CN109701023A - 治疗冠状幼脉微栓塞致心肌损伤药物及动物模型构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医疗技术领域，公开了一种治疗冠状幼脉微栓塞致心肌损伤药物及动物模型构建方法，治疗冠状幼脉微栓塞致心肌损伤药物为miRNA‑26a‑5p抑制剂。本发明首次探讨CME致心肌损伤过程中miRNAs表达谱的变化；首次探讨HMGA1介导的免疫炎症反应在CME致心肌损伤中的作用及其相关分子机制；分析miRNAs介导CM E致心肌损伤的机制是CME防治崭新的角度和更深入的探讨，有可能揭示CME致心肌损伤新的机制，为未来选择理想的方法防治CME致心肌损伤具有重要现实意义。

Description

治疗冠状幼脉微栓塞致心肌损伤药物及动物模型构建方法

技术领域

本发明属于医疗技术领域，尤其涉及一种治疗冠状幼脉微栓塞致心肌损伤药物及动物模型构建方法。

背景技术

冠状动脉微栓塞(CoronaryMicroembolization，CME)是由冠状动脉粥样斑块自发破裂或经皮冠状动脉介入(Percutaneous Coronary Intervention，PCI)治疗过程中微小栓子造成的冠状动脉微循环栓塞和心肌微梗死，据报道，PCI围手术期冠状动脉微栓塞发生率为15-20％，在高危患者可高达30-45％。分析表明，CME导致术后即刻“无血流”或“慢血流”及微循环功能障碍包括冠脉储备减少、心肌收缩功能失调、心肌损伤，继而导致心肌缺血、心律失常以及心功能衰竭等结果，是远期预后不良和主要心血管不良事件发生的强烈预测因子。目前对于CME尚无证据充分的预防措施，一旦发生CME，采取冠脉内应用溶栓剂、硝酸甘油、钙离子拮抗剂或血小板GPIIb/IIIa受体抑制剂等补救措施均不能显著改善患者近、远期临床预后。因此，CME并发症一直是临床亟待解决的棘手难题并引起广泛关注。

关于CME致心肌损伤的机制，既往分析发现CME后冠脉血流短暂减少即可恢复正常，而局部心肌收缩能力却进行性降低。进一步分析显示CME常伴有心肌炎症反应，表现为微梗死灶周围有明显白细胞和单核/巨噬细胞浸润，而CME所致坏死心肌细胞仅占少数，冠脉血流的短暂减少亦相对次要，在应用糖皮质激素干预后，局部炎症反应及炎症因子水平明显减少，心功能亦有所改善，说明CME所致心肌损伤与心外膜冠脉血流量的减少及少量心肌细胞坏死并无明显关系，而与局部炎症反应密切相关。

大量分析发现，CME所致心功能不全的发生机制与肿瘤坏死因子α(Tumornecrosis factor-α,TNF-α)介导的炎症反应密切相关。在直径25um的微球造成的CME模型中，缺血心肌组织TNF-α表达显著升高，并主要位于白细胞浸润灶及微梗死灶周边；在应用糖皮质激素抗炎后，TNF-α表达水平明显下调，心功能亦有所提高。Dorge等在犬的冠状动脉内注射微栓塞球前，分别给予TNF-α及其抗体干预，结果发现TNF-α能加剧微栓子所致心肌收缩功能障碍，而抗TNF-α抗体则能一定程度增强心肌细胞对微血管栓塞的耐受程度；另外在无CME时使用TNF-α亦可导致心肌损伤，说明TNF-α是冠脉微血管栓塞过程中，心肌收缩功能障碍发生的重要炎症介质。上述分析表明，炎症因子及其诱导的炎症反应是CME致心肌损伤的重要原因之一；而以TNF-α为首的炎症因子在CME致心肌损伤中起关键作用。作为一种炎症反应调节因子，核因子-κB(nuclear facotr-κappa B，NF-κB)激活是急性炎症发生发展的最早始动环节之一。分析发现许多与炎症相关的蛋白如TNF-α、IL-1、IL-6、ICAM-1等细胞因子的基因都含有NF-κB的结合位点，当NF-κB受内外源性刺激由细胞浆向细胞核转移并活化后，即与上述炎症因子的基因相结合，从而启动转录与表达，使TNF-α、IL-1β等促炎因子及粘附因子、趋化因子和生物活性酶等炎性介质产生过多，导致炎症反应的放大乃至失控的炎症反应造成组织损伤和结构破坏。Li等分析发现，NF-κB的广泛活化及由此引起的TNF-α等炎性介质的大量释放在CME所致进行性心功能不全及晚期心力衰竭发生中起重要作用，而在应用NF-κB特异性抑制剂PDTC抑制其活性后，CME所致心肌局部炎症反应明显减弱并可显著改善心功能。因此，NF-κB信号通路的激活，进而引起各类炎性介质的大量释放在CME致心肌损伤中起关键作用，然而其具体的基因调控和分子机制尚不清楚，有待进一步深入分析。

微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)是一类内源性非编码小分子RNA，通过与靶mRNA 3'非编码区(3'UTR)完全或不完全互补结合，抑制mRNA翻译或促进mRNA降解进行转录后调节，在细胞生长发育、分化及凋亡等过程中起重要调控作用。近年来miRNA在心血管生理和病理过程中的作用也得到广泛的分析，其中一些miRNA特异表达于心血管系统，在心血管免疫炎症性疾病中起重要作用。氧化低密度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein，oxLDL)在巨噬细胞中的聚集是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的一个重要病理过程。Yang等发现，给予oxLDL后巨噬细胞中miR-146a水平下降，miRNA-146a显著降低巨噬细胞中LDL、IL-6、IL-8和MMP-9的表达，过表达的miRNA-146a通过负反馈调控Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)信号通路抑制AS的形成，表明miRNA-146a参与AS的发生发展。Chen等分析发现，不稳定型心绞痛患者循环血CD4+T淋巴细胞差异表达miRNA-155，并可能通过调控IFN-γRα表达影响CD4+T淋巴细胞亚群的分化和功能，过表达miRNA-155可以促进Th1细胞的分化及其主要分泌的细胞因子IFN-γ的表达，促使斑块易于破裂。此外，前期分析发现，促使心肌组织过表达miRNA-21，可以有效减少CME后的心肌损伤，其效应机制可能是通过抑制PDCD4/NF-κB/TNF-α信号通路，进而减少CME所致心肌炎症发挥作用。然而，miRNAs在CME致心肌损伤中的表达及其相关作用机制却远未阐明。

