CN104087662A - 对抗、预防和/或测定心力衰竭或心力衰竭的风险的工具和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于诊断和/或预后受试者中的心力衰竭的方法，该方法包括下列步骤：测定获自所述受试者的体液样品中的至少一种遗传标志物的水平，其中所述至少一种遗传标志物是miRNA。本发明还涉及治疗或预防受试者中的心力衰竭的方法，该方法包括下列步骤：降低所述受试者中的至少一种miRNA的表达、数量和/或活性，或降低所述受试者中的至少一种miRNA与其mRNA靶标之间的相互作用，或增加所述受试者中的至少一种miRNA的mRNA靶标的表达、数量和/或活性。
Description
本申请是申请号为201080018687.1、申请日为2010年4月29日、发明名称为“对抗、预防和/或测定心力衰竭或心力衰竭的风险的工具和方法”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本申请涉及生物学和医学领域。更具体而言，本申请涉及用于诊断和治疗心力衰竭的miRNA。
背景技术
微RNA(miRNA)是植物和动物的基因组中编码的小RNA。它们存在于编码蛋白的基因的内含子中、编码多个miRNA的多顺反子转录物中和单个miRNA基因中。这些长度为大约21-23个核苷酸的高度同源的RNA通常通过结合特定mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)而调节基因的表达。人们认为每个miRNA调节多个基因，由于据预测在高等真核生物中存在数百种miRNA基因，所以miRNA所赋予的潜在的调节线路是巨大的。数个研究小组已经提供了证据证明miRNA是多种过程的关键调节者，如早期发育、细胞增殖和细胞死亡、调亡和脂肪代谢，以及细胞分化。据推论：在高等真核生物中，miRNA在调节基因表达中的作用可能与转录因子同样重要。目前已经验证了超过540种人类的miRNA；然而，计算机模型提示可能还有数千种。人们相信多达30％的人类基因受到miRNA的调节。
编码miRNA的基因是通过RNA聚合酶II从DNA转录而来的，但不翻译成蛋白质。初级转录物一般具有数千碱基的长度，被称作pri-miRNA。pri-miRNA在细胞核中被加工为较短的70-100个核苷酸 的茎-环结构，其被称作pre-miRNA。该过程在动物中是通过RNA酶III核酸内切酶Drosha进行的。然后，pre-miRNA被转运至细胞质，在那里它们被第二种RNA酶III核酸内切酶DICER加工为长度为21-23个核苷酸的双链miRNA。随后，miRNA双链体的一条链被掺入到RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。作为RISC的一部分，靶基因的基因表达通过抑制翻译和/或通过切割mRNA而被阻抑。成熟的miRNA与一种或多种mRNA分子部分互补。如果miRNA和mRNA在同一细胞中表达，则它们能够以序列特异性方式杂交，从而阻止mRNA翻译成蛋白质，因此调节特定蛋白质的水平。
miRNA作为可能的临床参与者的关注和信赖水平可由下列事实证明：最近已经建立起了多个基于miRNA的生物技术公司。
数种miRNA与癌症和心脏疾病相关。表达分析研究揭示：相对于正常组织，肿瘤中的miRNA表达是紊乱的。在乳腺癌、肺癌和结肠癌中，微RNA下调；而在Burkitt氏和其它人类B-细胞淋巴瘤中，微RNA上调。因此，人miRNA可能作为生物标志物有很大的用途，尤其是用于将来的癌症诊断，并且正迅速成为疾病干预的受关注的靶标。除了它们与癌症的关联之外，微RNA在控制心脏功能和紊乱的多个方面具有重要作用，包括肌细胞生长、心室壁的完整性、收缩性、基因表达和心律的维持。已经证明miRNA的表达失调对于多种形式的心脏疾病是必要的和足够的。
最近描述了miRNA也存在于血液中。在血清、血浆、血小板、红细胞以及有核血细胞中可以检测到相对高水平的数种miRNA。已经描述了具有镰状细胞贫血或前列腺癌的受试者的血液中的miRNA的异常表达谱。
虽然已经确定遗传因素与易于发生心力衰竭的倾向相关，但是，鉴于该病症的复杂性质，此类遗传因素的鉴定仍然是有疑问的。
已经描述了用于诊断急性冠状动脉综合征、包括心力衰竭的方法，尤其是WO/2002/083913、WO2002/089657和WO2006/120152。所有这些方法使用例如血液或尿液中的脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)的水平作为急性冠状动脉综合征的标志物。然而，该多肽是由心脏的心室响应于心肌细胞的过度伸展而分泌的，因此其是反映心脏状况的生理标志物。需要更精确地反映受试者患心力衰竭的遗传倾向性的遗传标志物。此类标志物也允许更早地进行诊断。
因此，预测患心力衰竭的遗传标志物的获得是十分理想的。目前，不存在此类标志物。
发明内容
现在发现：在心脏疾病中，血液中的miRNA谱被改变。不希望被任何理论所限，相信细胞、包括心肌细胞通过外来体将这些miRNA分泌进入血液，在疾病中，分泌模式被改变。
因此，本发明人证明，血液中的miRNA谱可用作心力衰竭的新的诊断工具或生物标志物方法。
本发明的目标是提供用于治疗、预防或测定心力衰竭(其风险)的工具和方法。
因此，在第一个方面，本发明提供了用于治疗或预防受试者中的心力衰竭的方法，该方法包括下列步骤：
-降低所述受试者中的至少一种miRNA的表达、数量和/或活性；或
-降低所述受试者中的至少一种miRNA与其mRNA靶标之间的相互作用；或
-增加所述受试者中的至少一种miRNA的mRNA靶标的表达、数量和/或活性，
其中所述至少一种miRNA选自miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-302d和solexa-3927-221。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防受试者中的心力衰竭的方法，该方法包括下列步骤：
-增加所述受试者中的至少一种miRNA的表达、数量和/或活性；或
-增加所述受试者中的至少一种miRNA与其mRNA靶标之间的相互作用；或
-降低所述受试者中的至少一种miRNA的mRNA靶标的表达、数量和/或活性，
其中所述至少一种miRNA选自miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142-3p和solexa-2952-306。
在上述方面的优选实施方式中，所述的增加所述miRNA的表达、数量和/或活性或相互作用的方法包括向所述受试者施用所述miRNA以作为功能性miRNA，作为前体微RNA(pre-miRNA)，或作为微RNA初级转录物(pri-miRNA)。
在另一个方面，本发明提供了选自miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142-3p和solexa-2952-306，或其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物，其用作药物，优选用于治疗或预防心力衰竭。
在另一个方面，本发明提供了能够与至少一种选自miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-302d和solexa-3927-221的miRNA及其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物特异性结合、从而抑制其活性和/或功能的化合物、优选核酸，其用作药物，优选用于治疗或预防心力衰竭。本文中的术语“功能”特别是指所述miRNA抑制靶mRNA的翻译的能力。因此，核酸优选能够以序列特异性方式抑制miRNA与其mRNA靶标之间的杂交。在本文定义的核酸的上下文中，术语“特异性结合”特别是指，核酸能够在严格条件下与所述miRNA杂交。在优选的实施方式中，所述核酸具有与如图3中提供的miRNA的序列互补的序列。
在另一个方面，本发明提供了用作药物、优选用于治疗或预防心力衰竭的载体，其包含：编码能够与至少一种选自miR-423-5p, miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-302d和solexa-3927-221的miRNA及其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物miRNA特异性结合、从而抑制其活性和/或功能的核酸的核酸序列；或者编码选自miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142-3p和solexa-2952-306的miRNA及其前体微RNA(pre-miRNA)和微RNA初级转录物的核酸序列，并能够表达所述核酸或(pre或pri)miRNA。
在另一方面，本发明提供了包含如上所述的根据本发明的载体的细胞，其用作药物、优选用于治疗或预防心力衰竭。
在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防受试者中的心力衰竭的药物组合物，其包含：
-如上所述的根据本发明的基因或其表达产物，如上所述的根据本发明的(pre-或pri-)miRNA，如上所述的根据本发明的载体，或如上所述的根据本发明的细胞；以及
-药学上可接收的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一方面，本发明提供了用于诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险的方法，该方法包括：
a)测定获自所述受试者的样品中的遗传标志物的水平，其中所述遗传标志物是选自miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-191,miR-302d,miR-30e,miR-744,miR-142-3p,solexa-2952-306和solexa-3927-221的miRNA及其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物；
b)基于步骤a)中测定的遗传标志物的水平诊断该受试者是否患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险的方法，该方法包括：
a)测定获自所述受试者的样品中的至少一种遗传标志物的水平， 其中所述至少一种遗传标志物是选自miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miK-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-191,miR-302d,miR-30e,miR-744,miR-142-3p,solexa-2952-306和solexa-3927-221的miRNA及其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物；和
