CN110433175A - 心梗条件下的血清外泌体在制备治疗心肌梗死药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种心梗条件下的血清外泌体在制备治疗心肌梗死药物中的应用及用于治疗心肌梗死的药物。本发明提供的含有心梗条件下的血清外泌体的药物能显著提高心梗大鼠的心脏功能；能够恢复心室壁厚度和节律性运动；能够改善心梗大鼠的左心室射血分数；能够显著减少心梗大鼠梗死区域的梗死面积。

Description

心梗条件下的血清外泌体在制备治疗心肌梗死药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种心梗条件下的血清外泌体在制备治疗心肌梗死药物中的应用。

背景技术

心肌梗死（Acute myocardial infarction, AMI）是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。急性心肌梗死是危害人类健康的重大疾病，在发达国家被称为“头号杀手”，是世界范围的主要死亡原因之一。我国近年来，随着经济的迅速发展、生活方式的转变以及人口老龄化的加剧，AMI的发病率和死亡率呈逐年增长趋势，心血管病成为我国疾病死因第一位。根据马尔科夫模型预测，未来20年间中国将新增2100 万急性冠脉事件，发生700万例心源性死亡。AMI 发病率的增加给个人、家庭和社会带来沉重的负担，控制AMI发病率，提高AMI的救治水平，成为心血管领域的一个重要课题。

外泌体(exosome)是由细胞内涵体向外分泌产生的一种微型囊泡，直径在40-100nm之间。微囊泡通过与靶细胞相关受体的相互作用以及蛋白、mRNA、 miRNA、 DNAs、脂质等的传递，在细胞之间信号交流方面扮演了重要的角色。研究发现，外泌体可来自各种类型的细胞，如B细胞、 T细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、干细胞、内皮细胞等，并可产生不同的作用，如清除无功能蛋白、抗原呈递、基因交换、血管增生、促进分化、炎症、肿瘤代谢、致病基因或癌基因的传递等。

目前基于外泌体的无细胞替代疗法正在不断兴起，在心血管领域中外泌体也有其独特的疗效，它们能够在急性局部缺血和再灌注模型以及慢性缺血期间保护心脏，在心梗后的疾病转归过程中具有促进血管新生，减轻纤维化，减小梗死面积，抑制凋亡等重要生物学功能，最终可改善心梗预后。它不但具备了干细胞移植疗效，而且减低了细胞移植风险，如免疫排斥反应，致畸致瘤等，因此近年来外泌体在心血管领域得到了广泛的关注和研究，在心梗治疗方面有着广大的应用前景。但现有技术中用于治疗心肌梗死的外泌体主要来源于间充质干细胞，间充质干细胞的培养、诱导和提取费时费力，难以大规模推广；外泌体广泛存在并分布于各种体液中，每微升血清中外泌体数量可达3×10⁶，但体液中外泌体主要来源于机体内大多数细胞，在治疗心肌梗死方面的疗效差强人意，不能满足临床需要。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种心梗条件下的血清外泌体在制备治疗心肌梗死药物中的应用及用于治疗心肌梗死的药物。

为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面提供一种心梗条件下的血清外泌体在制备治疗心肌梗死药物中的应用。

在本发明优选实施例中，所述心梗条件下的血清外泌体由以下方法制备而成：

S1：心肌梗死模型的建立:选取体重180-200gSD大鼠，用1%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉；分离组织肌肉，暴露心脏；结扎冠状动脉左前降支；从内向外依次缝合胸腔；超声鉴定心肌梗死模型是否成功造模；

S2：心梗条件下血清样本的制备：对造模成功的SD大鼠进行血液采集；采集的血液进行静置、离心后，收集上层血清样本，冷藏；

S3：心梗条件下血清外泌体的提取：取血清样本适量，从EIQ3-01001试剂盒中拿出试剂A，加入血清样本中，混匀，于4℃静置孵育30min，室温离心去上清，获得沉淀；所述沉淀用适量的灭菌PBS重悬，混匀，获得重悬液；从EIQ3-01001试剂盒中拿出试剂B加入所述重悬液中，混匀，静置孵育30min，室温离心去上清后，获得沉淀物，所述沉淀物用适量的已灭菌的PBS重悬，反复吹打均匀，分装，-80℃保存，获得心梗条件下血清外泌体。