针对上述问题，在前阶段的实验(详见“分析基础与工作条件”中的实验结果部分)中已通过基因芯片技术从大鼠CME模型中筛选出心肌组织差异表达的miRNAs，如miRNA-26a-5p表达水平较假手术组呈现明显下调；此外，亦发现经体内转染miRNA-26a-5p预处理后，大鼠心功能较单纯CME组有明显改善，表明miRNA-26a-5p可能在CME致心功能损伤中起关键作用；进一步利用生物信息学方法分析预测，结果提示高迁移率族蛋白A1(HMGA1)为miRNA-26a-5p潜在的靶基因，通过基因表达谱芯片技术得知大鼠CME模型HMGA1表达上调，由此，推测miRNA-26a-5p可能通过靶向作用于HMGA1介导的信号转导通路，在CME致心肌损伤中发挥重要作用。

高迁移率族蛋白(The high mobility group，HMG)由Goodwin等于1973年首次在牛胸腺细胞中发现，它是细胞核内一类水溶性强、在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈现高迁移率的小分子蛋白质。它可以参与多种细胞的基本分化过程，包括转录调控、胚胎形成、转化、细胞周期调控、分化、凋亡、炎症、病毒整合和DNA修复。

HMG蛋白被分为三种亚型，即HMGA，HMGB和HMGN，以前分别叫做HMGI/Y，HMG1/2，和HMG14/17。HMGA分为HMGA1和HMGA2两个亚型，染色体图分析定位HMGA1基因在人类6号染色体短臂(6p21)，人的HMGA1基因包括8个外显子，分布区域大概在10kb，HMGA1调节有助于增殖，分化，抗原提呈，募集炎性细胞，以及产生细胞因子和炎症介质。分析表明，HMGA1可调节多种参与炎症反应的基因从而引起组织损伤，包括诱生型一氧化氮合成酶、环氧合酶-2、IL-4、IL-2和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等。HMGA1主要是通过增强NF-κB的转录活性而诱导这些基因表达。在预实验中发现，CME后HMGA1的表达水平要较假手术组的明显升高(详见“分析基础与工作条件”中的实验结果部分)。由此，猜测HMGA1/NF-κB信号通路参与了CME所导致的心肌损伤。

HMGA1在201年首次被Li等发现为miRNA-26a-5p潜在的靶基因，并在二甲双胍抗胰腺肿瘤的实验中得以证实。随后大量分析发现，miRNA-26a-5p可以负性调控HMGA1及其介导的信号通路在肿瘤的发生发展中起着重要地作用。近年来分析发现，miRNA-26a-5p在多种心血管疾病中差异表达，在心肌缺血、心室重构中扮演着重要的角色。Fang等结扎大鼠冠状动脉左前降支后发现，缺血心肌miRNA-26a表达下调；Reddy等通过TAC和肺动脉缩窄分别建立左、右心室肥厚的小鼠模型。结果发现，与正常心室类似，肥厚心室表达最多的miRNA是miRNA-1、miRNA-133和let-7家族成员，但miRNA-21在肥厚的右心室表达较多，miRNA-26a则在肥厚的左心室表达较多。Liu等在腹主动脉缩窄术构建的心肌肥大大鼠模型中发现，过表达miRNA-26a可以通过抑制GATA4表达，拮抗心室肥厚。此外，Harada等发现miRNA-26a可通过下调TRPC3蛋白的表达进而调节心脏成纤维细胞的增殖和分化最终抑制心肌纤维化的发生。前期分析中已在基因芯片筛选的基础上，利用实时荧光定量PCR证实CME大鼠心肌组织中具有明显差异表达的miRNA-26a-5p；预实验中发现CME后HMGA1的表达水平要较假手术组的明显升高，由此，推测miRNA-26a-5p可能通过靶向作用于HMGA1/NF-κB信号通路，在CME致心肌损伤中发挥重要作用。

基于以上假说，本分析拟通过合成miRNA-26a-5p模拟物和抑制剂，在体外心肌细胞中确证miRNA-26a-5p与HMGA1基因的靶向关系；同时建立冠状动脉微栓塞大鼠的动物模型，通过大鼠尾静脉注射miRNA-26a-5p激动剂，检测CME后HMGA1/NF-κB信号转导通路中的关键分子如HMGA1、NF-κB及TNF-α、特征分子等评价该信号转导通路的激活情况，以深入阐明miRNA-26a-5p介导的HMGA1/NF-κB信号通路在CME致心肌损伤中的效应机制，为未来CME防治提供重要理论依据。

综上所述，现有技术存在的问题是：

现有技术中，没有对CME致心肌损伤过程中miRNAs表达谱的变化进行展现；不能明确HMGA1介导的免疫炎症反应在CME致心肌损伤中的作用及其相关分子机制；不能揭示CME致心肌损伤新的机制，造成不能为未来选择理想的方法防治CME致心肌损伤提供依据。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种治疗冠状幼脉微栓塞致心肌损伤药物及动物模型构建方法。

本发明是这样实现的，一种治疗冠状幼脉微栓塞致心肌损伤药物，所述治疗冠状幼脉微栓塞致心肌损伤药物为miRNA-26a-5p抑制剂。

本发明新的另一目的在于提供一种验证所述治疗冠状幼脉微栓塞致心肌损伤药物的动物模型构建方法，所述动物模型构建方法包括：

步骤一，采用SD大鼠，以45μm微栓子制备CME动物模型；

步骤二，实验分组：分为假手术组和CME组；

步骤三，CME大鼠心肌组织差异表达miRNAs的筛选；

采用miRNA基因芯片筛选出CME大鼠心肌组织miRNA表达谱，实时荧光定量聚合酶链式反应(Real Time PCR)对差异表达的miRNAs进行进一步验证；筛选出CME大鼠与假手术组心肌组织多种差异表达的miRNAs；

