤维蛋白FA-1，通过体外人源、鼠源纤维蛋白结合实验、裸鼠颈动脉血栓模型活体成像实验验证了适配子FA-1的靶向结合血栓能力，抗凝血活性测定表明其对凝血系统未造成明显影响。
具体的，本发明第一个目的是提供一种与纤维蛋白特异性结合的核酸适配子FA-1及其化学修饰物。
本发明的与纤维蛋白特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物，其特征在于，其核苷酸序列为CCATCCACACTCCGCAAGCCCCGGTTAGGTCCCGTGCAATTCCTGCCCTTTTCTGCAGTGAGTCGTGTTCTTCGTCCCTTGCGTCGGCTGCCTCTACAT。
所述的化学修饰物是在上述核酸适配子中包括的至少一个核苷酸的核糖2'位上的羟基被氢原子、氟原子、-O-酰基和氨基中任意一种所取代，或在3'端或5'端加入FCM、FITC、biotin、FAM、Cy5.5荧光基团，或偶联PEG或胆固醇等任意修饰
本发明的第二个目的是提供上述与纤维蛋白特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物在体外与纤维蛋白结合的应用。
本发明的第三个目的是提供上述与纤维蛋白特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物在制备与纤维蛋白结合的药物或试剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供上述与纤维蛋白特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物在制备抗凝血药物或治疗血栓疾病药物或溶栓药物中的应用。
本发明的第五个目的是提供上述与纤维蛋白特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物在制备治疗颈动脉血栓疾病药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供上述与纤维蛋白特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物在制备抗凝血药物或治疗血栓疾病药物或溶栓药物中的应用。
所述的纤维蛋白为鼠源或人源纤维蛋白
本发明的第六个目的是提供制备所述与纤维蛋白特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物的方法，构建全长为99nt的单链寡核苷酸随机文库，羧基磁珠包被纤维蛋白，SELEX技术筛选出纤维蛋白适配子群，子群经克隆、转化、孵育后测序，筛选出亲和力最强的纤维蛋白适配子FA-1。
本发明还涉及一种血栓示踪剂，，其特征在于，所述血栓标记物包括与纤维蛋白特异性结合的核酸适配子FA-1，所述FA-1经荧光标记修饰。所述血栓标记物可以用于临床观察血栓位置、大小等。
本发明涉及与纤维蛋白特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物在制备血栓示踪剂中应用。
本发明基于纤维蛋白适配子能够特异性结合血栓中的重要组成成分--纤维蛋白的原理，实现对血栓部位的高效、特异性结合。本发明筛选所得到纤维蛋白适配子群中活性最强的FA-1，经体外纤维蛋白凝块结合实验、体内BALB/c裸鼠颈动脉血栓模型活体成像实验，均表现出优异的纤维蛋白靶向结合能力。
本发明提供一种靶向特异性结合纤维蛋白的适配子群，可用于制备抗凝、溶栓、示踪等药物。本发明筛选所得到纤维蛋白适配子群中的FA-1适配子，体外人源、鼠源纤维蛋白结合实验、裸鼠颈动脉血栓模型活体成像实验验证了靶向结合血栓能力，抗凝血活性测定表明其对凝血系统未造成明显影响。具有以下特点：高度的特异性、可修饰性、稳定性和安全性。本发明筛选所得到的适配子群，可用于制备抗凝、溶栓药物；可进行荧光标记，以观察血栓位置、大小等；亦可对适配子进行修饰，如添加偶联物、加用化学修饰等，改变其半衰期、增强对核酸酶的耐受性等。本发明可望为血栓栓塞性疾病的治疗、血栓示踪等提供新手段。