优选地，所述大鼠心梗模型为心肌梗死模型或者缺血再灌注模型。

本发明另一方面，提供一种用于治疗心肌梗死的药物，所述药物包含心梗条件下的血清外泌体，所述心梗条件下的血清外泌体的的浓度为80-200μg/100μL。

优选地，所述药物由以下方法制备而成：

S1：心肌梗死模型的建立:选取体重180-200gSD大鼠，用1%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉；分离组织肌肉，暴露心脏；结扎冠状动脉左前降支；从内向外依次缝合胸腔；超声鉴定心肌梗死模型是否成功造模；

S2：心梗条件下血清样本的制备：对造模成功的SD大鼠进行血液采集；采集的血液进行静置、离心后，收集上层血清样本，冷藏；

S3：心梗条件下血清外泌体的提取：取血清样本适量，从EIQ3-01001试剂盒中拿出试剂A，加入血清样本中，混匀，于4℃静置孵育30min，室温离心去上清，获得沉淀；所述沉淀用适量的灭菌PBS重悬，混匀，获得重悬液；从EIQ3-01001试剂盒中拿出试剂B加入所述重悬液中，混匀，静置孵育30min，室温离心去上清后，获得沉淀物，所述沉淀物用适量的已灭菌的PBS重悬，反复吹打均匀，分装，-80℃保存，获得心梗条件下血清外泌体；

S4：取步骤S3中获得的心梗条件下血清外泌体，进行冷冻干燥或加入药学上可接受的溶剂或赋形剂，获得所述药物。

优选地，所述溶剂选自纯化水、生理盐水或磷酸缓冲盐溶液中的一种或多种。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明发现利用心梗条件下血清外泌体治疗心肌梗死具有较好的治疗效果，故本发明提供了一种心梗条件下的血清外泌体在制备治疗心肌梗死药物中的应用及包含心梗条件下的血清外泌体的药物。本发明提供的含有心梗条件下的血清外泌体的药物能显著提高心梗大鼠的心脏功能；能够恢复心室壁厚度和节律性运动；能够改善心梗大鼠的左心室射血分数；能够显著减少心梗大鼠梗死区域的梗死面积。

附图说明

图1A 为超声仪检测正常大鼠的鉴定结果；

图1B 为超声仪检测MI模型大鼠的鉴定结果；

图2 为透射电镜下观察的血清来源外泌体的基本形态；

图3A 为PBS组大鼠的心脏超声检测结果；

图3B 为正常外泌体组大鼠的心脏超声检测结果；

图3C 为心梗条件下的血清外泌体治疗心梗大鼠后的心脏超声检测结果；

图4A 为PBS组\正常外泌体组\心梗条外泌体组心梗大鼠治疗前后的左心室射血分数统计图；

图4B 为PBS组\正常外泌体组\心梗条外泌体组心梗大鼠治疗前后的左心室射血分数变化统计图；

图5A为PBS组Masson染色结果；

图5B为正常外泌体组Masson染色结果；

图5C为心梗外泌体组Masson染色结果；

图6为PBS组、正常外泌体组和心梗外泌体组三组梗死面积的统计结果。

具体实施例

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

试剂：EIQ3-01001试剂盒采购自上海华盈生物医药科技有限公司，产品批号为：LOT：170912，EIQ3-01001试剂盒中包含试剂A和试剂B。

实施例1：SD大鼠的心肌梗死模型(MI模型)的建立及鉴定

选取体重180-200g SD大鼠，用1%戊巴比妥钠（40mg/kg）进行腹腔注射麻醉后，仰卧固定于实验台上，连接动物人工呼吸机，呼吸频率86次/分左右，潮气量15ml，呼吸比设定为1：1。左前胸去毛，消毒铺巾，于胸骨旁第3、4肋骨间隙切开皮肤，钝性分离皮下组织、肌肉，然后将第3根肋骨剪断，并用缝线分离暴露心脏，于左心耳下缘2mm处结扎冠状动脉左前降支，结扎正确完成后可观察到左室前壁及心尖部位发白，然后从内向外依次缝合胸腔，并排出腔内气体以恢复胸腔内负压状态，最后进行造模大鼠的术后护理。SD大鼠造模手术1-2周后，利用超声仪器检测心脏超声的结果鉴定心肌梗死模型是否成功造模，模型鉴定结果如图1A-图1B所示，图1A 为超声仪检测正常大鼠的鉴定结果；图1B 为超声仪检测MI模型大鼠的鉴定结果；与正常大鼠的鉴定结果相比，可以观察到造模大鼠的左心室前壁运动功能减弱且室壁变薄，即可确定模型成功。