步骤四，差异表达miRNA靶基因的验证：利用miRanda、MicroCosm Targets、miRDB综合预测差异表达miRNA-26a-5p的靶基因，通过生物信息学数据库对比预测HMGA1为潜在靶基因；利用合成的miRNA-26a-5p的抑制剂体外培养乳鼠心肌细胞；用脂质体Lipofectamine RNAiMAX转染miRNA-26a-5p mimic、miRNA-26a-5p inhibitor和negativecontrol进入乳鼠心肌细胞，分别用Real Time PCR和Westernblot检测miRNA-6a-5p、HMGA1的表达变化；

构建HMGA1的荧光素酶报告基因载体，293T细胞同时转染miRNA-26a-5p mimic、miRNA-26a-5p inhibitor、negative control和HMGA1的报告基因载体，双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶的表达变化；

步骤五，HMGA1/NF-κB/TNF-α信号转导通路在CME致心肌损伤中的作用测定；

步骤六，进行miRNA-26a-5p在CME致心肌损伤中的作用分子机制测定。

进一步，步骤三具体包括：

CME模型建立8周龄成年SD大鼠雌雄不拘，体重250～300g，经尾静脉丙泊酚泵入麻醉，经口气管插管，连接呼吸机，于无菌手术台行后续操作；经左心室注射含45μm规格聚苯乙烯微球4000u的生理盐水悬浮液100μl，同时夹闭升主动脉20个心动周期；松开夹闭，关胸，逐层缝合，经尾静脉给予10000u青霉素预防感染，全程记录胸导联心电图；待大鼠自主呼吸恢复并麻醉苏醒后拔出气管导管，放回清洁饲养处；假手术组注入等量生理盐水；

miRNAs基因测序Trizol法提取总RNA，测定样品总RNA纯度和浓度；在每个样品总RNA的5'和3'添加RNA接头后，进行cDNA合成和扩增；从PAGE胶上提取并纯化PCR扩增片段，簇生成后进行测序；获取经过质控的测序片段，去接头，使用miRDeep2对全部去接头片段进行新miRNA预测，比对去接头且长度>＝15nt的片段到miRBase+新预测的pre-miRNA数据库上，以miRNA的tpm(tagpermillion)进行miRNA表达量标准化，进行样品间比较，获得差异表达miRNAs，并进行差异miRNAs的靶基因预测及靶基因的GO和Pathway分析；差异表达miRNA的验证RealTimePCR对差异表达的miRNAs进行进一步验证。

进一步，步骤四具体包括：全基因表达谱芯片筛查Trizol法提取总RNA，使用NanoDropND1000测定样品总RNA纯度和浓度；使用AgilentQuickAmpLabeling试剂盒对样品进行标记，使用AgilentSureHyb进行杂交实验；芯片经过洗涤后，进行扫描，采集芯片探针信号道，芯片标准化；挑选差异表达基因，差异表达基因的GO和Pathway功能分析；

分离培养大鼠心肌细胞取出生1～3d的SD大鼠乳鼠，处死后剪取心室，去心包，PBS清洗；将组织剪碎至体积1mm3左右的颗粒，加入5ml胶原酶II，于37℃轻轻吹打多次消化，收集上清液于10％FBS的DMEM完全培养基中终止消化。细胞筛过滤，离心弃上清，加入含10％FBS的DMEM完全培养基吹打混匀制成悬液，接种于培养瓶中，37℃、5％CO₂培养箱箱中培养1.5h差速贴壁去成纤维细胞，将细胞悬浮液接种于新培养瓶或孔板，加入补充培养液并按1μl/ml加入浓度100μmol/L的Brdu后每24h换培养液；

寡核苷酸序列设计与合成大鼠miRNA-26a-5p的抑制剂采用miRNA-26a-5p成熟体的反向互补序列；双链RNA的负对照为与哺乳动物基因组没有同源性的序列；

载体构建HMGA13'UTR报告基因载体pGL3-HMGA1-3'UTR-WT携带野生型的3'UTR，pGL3-HMGA1-3'UTR-Mut携带突变miRNA-26a-5p识别元件的3'UTR；

细胞转染和报告基因活性检测将乳鼠心肌细胞分为miRNA-26a-5p模拟物转染组(miRNA-26a-5pmimic)、miRNA-26a-5p抑制剂组(miRNA-26a-5pinhibitor)和阴性对照组(negativecontrol)；转染48h、72h后分别用实时荧光定量PCR和Westernblot检测miRNA-26a-5p、HMGA1mRNA和蛋白的表达变化；在双荧光素酶报告基因系统的实验中，293T细胞同时转染miRNA-26a-5pmimic、miRNA-26a-5pinhibitor、negativecontrol和HMGA1的报告基因载体；

腺相关病毒载体的构建把外源基因克隆进包含ITR/MCS的载体中，重组表达质粒同pHelper和pAAV-RC共转染迚AAV-293细胞，转染2到3天后重组AAV在包装细胞中组装完成；收集细胞而后裂解释放AAV颗粒到上清中，浓缩并纯化病毒上清液，通过2次CsCl密度梯度离心和1次超滤去除细胞蛋白和残留的CsCl离子；定量PCR法测定所得病毒滴度。

进一步，步骤五中，分为假手术组、CME组、CME+HMGA1过表达腺相关病毒载体(HMGA1up)组、CME+siRNA腺相关病毒载体(HMGA1down)组和CME+空载腺相关病毒(HMGA1vector)组，每组8只，共40只；HMGA1up组、HMGA1down组和HMGA1vector组在CME造模前14d分别以1×1011TU配伍100μl生理盐水，以微量注射器经尾静脉注射；

