CN106191251A - 一种miRNAs心衰标志物及其应用和心衰初筛检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种miRNAs心衰标志物及其应用和心衰初筛检测试剂盒。所述基于miRNAs心衰标志物的心衰初筛检测试剂盒，其包括miRNAs心衰标志物的特异性引物，所述特异性引物序列如SEQ ID NO：1‑11。本发明有益效果是：本发明提供的miRNAs心衰标志物和基于miRNAs心衰标志物的心衰初筛检测试剂盒，通过检测循环血差异表达的miRNAs可将不同病因的心衰与正常对照组区分开。具有快速、敏感和特异等特点，为临床救治和疾病控制提供一种新的检测方法和重要的实验依据。

Description

一种miRNAs心衰标志物及其应用和心衰初筛检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种miRNAs心衰标志物及其应用和心衰初筛检测试剂盒。
背景技术
微小RNA(microRNA或miRNAs)的发现及对基因转录后调控功能的认识为研究表观遗传学与疾病的关系开辟了新的研究领域。它是一类在进化上非常保守的、分子长度约19-25个核苷酸序列的非蛋白编码的基因家族产物。至今，miRBase数据库中已公布来自58个不同物种的总数近9000个成熟miRNAs，其中人类基因组中确认的miRNAs数目已达800多个，这些miRNAs调控着30％的人类基因及信号通路。miRNAs可通过与靶基因mRNA分子3’末端非翻译区域(Untranslated Regions UTR)特异性结合，在转录后水平沉默特定靶基因，抑制其翻译。miRNAs参与生命过程中，包括早期胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢、甚至干细胞分化等一系列重要进程。越来越多的研究证实miRNAs在调控各种疾病的发生、发展及药物治疗方面起到关键的作用。目前研究发现miRNAs参与心脏的病理重构整个过程，它通过调节参与适应性和适应不良性的心室重塑的基因表达而调节心脏重构，进而导致心力衰竭的发生。2008年首次提取并检测出体液中miRNAs，并被后来的研究所证实。近年来科学家们越来越关注循环miRNAs的研究，致力于将其用于临床疾病的无创诊断预警。随着研究的深入，人们发现作为稳定的以血浆为基础的生物标记物对心血管疾病的早期诊断及治疗具有重要的临床意义。循环血miRNAs已作为生物标志物用于诊断心力衰竭和判断预后的研究。一种理想的生物标记物应满足：获得容易如血浆和非创伤性；高度特异性和敏感性；能区分不同的病变；疾病早期出现；对疾病转归变化敏感；在标本内稳定且半衰期较长；能被简单、快速、精确检测且相对廉价等。循环中的miRNAs基本能够满足上述 要求，例如它们在血液中稳定存在；序列高度进化稳定性；表达具有组织或疾病特异性；检测方法高度特异和敏感性。
检测循环miRNAs作为生物标志物的方法包括实时定量PCR、miRNAs芯片法和测序法。一般做法是提取待查样本全RNA，用miRNAs芯片或测序法筛查miRNAs，并与对照组(正常)比较，将明显增高或降低超过1.5或2.0倍且统计学有显著性差异的miRNAs作为备选标志物并进行适时定量PCR验证。
心力衰竭(HF)是一种复杂的病理生理综合征，是大多数心血管疾病的最终归宿。各种病理信号刺激心脏出现重构、心肌细胞凋亡、能量代谢障碍等，导致心肌收缩力下降、心脏扩大，最终出现HF。近些年，在全球范围内，HF的患病率和死亡率居高不下，患者5年死亡率高达50％，同时伴有生活质量的低下及高达15％的年住院率。对HF发病机制的研究经历了血液动力学紊乱、神经内分泌激活、分子生物学调节等理论，目前更深入到基因水平。在心衰发生发展过程中有几种生物标记物与之相关，其中最为重要的是脑钠肽(natriuretic peptides，BNP)尤其是B-BNP和NT-proBNP，对与心衰具有较高的临床诊断价值，但在某些疾病如肾功能不全、源发性醛固酮增多症以及某些甲状腺疾病是这些标志物也会增高；此外，在不同病因所致的心衰时其增高的反应性和程度不同，因此，其对心衰诊断的特异性和敏感性受到质疑，需要发现一种新的、更可靠的、更特异性的和更灵敏的预测心衰发生发展的生物标志物并应用于临床心衰早期诊断。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种更可靠的、更特异性的和更灵敏的miRNAs心衰标志物和基于miRNAs心衰标志物的心衰初筛检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种miRNAs心衰标志物，包括：hsa-miR-210，hsa-miR-2110，hsa-miR-21-3p，hsa-miR-320a，hsa-miR-423-5p，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-17-3p，hsa-miR-22-3p，hsa-miR-195-3p，hsa-miR-16-2-3p和hsa-miR-339-5p。