实施例2：血清样本的准备

对造模成功的SD大鼠进行血液采集，将采集的新鲜血液不加抗凝剂、室温静置60min，3000rpm 、4℃离心10min，收集上层血清样本。然后将血清样本放置于冰上，如初始血清样本为冻存样本，需在25℃水浴中解冻，至其完全融化后置于冰上；取一定量的血清样本4℃、3000g，离心10min,最后，转移上清至另一新的离心管中，冷藏。

实施例3：血清外泌体的提取

使用EIQ3-01001试剂盒进行血清外泌体提取，提取试剂使用前需平衡至室温。取离心过的血清样本适量，加入对应量的提取试剂A，用移液器反复吹打均匀或用漩涡混合器混匀（注：血清体积：试剂A体积=4:1）。混合溶液于4℃静置孵育30min。孵育结束后，混合液室温3000g、离心10min，去上清，管底可见沉淀；所得沉淀简短离心，区残留的上清；沉淀用适量的灭菌PBS重悬，并反复吹打均匀（注：重悬液体积与起始血清体积相等）。然后向重悬液中加入对应体积的试剂B，用移液器反复吹打均匀或用涡旋混合器混匀（注：重悬液体积：试剂B体积=4:1）；混合液4℃静置孵育30min；孵育结束后，室温3000g离心10min，去上清；对所得沉淀简短离心，去残留的上清，沉淀用适量的已灭菌的PBS重悬，反复吹打均匀、分装、-80℃保存、鉴定及备用。鉴定结果如图2所示，图2为透射电镜下观察的血清来源外泌体的基本形态。

实施例4：SD大鼠MI模型的治疗及超声检测

对经过超声检测确定MI造模成功的大鼠进行外泌体的心肌内治疗。用1%戊巴比妥钠（40mg/kg）进行腹腔注射麻醉后，仰卧固定于实验台上，连接动物人工呼吸机，呼吸频率86次/分左右，潮气量15ml，呼吸比设定为1：1。左前胸去毛，消毒铺巾，于胸骨旁第3、4肋骨间隙切开皮肤，钝性分离皮下组织、肌肉，然后将第4根肋骨剪断，并用缝线分离暴露心脏，然后在心梗区域边缘取3-4个点进行心肌内注射外泌体治疗大鼠心肌梗死，每只大鼠的外泌体剂量为80μg-200μg/100μL。最后，从内向外依次缝合胸腔，并排出腔内气体，进行造模大鼠的术后护理。于治疗后不同时间点通过超声检测心梗大鼠的治疗效果。超声检测结果如图3A-图4B所示，其中图3A 为PBS组大鼠的心脏超声检测结果；图3B 为正常外泌体组大鼠的心脏超声检测结果；图3C 为心梗条件下的血清外泌体治疗心梗大鼠后的心脏超声检测结果；结果显示与PBS对照组和正常外泌体组相比，血清来源的外泌体治疗心梗大鼠后能够显著改善心室壁厚度和节律性运动；图4A 为PBS组\正常外泌体组\心梗外泌体组心梗大鼠治疗前后的左心室射血分数统计图；图4B 为PBS组\正常外泌体组\心梗外泌体组心梗大鼠治疗前后的左心室射血分数变化统计图；结果显示与PBS组和正常外泌体组相比，心梗外泌体组即血清来源的外泌体治疗心梗大鼠后能够显著提高左心室射血分数。