b)基于步骤a)中测定的所述至少一种遗传标志物的水平诊断该受试者是否患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。在优选的实施方式中，所述至少一种遗传标志物包括至少两种miRNA，更优选至少三种miRNA，其选自于选自miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-191,miR-302d,miR-30e,miR-744,miR-142-3p,solexa-2952-306和solexa-3927-221的miRNA及其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物。在另一个优选的实施方式中，至少两种miRNA选自miR-423-5p和miR-191*,miR-423-5p和miR-15b,miR-423-5p和miR-1228*,miR-423-5p和miR-181a,miR-423-5p和miR-18a*,miR-423-5p和miR-107,miR-423-5p和miR-299-3p,miR-423-5p和miR-342-3p,miR-423-5p和miR-652,miR-423-5p和miR-675,miR-423-5p和miR-129-5p,miR-423-5p和miR-18b*,miR-423-5p和miR-1254,miR-423-5p和miR-622,miR-423-5p和HS_202.1,miR-423-5p和miR-191,miR-423-5p和miR-302d,miR-423-5p和miR-30e,miR-423-5p和miR-744,miR-423-5p和miR-142-3p,miR-423-5p和solexa-2952-306,或miR-423-5p和solexa-3927-221。
在另一方面，本发明提供了用于诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险的方法，该方法包括：
a)测定获自所述受试者的样品中的遗传标志物的水平，其中所述遗传标志物是选自miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652, miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-191,miR-302d,miR-30e,miR-744,miR-142-3p,solexa-2952-306和solexa-3927-221的miRNA及其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物；
b)基于步骤a)中测定的遗传标志物的水平诊断该受试者是否患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。
在所述方法的优选实施方式中，当下列情况时，所述步骤b)认为所述受试者患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险：
-相对于不患有或不具有患心力衰竭的风险的对照受试者，miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-302d和/或solexa-3927-221或其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物的表达、数量和/或活性上调；和/或
-相对于不患有或不具有患心力衰竭的风险的对照受试者，miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142-3p和/或solexa-2952-306或其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物的表达、数量和/或活性下调。
本发明还提供了用于治疗或预防受试者中的心力衰竭的方法，该方法包括：基于根据本发明的至少一种遗传标志物的水平诊断该受试者是否患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险；和，当该受试者患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险时，治疗该受试者。
在另一方面，本发明提供了诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险的试剂盒(kit of parts)，其包含：
-能够特异性结合选自miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-191,miR-302d,miR-30e,miR-744,miR-142-3p,solexa-2952-306和solexa-3927-221的至少一种miRNA及其前体微 RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物的至少一种化合物；和
-使用所述化合物根据本发明的方法诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险的说明书。
在另一个方面，本发明提供了用于确定候选化合物是否能够治疗或预防人类受试者中的心力衰竭的方法，该方法包括：
-将所述候选化合物与人组织细胞、优选心脏组织细胞接触，和
-确定所述候选化合物是否能够调节所述组织细胞中的miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-191,miR-302d,miR-30e,miR-744,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-142-3p,solexa-2952-306和solexa-3927-221中的任一项的表达、数量和/或活性。优选地，所述化合物以不再与心力衰竭(其风险)相关的方向影响所有miRNA的表达。
在用于确定候选化合物是否能够治疗或预防人类受试者中的心力衰竭的优选方法中，该方法包括：
-将所述候选化合物与组织细胞、优选人组织细胞、更优选心脏组织细胞接触，和
-确定所述候选化合物是否能够降低所述组织细胞中的miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-302d solexa-3927-221的表达、数量和/或活性，和/或是否能够增加所述组织细胞中的miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142-3p或solexa-2952-306的表达、数量和/或活性。
在所有的方面和实施方式中，本发明的一部分是下列miRNA：miR-654-3p,miR-346,miR-1301,miR-24-2和HS_239，发现与健康对照的血浆相比，它们在HF患者的血浆中差别化表达。
本发明的涉及筛选候选治疗化合物的方面也可以在模型系统中进行，例如在动物模型中进行，其显示出如本文指明的与心力衰竭(增 加的风险)相关的特定miRNA表达模式。因此，本发明的另一个方面是显示出如本文指明的与心力衰竭(增加的风险)相关的miRNA表达模式的(动物、包括人)模型系统。此类模型系统可用于筛选候选治疗剂的方法中，所述方法包括步骤：将所述模型系统(的细胞)暴露于、或向所述模型系统施用候选化合物，和测定所述候选化合物是否能够诱导所述miRNA表达谱的变化，其不再与心力衰竭(其增加的风险)相关，尤其是能够增加所述模型系统(其细胞)中的miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142-3p或solexa-2952-306的表达、数量和/或活性，和/或降低所述模型系统(其细胞)中的miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-302d或solexa-3927-221的表达、数量和/或活性。
附图说明
图1显示了心力衰竭(HF)患者的血浆中富含的miRNA。血浆样品：1)健康人员1；2)健康人员2；4)HF患者1；5)HF患者2；6)HF患者3。
图2显示了在心力衰竭患者的血浆中下调的miRNA。血浆样品：1)健康人员1；2)健康人员2；4)HF患者1；5)HF患者2；6)HF患者3。
图3显示了本文讨论的miRNA的序列(5'-3')
图4显示了在DNA芯片阵列上测定的如本文讨论的miRNA的表达，其中显示了每个miRNA的24个测定值。前12个是来自患者样品的测定值，后12个(13-24号)是对照。FC＝倍数变化；p＝p值；p校正是就多个测试校正的p值。通过QPCR确认了结果。
图5显示了HF患者和对照受试者的血浆中的16种候选miRNA的表达谱。每个图板中的左侧2个条柱显示的是通过miRNA阵列测定的12个健康对照和12个HF患者中的miRNA水平。右侧两个条 柱显示了通过实时PCR在单独的受试者(30个HF病例和39个健康对照)中验证的相同的miRNA的水平。数据表示为平均值±SEM。*表示相对于健康对照P<0.05。
图6显示了miRNA的诊断精确性。A、D和G显示了健康对照、非HF病例和HF病例中的miRNA水平。数据表示为平均值±SEM。*表示相对于健康对照P<0.05；$表示相对于非HF病例P<0.05。B、E和H显示了关于曲分HF与非HF病例的诊断能力的ROC曲线和AUC。C、F和I显示了proBNP与miRNA之间的Spearman关联，对于miR-423-5p是显著性的(P＝0.002)，对于miR-18b*是边缘显著性的(P＝0.049)。单一离群值的舍弃对于miR423-5p的相关性没有影响，但是降低了miR-18b*的相关性。
图7显示了相对于死于非心脏原因的受试者(对照)，死于扩张型心肌病(DCM)的受试者的尸检心肌组织中的miRNA表达。就U6的表达校正miR-423-5p的实时PCR。
*表示相对于对照p<0.05。
图8显示了具有动脉粥样硬化形式的心力衰竭和非动脉粥样硬化形式的心力衰竭的受试者中的循环miRNA的水平。为了根据心力衰竭的潜在诱因比较循环miRNA的水平，我们区分了HF的动脉粥样硬化形式和HF的非动脉粥样硬化形式。在此重要的是指出：在该研究中，我们排除了显示出心肌缺血的实际症候的患者，所以活性缺血被排除在HF的诱因之外。在30位患者中，有12位具有慢性广泛的冠状动脉粥样硬化性疾病史，其导致HF。相对于具有非动脉粥样硬化性HF的患者(n＝18)，这些具有动脉粥样硬化疾病的受试者显示出显著较高的miR-423-5p和miR-675的循环水平，但miR-18b*则不是这样。*：相对于非动脉粥样硬化形式p<0.05。
具体实施方式
术语"心力衰竭(heart failure)"或"心力衰竭(cardiac failure)"是指这样的病理生理学状态：其中，由于心脏功能的异常(可检测到的或 不可检测到的)，不能以代谢中的组织的需求相当的速率泵血，和/或仅以异常升高的舒张充盈压泵血。心力衰竭可以由心肌衰竭引起，但也可以在高需求条件下在存在接近正常心脏功能的情况下发生。心力衰竭总是引起循环衰竭，但反之则不总是如此，因为在正常、中等程度破坏、甚至是超常心脏功能的情况下，多种非心脏状况(例如低血容量性休克、脓毒性休克)也会产生循环衰竭。因此，术语"心力衰竭"包括收缩和舒张心力衰竭，急性心力衰竭和慢性心力衰竭，与心力衰竭的起因无关，并且与是否存在与心力衰竭和/或心力衰竭的起因相关的遗传成分无关。
如本文使用的"核酸"包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有指明，否则包括具有天然核苷酸的必要结构的类似物(例如肽核酸)：它们以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交。