本发明筛选所得到的纤维蛋白适配子FA-1具有以下特点：①高特异性——以纤维蛋白为靶标，利用SELEX技术逐渐递增筛选压力，对随机寡核苷酸进行筛选、反筛，胶体金标记适配子，斑点渗滤法显示筛选出的纤维蛋白适配子群均具有较好的特异性；体外人源、鼠源纤维蛋白结合实验、裸鼠颈动脉血栓模型活体成像中，相对荧光强度较高，表明适配子具有高特异性结合活性。②可修饰性——FA-1适配子3'先后成功标记FAM、Cy5.5荧光基团，5'端成功标记生物素。可在糖或核苷酸间磷酸二酯键中修饰以增强核酸酶的抗性，添加偶联剂如PEG或胆固醇可增加循环半衰期，降低肾滤过率，甚至为适配子引入了新的功能。③半衰期较长稳定性好——裸鼠颈动脉血栓模型活体成像中，由相对荧光强度计算所得的适配子体内半衰期约为11小时(hour，h)，适配子注射24h实验组仍明显高于对照组和空白对照组，具有统计学意义；④安全性——适配子无毒，免疫原性低、组织渗透性好；抗凝血活性测定显示血浆中适配子FA-1的浓度低于200pmol/mL时，凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶时间(thrombin time，TT)无明显变化，即适配子FA-1对外源性凝血系统、内源性凝血系统均无明显影响。本发明可为血栓栓塞性疾病的靶向治疗、血栓的示踪等提供一种新手段。
本发明利用SELEX技术筛选出了特异性纤维蛋白适配子群，经斑点渗滤法、生物素-亲和素-碱性磷酸酶系统初步证明适配子具备纤维蛋白特异性、高亲和力，其中以FA-1的结合活性最强；体外、体内实验进一步证实了适配子FA-1纤维蛋白靶向结合的特异性及稳定性，并发现其对凝血系统无明显影响，目的是获得纤维蛋白靶向性适配子，为后续构建血栓靶向特异性的抗凝、溶栓新型药物分子奠定基础，为临床治疗血栓栓塞性疾病提供新策略及新制剂；亦可将本发明用于血栓的示踪及血栓性疾病治疗前后的疗效评估。
附图说明
图1为适配子FA-1与鼠源纤维蛋白荧光成像图
图2为适配子FA-1与人源纤维蛋白荧光成像图
图3为纤维蛋白共聚焦相对荧光强度分析图
图4为适配子FA-1对PT的影响
图5为适配子FA-1对APTT的影响
图6为适配子FA-1对TT的影响
图7裸鼠颈动脉造模前(左)、造模后(右)对比图
图8为裸鼠颈动脉血栓显微镜下切片图
图9为裸鼠实验组、阴性对照组、空白组成像图(0h)
图10为裸鼠实验组、浓度对照组、空白组成像图(0h)
图11为适配子裸鼠尾静脉注射成像图(1h)
图12为适配子裸鼠尾静脉注射成像图(2h)
图13为适配子裸鼠尾静脉注射成像图(6h)
图14为适配子裸鼠尾静脉注射成像图(24h)
图15为造模裸鼠颈动脉不同时间点相对荧光强度比较
图16为裸鼠重要脏器荧光成像图(2h)
图17为裸鼠颈动脉冰冻切片激光共聚焦荧光成像(2h)
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1纤维蛋白适配子群的筛选
1、纤维蛋白适配子群的SELEX筛选
①设计并合成引物与核酸文库，在体外构建全长为99nt的单链寡核苷酸随机文库，文库两端为18nt的固定引物序列，中间为63nt的随机序列，库容量大约为1017-1018。
②以羧基磁珠Dynabeads M-270Epoxy为介质，包被纤维蛋白。
③利用SELEX技术，通过磁力架分离结合与未结合的核酸分子，通过不断增加筛选压力(增加tRNA量、增加洗涤次数、增加摇床频率、缩短结合反应时间)，对核酸文库进行重复筛选，并在第6、9、12轮进行反筛——以空白磁珠与核酸文库结合，除去与纤维蛋白非特异结合的核酸分子；在筛选的偶数轮用FAM标记的引物3和biotin标记的引物4进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增文库，经纯化后分离单链，测定下一轮筛选前后的ssDNA荧光值，计算各轮ssDNA与纤维蛋白的结合百分率。13轮之后，结合率基本保持稳定，继续筛选2轮，结合率无明显变化，遂停止筛选。经过筛选压力递增的15个循环，最终筛选出了纤维蛋白适配子群。
