CN115998768B - M2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用 - Google Patents
M2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用 Download PDFInfo
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本发明涉及分子生物技术领域,具体公开了M2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。本发明中的M2型巨噬细胞外泌体能够用于制备治疗心肌缺血再灌注损伤造成的心律失常的药物,所述M2型巨噬细胞外泌体是利用白细胞介素‑4刺激RAW264.7细胞并孵育而得。本发明中的M2型巨噬细胞外泌体可以通过其内包裹的长链非编码RNA Morrbid通过增强TRPV1表达,调控钙离子通路而改善心肌缺血再灌注损伤小鼠心脏,从而缓解心律失常,本发明为以巨噬细胞来源的外泌体治疗缺血再灌注损伤心律失常提供理论基础和科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域,具体涉及M2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
背景技术
心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)是一种急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI),MI/RI后,无论是缺血心肌还是非缺血心肌,心脏电生理都发生了深刻的变化,导致复极异质性,引发室性心律失常(VAs)。室性心律失常可通过跨越不同异质复极区的多个折返回路来引发和维持,是世界范围内死亡率和致残率较高的疾病。目前广泛应用的治疗方法包括经皮冠状动脉介入治疗技术、抗血小板药物和抗血栓药物,但至今尚无有效的预防MI/RI后心律失常的策略。
大量研究表明,巨噬细胞可通过与心肌细胞形成缝隙连接促进房室结内的电传导。当发生MI/RI时,来自体循环的大量单核细胞将聚集在心脏并分化为巨噬细胞,并比其他炎症细胞更多地渗透到炎症部位。在心脏募集后,巨噬细胞在免疫反应中比常驻巨噬细胞发挥更核心的作用。炎性巨噬细胞在MI/IR后心律失常中发挥关键作用,但其机制尚不清楚。
募集的巨噬细胞分为两个亚型,即促炎的M1型巨噬细胞和抗炎的M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞产生促炎因子,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6,并促进MI/RI进展。众所周知,M2型巨噬细胞作为抗炎细胞发挥作用,分泌包括IL-10和IL-4在内的强大抗炎因子,抑制促炎因子的产生,阻断炎症反应,同时促进健康的组织重塑和组织修复。此前,几项临床研究提供的证据表明,炎性细胞因子的增加与心律失常密切相关。这些结果表明炎症影响室性心律失常的发生和发展,VAs涉及底物触发的心脏电和结构重构,炎症有助于异位触发的活动和折返的发生。据报道,炎性巨噬细胞在MI/IR后VAs发挥关键作用。此外,临床研究表明,巨噬细胞或巨噬细胞分泌的炎性细胞因子升高与VAs密切相关
先前的研究证明,IR后心脏内各种细胞外囊泡(EV)的释放显著增加。众所周知,EV是心脏生理学和病理学中生物信号传导的有效传播者。作为EV的一种,外泌体(直径为30-200nm)可以被所有细胞分泌,它们通过将其内容物转移到不同的细胞,影响基因转录和细胞增殖,从而在细胞间通讯中发挥重要作用。自外泌体被发现以来,其在心血管疾病中的研究引起了广泛关注。外泌体可以在细胞间携带蛋白质、microRNA、非编码RNA、DNA等多种基因药物,因此也被称为基因治疗的“下一代”载体。