术语"分离的"，例如在"分离的细胞"中，是指这样的物质，例如细胞，其实质上或基本上不含在天然存在的环境中通常伴随它的成分或与其相互作用的成分。分离的细胞可以是通过培养细胞(分离自其通常驻留于的组织，并且不再整合于其所源自的生物体的组织内)而获得的细胞培养物。
"核苷酸"是通过以下的IUPAC命名法通过它们的通常接受的单字符来指称的：A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、T(胸腺嘧啶)、G(鸟嘌呤)、U(尿嘧啶)、W(A或T)、R(A或G)、K(G或T)、Y(C或T)、S(C或G)、M(A或C)、B(C、G或T)、H(A、C或T)、D(A、G或T)、V(A、C或G)、N(A、C、G或T)。
"编码(coding)"或"编码(encoding)"序列是编码蛋白的氨基酸序列或功能性RNA例如tRNA或rRNA的基因的一部分。
如本文使用的术语“基因”是指DNA序列，包括但不限于这样的DNA序列：可以转录为mRNA的，mRNA可以翻译为多肽链；可以转录为rRNA或tRNA的，或作为酶及其它参与DNA复制、转录和调节的蛋白的识别位点。该术语是指任意DNA序列，包括数个可操 作连接的DNA片段、例如启动子区域、5'非翻译区(5'UTR)、编码区(其可以编码或可以不编码蛋白)和包括多腺苷化位点的3'非翻译区(3'UTR)。通常而言，5'UTR、编码区和3'UTR转录为RNA，在编码蛋白的基因的情况下，编码区翻译为蛋白。基因通常包括内含子和外显子。基因可以包括另外的DNA片段，例如内含子。
“样品”以其最广泛的含义使用，包括核酸。样品可以包括体液，例如血液或尿液；细胞制备物的可溶性级分，或细胞生长培养基的等份试样；染色体，细胞器，或分离或提取自细胞的膜；溶液中的或结合至基底的基因组DNA、RNA或cDNA；细胞；组织印迹；指纹，口颊细胞，皮肤或毛发；等等。
用于检测根据本发明的miRNA的优选样品是选自血液和尿液的体液。最优选的样品是血液样品。血液样品可以包括全血样品，或通过离心和/或过滤获得的样品，例如，血浆、血清、血小板、红细胞、白细胞，如技术人员已知。血液样品可以通过静脉穿刺、动脉穿刺和/或毛细血管穿刺获得，例如手指穿刺。可以将样品、优选血液样品收集于含有抗凝剂的管中，例如肝素管或EDTA-管，如技术人员已知。
本发明涉及如本文指明的miRNA的诊断性、预后性和治疗性应用，所述miRNA是hsa-miR-423-5p,hsa-miR-191*,hsa-miR-15b,hsa-miR-1228*,hsa-miR-181a,hsa-miR-18a*,hsa-miR-107,hsa-miR-299-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-652,hsa-miR-675,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-18b*,hsa-miR-1254,hsa-miR-622,HS_202.1,hsa-miR-191,hsa-miR-302d,hsa-miR-30e,hsa-miR-744,hsa-miR-142-3p,solexa-2952-306,solexa-3927-221。这些miRNA的核苷酸序列提供于图3中。
MiRNA通过与编码蛋白基因产物的基因编码的mRNA退火而阻抑特定基因产物的表达。因此，miRNA具有翻译性地阻抑靶mRNA的能力，从而功能性调节靶mRNA。
因此，通过影响所述细胞中的选自hsa-miR-423-5p,hsa-miR-191*,hsa-miR-15b,hsa-miR-1228*,hsa-miR-181a,hsa-miR-18a*, hsa-miR-107,hsa-miR-299-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-652,hsa-miR-675,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-18b*,hsa-miR-1254,hsa-miR-622,HS_202.1,hsa-miR-191,hsa-miR-302d,hsa-miR-30e,hsa-miR-744,hsa-miR-142-3p,solexa-2952-306,solexa-3927-221的至少一种miRNA或其功能部分或衍生物的表达、数量和/或活性，和/或通过影响靶mRNA与所述细胞中的选自hsa-miR-423-5p,hsa-miR-191*,hsa-miR-15b,hsa-miR-1228*,hsa-miR-181a,hsa-miR-18a*,hsa-miR-107,hsa-miR-299-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-652,hsa-miR-675,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-18b*,hsa-miR-1254,hsa-miR-622,HS_202.1,hsa-miR-191,hsa-miR-302d,hsa-miR-30e,hsa-miR-744,hsa-miR-142-3p,solexa-2952-306,solexa-3927-221的至少一种miRNA或其功能部分或衍生物之间的相互作用来影响细胞中的这些mRNA编码的基因产物的表达。因此，还提供了选自hsa-miR-423-5p,hsa-miR-191*,hsa-miR-15b,hsa-miR-1228*,hsa-miR-181a,hsa-miR-18a*,hsa-miR-107,hsa-miR-299-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-652,hsa-miR-675,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-18b*,hsa-miR-1254,hsa-miR-622,HS_202.1,hsa-miR-191,hsa-miR-302d,hsa-miR-30e,hsa-miR-744,hsa-miR-142-3p,solexa-2952-306,solexa-3927-221的至少一种miRNA或其功能部分或衍生物的用途，或能够影响细胞中的选自hsa-miR-423-5p,hsa-miR-191*,hsa-miR-15b,hsa-miR-1228*,hsa-miR-181a,hsa-miR-18a*,hsa-miR-107,hsa-miR-299-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-652,hsa-miR-675,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-18b*,hsa-miR-1254,hsa-miR-622,HS_202.1,hsa-miR-191,hsa-miR-302d,hsa-miR-30e,hsa-miR-744,hsa-miR-142-3p,solexa-2952-306,solexa-3927-221的至少一种miRNA的表达、数量和/或活性的化合物的用途，或能够影响靶mRNA与选自hsa-miR-423-5p,hsa-miR-191*,hsa-miR-15b,hsa-miR-1228*,hsa-miR-181a,hsa-miR-18a*,hsa-miR-107,hsa-miR-299-3p,hsa-miR-342-3p, hsa-miR-652,hsa-miR-675,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-18b*,hsa-miR-1254,hsa-miR-622,HS_202.1,hsa-miR-191,hsa-miR-302d,hsa-miR-30e,hsa-miR-744,hsa-miR-142-3p,solexa-2952-306,solexa-3927-221的至少一种miRNA之间的相互作用的化合物的用途，用于影响所述细胞中的由miRNA的靶mRNA编码的特定基因产物的表达。在一个实施方式中，在体外、例如在细胞培养物中影响特定基因产物的表达。
miRNA沿用标准的命名法系统，如技术人员已知。无大写字母的"mir-"是指pre-miRNA，而有大写字母的"miR-"是指成熟的形式。具有几乎相同的序列的miRNA以另外的小写字母表示。例如，miR-123a与miR-123b密切相关。100％相同但是在基因组中的不同位置被编码的miRNA以另外的破折号-数字后缀表示：miR-123-1和miR-123-2是相同的，但是产生于不同的pre-miRNA。来源的物种以三字符前缀表示，例如hsa-miR-123来自人(智人)，oar-miR-123来自绵羊(Ovis aries)miRNA。当已知相对表达水平时，名称后面的星号表示在相对于发夹的相对臂的miRNA较低的水平表达的miRNA。例如miR-123和miR-123*具有相同的pre-miRNA发夹，但是细胞中存在相对较多的miR-123。后缀5p和3p分别表示miRNA来源于pre-miRNA的5’臂和3’臂。当两种miRNA以相同水平表达时，使用这些后缀。例如miR423-5p和miR423-3p具有相同的pre-miRNA发夹。
根据本发明，如本文提及的miRNA能够阻抑特定基因产物的表达。如本文使用的术语"miRNA"包括：所述miRNA的任何同种型，并且所述miRNA家族的所有成员都能够阻抑特定基因产物的表达。因此，术语“miRNA”包括前体，例如pri-miRNA和pre-miRNA，星-序列，例如miR-123和miR-123*，家族成员例如miR-17和miR-18；以及簇成员，例如miR-92a,miR-92a-2*和miR-363。
因此，术语miR-423-5p包括同种型pre-mir423和miR423-3p；术语miR-129-5p包括同种型pre-mir129-1,pre-mir129-2,miR-129*和miR-129-3p；术语miR-18b*包括同种型pre-mir18b,miR-18b, pre-mir17,miR-17,miR-17*,pre-mir18a,miR-18a,miR-18a*,pre-mir20a,miR-20a,pre-mir20b,miR-20b,miR-20b*,pre-mir93,miR-93,miR-93*,pre-mir106a,miR-106a,miR-106a*,pre-miR106b,miR-106b,miR-106b*,pre-mir19b-2,miR-19b,miR-19b-2*,pre-mir92a-2,miR-92a,miR-92a-2*,pre-mir363,miR-363和miR-363*；术语miR-1254包括同种型pre-mir1254；术语miR-622包括同种型pre-mir622；术语HS_202.1包括同种型pre-mir221,miR-221和miR-221*。
因此，如本文使用的术语"miRNA"包括任何miRNA成员。虽然hsa-miR-423-5p,hsa-miR-191*,has-miR-15b,hsa-miR-1228*,hsa-miR-181a,hsa-miR-18a*,hsa-miR-107,hsa-miR-299-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-652,hsa-miR-675,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-18b*,hsa-miR-1254,hsa-miR-622,HS_202.1,hsa-miR-191,has-miR-302d,hsa-miR-30e,hsa-miR-744,hsa-miR-142-3p,solexa-2952-306和solexa-3927-221是本领域已知的，但它们与心力衰竭的关联和它们对于心力衰竭的效应在本发明之前是未知的。