2、纤维蛋白适配子群的序列及结构测定
①把结合率不再提高时所筛选的适配子进行PCR扩增，纯化后连接T载体，进行T/A克隆，并转化大肠杆菌感受态菌，挑取单克隆菌落接种于氨苄青霉素(ampicillin，Amp)抗性的液体培养基中，于恒温摇床中震荡培养12-16小时，阳性克隆进行DNA测序，获得88种适配子序列。
②用BioEdit软件对所获得的88种适配子序列进行比对，分析适配子一级结构特点，发现50-73位具有较高相似性的序列，此为适配子的保守序列。用DNAMAN 8.0软件对适配子序列的二级结构进行分析，发现各适配子多以茎环结构为主，有圆环和凸环，但茎环的数目、大小和位置存在差异，且最低自由能也不同。
3、纤维蛋白适配子群结合特异性测定
将纤维蛋白(fibrin)、纤维蛋白原(fibrinogen)、牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)溶液分别滴加在硝酸纤维素膜上，用封闭液封闭后滴加胶体金标记适配子，结果显示：滴加纤维蛋白的硝酸纤维素膜上快速出现红色斑点，而纤维蛋白原和BSA的膜处均无明显颜色变化，表明适配子具有纤维蛋白结合特异性。
4、纤维蛋白适配子群结合活性及亲和力测定
①适配子群结合活性测定：生物素(biotin)标记的适配子与一定量的纤维蛋白结合后，用标记碱性磷酸酶的亲和素与之结合，经显色底物反应后，于酶标仪上读取波长450nm处的各孔吸光度(optical density，OD)值。经测量3次取其平均值，OD值越大结合力越强，经比较适配子FA-1结合力最强。
FA-1的序列为：
CCATCCACACTCCGCAAGCCCCGGTTAGGTCCCGTGCAATTCCTGCCCTTTTCTGCAGTGAGTCGTGTTCTTCGTCCCTTGCGTCGGCTGCCTCTACAT。
②适配子亲和力测定测定：将适配子稀释为7种不同的浓度(800nmol/L、400nmol/L、200nmol/L、100nmol/L、50nmol/L、25nmol/L、12.5nmol/L)测其OD值，数据分析显示适配子FA-1与纤维蛋白亲和力的解离常数Kd可达54.43nmol/L，表明纤维蛋白适配子FA-1具有较高的亲和力。
实施例2纤维蛋白适配子FA-1的功能验证
1、纤维蛋白适配子FA-1体外纤维蛋白结合活性
①取凝血功能正常人静脉血液10管，灭菌15mL离心管取上层清亮血浆混匀，置于Beckman Coulter Allegra X-15R台式冷冻离心机上，3000转/分钟(revolutions perminute，rpm)离心5min，另取灭菌15mL离心管取上层清亮血浆备用。
②96孔板中，100μL血浆加入2μL 1M CaCl2溶液，混匀静置形成纤维蛋白凝块。将纤维蛋白凝块加入10μL不同浓度的适配子FA-1溶液，电热恒温培养箱中37℃孵育15min，加入1mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)溶液，置于摇床上，130rpm震荡5min，洗涤3次。
③纤维蛋白小心取出置于载玻片上，盖上盖玻片，缓慢将血栓尽量压平，做好组别、浓度标记，Nikon A1R激光共聚焦显微镜下观察，以固定的参数(HV 167，Offset 0，Laser 44.5)扫描成像。
④鼠源纤维蛋白结合实验参照上述人源纤维蛋白处理。
⑤人源、鼠源纤维蛋白结合实验中，不同浓度的适配子FA-1均能与之结合，且随着加入适配子FA-1浓度的增加，荧光强度随之增强，表明适配子FA-1可特异结合纤维蛋白(图1-2)。