各组建模后9h取外周血及心肌组织进行相关指标测定；取外周血血清测定CK-MB、肌钙蛋白I等心肌坏死标记物；心肌组织HE染色计数炎症细胞；HBFP染色与Masson染色检测心肌微梗死面积；免疫组化对HMGA1进行定位及半定量；Real Time PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、HMGA1表达水平；免疫印迹法检测HMGA1、TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-10；电泳迁移率变动分析(EMSA)测定NF-κB活性。

进一步，步骤六包括：

分为假手术组、CME组、HMGA1up组、HMGA1down组、HMGA1vector组和CME+Agomir-26a-5p(miRNA-26a-5p up)组，每组8只，共48只；

HMGA1up组、HMGA1down组和HMGA1vector组在CME造模前14d分别以1×1011TU配伍100μl生理盐水，以微量注射器经尾静脉注射；miRNA-26a-5p up组于CME造模前3d给予尾静脉注射Agomir-26a-5p，30mg/kg；

各组建模后9h取外周血及心肌组织进行相关指标测定；取外周血血清测定CK-MB、肌钙蛋白I等心肌坏死标记物；心肌组织HE染色计数炎症细胞；HBFP染色与Masson染色检测心肌微梗死面积；免疫组化对HMGA1进行定位及半定量；Real Time PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、HMGA1、miRNA-26a-5p等表达水平；Westernblot检测HMGA1、TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-10；EMSA测定NF-κB活性。

本发明的优点及积极效果为：

本发明首次探讨CME致心肌损伤过程中miRNAs表达谱的变化；首次探讨HMGA1介导的免疫炎症反应在CME致心肌损伤中的作用及其相关分子机制；分析miRNAs介导CME致心肌损伤的机制是CME防治崭新的角度和更深入的探讨，有可能揭示CME致心肌损伤新的机制，为未来选择理想的方法防治CME致心肌损伤具有重要现实意义。

附图说明

图1是本发明实施提供的动物模型构建方法流程图。

图2是本发明实施提供的CME大鼠心肌组织miRNAs表达谱分析图。

图3是本发明实施提供的差异表达miRNA-26a-5p靶基因验证图。

图4是本发明实施提供的HMGA1/NF-κB/TNF-α信号通路在CME致心肌损伤中的作用图。

图5是本发明实施提供的miRNA-26a-5p在CME致心肌损伤中的作用及其分子机制图。

图6是本发明实施提供的CME造模：A.CME模型制作；B.CME心脏；C.术前(上)，术后即刻(中)，术后9h(下)胸导心电图，可见微栓塞后心肌缺血，ST段压低，T波低平，随时间逐步向基线恢复，且未见病理性Q波，符合微栓塞心电图表现；D.HE染色可见微动脉内微球(×200)。

图7是本发明实施提供的荧光定量PCR检测TNF-αmRNA表达量的变化与假手术组相应时间点比较，^aP<0.05图。

图8是本发明实施提供的Westernblot检测TNF-α蛋白表达量的变化与假手术组相应时间点比较，^aP<0.05图。

图9是本发明实施提供的CME后9h心肌组织miRNA表达谱分析

图10是本发明实施提供的CME后差异表达的miRNA-26a-5p荧光定量PCR验证结果与假手术组比较，^aP<0.05图。

图11是本发明实施提供的经体内转染miRNA-26a-p预处理后心肌组织miRNA-26a-5p表达水平变化与单纯CME组比较，^aP<.05图。

图12是本发明实施提供的荧光定量PCR检测HMGA1mRNA表达量与假手术组比较，^aP<0.05图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术中，没有对CME致心肌损伤过程中miRNAs表达谱的变化进行展现；不能明确HMGA1介导的免疫炎症反应在CME致心肌损伤中的作用及其相关分子机制；不能揭示CME致心肌损伤新的机制，造成不能为未来选择理想的方法防治CME致心肌损伤提供依据。

为解决上述技术问题，下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。

本发明实施例提供的治疗冠状幼脉微栓塞致心肌损伤药物为miRNA-26a-5p抑制剂。

如图1所示，本发明实施例提供的动物模型构建方法包括：

S101，采用SD大鼠，以45μm微栓子制备CME动物模型。

S102，实验分组；选择CME后9h为观察时间点，分为假手术组和CME组。

S103，CME大鼠心肌组织差异表达miRNAs的筛选。采用miRNA基因芯片筛选出CME大鼠心肌组织miRNA表达谱，实时荧光定量聚合酶链式反应(Real Time PCR)对差异表达的miRNAs进行进一步验证。目前该工作已经完成，已筛选出CME大鼠与假手术组心肌组织多种差异表达的miRNAs，如表达显著下调的miRNA-26a-5p。本项目拟对miRNA-26a-5p的功能及其在CME致心肌损伤中的作用及相关分子机制进行进一步分析。

S104，差异表达miRNA靶基因的验证:利用miRanda、MicroCosm Targets、miRDB等软件综合预测差异表达miRNA-26a-5p的靶基因，通过生物信息学数据库对比预测HMGA1为其潜在靶基因。因此，在体外培养乳鼠心肌细胞中，采用化学合成miRNA-26a-5p的模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)。用脂质体Lipofectamine RNAiMAX转染miRNA-26a-5pmimic、miRNA-26a-5p inhibitor和negative control进入乳鼠心肌细胞，分别用RealTime PCR和Westernblot检测miRNA-6a-5p、HMGA1的表达变化.

此外，构建HMGA1的荧光素酶报告基因载体，293T细胞同时转染miRNA-26a-5pmimic、miRNA-26a-5p inhibitor、negative control和HMGA1的报告基因载体(WT野生型或Mut突变体)，双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶的表达变化.

S105，HMGA1/NF-κB/TNF-α信号转导通路在CME致心肌损伤中的作用测定；实验分为假手术组、CME组、CME+HMGA1过表达腺相关病毒载体(HMGA1up)组、CME+siRNA腺相关病毒载体(HMGA1down)组和CME+空载腺相关病毒(HMGA1vector)组，每组8只，共40只。HMGA1up组、HMGA1down组和HMGA1vector组在CME造模前14d分别以1×1011TU配伍100μl生理盐水，以微量注射器经尾静脉注射.