本发明现提供了以下视点：上述miRNA与心力衰竭相关联，可以诊断、预防和治疗心力衰竭。本文描述的miRNA与心力衰竭衰竭之间的关联是通过特定基因产物，其表达被miRNA阻止或调节。阻抑这些特定基因产物中的一些的表达将引起这些特定基因产物的量的降低，这继而又会减少心力衰竭的发作、进展和/或效应。对于那些表达受到在心力衰竭中上调的miRNA调控的基因产物，尤其是这样。此外，刺激这些特定基因产物中的某一些的表达，例如，通过阻止miRNA的表达，将引起这些特定基因产物中的其它项的较高的量，这也可以减少心力衰竭的发作、进展和/或效应。对于那些表达受到在心力衰竭中下调的miRNA调控的基因产物，尤其是这样。因此，这些特定基因产物是心力衰竭的重要介导子，但其机理仍然未知。根据本发明，选自hsa-miR-423-5p,hsa-miR-191*,hsa-miR-15b,hsa-miR-1228*,hsa-miR-181a,hsa-miR-18a*,hsa-miR-107, hsa-miR-299-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-652,hsa-miR-675,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-18b*,hsa-miR-1254,hsa-miR-622,HS_202.1,hsa-miR-191,hsa-miR-302d,hsa-miR-30e,hsa-miR-744,hsa-miR-142-3p,solexa-2952-306,solexa-3927-221的数种miRNA能够通过阻抑特定基因产物的表达而对抗心力衰竭。
因此，一个实施方式提供了用于对抗、治疗、减少、延缓和/或预防受试者中的心力衰竭的方法，该方法包括：
-增加所述受试者中的选自hsa-miR-191,hsa-miR-30e,hsa-miR-744,hsa-miR-142-3p,solexa-2952-306的miRNA或其功能部分或衍生物的表达、数量和/或活性；和/或
-增加所述受试者中的特定靶mRNA与选自hsa-miR-191,hsa-miR-30e,hsa-miR-744,hsa-miR-142-3p,solexa-2952-306的miRNA或其功能部分或衍生物之间的相互作用。如上文所述，所述miRNA包括所述miRNA家族的任意成员，和/或
-降低所述受试者中的选自hsa-miR-423-5p,hsa-miR-191*,hsa-miR-15b,hsa-miR-1228*,hsa-miR-181a,hsa-miR-18a*,hsa-miR-107,hsa-miR-299-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-652,has-mir-675,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-18b*,hsa-miR-1254,hsa-miR-622,HS_202.1,miR-302d和/或solexa-3927-221的miRNA或其功能部分或衍生物的表达、数量和/或活性；和/或
-减少所述受试者中的特定靶mRNA与选自hsa-miR-423-5p,hsa-miR-191*,hsa-miR-15b,hsa-miR-1228*,hsa-miR-181a,hsa-miR-18a*,hsa-miR-107,hsa-miR-299-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-652,hsa-miR-675,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-18b*,hsa-miR-1254,hsa-miR-622,HS_202.1和/或solexa-3927-221的miRNA或其功能部分或衍生物之间的相互作用。如上文所述，所述miRNA包括所述miRNA家族的任意成员。
在一个实施方式中，所述受试者被诊断为具有心力衰竭。而在另一个实施方式中，所述受试者具有增大的心力衰竭的风险，例如，由 于所述受试者已经具有损伤或疾病。在备选实施方式中，执行根据本发明的方法以在未受影响的受试者中一般性地预防心力衰竭。
用于诊断心力衰竭的方法是本领域已知的。例如，通过测定僵硬是否增加，正常的功能例如心脏的电性质是否降低，ECM蛋白是否过量积累，和/或特定基因产物的水平是否高于一定的阈值水平来诊断受试者具有心力衰竭。当受试者具有损伤或病症时，心力衰竭的增大的风险通常存在于该受试者中。
本发明的方法适合于心力衰竭的诊断和治疗性应用。在一个优选的实施方式中，根据本发明的方法用于对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭。因此，还提供了用于治疗和/或预防受试者中的心力衰竭的方法，该方法包括：
-在有此治疗和/或预防需要的受试者中增加如本文中鉴定的在心力衰竭中下调的miRNA的表达、数量和/或活性；和/或降低如本文鉴定的心力衰竭中上调的miRNA的表达、数量和/或活性。这可以通过例如下列方式进行：对于下调的miRNA，增加这些miRNA与靶mRNA之间的相互作用；和/或，对于上调的miRNA，减少这些miRNA与靶mRNA之间的相互作用。
在一个实施方式中，所述受试者被诊断为具有心力衰竭，或具有心力衰竭的风险。在备选的实施方式中，执行所述方法以在未受影响的受试者中一般性地预防心力衰竭。
可以直接增加如本文指明的在心力衰竭中下调的miRNA的表达、数量和/或活性，例如通过施用能够增大所述miRNA的表达和/或活性的激活性化合物来进行。也可以间接增加miRNA的表达、数量和/或活性，例如通过降低miRNA抑制剂的表达、数量和/或活性来进行。对于降低那些如本文指明的在心力衰竭中上调的miRNA的表达、数量和/或活性而言，适用相反的情况。
在优选的实施方式中，通过向所述受试者施用pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA或其功能部分或衍生物来增加miRNA的量。这些化合物中的任意项或这些化合物的任意组合的施用引起靶 mRNA的(增加的)抑制，因此会对抗和/或预防心力衰竭。pri-miRNA是miRNA的初级转录物，长度为数千碱基，其是通过RNA聚合酶II进行的基因组miRNA序列的转录获得的。Pre-miRNA较短，为70-100个核苷酸的茎-环结构，其是在通过核糖核酸酶Drosha进行的pri-miRNA的加工之后获得的。本文中所指的miRNA的序列记载于图3中。
pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的功能部分在本文中定义为具有至少7个核苷酸的长度(分别短于pri-miRNA或pre-miRNA或(成熟的)miRNA)并且能够结合靶mRNA基因(编码miRNA所结合的mRNA的基因)和/或靶mRNA并阻抑从所述编码mRNA或基因的蛋白表达的核酸序列。所述功能部分优选能够结合至靶mRNA上的能被miRNA结合的相同的3’UTR区。所述功能部分优选包括miRNA的种子区(seed region)的序列。miRNA的种子区存在于天然存在的miRNA的5’区域。所述种子区特别参与靶标识别。本领域技术人员通过进行miRNA与mRNA之间的结合实验可以发现miRNA的种子区的序列，无需花费艰难或创造性劳动。因此，pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的功能部分优选为具有至少7个核苷酸的长度的核酸序列，其包含种子区序列。然而，所述种子区的微小修饰是允许的，只要维持其结合靶mRNA基因或靶mRNA的能力。因此，pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的功能部分也包括具有至少7个核苷酸的长度的核酸序列，包括与本文指明的miRNA的种子区的序列具有至少72％，更优选至少80％，更优选至少86％，最优选更优选至少90％序列同一性的序列。
pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的功能衍生物在本文中定义为这样的分子，其包含与pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA具有70％或以上，但小于100％的序列同一性的序列，并且，不考虑定量，与它们具有至少一个相同性质。所述功能等同物能够结合靶mRNA基因和/或靶mRNA，并阻抑所述基因编码的蛋白的表达，虽然不一定与pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的程度相同。此类功能等同物包 括例如：
-这样的多核苷酸：其中向pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的原始序列添加了一个或多个核苷酸；
-这样的pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA分子：其中1％-40％的核苷酸被一个或多个其它核苷酸置换，条件是种子区序列与图3所示的miRNA序列保持至少72％的序列同一性；和/或
-这样的pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA衍生物：其中至少一个核苷酸被修饰，从而得到的产物具有非天然存在的核苷酸。优选地，pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的功能等同物包含与pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA具有至少大约75％序列同一性，优选至少大约80％，更优选至少大约85％，更优选至少大约90％，最优选至少大约95％的序列同一性的核苷酸序列。序列同一性越高，所述功能等同物类似于pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA分子的程度越紧密。
pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA的功能等同物的优选实例是至少包含miRNA的种子区的载体，或包含与种子区序列具有至少72％，优选至少80％，更优选至少86％，最优选至少90％的序列同一性的序列的载体。
术语"％序列同一性"在本文中定义为：在比对序列并任选导入空隙(视需要)以达到最大百分率的序列同一性之后，与目标核酸序列中的核苷酸相同的核酸序列中的核苷酸的百分率。用于比对的方法和计算机程序是本领域熟知的。如本文使用的术语“核酸序列”和“核苷酸”也包括基于和/或衍生于核酸序列的非天然分子，例如人工修饰的核酸序列、肽序列，以及包含至少一个修饰的核苷酸和/或非天然核苷酸、例如肌苷的核酸序列。