本发明的另一技术方案为提供一种上述的miRNAs心衰标志物在制备心衰 初筛检测试剂盒中的应用。
本发明的又一技术方案为提供一种基于miRNAs心衰标志物的心衰初筛检测试剂盒，所述miRNAs的心衰标志物为权利要求1所述的miRNAs心衰标志物，所述心衰初筛检测试剂盒包括逆转录反应体系和PCR反应体系，所述PCR反应体系包括针对权利要求1所述的miRNAs心衰标志物的特异性引物和通用引物，所述特异性引物序列如SEQ ID NO：1-11。
本发明有益效果是：本发明提供的miRNAs心衰标志物和基于miRNAs心衰标志物的心衰初筛检测试剂盒，通过检测循环血差异表达的miRNAs可将不同病因的心衰与正常对照组区分开。具有快速、敏感和特异等特点，为临床救治和疾病控制提供一种新的检测方法和重要的实验依据。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。
本发明最关键构思：采集静脉血提取血浆并提取全RNA，采用二代测序法建立miRNAs文库和心衰患者循环血miRNAs表达谱；将不同病因心衰循环血miRNAs表达变化与正常对照组比较增高1.5倍以上且统计学有显著性差异(P＜0.05)作为备选心衰诊断标志物；比较不同病因心衰备选诊断标志物并筛选出共同增高的miRNAs制备miRNA芯片(心衰初筛诊断试剂盒)。
实施例1
一种基于miRNAs心衰标志物的心衰初筛检测试剂盒，所述miRNAs的心衰标志物为：hsa-miR-210，hsa-miR-2110，hsa-miR-21-3p，hsa-miR-320a，hsa-miR-423-5p，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-17-3p，hsa-miR-22-3p，hsa-miR-195-3p，hsa-miR-16-2-3p和hsa-miR-339-5p。
所述心衰初筛检测试剂盒包括逆转录反应体系和PCR反应体系，所述PCR反应体系包括上述心衰标志物的特异性引物，所述特异性引物序列如SEQ ID NO：1-11。
表1
hsa-miR-210 agcccctgcccaccgcacactg(SEQ ID NO：1)
hsa-miR-2110 ttggggaaacggccgctgagtg(SEQ ID NO：2)
hsa-miR-21-3p caacaccagtcgatgggctgt(SEQ ID NO：3)
hsa-miR-320a aaaagctgggttgagagggcga(SEQ ID NO：4)
hsa-miR-423-5p tgaggggcagagagcgagacttt(SEQ ID NO：5)
hsa-miR-483-5p aagacgggaggaaagaagggag(SEQ ID NO：6)
hsa-miR-17-3p actgcagtga aggcacttgt ag(SEQ ID NO：7)
hsa-miR-22-3p aagctgccag ttgaagaact gt(SEQ ID NO：8)
hsa-miR-195-3p tagcag cacagaaata ttggc(SEQ ID NO：9)
hsa-miR-16-2-3p ccaatattac tgtgctgctt ta(SEQ ID NO：10)
hsa-miR-339-5p tccctgtcct ccaggagctc acg(SEQ ID NO：11)
实施例2
一、材料与方法
1、研究对象的选择：
(1)心力衰竭诊断：根据纽约心脏学会(NYHA)心功能分级标准(I-IV级)，心功能III-IV级；二维心脏超声左心室射血分数＜45％；循环血NT-proBNP含量＞1000ng/L。满足上述标准的心脏病患者入组研究。
(2)缺血性心肌病心衰(IHF)：满足上述标准及冠状动脉造影显示主要分支狭窄或支架术后再狭窄≥75％；动脉血压＜160/100mmHg；无心肌炎、原发性心脏瓣膜病、持续快速室上性心律失常、心包疾病、先天性心脏病、肺心病、继发于其它全身疾病所致的心脏病变。
(3)非缺血性心肌病心衰(NIHF)：满足上述标准及冠状动脉造影显示主要分支狭窄＜50％；动脉血压＜160/100mmHg；无心肌炎、原发性心脏瓣膜病、持续快速室上性心律失常、心包疾病、先天性心脏病、肺心病、继发于其它全身疾病所致的心脏病变。
(4)正常对照(NC)：选择年龄和性别相配的正常捐助者。无上述疾病且心功能正常。无妊娠、透析治疗、恶性肿瘤或经肿瘤治疗等。
2、血浆样本全RNA分离和纯化：用含EDTA离心管采集全血样本(5ml) 并在4℃条件下离心分离血浆，mirVana PARIS试剂盒分离血全RNA。在分离血全RNA前，向血浆中加入25fmol人工合成的秀丽隐杆线虫MicroRNA-39作为内参。将分离的血全RNA重悬于100μL无RNA酶水中，-80℃保存待测。