⑥ImageJ图像分析软件对结合有不同浓度适配子FA-1的鼠源、人源纤维蛋白成像图片进行相对荧光强度分析，并按照不同浓度组进行统计学分析，结果表明不同浓度适配子FA-1组孵育的纤维蛋白相对荧光强度具备差异性、适配子FA-1结合鼠源、人源纤维蛋白无种属差异(图3)。
2、纤维蛋白适配子FA-1对凝血系统的影响
①按9:1的比例将人静脉全血与3.2％枸橼酸钠混合均匀，置于Beckman CoulterAllegra X-15R台式冷冻离心机上，3000rpm离心25min，灭菌15mL离心管取上层清亮血浆混匀备用。
②将纤维蛋白适配子FA-1原液用PBS稀释成20pmol/μL，取20μL加入980μL的血浆中，混匀后取500μL测定PT、APTT、TT。剩下的500μL再加入500μL血浆，混匀后取500μL测量。以倍比稀释法将血浆中FA-1适配子浓度不断稀释，最终为400pmol/mL、200pmol/mL、100pmol/mL、50pmol/mL。
③SYSMEX CS-5100全自动血凝分析仪测定PT、APTT、TT数值，均数与方差如下：
表1浓度梯度FA-1血浆的PT、APTT、TT
Note:*p＜0.05
④PT组中，各浓度统计分析结果显示，均P＞0.05，实验组和对照组测得的PT值差异均无统计学意义；即加入适配子FA-1溶液后血浆中的PT值无显著变化(图4)。
⑤APTT组中，各浓度统计分析结果显示，均P＞0.05，实验组和对照组测得的APTT值差异均无统计学意义；即加入适配子FA-1溶液后血浆中的APTT值无显著变化(图5)。
⑥TT组中，分析结果显示，血浆中适配子FA-1浓度为400pmol/mL时，P＝0.004＜0.05，实验组和对照组测得的TT值差异有统计学意义；浓度为50pmol/mL、100pmol/mL和200pmol/mL时，均P＞0.05，实验组和对照组测得的TT值差异无统计学意义；即当加入纤维蛋白适配子FA-1的浓度低于200pmol/mL时，血浆中的TT值无显著变化(图6)。
3、纤维蛋白适配子FA-1体内纤维蛋白靶向性实验
①实验动物及分组。选用6周龄BALB/C裸鼠，雌雄各半。分组：实验组：FA-1-400pmol；浓度对照组：FA-1-200pmol；阴性对照组(前列腺癌适配子A10)：A10-400pmol；空白组：PBS。
②10％FeCl3诱导裸鼠颈动脉血栓
1)麻醉：电子称称重后记录，按照400mg/kg的剂量腹腔注射5％水合氯醛。
2)固定：麻醉裸鼠取仰卧位置于操作板上，缝合线固定切牙，两端固定在鼠板上，用胶带贴住尾部，使裸鼠颈部暴露并保持笔直。
3)消毒：用75％酒精棉球对裸鼠颈部手术部位进行消毒。
4)剪切：左手用镊子固定颈部右侧皮肤，右手持手术剪做一个小切口(2-3mm)。用镊子夹住切口的皮肤，插入手术剪刀，将切口扩大至1cm。
5)分离：用弯镊钝性分离各层肌肉、筋膜，暴露出颈动脉并将颈动脉分离出约8mm(注意镊子头不要扎到颈动脉，防止出血；注意不伤及迷走神经)。
6)保护：将事先准备好的保鲜膜(5mm×10mm)穿过所分离的颈动脉，置于颈动脉与组织中间，用于保护血管周围组织不被FeCl3侵蚀。
7)敷滤纸：将滴加10％FeCl3溶液的小片Whatman滤纸(6mm×3mm)包住暴露的颈动脉。
8)冲洗：敷滤纸5min后去除滤纸片、保鲜膜，用生理盐水冲洗3遍，缝合。
③颈动脉血栓模型裸鼠活体成像。造模前后的颈动脉大体外观显示正常颈动脉呈淡红色，干预血管明显呈暗红色，表明血管在高价铁离子作用下发生氧化(图7)；HE染色后置于显微镜下观察，正常裸鼠颈动脉血管内未见血栓，造模裸鼠颈动脉血管内有血栓形成(图8)，表明模型成功建立。造模后行尾静脉注射相应药物，设此时间点为0h。将适配子FA-1实验组、浓度对照组、适配子A10(前列腺癌适配子)阴性对照组、PBS组裸鼠用IVIS LuminaII小动物成像系统成像，先用黑色挡光板挡住尾部成像，再挡住胸腹部区域继续成像，图像以Living Image软件处理(图9-10)。