各组建模后9h取外周血及心肌组织进行相关指标测定。取外周血血清测定CK-MB、肌钙蛋白I等心肌坏死标记物；心肌组织HE染色计数炎症细胞；HBFP染色与Masson染色检测心肌微梗死面积；免疫组化对HMGA1进行定位及半定量；Real Time PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、HMGA1等表达水平；免疫印迹法(Western blot)检测HMGA1、TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-10；电泳迁移率变动分析(EMSA)测定NF-κB活性。

S106，miRNA-26a-5p在CME致心肌损伤中的作用及其分子机制测定。

下面结合具体分析对本发明作进一步描述。

在本发明实施例中，本发明提供的miRNA-26a-5p在CME致心肌损伤中的作用及其分子机制测定方法如下：

首先，实验分为假手术组、CME组、HMGA1up组、HMGA1down组、HMGA1vector组和CME+Agomir-26a-5p(miRNA-26a-5p up)组，每组8只，共48只；

然后，HMGA1up组、HMGA1down组和HMGA1vector组在CME造模前14d分别以1×1011TU配伍100μl生理盐水，以微量注射器经尾静脉注射；miRNA-26a-5p up组于CME造模前3d给予尾静脉注射Agomir-26a-5p，30mg/kg；

最后，各组建模后9h取外周血及心肌组织进行相关指标测定；取外周血血清测定CK-MB、肌钙蛋白I等心肌坏死标记物；心肌组织HE染色计数炎症细胞；HBFP染色与Masson染色检测心肌微梗死面积；免疫组化对HMGA1进行定位及半定量；Real Time PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、HMGA1、miRNA-26a-5p等表达水平；Westernblot检测HMGA1、TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-10；EMSA测定NF-κB活性。

在本发明实施例中，本发明提供的实验设备包括：

本项目基础分析部分全部在广西心血管分析所实验室完成，实验室具有实验所需全部仪器：高速组织捣碎机、低温高速离心机、实时荧光定量PCR仪、水平电泳槽、免疫印迹设备(Bio-Rad)、电子精密天平、气浴恒温振荡器、超低温冰箱、电泳仪及电泳槽、紫外可见光光度仪、荧光显微镜、DSA血管造影仪、手提式压力蒸汽灭菌器、PH计、微量移液器、手提式紫外分析仪、细胞培养相关设备、多导生理仪等相关实验设备；

广西心血管病分析所实验室位于广西医学科学实验中心内，为其重要分部，该实验中心是广西省级实验中心和广西“十五”期间重点建设实验室之一，有12个重点学科实验室，3个分析中心，1个分析所，1个临床博士后流动站，有8000平方米的实验空间和5000万元的实验设备，各子实验室设备和广西心血管分析所实验室自由共享，可充分满足本项目所需要的实验条件；

生化分析和分子生物学检测：具备高速组织捣碎机、低温高速离心机、免疫印迹设备(BioRad)、实时荧光定量PCR、超低温冰箱、酶标仪、16导生理记录仪等。

下面结合技术路线对本发明作进一步描述。

本发明实施例提供的动物模型构建方法包括：

CME大鼠心肌组织miRNAs表达谱分析，如图2。

差异表达miRNA-26a-5p靶基因验证，如图3。

HMGA1/NF-κB/TNF-α信号通路在CME致心肌损伤中的作用，如图4。

miRNA-26a-5p在CME致心肌损伤中的作用及其分子机制，如图5。

具体包括：

①CME模型建立8周龄成年SD大鼠雌雄不拘，体重250～300g，经尾静脉丙泊酚泵入麻醉，经口气管插管，连接呼吸机，于无菌手术台行后续操作。沿胸骨左缘3、4肋间钝性分离软组织，撑开肋骨，剥离心包。经左心室注射含45μm规格聚苯乙烯微球4000u的生理盐水悬浮液100μl，同时夹闭升主动脉20个心动周期(约10s)。松开夹闭，关胸，逐层缝合，经尾静脉给予10000u青霉素预防感染，全程记录胸导联心电图。待大鼠自主呼吸恢复并麻醉苏醒后拔出气管导管，放回清洁饲养处；假手术组注入等量生理盐水，其他操作同CME造模。

②miRNAs基因测序Trizol法提取总RNA，测定样品总RNA纯度和浓度。在每个样品总RNA的5'和3'添加RNA接头后，进行cDNA合成和扩增。随后从PAGE胶上提取并纯化PCR扩增片段，簇生成后进行测序。获取经过质控的测序片段，去接头，使用miRDeep2对全部去接头片段进行新miRNA预测，比对去接头且长度>＝15nt的片段到miRBase+新预测的pre-miRNA数据库上，以miRNA的tpm(tagpermillion)进行miRNA表达量标准化，进行样品间比较，获得差异表达miRNAs，并进行差异miRNAs的靶基因预测及靶基因的GO和Pathway分析。差异表达miRNA的验证RealTimePCR对差异表达的miRNAs进行进一步验证。

③全基因表达谱芯片筛查Trizol法提取总RNA，使用NanoDropND1000测定样品总RNA纯度和浓度。使用AgilentQuickAmpLabeling试剂盒对样品进行标记，使用AgilentSureHyb进行杂交实验。芯片经过洗涤后，使用AgilentDNAMicroarrayScanner扫描。使用AgilentFeatureExtraction软件(v11.0.0.1)采集芯片探针信号道。使用AgilentGeneSpringGXv12.1软件进行芯片标准化。使用AgilentGeneSpringGXv12.1软件挑选差异表达基因。并使用康成生物编写的脚本进行差异表达基因的GO和Pathway功能分析。

④分离培养大鼠心肌细胞取出生1～3d的SD大鼠乳鼠，处死后剪取心室，去心包，PBS清洗。将组织剪碎至体积1mm3左右的颗粒，加入5ml胶原酶II，于37℃轻轻吹打多次消化，收集上清液于10％FBS的DMEM完全培养基中终止消化。细胞筛过滤，离心弃上清，加入含10％FBS的DMEM完全培养基吹打混匀制成悬液，接种于培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱箱中培养1.5h差速贴壁去成纤维细胞，将细胞悬浮液接种于新培养瓶或孔板，加入补充培养液并按1μl/ml加入浓度100μmol/L的Brdu后每24h换培养液。