用于向细胞中导入多核苷酸的方法是本领域已知的。用于导入核酸的方法包括，例如，磷酸钙转染、DEAE-Dextran、电穿孔或脂质体介导的转染。备选地，使用直接注射多核苷酸。然而优选的是，通过载体将核酸序列导入细胞，优选病毒载体。所述载体优选包括逆转 录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)或慢病毒载体。在一个实施方式中，使用AAV9载体。
本领域已知有多个术语用于指称通过载体将核酸导入细胞中。此类术语的实例有"转导"、"转染"和"转化"。用于产生含有核酸序列的载体和将所述载体导入细胞的技术是本领域已知的。
优选地，使用pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA或其功能部分或衍生物，其能够被导入体内的哺乳动物细胞。根据本发明的方法的非限制性实例是将所述核酸序列偶联于细胞透过性肽、微载体或纳米载体，或使用包含所述核酸序列的脂质体。优选地，所述抑制剂靶向心肌细胞，例如通过使用结合至所述抑制剂的人工HDL-样颗粒，增强向心肌的递送。
根据本发明，通过向患有心力衰竭或具有患心力衰竭风险的受试者施用在所述受试者中下调或表达不足的pri-miRNA或pre-miRNA或miRNA或其功能部分或衍生物，特别好地对抗和/或预防心力衰竭。通过施用能够增加或恢复在所述受试者中下调或表达不足的miRNA的表达、数量和/或活性，或者通过施用能够增加靶mRNA与在所述受试者中下调或表达不足的miRNA之间的相互作用的化合物，来对抗和/或预防心力衰竭。因此，本发明还提供了在所述受试者中下调或表达不足的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA或其功能部分或衍生物，或能够增加或恢复细胞中的如本文指明的在心力衰竭中下调或表达不足的miRNA的表达、数量和/或活性的化合物，或能够增加如本文指明的在心力衰竭中下调或表达不足的miRNA与靶mRNA之间的相互作用的化合物，它们用于对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭。对于如本文指明的在心力衰竭中上调或过表达的miRNA而言，适用相反的情况。
因此，上述化合物或其任意组合特别适合于制备针对心力衰竭的药物或预防性试剂。因此，还提供了如本文指明的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA或其功能部分或衍生物的用途，能够增加或恢复细胞中的miRNA的表达、数量和/或活性的化合物的用途，或能 够增加靶mRNA与所述miRNA之间的相互作用的化合物的用途，用于制备针对心力衰竭的药物或预防性试剂。所述预防性试剂特别适合于具有增加的心力衰竭风险的受试者，以及已经患有心力衰竭的受试者。然而，所述预防性试剂也适合于在未受影响的受试者中一般性预防心力衰竭。
也可以通过增加或减少如本文指明的miRNA的靶mRNA编码的蛋白产物的量或活性来实现上述效应。向受试者施用任意上述化合物或其任意组合特别适合于在所述受试者中对抗和/或预防心力衰竭。在一个实施方式中，向被诊断具有心力衰竭的受试者施用任意上述化合物或其任意组合。在另一个实施方式中，向具有升高的心力衰竭风险的受试者、例如已经具有损伤或疾病的受试者施用任意上述化合物或其任意组合。然而，所述化合物或其任意组合也适合于在未受影响的受试者中一般性预防心力衰竭。
如已经描述的那样，用于确定心力衰竭的存在或风险的方法包括心脏功能的检查。现在发现，可以提供这样的方法，其包括测定如本文指明的(pri/pre)miRNA的积累或靶mRNA编码的蛋白的水平。然而，现在本发明公开了一组miRNA与心力衰竭之间存在的关联，所以另外的方法是可获得的。根据本发明，通过测定受试者的样品中的如本文指明的与心力衰竭相关的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的量是否高于或低于一定的参考值来确定心力衰竭的存在或风险。在一个实施方式中，所述参考值代表健康受试者或健康群体中的选自miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142-3p和solexa-2952-306的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的量。如果受试者的样品中的所述pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的量显著低于参考值，则靶mRNA的表达未被足够地抑制。因此，由靶mRNA编码的蛋白的表达将会太高，所述受试者患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。在这样的情况下，推荐根据本发明的治疗。
另一方面，如果受试者的样品中的选自miR-423-5p,miK-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p, miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-302d和/或solexa-3927-221的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的量显著高于该参考值，则靶mRNA的表达(或靶mRNA向蛋白的翻译)被严重抑制。在这种情况下，受试者也被诊断为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。
可以在从样品、优选血液样品或尿液样品中分离RNA之后测定与心力衰竭相关的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的量。优选在强变性剂例如GITC,LiCl,SDS和/或苯酚存在的情况下进行RNA的分离，以便灭活RNA酶，如果其存在的话。用于分离RNA的方法是本领域已知的，包括使用商售的RNA分离试剂盒，例如mirVana PARIS试剂盒(Ambion)和Trizol LS(Invitrogen)。然而，可以在不预先分离RNA的情况下处理样品以检测miRNA序列，例如通过从样品分离囊泡例如微囊泡。
用于检测样品中的miRNA的方法是本领域技术人员已知的，包括Northern印迹，使用微阵列和大阵列，原位杂交，液相中的单分子检测，大量平行测序和定量聚合酶链式反应(Q-PCR)。优选在检测miRNA序列之前扩增样品中的RNA。用于扩增RNA序列的方法是本领域已知的，包括逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)和基于扩增的核酸测序(NASBA)。优选的扩增方法包括通过例如使用SYBR GREEN(Roche,Basel,Switzerland)或荧光标记的Taqman探针(Applied Biosystems,Foster City,USA)定量扩增RNA序列。
用于逆转录酶介导的cDNA合成的引物可以这样提供：通过连接或通过末端转移酶的作用向所有的miRNA序列提供共有的序列，例如poly(A)-尾巴，然后进行接头-oligo(dT)引物的退火。另外的方法包括使用茎-环引物，和/或使用miRNA特异性引物。优选通过实时PCR进行RNA序列的定量扩增，优选包括普遍引物和miRNA特异性引物。
用于检测、cDNA合成和/或扩增的引物优选包括RNA核苷酸、DNA核苷酸或修饰的核苷酸，例如锁核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸，和/或2'-O-烷基修饰、2'-氟修饰、4'-硫修饰，硫代磷酸酯键， 吗啉键，膦酰羧酸酯键。在优选的实施方式中，引物、优选miRNA特异性引物的长度与特定的miRNA的长度相同。在进一步优选的实施方式中，miRNA特异性引物的长度短于miRNA的长度，例如，14个核苷酸，15个核苷酸，16个核苷酸，17个核苷酸，18个核苷酸，19个核苷酸，20个核苷酸，21个核苷酸，22个核苷酸或23个核苷酸，取决于特定miRNA的长度。相对于miRNA的序列或添加到miRNA上的接头序列，引物、优选miRNA特异性引物的序列优选包含一个或两个错配，更优选与miRNA的序列相同。
用于检测样品中的一个或多个miRNA的方法和工具优选以试剂盒提供。所述试剂盒优选包括引物组，优选至少一组特异性引物，酶，例如RNA依赖性DNA聚合酶和/或DNA依赖性DNA聚合酶，以及用于进行反应的至少一种缓冲液。所述试剂盒可以以干燥物质提供，例如，在冻干后，或作为液体提供。
如果受试者的样品中的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的量与参考值基本上相同，则靶mRNA的表达被足够地抑制。在这种情况下，受试者不被诊断为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。
当然，可以使用除了健康受试者之外的其它类型的参考值。例如，可以使用代表患有心力衰竭的受试者或群体中的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的数量的参考值。在这种情况下，具有基本上等于所述参考值的量的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的样品指示心力衰竭(其风险)。所述值低得多或高得多的样品指示健康。
因此，本发明提供了用于确定受试者是否患有心力衰竭或受试者是否具有增加的患心力衰竭风险的方法，该方法包括：
-从所述受试者获得样品；
-测定所述样品中的本文中指明的与心力衰竭相关的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的量；
-将所述量与参考量进行比较；和
-从所述比较确定该受试者是否患有心力衰竭，或具有患心力衰竭的增加的风险。
优选使用结合性化合物测定受试者的样品中的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的量。优选地，将至少部分样品与此类结合性化合物接触(任选在对样品进行预先处理之后)，然后优选洗掉未结合的成分，优选显示并定量结合的化合物的量。因此，一个实施方式提供了根据本发明的用于确定受试者是否患有心力衰竭或确定受试者是否具有增加的患心力衰竭的风险的方法，该方法还包括：将所述样品的至少一部分与能够特异性结合pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的至少一种化合物接触。当然，如果仅使用一部分所述样品，则使用含有微RNA的部分，从而进行适当的测试。
样品优选是血液或血浆或尿液样品。
本发明还提供了用于执行根据本发明的方法的试剂盒。因此，还提供了试剂盒，其包含：
-能够特异性结合如本文指明的与心力衰竭相关的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的至少一种化合物；和
-使用所述化合物确定受试者是否患有心力衰竭的说明书。
本发明还提供了用于执行根据本发明的治疗的试剂盒。通过此类试剂盒，通常通过miRNA阻抑靶mRNA的表达。根据本发明的试剂盒包含：
-在本文中所指明的在心力衰竭中下调或表达不足的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA，或其功能部分或衍生物，和/或
-能够增加或恢复细胞中的如本文中指明的在心力衰竭中下调或表达不足的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA的表达、数量和/或活性的化合物，和/或