④适配子血栓靶向特异性：尾静脉注射相应药物后，实验组颈动脉迅速出现明显强荧光，表明局部结合的FA-1适配子数量多；阴性对照组相应部位存在弱荧光(图9、图11-14)。相对荧光强度统计学分析，0h、1h、2h、6h、24h等时间点实验组与阴性对照组、空白对照组比较，均p<0.05，差异有统计学意义(图15)，表明适配子FA-1具有血栓靶向特异性。
⑤适配子体内稳定性：适配子注射24h后，实验组裸鼠颈动脉手术部位仍可清晰成像，各组相对荧光强度比较，实验组＞浓度对照组＞阴性对照组(图15)。相对荧光强度统计学分析实验组与浓度对照组、阴性对照组、空白对照组比较，均p<0.05，差异具有统计学意义，表明适配子FA-1与血栓的结合相对稳定，半衰期约为11h。
⑥适配子主要经肝脏、肾脏代谢：适配子注射2h后迅速处死实验裸鼠，离体肝、心、脾、肺、双肾、颈动脉等相关脏器成像，可看到各适配子组肝脏、肾脏均出现强荧光，表明适配子经尾静脉注射后迅速通过肝肾代谢，与活体成像所见相符(图9-10)；浓度对照组荧光强度低于实验组、阴性对照组荧光聚集在肝脏、肾脏(图16)。
⑦颈动脉切片证实纤维蛋白适配子FA-1结合在血栓部位。各组裸鼠颈动脉离体后迅速行冰冻切片，并行HE染色后置于激光扫描共聚焦显微镜下观察。荧光成像时以固定参数成像(HV 130，Offset 0，Laser 39.5)。实验组(FA-1-400pmol)、浓度对照组(FA-1-200pmol)颈动脉切片管腔内均可见荧光，表明纤维蛋白适配子FA-1的确结合于血栓部位(图17)。
本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围准。

Claims (10)

1.一种与纤维蛋白特异性结合的核酸适配子FA-1及其化学修饰物，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ NO.1：
CCATCCACACTCCGCAAGCCCCGGTTAGGTCCCGTGCAATTCCTGCCCTTTTCTGCAGTGAGTCGTGTTCTTCGTCCCTTGCGTCGGCTGCCTCTACAT。
2.根据权利要求1所述的核酸适配子FA-1及其化学修饰物，所述的化学修饰物是在上述核酸适配子中包括的至少一个核苷酸的核糖2'位上的羟基被氢原子、氟原子、-O-酰基和氨基中任意一种所取代，或在3'端或5'端加入FCM、FITC、biotin、FAM、Cy5.5荧光基团修饰，或偶联PEG或胆固醇等任意修饰。
3.根据权利要求1或2所述的核酸适配子FA-1及其化学修饰物，所述的纤维蛋白为鼠源或人源纤维蛋白。
4.权利要求1-3任意一项所述的核酸适配子FA-1及其化学修饰物在体外与纤维蛋白结合的应用。
5.权利要求1-3任意一项所述的核酸适配子FA-1及其化学修饰物在制备与纤维蛋白结合的药物或试剂中的应用。
6.权利要求1-3任意一项所述的核酸适配子FA-1及其化学修饰物在制备抗凝血药物或治疗血栓疾病药物或溶栓药物中的应用。
7.权利要求1-3任意一项所述的核酸适配子FA-1及其化学修饰物在制备治疗颈动脉血栓疾病药物中的应用。
8.权利要求1-3任意一项所述的核酸适配子FA-1及其化学修饰物在制备血栓示踪剂中应用。
9.一种血栓示踪剂，其特征在于，所述血栓标记物包括权利要求1-3任意一项所述的核酸适配子FA-1，所述FA-1经荧光标记修饰。
10.一种制备权利要求1-3任意一项所述的核酸适配子FA-1及其化学修饰物的方法，构建全长为99nt的单链寡核苷酸随机文库，羧基磁珠包被纤维蛋白，SELEX技术筛选出纤维蛋白适配子群，子群经克隆、转化、孵育后测序，筛选出亲和力最强的纤维蛋白适配子FA-1。
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