目前没有发现M2型巨噬细胞外泌体对心肌缺血再灌注损伤诱发的心律失常的作用。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供了M2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用,本发明中的M2型巨噬细胞外泌体可以通过其内包裹的长链非编码RNA Morrbid通过增强TRPV1表达,调控钙离子通路而改善心肌缺血再灌注损伤小鼠心脏,从而缓解心律失常,本发明为以巨噬细胞来源的外泌体治疗缺血再灌注损伤心律失常提供理论基础和科学依据。
本发明提供了M2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
进一步地,所述M2型巨噬细胞外泌体用于制备治疗心肌缺血再灌注损伤造成的心律失常的药物。
进一步地,所述M2型巨噬细胞外泌体通过长链非编码RNA Morrbid激活心肌细胞线粒体上的TRPV1钙离子通道,释放线粒体内超载的钙离子,调控线粒体内钙稳态,实现对缺血再灌注后心律失常的有效治疗。
进一步地,所述M2型巨噬细胞外泌体提取过程为:用白细胞介素-4刺激RAW264.7细胞,利用无血清培养基孵育后收集培养基,然后通过梯度离心法分离外泌体。
进一步地,所述梯度离心法分离外泌体过程为:将收集的培养基以2000g离心10min,然后以10000g离心30min以去除细胞碎片,然后,将上清液以2000g时浓缩8min至原始体积的30%,最后,将上清液120,000g离心70min,洗涤沉淀后获得M2型巨噬细胞外泌体。
进一步地,用冷PBS洗涤沉淀。
进一步地,无血清培养基孵育后收集培养基的过程为:无血清培养基中孵育24h,收集培养基,用新鲜的无血清培养基代替,将培养物再孵育24h,然后再次收集培养基,将收集的两体积的培养基混合在一起。
进一步地,所述白细胞介素-4质量浓度为100ng/mL,所述RAW264.7细胞接种量为2.0×106个/孔。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
1、本发明成功提取的M2型巨噬细胞外泌体,利用透射电镜观察到其直径大致均在40-100nm之间,且我们利用Western blot技术也成功检测到其表面存在外泌体特征蛋白的表达,利用BCA技术可以测得平均12个10cm皿的巨噬细胞可以提取2mg/ml的M2型巨噬细胞外泌体;
本发明提取的M2型巨噬细胞外泌体内的长链非编码RNA Morrbid能调控心肌细胞线粒体TRPV1钙离子通道蛋白的表达从而达到治疗缺血再灌注后心律失常的目的,具有用于制备治疗缺血再灌注后心律失常药物的潜力。
2、本发明能简易高效的制备一种高效低毒的治疗缺血再灌注后心律失常的具有生物活性的细胞囊泡,具有潜在的医用前景。
3、本发明提取的M2型巨噬细胞外泌体在心血管疾病金针过程中具有重要的作用,它是一种直径为30-150nm的微小囊泡,其中富含大量的miRNA、mRNA、蛋白质、胆固醇等多种物质,它是细胞间通讯交流和物质交流的重要载体,可以将富含生物信息的物质运送到靶细胞,从而调控细胞功能及代谢,进一步影响疾病进程。
4、本发明中的M2型巨噬细胞外泌体能够抑制炎症的发生,外泌体比较稳定,且安全性高,易保存,可以调节多个靶基因表达,相较于其他的外源性药物载体,外泌体具有更低的免疫原性,并能够靶向作用于病变细胞,本发明中的M2型巨噬细胞外泌体不仅可以持续改善细胞环境,而且可以直接进入到细胞,直接修复损伤心肌组织。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中M2型外泌体的形态特征;
其中,图A和图B均为在透射电镜下拍摄外泌体的形态;
图C为利用Western blot技术对外泌体的特征蛋白进行表征。
图2为本发明中心肌注射M2型巨噬细胞来源外泌体后处于不同时间的小鼠活体呈像;
其中,第一行左图为心肌注射M2型巨噬细胞来源外泌体6h时的活体呈像,第一行右图为心肌注射M2型巨噬细胞来源外泌体24h时的活体呈像;