⑤寡核苷酸序列设计与合成大鼠miRNA-26a-5p的模拟物(mimic)根据其成熟体序列合成，miRNA-26a-5p的抑制剂(inhibitor)则采用miRNA-26a-5p成熟体的反向互补序列。双链RNA的负对照(negativecontrol)为与哺乳动物基因组没有同源性的序列。

⑥载体构建HMGA13'UTR报告基因载体pGL3-HMGA1-3'UTR-WT携带野生型(wildtype，WT)的3'UTR，而pGL3-HMGA1-3'UTR-Mut则携带突变了miRNA-26a-5p识别元件的3'UTR(突变体，mutant，Mut)。野生型插入片段的模板是大鼠HMGA1基因3'UTR。突变型插入片段的模板是以野生型载体为基础，在PCR扩增使用的引物上引入突变位点产生。

⑦细胞转染和报告基因活性检测将乳鼠心肌细胞分为miRNA-26a-5p模拟物转染组(miRNA-26a-5pmimic)、miRNA-26a-5p抑制剂组(miRNA-26a-5pinhibitor)和阴性对照组(negativecontrol)。转染48h、72h后分别用实时荧光定量PCR和Westernblot检测miRNA-26a-5p、HMGA1mRNA和蛋白的表达变化。在双荧光素酶报告基因系统的实验中，293T细胞同时转染miRNA-26a-5pmimic、miRNA-26a-5pinhibitor、negativecontrol和HMGA1的报告基因载体(WT野生型或Mut突变体)。报告基因活性检测按说明书操作，用化学发光法检测。

⑧腺相关病毒载体的构建把外源基因克隆进包含ITR/MCS的载体中，重组表达质粒同pHelper(携带腺病毒来源的基因)和pAAV-RC(携带AAV复制和衣壳基因)共转染迚AAV-293细胞，转染2到3天后重组AAV在包装细胞中组装完成。收集细胞而后裂解释放AAV颗粒到上清中，浓缩并纯化病毒上清液，通过2次CsCl密度梯度离心和1次超滤可以去除绝大部分的细胞蛋白和残留的CsCl离子。定量PCR法测定所得病毒滴度。

⑨HMGA1-siRNA的设计和合成由广州市锐博生物科技有限公司设计并合成。

⑩大鼠体内转染固定大鼠，用75％酒精对大鼠尾静脉进行消毒。

病毒注射进针部位通常选择尾巴的中下段，保持注射面水平，针头进入血管后会有突破感，阻力较小，推注速度保持在0.05～0.10ml/秒，注射结束后退针。

超声心动图评估心功能采用Philipssonos7500型超声心动图仪。探头频率10MHz。大鼠经腹腔1％戊巴比妥注射液150μL麻醉后，仰卧于检测台。探头置于大鼠左胸前壁，分别取胸骨旁左室长轴及心尖四腔心和两腔心切面行M型和二维超声检测，所有测量值均取三个心动周期的平均值。测量指标：左室舒张末期容量(EDV)、收缩末期容量(ESV)、左室舒张期末径(LVEDd)、左室收缩期末径(LVEDs)和心排血量(CO)。计算指标：左室射血分数(LVEF)＝(EDV-ESV)/EDV×100％、左室短轴缩短率(LVFS)＝(LVEDd-LVEDs)/LVEDd×100％。所有超声心动图检查均由具有丰富超声心动图检查检验经验的专科医生完成。

心脏组织取材将大鼠经尾静脉泵入丙泊酚麻醉，接入呼吸机，沿原开胸入路再次开胸，自升主动脉根部剪取完整心脏，置于冰生理盐水清洗残血并去除心房及心周组织。将心脏沿长轴分成4个厚片，经液氮速冻后装入冻存管-80℃冻存待用。

心肌微梗死面积测定心肌组织HBFP染色：取近心室前壁心肌石蜡标本，沿心室长轴行连续切片，明矾－苏木素染色，冲洗后碱性复红染色，双蒸水清洗，纯丙酮清洗；0.1％苦味酸纯丙酮液迅速分化,纯丙酮快速脱水，二甲苯透明、中性树胶封片。缺血心肌、红细胞呈红染，正常心肌胞浆黄染、胞核蓝染。心肌组织Masson染色：取近心室前壁心肌石蜡切片，在3℃下用二甲苯脱蜡2次，用体积分数100％，95％，85％，75％乙醇逐级水化，然后水洗10min。用丽春红酸性品红液染色10min后用蒸馏水清洗。再用1％磷钼酸溶液染色2min，苯胺蓝或亮绿染色液染色5min后用蒸馏水清洗。无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。染色后正常心肌呈红色，微梗死区呈蓝色。DMR+Q550病理图像分析仪检查，每张HBFP或Masson染色切片随机选取5个视野(100倍)，使用LeicaQwin分析软件平面法测量梗死区域，并表示为总分析切片的面积百分比，取平均值。

HE染色与计数炎症细胞取经甲醛固定的标本石蜡包埋，沿左室长轴以4um厚度连续切片，每份标本随机取5个切片行HE染色，观察心肌组织出血、炎症细胞浸润及心肌损伤情况。用DMR+Q550病理图像分析仪及LeicaQwin分析软件(德国)对每张切片随机取5个视野(400倍，总面积约1mm2计数炎症细胞，该张切片的单位面积(1mm2)炎症细胞数等于5个视野炎症细胞数的总和。

免疫组织化学染色切片常规脱蜡入水，实验步骤严格按照试剂盒说明进行。阳性细胞的细胞浆成黄色或棕黄色。用DMR+Q550型病理图像分析系统分析每张图片，随机检测10个400倍视野，用LeicaQwin分析软件分析灰度值，同时记录平均值。