-能够增加靶mRNA与如本文中指明的在心力衰竭中下调或表达不足的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA之间的相互作用的化合物，和
-使用所述化合物在有此需要的受试者中对抗、治疗、减少、延缓 和/或预防心力衰竭的说明书。所述的如本文中指明的在心力衰竭中下调或表达不足的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA或其功能部分或衍生物优选存在于载体中。也可以使用包含编码任意上述化合物的核酸序列的载体。所述载体优选包括病毒载体，最优选逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或慢病毒载体。在一个实施方式中，使用AAV9载体。
因此，还提供了载体，其包含：
-如本文中指明的在心力衰竭中下调或表达不足的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA或其功能部分或衍生物，和/或
-编码能够增加或恢复细胞中的如本文中指明的在心力衰竭中下调或表达不足的miRNA的表达、数量和/或活性的化合物的核酸序列，和/或
-编码能够增加靶mRNA与如本文中指明的在心力衰竭中下调或表达不足的miRNA之间的相互作用的化合物的核酸序列。
在一个优选的实施方式中，所述载体包含：
-miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142-3p和solexa-2952-306中的一项或多项，或其pre-或pri-miRNA，或其功能部分或衍生物，和/或
-编码能够增加或恢复细胞中的miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142-3p和solexa-2952-306中的一项或多项的表达、数量和/或活性的化合物的核酸序列，和/或
-编码能够增加miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142-3p和solexa-2952-306中的一项或多项的靶mRNA与miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142和solexa-2952-306之间的相互作用的化合物的核酸序列。此类载体特别适合于对抗心力衰竭。
根据本发明的载体优选包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或慢病毒载体。在一个实施方式中，所述载体包括AAV9载体。
上述的任意的根据本发明的载体的核酸序列优选地可操作地连接于启动子，从而在转染之后将发生所述核酸的表达。所述启动子优选 适合于在哺乳动物细胞中的表达。在特别优选的实施方式中，根据本发明的载体适合于在心细胞中的表达，从而对抗心力衰竭(其风险)。在该情况下，所述载体优选包含适合于在心细胞中表达的启动子。然而，在另一个实施方式中，根据本发明的载体包含普遍的启动子。有利的是使用可诱导启动子，从而可以按照需要调节根据本发明的(至少一个)载体核酸的表达。可诱导型启动子的非限制性实例有心肌钙蛋白和α肌球蛋白重链，其为心肌细胞特异性启动子。在一个实施方式中，可以使用心成纤维细胞特异性启动子。
根据本发明的载体特别适合于治疗。因此，还提供了如上文定义的载体在制备用于对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的药物和/或预防性试剂中的用途。
还提供了用于在受试者中对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗量的根据本发明的载体。如上所述，所述载体优选包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或慢病毒载体。在一个实施方式中，使用AAV9载体。本文还提供了包含根据本发明的载体的分离或重组的细胞。
可以在体外向细胞提供pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA。此类细胞特别适合于研究目的。此外，此类细胞适合于治疗。例如，可以向受试者施用过表达miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142-3p和solexa-2952-306中的一项或多项的细胞，以降低心力衰竭的风险。因此，还提供了能够过表达miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142-3p和solexa-2952-306中的一项或多项或其功能部分或衍生物的分离的细胞在制备用于对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的药物和/或预防性试剂中的用途。备选地，提供了能够过表达、优选分泌如本文指明的在患有心力衰竭的受试者中过表达的miRNA的靶mRNA编码的一种或多种蛋白的分离的细胞的用途。
本文还提供了允许预防和/或治疗心力衰竭的药物组合物，其包含如本文指明的一种化合物或化合物的组合，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
根据本发明的药物组合物可以包含在本文中指明的其下调或表达不足与心力衰竭相关的pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA或miRNA的功能部分或衍生物，和/或
-能够增加或恢复细胞中的所述miRNA的表达、数量和/或活性的化合物，和/或
-能够增加靶mRNA与所述miRNA之间的相互作用的化合物，和/或
-能够在细胞中表达所述miRNA的根据本发明的载体，和/或
-能够过表达所述miRNA或其功能部分或衍生物的细胞，和/或
-如本文指明的其上调或过表达与心力衰竭相关的miRNA的靶mRNA编码的蛋白，或能够表达所述蛋白的载体或细胞，
以及药学上可接受的载体载体、稀释剂或赋形剂。
还提供了用于在受试者中对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗量的根据本发明的药物组合物。
还提供了非人动物，其包含：
-包含如本文指明的其上调或下调与心力衰竭相关的一种或多种pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或miRNA或其功能部分或衍生物的外源核酸序列，和/或
-编码能够增加或抑制细胞中的如本文指明的其下调或上调与心力衰竭相关的miRNA或其功能部分或衍生物的表达、数量和/或活性的化合物的外源核酸序列，和/或
-编码能够增加靶mRNA与如本文指明的其上调或下调与心力衰竭相关的miRNA之间的相互作用的化合物的外源核酸序列。
所述非人动物优选包括哺乳动物。在一个优选实施方式中，所述非人动物包括测试动物，例如啮齿类、兔子、山羊、母牛、绵羊或猴子。还提供了向其中提供了根据本发明的载体、分离的细胞和/或药物组合物的非人动物。根据本发明的非人动物尤其适用于筛选、检测和/或鉴定能够抑制或降低如本文指明的心力衰竭中上调的miRNA的表 达、数量和/或活性的候选化合物。所述非人测试动物尤其适用于筛选、检测和/或鉴定能够降低靶mRNA与其对应的miRNA之间的相互作用的候选化合物。因此，根据本发明的非人测试动物尤其适用于筛选、检测和/或鉴定能够诱导或增强心力衰竭的候选化合物。如果候选化合物似乎具有此性质，则推荐避免向人类受试者施用。
在根据本发明的治疗方法中，受试者优选是哺乳动物，最优选是人，在优选实施方式，如本文指明的miRNA是指智人(has)的miRNA。
在另一个实施方式中，提供了用于筛选、检测和/或鉴定能够对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的候选化合物的方法。在该实施方式中，通常就潜在的增加那些下调与心力衰竭相关的miRNA的表达、数量和/或活性的能力、就潜在的降低那些上调与心力衰竭相关的miRNA的表达、数量和/或活性的能力，或具有对抗如本文指明的与异常miRNA表达相关的异常蛋白表达的效应的能力来筛选候选化合物。如果候选化合物似乎具有此性质，则其能够对抗或预防心力衰竭。因此，还提供了用于确定候选化合物是否能够对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的方法，所述方法包括：
-将所述候选化合物与细胞、优选心细胞接触；和
-确定所述候选化合物是否能够在所述细胞中对抗如本文指明的与异常miRNA表达相关的异常蛋白表达的效应。
在一个优选实施方式中，将候选化合物与根据本发明的细胞接触，在所述细胞中miRNA(优选为在心力衰竭下调的)的表达是降低的，从而候选化合物对于miRNA表达或活性的效应更加清晰可见。然而，也可以使用本领域目前已知的任何细胞或非人动物进行根据本发明的筛选方法。在一个实施方式中，使用根据本发明的非人动物。
在另一个实施方式中，就增加靶mRNA与如本文指明的miRNA或其功能部分或衍生物之间的相互作用的能力来筛选候选化合物。如果候选化合物似乎具有针对那些其下调与心力衰竭相关的miRNA的性质，则其能够对抗或预防心力衰竭。因此，还提供了用于确定候选化合物是否能够对抗、治疗、减少、延缓和/或预防心力衰竭的方法， 该方法包括：
-将所述候选化合物与细胞、优选心细胞接触；和
-确定所述候选化合物是否能够在所述细胞内增加mRNA与miR-191,miR-30e,miR-744,miR-142-3p和solexa-2952-306中的一项或多项或其功能部分或衍生物之间的相互作用。
在优选的实施方式中，根据本发明的用于诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭风险的方法包括(a)测定选自miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,solexa-3927-221,miR-191,miR-302d,miR-30e,miR-744,miR-142-3p和/或solexa-2952-306的至少一种miRNA或其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物的水平；和(b)基于步骤(a)中所测的所述的至少一种遗传标志物的水平诊断该受试者患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险。优选的miRNA是miR-423-5p。
在另一个优选的实施方式中，根据本发明的方法包括测定选自miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,solexa-3927-221,miR-191,miR-302d,miR-30e,miR-744,miR-142-3p的至少两种miRNA和/或solexa-2952-306或其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物的水平，例如选自miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,solexa-3927-221,miR-191,miR-302d,miR-30e,miR-744,miR-142-3p和/或solexa-2952-306的2种miRNA、3种miRNA、4种miRNA、5种miRNA、6种miRNA、7种miRNA、8种miRNA、9种miRNA、10种miRNA、15种miRNA、20种miRNA或全部miRNA或其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物。