第二行左图为心肌注射M2型巨噬细胞来源外泌体36h时的活体呈像,第二行右图为心肌注射M2型巨噬细胞来源外泌体48时的活体呈像。
图3为本发明中小鼠心肌缺血再灌注后心肌注射M2型外泌体后,小鼠心电图变化情况;
其中,图A为正常缺血再灌注小鼠再灌注后心电图变化情况;
图B为心肌注射M1-Exo再灌注后小鼠心电图变化情况;
图C为肌注射M2-Exo再灌注后小鼠心电图变化情况;
图D不同组别小鼠发生传导阻滞频率统计图。
图4为本发明中注射M2型巨噬细胞外泌体后和未注射外泌体的小鼠心功能变化情况;
其中,图A为小鼠心肌注射M2型巨噬细胞外泌体1天后小鼠超声心动图;
图B为小鼠心肌注射M2型巨噬细胞外泌体3天后小鼠超声心动图;
图C为小鼠射血分数变化情况;
图D为小鼠左心室短轴缩短率变化情况。
图5为本发明中注射M2型巨噬细胞外泌体后和未注射外泌体的小鼠心脏蛋白表达TRPV1的情况;
其中,图A为注射了M1-Exo和M2-Exo的心肌组织中TRPV1的蛋白表达量;
图B为对注射了M1-Exo和M2-Exo的心肌组织中TRPV1的蛋白表达量的统计。
图6为本发明中M1、M2型巨噬细胞外泌体内长链非编码RNA Morrbid的含量。
图7为本发明中膜片钳检测乳鼠心肌细胞动作电位的变化情况;
其中,图A为动作电位复极化90%的时程;
图B为动作电位复极化50%的时程;
图C为动作电位复极化10%的时程。
图8为本发明中心肌细胞上线粒体内TRPV1表达情况;
其中,图A为线粒体特异性荧光探针;
图B为TRPV1特异性荧光探针;
图C为细胞核特异性荧光探针;
图D为图A、图B和图C的合并图。
图9为本发明中正常心肌细胞、缺氧复氧后的心肌细胞和心肌细胞与M2型巨噬细胞外泌体共培养缺氧复氧后心肌细胞线粒体钙离子表达情况;
其中,图A是常氧条件下心肌细胞内钙离子的表达;
图B是缺氧复氧后心肌细胞内钙离子的表达;
图C是心肌细胞与M2-Exo共同孵育再缺氧复氧后心肌细胞内钙离子的表达。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。本发明实施举例所用到的材料、试剂及方法,如无特殊说明,均为常规操作及商业购买可得。
实施例1
一、实验方法
1、M2型巨噬细胞外泌体的提取与鉴定
为制备M2巨噬细胞来源的外泌体(M2 Exo),将RAW264.7细胞(2.0×106个/孔)在无血清条件下用100ng/mL白细胞介素-4刺激24h。具体地,用100ng/mL白细胞介素-4为获得巨噬细胞来源的外泌体,接种RAW264.7细胞(2.0×106个/孔),使其70-80%融合,然后在无血清培养基中孵育24h,收集培养基,用新鲜的无血清培养基代替。将培养物再孵育24h,然后再次收集培养基。将收集的两体积的培养基混合在一起,用梯度离心法分离外泌体。首先,将培养基以2000g离心10min,然后以10000g离心30min以去除细胞碎片。然后,用超滤管(MWCO=10,000)将上清液以2000g时浓缩8min至原始体积的约30%。最后,将上清液在超速离心机中120,000g离心70min。沉淀用冷PBS洗涤,120,000g离心70min以确保最大的外泌体纯度。所有的离心程序均在4℃下进行。将颗粒重新悬浮在PBS中,并储存于-80℃。用Bradford法测定外泌体的数量。
使用透射电子显微镜观察M2型巨噬细胞外泌体的形态。分离后,将M2型巨噬细胞外泌体外泌体的10μL稀释到过滤后的PBS中,分别用NanoSight NS300测定其大小分布。
2、利用小动物活体成像技术观察外泌体在心脏内停留的时间
利用pKH67膜染料对M2型巨噬细胞外泌体进行标记;采用三点注射法将PKH67标记的M2型外泌体打入小鼠心脏内,分别在6h、24h、48h进行小动物活体呈像并进行拍照。
3、小鼠心电图监测
小鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉。进一步对小鼠开胸,采用无损伤缝合方法阻断左冠状动脉前降支血管,诱导缺血。30min后,松开缝合,使血管通畅,再灌注过程持续120min。分别于缺血前30min(T0)、缺血结束再灌注开始时(T1)、再灌流中期(T2)、再灌流结束时(T3)记录不同时间点的心电图。根据记录的心电图计算心率(HR)、PR间期、心率压乘积(RPP)和平均动脉压(MAP)。记录QRS间期、室性心律失常、QRS间期时间及室性心律失常。室性心律失常以室性心动过速(VT)和室颤(VF)计算。根据室速和室颤的累积持续时间,对心律失常评分进行分级。
4、经胸超声心动图检测小鼠心功能
在基线和再灌注后24h和3天,使用12MHz探头进行经胸超声心动图检查。测量左胸骨旁图像的左心室射血分数(EF)和短轴缩短率(FS),以评价心功能。
5、Western blot检测小鼠心脏中TRPV1的表达情况
将再灌注3天后的小鼠心脏摘除提取心脏蛋白,利用BCA法测定蛋白浓度,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离,转模,TRPV-1(1:1000),抗体4℃孵育过夜,TBST漂洗3次,每次5min;二抗稀释后室温孵育30min,TBST漂洗3次,每次5min。以β-actin为内参,ECL试剂盒显影成像,采用Image J软件测定条带灰度值,通过比较目标条带TRPV-1灰度值比值来分析心脏摄取M2 Exo和M1 Exo后TRPV-1的水平。
6、q-pcrM2型外泌体中Morrbid的表达含量
将再灌注3天后的小鼠心脏摘除提取心脏RNA,利用q-pcr技术检测M2Exo和M1 Exo中Morrbid的含量。
7、膜片钳检测乳鼠心肌细胞动作电位的变化情况
所有实验均在35℃至37℃下进行。所有细胞在进行膜片钳实验前缺氧24小时。如前所述,使用全细胞配置对细胞进行膜片钳固定。在动作电位记录中,用吸管溶液充满膜片吸管(阻力2~3MΩ),每单位吸管溶液含天冬氨酸110K,30KCl,5NaCl,0.1EGTA,10HEPES,5mg ATP,5mg ATP,5mg磷酸肌酸,0.05cAMP,KOH调节pH至7.2。在吸管溶液中加入0.5%的荧光黄,以指示通过缝隙连接相互连接的细胞。在细胞膜破裂后1min、3min和20min打开荧光快门几秒钟,以尽量减少光毒性。在镀液中加入静息膜(RMPs)。
记录动作电位:动作电位以2ms的持续时间和2倍的舒张期阈值电流脉冲以1Hz的频率被激发。记录动作电位后,小心移除移液管,荧光黄色逐渐褪色。为了标记精确的膜片钳细胞,盖片上刻有一个玻璃标记钻石。连续刺激,记录至少10-20个动作电位,在Clampfit软件中分析静息电位、动作电位幅度、最大除极速率,以及动作电位10%、50%、90%复极化时程(APD10、APD50、APD90)。
8、免疫荧光共定位检测心肌细胞线粒体上TRPV1的表达
将MitoTracker Red与心肌细胞共同孵育30min标记心肌细胞线粒体;再将标记好线粒体的心肌细胞用4%多聚甲醛固定30min;接着用0.3%的TritonX100打孔15min;用10%BSA封闭1h;加入TRPV1(1:1000)一抗4℃过夜孵育;加入PBST中洗3次/10min;荧光二抗室温孵育1h,进行免疫荧光拍照。
9、免疫荧光技术检测心肌细胞线粒体钙离子变化情况
心肌细胞中加入M2型巨噬细胞来源的外泌体后,在37℃、95% N2和5%CO2的厌氧室中培养,30min后移入常氧培养箱中培养30min,H/R模型的心肌细胞,用Rhod2 AM共同孵育30min,用激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体内钙离子变化情况。
二、实验结果
1、M2型巨噬细胞外泌体的提取与鉴定
结果如图1所示,利用差速离心法我们成功提取的M2型巨噬细胞外泌体,利用透射电镜观察到其直径大致均在40-100nm之间,且我们利用Western blot技术也成功检测到其表面存在外泌体特征蛋白的表达,利用BCA技术可以测得平均12个10cm皿的巨噬细胞可以提取2mg/ml的M2型巨噬细胞外泌体。
2、外泌体在心脏内停留的时间观察