EMSA评价NF-κB活性：根据核蛋白抽提试剂盒说明提取心肌细胞核蛋白；制备生物素标记探针，核蛋白与探针室温下孵育20min后在6.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶图像分析系统分析吸光度值(A值)，反应NF-κB的活化程度。

RealTimePCR按照Trizol操作说明提取组织或细胞的总RNA，行1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA有无降解，且检测RNA浓度，根据说明书分别目的基因逆转录成cDNA。采用SYBRGreenⅠ荧光标记法检测PCR产物,根据说明书分别加入不同组分，总反应体系均为20ul。目的基因及内参U6引物由Primer5.0ViiA7Real-timePCRSystem(AppliedBiosystems)设计，按试剂盒说明设置反应体系及参数，每个样本均做复孔检测，同时每次反应均设置阴性孔。PCR产物经过测序检测。结果采用2-ΔΔCT法比较。

Western-blot收集标本，RIPA裂解液裂解标本，测定蛋白浓度，按50μg/ml蛋白含量配制上样蛋白样品。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭蛋白，依次孵育一抗、二抗，最后用底物发光法进行显色，胶片曝光。

心肌损伤标记物测定应用免疫化学发光法测定，该法为一种固相、双位点免疫化学发光测量法，固相为聚乙烯珠，包被有抗CK-MB/肌钙蛋白I的特异性单克隆抗体，与血中CK-MB/肌钙蛋白I结合后，再与碱性磷酸酶多克隆抗体形成夹心复合物，加入化学发光底物后，通过全自动免疫化学发光分析仪温控光度计测量光量子，应用Master'S曲线计算结果。肌钙蛋白I的测定范围为0-180ng/L，CK-MB的测定范围为0-500ng/ml。

下面结合效果对本发明作进一步描述。

本发明拟在位于广西医学科学实验中心内的心血管分析所实验室进行，实验室可完成本实验所需的动物培养、动物试验、细胞培养、WesternBlot、DNA测序、分子克隆、荧光定量PCR检测及基因克隆等分子生物学技术，实验中心具有先进的低温超高速离心机(Beckman)、动物专用DSA血管造影仪、凝胶成像分析系统、干胶仪、倒置荧光显微镜、流式细胞仪以及其他分子生物学基本设备。

下面结合大鼠CME模型制作(图6)对本发明的应用作进一步描述。

图6CME造模：A.CME模型制作；B.CME心脏；C.术前(上)，术后即刻(中)，术后9h(下)胸导心电图，可见微栓塞后心肌缺血，ST段压低，T波低平，随时间逐步向基线恢复，且未见病理性Q波，符合微栓塞心电图表现；D.HE染色可见微动脉内微球(×200)。

成功建立CME模型后，与假手术组相比，除0h外CME组各时间点TNF-α表达均显著升高，其中9h组TNF-α表达水平达高峰(图7,8)，提示CME后9h炎症反应达高峰。在此基础上，本发明在CME后9h取心肌组织行miRNA表达谱分析(图9)，结果提示与假手术组相比，CME组miRNA-26a-5p表达水平明显下调，荧光定量PCR进一步证实其结果与基因芯片的结果一致(P＜0.05，图10)，因此本发明推测差异表达miRNA-26a-5p可能在CME致心肌损伤中发挥重要作用。

CME前，经体内转染miRNA-26a-5p预处理后，结果提示：miRNA-26a-5p转染组与单纯CME组相比，心肌组织miRNA-26a-5p表达水平显著提高(P＜0.05，图11)，心功能亦有显著改善(P＜0.05，表1)

表1单纯CME组与miRNA-26a-5p转染组心功能比较

注：LVEF：左室射血分数；CO：心排血量；LVEDd：左室舒张期末径；LVFS：左室短轴缩短率；与单纯CME组相比，^aP＜0.05

CME后本发明通过检测心肌组织HMGA1表达，发现其较假手术组相比明显升高(P＜0.05，图12)。在此基础上，本发明利用生物信息学方法预测差异表达miRNA-26a-5p的靶基因，结果表明HMGA1为其潜在靶基因。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种治疗冠状幼脉微栓塞致心肌损伤药物，其特征在于，所述治疗冠状幼脉微栓塞致心肌损伤药物为miRNA-26a-5p抑制剂。

2.一种验证权利要求1所述治疗冠状幼脉微栓塞致心肌损伤药物的动物模型构建方法，其特征在于，所述动物模型构建方法包括：

步骤一，采用SD大鼠，以45μm微栓子制备CME动物模型；

步骤二，实验分组：分为假手术组和CME组；

步骤三，CME大鼠心肌组织差异表达miRNAs的筛选；

采用miRNA基因芯片筛选出CME大鼠心肌组织miRNA表达谱，实时荧光定量聚合酶链式反应(Real Time PCR)对差异表达的miRNAs进行进一步验证；筛选出CME大鼠与假手术组心肌组织多种差异表达的miRNAs；

步骤四，差异表达miRNA靶基因的验证：利用miRanda、MicroCosm Targets、miRDB综合预测差异表达miRNA-26a-5p的靶基因，通过生物信息学数据库对比预测HMGA1为潜在靶基因；利用合成的miRNA-26a-5p的抑制剂体外培养乳鼠心肌细胞；用脂质体LipofectamineRNAiMAX转染miRNA-26a-5p mimic、miRNA-26a-5p inhibitor和negative control进入乳鼠心肌细胞，分别用Real Time PCR和Westernblot检测miRNA-6a-5p、HMGA1的表达变化；

构建HMGA1的荧光素酶报告基因载体，293T细胞同时转染miRNA-26a-5p mimic、miRNA-26a-5p inhibitor、negative control和HMGA1的报告基因载体，双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶的表达变化；