在优选的实施方式中，所述至少两种miRNA选自miR-423-5p和miR-191*,miR-423-5p和miR-15b,miR-423-5p和miR-1228*,miR-423-5p和miR-181a,miR-423-5p和miR-18a*,miR-423-5p和miR-107,miR-423-5p和miR-299-3p,miR-423-5p和miR-342-3p,miR-423-5p和miR-652,miR-423-5p和miR-675,miR-423-5p和miR-129-5p,miR-423-5p和miR-18b*,miR-423-5p和miR-1254,miR-423-5p和miR-622,miR-423-5p和HS_202.1,miR-423-5p和miR-191,miR-423-5p和miR-302d,miR-423-5p和miR-30e,miR-423-5p和miR-744,miR-423-5p和miR-142-3p,miR-423-5p和solexa-2952-306，或，miR-423-5p和solexa-3927-221。
根据本发明的优选的诊断和/或预后方法还包括检测可用于诊断和/或预后心力衰竭的一种或多种生物标志物。这些生物标志物优选包括炎性标志物，例如C-反应性蛋白，和炎性细胞因子，例如白介素-6和肿瘤坏死因子(TNF)；氧化应激的指示物，例如血浆和尿液中的低密度脂蛋白、丙二醛和髓过氧化物酶和异构前列腺素水平；心室的细胞外基质重塑的标志物，例如I型前肽前胶原和/或III型前肽前胶原；神经激素，例如去甲肾上腺素和内皮素-1的血浆水平；肌细胞损伤的标志物，例如心肌钙蛋白T和I；心重塑和纤维化的标志物，例如半乳凝素-3；以及肌细胞应激标志物，例如钠肽BNP和N-末端前脑钠肽(NT-pro-BNP)、肾上腺髓素和ST2(白介素-1受体家族的成员)。根据本发明的另一个优选的诊断和/或预后方法还包括常规方法，例如，心电图、超声波心动描记术和/或心脏磁共振成像(CMR)。
在另一个优选的实施方式中，根据本发明的诊断和/或预后方法的结果至少部分确定患有心力衰竭或具有患心力衰竭风险的受试者的治疗方法。可能的治疗方法包括食谱措施，例如减少钠的摄入，肥胖受试者的体重减少，和/或鼓励戒烟；开处方药，例如血管紧缩素转化酶抑制剂和/或β-肾上腺素受体拮抗剂；和/或侵入性程序，例如血管再形成程序，二尖瓣手术、心室恢复和心脏移植。治疗的选择可以至少部分取决于在获自受试者的样品中测定的选自下列的至少一种遗传标 志物的性质和/或表达水平：miR-423-5p,miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miK-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-191,miR-302d,miR-30e,miR-744,miR-142-3p,solexa-2952-306和solexa-3927-221及其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物。
药物组合物和治疗应用
药物组合物可以包括要求保护的本发明的多肽、多核苷酸或小分子，在本文中联合起来称作药学化合物。药物组合物将包含治疗有效量的如本文描述的生物标志物蛋白、多核苷酸或小分子。
如本文使用的术语“治疗有效量”是指用于治疗、缓解或预防目标疾病或病况或用于显示可检测的治疗或预防效应的治疗剂的量。可以通过例如临床标志物或抗原水平来检测所述的量。治疗效应还包括身体症状的减少。用于受试者的精确的有效量将取决于受试者的体形和健康状况，病况的性质和程度，以及所选的用于施用的治疗剂或治疗剂的组合。因此，事先指明精确的有效量是无用的。然而，给定状况的有效量可以通过常规实验确定，并且可由临床医生判断。
为了本发明的目的，施用至个体的有效剂量将是大约0.01mg/kg至50mg/kg或0.05mg/kg至大约10mg/kg多核苷酸或多肽成分。
药物组合物也可以包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”是指用于施用治疗剂、例如多肽、多核苷酸和其它治疗剂的载体。该术语是指自身不诱导产生对于接受组合物的个体有害的抗体并且可以施用而无不适当毒性的任意药学载体。适宜的载体可以是大的，缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。此类载体是本领域普通技术人员熟知的。
可用于其中的药学上可接受的盐有，例如，矿物质酸盐，例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸等的盐；以及有机酸例如乙酸、丙酸、丙二酸、苯甲酸等的盐。关于药学上可接受的赋形剂的详细讨论见 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)。
治疗性组合物中的药学上可接受的载体可以包括液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。另外，此类介质中可以存在辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常而言，治疗性组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备适合在注射前溶解于或悬浮于液体介质中的固体形式。脂质体包括在药学上可接受的载体的定义内。
递送方法
配置完成之后，本发明的药物组合物可以(1)直接施用至受试者；(2)离体递送至源自受试者的细胞；或(3)体外递送以表达重组蛋白。
组合物的直接递送一般通过注射完成，可以通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内；或者递送至组织的间质间隙(interstitial space)。也可以将组合物施用至神经系统。其它施用途径包括表面、口、栓剂和透皮施用、针和颗粒枪或无痛皮下喷射器(hypospray)。剂量处理可以是单剂方案或多剂方案。
用于离体递送和将经转化的细胞再植入受试者中的方法是本领域已知的，描述于例如国际公开号WO93/14778。离体应用的细胞的实例包括例如，干细胞、尤其是造血干细胞，淋巴细胞，巨噬细胞，树突细胞或肿瘤细胞。
一般地，用于离体和体外应用的核酸的递送可以通过例如葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸封装于脂质体中，和直接将DNA微注射进入细胞核来进行，如本领域熟知。
可以使用多种方法将治疗性组合物直接施用至体内的特定位点。也可以使用含有反义多核苷酸、亚基因组多核苷酸或针对特定组织的抗体的治疗性组合物的受体介导的靶向递送。受体介导的DNA递送技术描述于例如Findeis等人.,Trends in Biotechnol.(1993)11:202-205；Wu等人.,J.Biol.Chem.(1994)269:542-46。
包含多核苷酸的药物组合物优选地以大约100ng至大约200mg的多核苷酸来施用，以在基因治疗程序中局部施用。也可以在基因治 疗程序中使用大约500ng至大约50mg、大约1μg至大约2mg、大约5μg至大约500μg和大约20μg至大约100μg的多核苷酸。诸如作用方法和转化及表达功效将是影响多核苷酸的最终功效所需的剂量的考虑因素。当需要在较大的组织区域的较高表达时，可能需要在连续施用程序中再次施用较大量的多核苷酸或相同的量，或数次施用至例如神经末梢或突触的不同的邻近的或靠近的组织部分，以达到阳性治疗结果。在所有的情况下，临床试验中的常规实验将确定用于最佳治疗效果的具体范围。关于基因治疗载体的更完整的描述、尤其是逆转录病毒载体，包含于WO98/00542中，其明确地并入本文。
现在将通过以下非限制性实施例来例示本发明。
实施例
实施例1.使用miRNA作为检测心力衰竭的循环生物标志物
从2个健康个体和3个心力衰竭患者采血。在1550x g离心15分钟之后收集血浆。根据生产商的说明书，使用RNA分离PARIS试剂盒(Applied Biosystems)分离小RNA。使用Illumina人类miRNA表达谱板(用于珠芯片的用户卡，cat#MI-501-1001,part#11297760RevA)进行miRNA表达谱测定。这是试点阵列。使用Genespring软件进行校正。
发现总共有9种miRNA在心力衰竭患者的血液上显著上调，有6种miRNA下调(见表1和图1-2)。
这些显著调节的miRNA可用作检测心力衰竭的生物标志物。
表1.在心力衰竭患者的血浆中中差别化表达的miRNA
在HF中上调的
在心力衰竭中下调的
实施例2.使用miRNA作为检测心力衰竭的循环生物标志物。确定性阵列。
在为了此次新筛选而特别产生的新阵列上就重叠的miRNA组重 复以上实施例。从12个健康个体和12个心力衰竭患者采血。在1550xg离心15分钟之后收集血浆。根据生产商的说明书，使用RNA分离mirVana PARIS试剂盒(Applied Biosystems)分离小RNA。使用Illumina人类miRNA表达谱进行miRNA表达谱测定。使用Genespring软件进行校正。
通过QPCR确认显示于图4中的阵列结果。发现有一种miRNA(solexa-3927-221)在本实验中上调，而在图1的试点阵列实验中其显示为下调。QPCR结果确认了该miRNA事实上在心力衰竭患者中是上调的。确认了其余的miRNA。
这些差别化调节的miRNA可用作生物标志物以检测心力衰竭。
实施例3.使用miRNA作为检测心力衰竭的循环生物标志物。在独立的临床研究中验证。
方法
在知情同意的情况下，在Academic Medical Center的机构审查委员会关于人类材料的正确二次应用的一般豁免下，获得人血浆样品。关于呼吸困难登记，以荷兰的多中心努力(涉及3个中心)的一部分获得血浆样品。以获自Academic Medical Center的样品进行所描述的实验。
当受试者满足Framingham的诊断标准并且循环的NT-proBNP高于1000ng/L时，将受试者归类为HF病例。如果临床诊断排除HF并且循环的NT-proBNP低于Januzzi等人(Januzzi等人.2006.Eur Heart J27:330)公布的年龄相关的临界值，则将受试者归类为非HF病例。总计在77位患者中有50位就呼吸困难登记进行了筛选的患者满足标准。
对39位健康对照和50位呼吸困难登记的受试者进行了研究。在这50位受试者中，有20位受试者诊断为不具有HF，有30位受试者诊断为具有HF。使用students t-检验或Mann-Whitney-U-检验比较了病例与对照的miRNA表达水平。使用逻辑回归分析法进行分析。在 区分HF病例和非HF病例或健康对照的逻辑回归模型的预测概率的多个截止水平构建受试者特征曲线(ROC)。估计ROC曲线下的面积(AUC)以测定miRNA的诊断精确性。使用SPSS进行所有的分析，所有的统计学测试均为双侧的。对于所有的分析，p-值<0.05被认为是统计学上显著的。
心肌组织
我们从死于先天性DCM的受试者获取了尸检心肌样品，从死于非心脏诱因的受试者获得了心肌样品，使用Trizol(Invitrogen)提取总RNA。确定RNA的质量，然后使用实时PCR测定miR-423-5p的表达水平。就U6的表达进行校正以评价miR-423-5p的相对心肌表达。.