如图2所示,M2型巨噬细胞外泌体可在心脏内停留48h。
3、小鼠心肌缺血再灌注后M2型外泌体后,小鼠心电图变化情况
结果图3所示,M2型巨噬细胞外泌体后小鼠再灌注后发生心律失常的频率明显下降,表明M2型巨噬细胞外泌体可以明显改善缺血再灌注后的心律失常。
4、M2型巨噬细胞外泌体对小鼠心功能的影响
结果如图4所示,心脏注射M2型巨噬细胞外泌体的小鼠在缺血再灌注后的第三天,小鼠心脏的射血分数和左心室短轴缩短率与第一天相比都得到了明显的恢复,表明M2型巨噬细胞外泌体可恢复受损的心功能
5、M2型巨噬细胞外泌体对小鼠心脏中TRPV1的表达的影响
结果如图5所示,M2型巨噬细胞外泌体与M1型巨噬细胞外泌体相比,M2型巨噬细胞外泌体能更多的激活小鼠心脏中TRPV1的表达
6、M2型巨噬细胞外泌体内长链非编码RNA Morrbid的检测
结果如图6所示,将再灌注3天后的小鼠心脏摘除提取心脏RNA,利用q-pcr技术检测M2 Exo和M1 Exo中Morrbid的含量,发现再灌注后小鼠心脏中的M2 Exo中Morrbid的含量显著高于M1 Exo中Morrbid的含量。
7、乳鼠心肌细胞动作电位的变化
结果如图7所示,M2型巨噬细胞外泌体明显缩短了由于缺氧复氧导致的乳鼠原代心肌细胞动作电位复极化时间延长
8、心肌细胞线粒体上TRPV1的表达
结果如图8所示,心肌细胞线粒体上存在TRPV1受体
9、M2型巨噬细胞来源的外泌体对心肌细胞线粒体钙离子的影响
结果如图9所示,与只进行缺氧复氧的心肌细胞相比,心肌细胞与M2型巨噬细胞外泌体共同孵育后再缺氧复氧,细胞内钙离子明显降低,结果表明M2型巨噬细胞可明显改善由于缺氧复氧导致的心肌细胞内钙离子超载的病理情况。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (5)
1.M2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤造成的心率失常的药物中的应用,其特征在于,所述M2型巨噬细胞外泌体提取过程为:用白细胞介素-4刺激RAW264.7细胞,利用无血清培养基孵育后收集培养基,然后通过梯度离心法分离外泌体。
2.根据权利要求1所述的M2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤造成的心率失常的药物中的应用,其特征在于,所述梯度离心法分离外泌体过程为:将收集的培养基以2000 g离心10 min,然后以10000 g离心30 min以去除细胞碎片,然后,将上清液以2000 g浓缩8 min至原始体积的30%,最后,将上清液120,000 g离心70 min,洗涤沉淀后获得M2型巨噬细胞外泌体。
3.根据权利要求2所述的M2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤造成的心率失常的药物中的应用,其特征在于,用冷PBS洗涤沉淀。
4.根据权利要求3所述的M2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤造成的心率失常的药物中的应用,其特征在于,无血清培养基孵育后收集培养基的过程为:无血清培养基中孵育24 h,收集培养基,用新鲜的无血清培养基代替,将培养物再孵育24 h,然后再次收集培养基,将收集的两体积的培养基混合在一起。
5.根据权利要求4所述的M2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤造成的心率失常的药物中的应用,其特征在于,所述白细胞介素-4质量浓度为100 ng/mL,所述RAW264.7细胞接种量为2.0×106个/孔。
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GR01 | Patent grant | ||
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