步骤五，HMGA1/NF-κB/TNF-α信号转导通路在CME致心肌损伤中的作用测定；

步骤六，进行miRNA-26a-5p在CME致心肌损伤中的作用分子机制测定。

3.如权利要求2所述的动物模型构建方法，其特征在于，步骤三具体包括：

CME模型建立8周龄成年SD大鼠雌雄不拘，体重250～300g，经尾静脉丙泊酚泵入麻醉，经口气管插管，连接呼吸机，于无菌手术台行后续操作；经左心室注射含45μm规格聚苯乙烯微球4000u的生理盐水悬浮液100μl，同时夹闭升主动脉20个心动周期；松开夹闭，关胸，逐层缝合，经尾静脉给予10000u青霉素预防感染，全程记录胸导联心电图；待大鼠自主呼吸恢复并麻醉苏醒后拔出气管导管，放回清洁饲养处；假手术组注入等量生理盐水；

miRNAs基因测序Trizol法提取总RNA，测定样品总RNA纯度和浓度；在每个样品总RNA的5'和3'添加RNA接头后，进行cDNA合成和扩增；从PAGE胶上提取并纯化PCR扩增片段，簇生成后进行测序；获取经过质控的测序片段，去接头，使用miRDeep2对全部去接头片段进行新miRNA预测，比对去接头且长度>＝15nt的片段到miRBase+新预测的pre-miRNA数据库上，以miRNA的tpm(tagpermillion)进行miRNA表达量标准化，进行样品间比较，获得差异表达miRNAs，并进行差异miRNAs的靶基因预测及靶基因的GO和Pathway分析；差异表达miRNA的验证RealTimePCR对差异表达的miRNAs进行进一步验证。

4.如权利要求2所述的动物模型构建方法，其特征在于，步骤四具体包括：全基因表达谱芯片筛查Trizol法提取总RNA，使用NanoDropND1000测定样品总RNA纯度和浓度；使用AgilentQuickAmpLabeling试剂盒对样品进行标记，使用AgilentSureHyb进行杂交实验；芯片经过洗涤后，进行扫描，采集芯片探针信号道，芯片标准化；挑选差异表达基因，差异表达基因的GO和Pathway功能分析；

分离培养大鼠心肌细胞取出生1～3d的SD大鼠乳鼠，处死后剪取心室，去心包，PBS清洗；将组织剪碎至体积1mm3左右的颗粒，加入5ml胶原酶II，于37℃轻轻吹打多次消化，收集上清液于10％FBS的DMEM完全培养基中终止消化。细胞筛过滤，离心弃上清，加入含10％FBS的DMEM完全培养基吹打混匀制成悬液，接种于培养瓶中，37℃、5％CO₂培养箱箱中培养1.5h差速贴壁去成纤维细胞，将细胞悬浮液接种于新培养瓶或孔板，加入补充培养液并按1μl/ml加入浓度100μmol/L的Brdu后每24h换培养液；

寡核苷酸序列设计与合成大鼠miRNA-26a-5p的抑制剂采用miRNA-26a-5p 成熟体的反向互补序列；双链RNA的负对照为与哺乳动物基因组没有同源性的序列；

载体构建HMGA13'UTR报告基因载体pGL3-HMGA1-3'UTR-WT携带野生型的3'UTR，pGL3-HMGA1-3'UTR-Mut携带突变miRNA-26a-5p识别元件的3'UTR；

细胞转染和报告基因活性检测将乳鼠心肌细胞分为miRNA-26a-5p模拟物转染组(miRNA-26a-5pmimic)、miRNA-26a-5p抑制剂组(miRNA-26a-5pinhibitor)和阴性对照组(negativecontrol)；转染48h、72h后分别用实时荧光定量PCR和Westernblot检测miRNA-26a-5p、HMGA1mRNA和蛋白的表达变化；在双荧光素酶报告基因系统的实验中，293T细胞同时转染miRNA-26a-5pmimic、miRNA-26a-5pinhibitor、negativecontrol和HMGA1的报告基因载体；

腺相关病毒载体的构建把外源基因克隆进包含ITR/MCS的载体中，重组表达质粒同pHelper和pAAV-RC共转染迚AAV-293细胞，转染2到3天后重组AAV在包装细胞中组装完成；收集细胞而后裂解释放AAV颗粒到上清中，浓缩并纯化病毒上清液，通过2次CsCl密度梯度离心和1次超滤去除细胞蛋白和残留的CsCl离子；定量PCR法测定所得病毒滴度。

5.如权利要求2所述的动物模型构建方法，其特征在于，步骤五中，分为假手术组、CME组、CME+HMGA1过表达腺相关病毒载体(HMGA1up)组、CME+siRNA腺相关病毒载体(HMGA1down)组和CME+空载腺相关病毒(HMGA1vector)组，每组8只，共40只；HMGA1up组、HMGA1down组和HMGA1vector组在CME造模前14d分别以1×1011TU配伍100μl生理盐水，以微量注射器经尾静脉注射；

各组建模后9h取外周血及心肌组织进行相关指标测定；取外周血血清测定CK-MB、肌钙蛋白I等心肌坏死标记物；心肌组织HE染色计数炎症细胞；HBFP染色与Masson染色检测心肌微梗死面积；免疫组化对HMGA1进行定位及半定量；Real Time PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、HMGA1表达水平；免疫印迹法检测HMGA1、TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-10；电泳迁移率变动分析(EMSA)测定NF-κB活性。

6.如权利要求2所述的动物模型构建方法，其特征在于，步骤六包括：

分为假手术组、CME组、HMGA1up组、HMGA1down组、HMGA1vector组和CME+Agomir-26a-5p(miRNA-26a-5p up)组，每组8只，共48只；

HMGA1up组、HMGA1down组和HMGA1vector组在CME造模前14d分别以1×1011TU配伍100μl生理盐水，以微量注射器经尾静脉注射；miRNA-26a-5p up组于CME造模前3d给予尾静脉注射Agomir-26a-5p，30mg/kg；

各组建模后9h取外周血及心肌组织进行相关指标测定；取外周血血清测定CK-MB、肌钙蛋白I等心肌坏死标记物；心肌组织HE染色计数炎症细胞；HBFP染色与Masson染色检测心肌微梗死面积；免疫组化对HMGA1进行定位及半定量；Real Time PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、HMGA1、miRNA-26a-5p等表达水平；Westernblot检测HMGA1、TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-10；EMSA测定NF-κB活性。