3、miRNAs文库的构建：选取缺血性心衰患者8例、非缺血性心衰患者8例和健康对照人8例，提取血浆、分离全RNA并建立miRNAs文库。
建库流程：
1)分离Small RNA，PAGE胶分离提取18-30nt大小的RNA，进行回收。
2)接头连接，配制连接体系，混匀离心，适温连接一段时间。
3)RT-PCR，配制反转录体系，在PCR仪上适温反应一定时间，使连接产物反转录成双链，再配制。PCR反应体系，在PCR仪上按照一定程序进行扩增。
4)PCR产物回收纯化，对PCR产物进行切胶回收纯化，完成文库构建。
5)文库质量检测：构建好的文库使用Agilent 2100Bioanalyzer和ABIStepOnePlus Real-Time PCR System进行质量和产量的检测。
4、qRT-PCR验证实施例1所述心衰标志物；
本发明miRNAs心衰标志物定量分析采用两步法进行，即逆转录和PCR扩增。
每10微升RT反应体系含0.5μg RNA，2μl of PrimerScript Buffer，0.5μl ofoligo dT，0.5μl of random hexamers and 0.5μl of PrimerScript RT Enzyme Mix I(Takara，Japan)。
RT反应在GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems，USA)上完成(15min，37℃)，再经RT酶热变性(5秒，85℃)。将10-μl RT反应体系用去核酸酶水溶液稀释10倍，保存在-20℃备用。在LightCycler 480 II Real-time PCR仪上完成Real-time PCR。10-μl反应体系含有：1μl cDNA，5μl of 2×LightCycler 480SYBR Green I Master(Roche)，0.2μlprimers and 3.6μl无核酸酶水。
心衰标志物的特异性引物如表1所示，Generay Biotech(China)公司合成。样品在384-well optical plate(Roche，Swiss)上孵育95℃，10分钟，95℃，10秒和60℃，30秒共40个循环，PCR循环结束后完成熔化曲线并验证特异性 PCR产物。
U6小核RNAs，序列为：CAAGGATGACACGCAAATTCG(SEQ ID NO：11)，作内参以去除背景噪音。计算miRNAs相对表达量(normalized Ct value)。Inverted-normalized Ct＝MaxDetectable Ct-{(Detected Ct U6’s Ct Of the Sample)+Average U6’s Ct Of AllSamples)。数值越高表明较表达并计算倍数变化。
4)结果的统计学处理：全部统计学分析在SPSS 17.0统计分析软件上进行。
所得资料用X±SD和百分率表示；两组资料比较分别使用不成对的t检验和X2检验；多组资料比较用方差分析检验；相关性以Pearson’s相关系数表示。P<0.05为统计学上有显著性。
二、结果
从5毫升血浆样本中提取全RNA进行测序，每个样本平均产生9.5-14.65M读数，根据测序和差异表达miRNAs分析结果，计算出表达倍数和P值，P＜0.05为统计学上有显著性差异，如果检测的实施例1所述心衰标志物与对照试样具有显著差异，则判定患有心力衰竭。上述以实施例1所述心衰标志物检测心力衰竭诊断的阳性符合率为15例，阴性符合率为7例。说明本发明实施例1所述心衰标志物能够实现对心衰早期诊断。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种miRNAs心衰标志物，其特征在于，包括：hsa-miR-210，hsa-miR-2110，hsa-miR-21-3p，hsa-miR-320a，hsa-miR-423-5p，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-17-3p，hsa-miR-22-3p，hsa-miR-195-3p，hsa-miR-16-2-3p和hsa-miR-339-5p。
2.权利要求1所述的miRNAs心衰标志物在制备心衰初筛检测试剂盒中的应用。
3.一种基于miRNAs心衰标志物的心衰初筛检测试剂盒，其特征在于，所述miRNAs的心衰标志物为权利要求1所述的miRNAs心衰标志物，所述心衰初筛检测试剂盒包括逆转录反应体系和PCR反应体系，所述PCR反应体系包括针对权利要求1所述的miRNAs心衰标志物的特异性引物和通用引物，所述特异性引物序列如SEQ ID NO：1-11。
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