血液处理
通过直接静脉穿刺法收集所有受试者的血液，收集于含有2.7ml柠檬酸钠的管(BD Biosciences363048)中。为了进行miRNA阵列，从受试者中获取10.8ml血液，为了进行实时PCR，收集5.4ml血液。在收集后4小时的时间内，处理所有血液以分离血浆。通过在1550xg在室温离心10分钟来处理血液。将血浆仔细地转移到新鲜的不含RNA酶/DNA酶的管中，并储存于-80℃。
RNA分离
为了进行miRNA阵列，我们分离了4.4ml血浆的RNA，为了进行实时PCR，我们分离了500μl血浆的RNA。将血浆在冰上解冻，根据生产商关于液体样品的说明书，使用mirVana PARIS试剂盒(Ambion)分离RNA。修改了程序：使用等体积的酸苯酚氯仿进行两次样品提取，在最后的洗涤步骤之后和洗脱之前使柱干燥3分钟。
miRNA阵列
为了进行miRNA阵列，将50μl洗脱的样品浓缩至12μl；对于 每个样品，使用5μl进行阵列。在这些样品上进行Illumina人v2miRNA表达谱。Illumina miRN珠芯片探测1146种miRNA以及其它的预测为miRNA的小RNA。使用统计软件包R(2.9.0版本)中的珠阵列包(1.12.1版本)对原始数据进行预处理、总结、对数转化和分位数校正。使用limma包(2.18.3版本)，使用适度t-检验分析差别化表达。如果P-值小于0.05，则认为微RNA是显著差别化表达的。
实时PCR
对于血浆样品，使用来自RNA分离的洗脱物的8μl的固定体积，对于心肌组织样品，使用1μg的输入RNA作为逆转录反应的输入物。根据生产商的说明书，使用miScript逆转录试剂盒(Qiagen)逆转录输入的RNA。使用High Resolution Melting Master(Roche)进行实时PCR。以2.5mmol/L的终浓度使用MgCl2，在10μl的总体积中使用2μl8倍稀释的cDNA。正向引物具有与成熟的miRNA序列相同的序列，其中将所有的U改变为T，反向引物的序列为GAATCGAGCACCAGTTACGC，其互补于用于产生miRNA的cDNA的RT引物的接头序列(miScript逆转录试剂盒的一部分)。使用如下程序在LightCycler480系统II(Roche)上进行实时PCR：在95℃预温育10分钟，40个循环的“95℃变性45秒、55℃退火45秒、72℃延伸45秒”。使用LinRegPCR定量PCR数据分析软件(11.3.3版本)分析数据。就miR-1249的估计的起始浓度校正通过该软件评估的miRNA的起始浓度，miR-1249是我们的miRNA阵列中稳定表达的内源性miRNA。
结果
HF患者的血浆中的miRNA的表达谱
在来自12位HF患者和12位健康对照的血浆的RNA中进行了miRNA阵列(Illumina珠芯片,人v2miRNA组)。在HF患者和对照中显著差别化表达的miRNA共有108种。从这些之中，我们基于它 们的倍数变化和概率值选择了16种miRNA，以进行进一步验证。
在独立群体中验证候选miRNA
我们在3组新的受试者中验证了16种候选miRNA的表达。第一组由来自诊断为HF的呼吸困难登记受试者组成(HF病例，n＝30)，第二组受试者也是来自呼吸困难登记，但是临床诊断为没有HF(非HF病例，n＝20)，第三组由健康对照组成(n＝39)。在HF病例中，30位受试者中有19位具有低于45％的射血分数(EF)，而在20位非HF病例中，有3位受试者具有低于45％的EF。因此后述3位受试者具有左侧心室功能不调，但是不具有临床和NTproBNP标准被诊断为HF。通过实时PCR测定了miRNA的表达水平，并根据miR-1249的表达水平进行校正，miR-1249被发现在本阵列中是不变的。图5中显示了HF病例、健康对照的miRNA水平的倍数变化。
候选miRNA的诊断精确性
发现一种miRNA，miR-423-5p，是多变量逻辑回归模型(包括年龄和性别)中的HF诊断的显著预测者。图6显示：相对于健康对照和呼吸困难非HF病例，miR-423-5p在HF病例中特别地升高。MiR-423-5p将HF病例与健康对照区别开，曲线下面积(AUC)是0.91(95％置信区间，0.84至0.98)。当比较HF与非HF病例时，miR-423-5p的预测能力在呼吸困难登记中也是高的(AUC,0.83；95％置信区间，0.71至0.94)。循环的miR-423-5p与NT-proBNP和EF相关(分别是：Spearman相关系数：0.43，概率值：0.002；Spearman相关系数0.34，概率值：0.023)。相对于正常人心脏，衰竭的人心肌中的miR-423-5p的表达升高3倍(见图7)。
除了miR-423-5p之外，发现6种其它的miRNA(miR-18b*,miR-129-5p,miR-1254,miR-675,HS_202.1和miR-622)在HF病例中也升高，其中miR-18b*和miR-675显示于图6。然而，在呼吸困难群体中，miR-18b*在非HF病例中也稍有升高，而miR-675在非HF病 例中甚至上调至与HF病例相同的程度。这说明：当呼吸困难不是由HF引起时，最初通过比较HF病例与健康对照而鉴定的一些miRNA实际上也表现为升高，因此对于HF的特异性较低。然而，已知，在由于右侧心室负担过重而引起的肺病的情况下，NT-proBNP也可能稍有升高，所以miRNA例如miR-18b*仍然可以作为HF的有价值的生物标志物。
为了研究候选miRNA是否与疾病严重性或病因学相关，我们根据HF患者的EF、NYHA类别或潜在病因对他们进行了分类。相对于具有>45％的EF的受试者，在具有≤45％的EF的受试者中，循环的miR-423-5p和miR-18b*的水平较高，但未达到统计学上的显著性。miR-423-5p以及其它miRNA例如miR-18b*的循环水平随着NYHA类别的升高而升高。最后，相对于非动脉粥样硬化形式的HF，在动脉粥样硬化形式的HF中，一些候选miRNA(miR-423-5p和miR-675，但miR-18b*不是)较高(见图8)。
Claims (3)
1.测定获自受试者的体液中的微RNA或其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物的水平的试剂在制备用于诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭风险的试剂中的用途，所述诊断包括：
a)测定获自所述受试者的体液中的微RNA或其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物的水平；
b)基于步骤a)中测定的微RNA或其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物的水平诊断该受试者是否患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险；
其中所述微RNA选自miR-191*,miR-15b,miR-1228*,miR-181a,miR-18a*,miR-107,miR-299-3p,miR-342-3p,miR-652,miR-675,miR-129-5p,miR-18b*,miR-1254,miR-622,HS_202.1,miR-191,miR-302d,miR-30e,miR-744,miR-142-3p,solexa-2952-306和solexa-3927-221。
2.权利要求1的用途，其中，当下列情况时，所述受试者被诊断为患有心力衰竭或预后为具有患心力衰竭的风险：
-所述微RNA或其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物的表达、数量和/或活性相对于未患有心力衰竭或不具有患心力衰竭风险的对照受试者而言上调。
3.诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险的试剂盒，其包含：
-能够特异性结合微RNA或其前体微RNA(pre-miRNA)或微RNA初级转录物的至少一种化合物；和
-使用所述化合物根据权利要求1或2的用途诊断受试者为患有心力衰竭或具有患心力衰竭的风险的说明书。
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