实施例5：SD大鼠心脏组织的Masson三色染色

周期结束后，将大鼠心脏进行取材后固定于4%多聚甲醛溶液中固定12h左右，取出心脏组织裁剪出发生梗死的心脏区域，再固定12h后，将固定液弃掉，加入PBS反复清洗至无多聚甲醛固定液残留后，弃掉PBS加入30%的蔗糖脱水至心脏组织沉至管底。然后使用冰冻包埋剂（OCT）对心脏组织进行包埋、切片。最后，用Weigert 铁苏木素A、B液等比例混合液染片5-10min，流水冲洗；再用1%盐酸酒精分化液分化数秒到数十秒，流水冲洗干净（最好镜下观察）；后用丽春红酸性品红染片5-10min，流水冲洗；后用磷钼酸溶液处理5min，倾去玻片上的磷钼酸溶液（不用水洗），用苯胺蓝染液复染90s左右，倾去玻片上的染色液后，用1%冰醋酸处理1min左右，冲洗切片至无蓝色脱出，即可按程序脱水、中性树脂封片。最后，用体式显微镜采集结果。检测结果如图5A、图5B和图5C所示，其中图5A为PBS组Masson染色结果；图5B为正常外泌体组Masson染色结果；图5C为心梗外泌体组Masson染色结果；图6为PBS组、正常外泌体组和心梗外泌体组三组梗死面积的统计结果，根据结果显示，与PBS组和正常外泌体组相比，心梗外泌体组即血清来源的外泌体治疗心梗大鼠后能够显著减小梗死区的梗死面积。

Claims (6)

1.心梗条件下的血清外泌体在制备治疗心肌梗死药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述心梗条件下的血清外泌体由以下方法制备而成：

S1：心肌梗死模型的建立:选取体重180-200gSD大鼠，用1%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉；分离组织肌肉，暴露心脏；结扎冠状动脉左前降支；从内向外依次缝合胸腔；超声鉴定心肌梗死模型是否成功造模；

S2：心梗条件下血清样本的制备：对造模成功的SD大鼠进行血液采集；采集的血液进行静置、离心后，收集上层血清样本，冷藏；

S3：心梗条件下血清外泌体的提取：取血清样本适量，从EIQ3-01001试剂盒中拿出试剂A，加入血清样本中，混匀，于4℃静置孵育30min，室温离心去上清，获得沉淀；所述沉淀用适量的灭菌PBS重悬，混匀，获得重悬液；从EIQ3-01001试剂盒中拿出试剂B加入所述重悬液中，混匀，静置孵育30min，室温离心去上清后，获得沉淀物，所述沉淀物用适量的已灭菌的PBS重悬，反复吹打均匀，分装，-80℃保存，获得心梗条件下血清外泌体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述大鼠心梗模型为心肌梗死模型或者缺血再灌注模型。

4.用于治疗心肌梗死的药物，其特征在于，所述药物包含心梗条件下的血清外泌体，所述心梗条件下的血清外泌体的浓度为80-200μg/100μL。

5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物由以下方法制备而成：

S1：心肌梗死模型的建立:选取体重180-200gSD大鼠，用1%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉；分离组织肌肉，暴露心脏；结扎冠状动脉左前降支；从内向外依次缝合胸腔；超声鉴定心肌梗死模型是否成功造模；

S2：心梗条件下血清样本的制备：对造模成功的SD大鼠进行血液采集；采集的血液进行静置、离心后，收集上层血清样本，冷藏；

S3：心梗条件下血清外泌体的提取：取血清样本适量，从EIQ3-01001试剂盒中拿出试剂A，加入血清样本中，混匀，于4℃静置孵育30min，室温离心去上清，获得沉淀；所述沉淀用适量的灭菌PBS重悬，混匀，获得重悬液；从EIQ3-01001试剂盒中拿出试剂B加入所述重悬液中，混匀，静置孵育30min，室温离心去上清后，获得沉淀物，所述沉淀物用适量的已灭菌的PBS重悬，反复吹打均匀，分装，-80℃保存，获得心梗条件下血清外泌体；

S4：取步骤S3中获得的心梗条件下血清外泌体，进行冷冻干燥或加入药学上可接受的溶剂或赋形剂，获得所述药物。

6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述溶剂选自纯化水、生理盐水或磷酸缓冲盐溶液中的一种或多种。