CN107184594A - miR‑142‑3p用于预防和/或治疗心脏疾病的组合物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了miR‑142‑3p用于预防和/或治疗心脏疾病的组合物及应用，所述组合物中含有miR‑142‑3p及含有miR‑142‑3p的编码基因的重组载体、重组病毒、重组病毒载体，所述miR‑142‑3p的序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA；所述药物组合物包括有效剂量的miR‑142‑3p及其药学上可接受的载体、病毒或辅料。本发明说明miR‑142‑3p通过抑制心肌细胞肥大对心脏具有保护作用，它对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值，可称为一种治疗心肌肥大，预防心肌纤维化的药物。

Description

miR-142-3p用于预防和/或治疗心脏疾病的组合物及应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，涉及一种内源性非编码小RNAs的新药及其用途，尤其是涉及miR-142-3p用于预防和/或治疗心脏疾病的组合物及应用。

背景技术

心血管疾病主要包括高血压、冠心病和充血性心力衰竭等，心血管疾病是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因，预防和治疗心血管疾病仍然是医学与生物学的重大任务。

心肌肥大是指组织水平上心肌组织的增厚和细胞水平上心肌细胞体积的增大的总称，是由于心肌细胞体积增大而导致心脏体积增大所发生的一种疾病。该病是由一些生理和病理因素的共同刺激而发生的，是许多心血管疾病的综合性表现；心肌肥大是心肌病的一种，是心肌细胞针对于血液动力学增加的一种应答反应，多种情况可引起人体内血液动力的增加，如高血压，心脏瓣膜疾病。长期的超负荷血液动力刺激会引起以心肌细胞体积增大为特征的心肌细胞重塑过程，就是心肌肥大。现在一般认为存在两种情况的心肌肥大，一种是正常的生理性肥大，比如出生后伴随着发育发生的心肌肥大，还有体育锻炼引起的心肌肥大；另外一种是病理性心肌肥大，其早期特征是室壁和室间隔增厚，心肌收缩功能增强，因此被视为代偿性肥大，如果病情一直未得到缓解，心肌肥大后期会发生心室壁间质纤维化、心肌细胞收缩功能失调以及能量代谢，基因表达和电生理特征的异常，最终导致心脏功能衰竭。鉴于心肌肥大的发生是一个进行性不可逆过程，而且最终会引起心力衰竭，现代医学已经把它作为心脏发生临床病变的一个里程碑式的心肌形态变化，认为它是导致心脏疾病和心脏猝死的一个危险因素。

随着近来miRNA研究应用的热潮，内源性非编码小RNAs已经作为一个基因表达调节的中心因子显露，参加许多重要的生理过程，对于 miRNA来说，调控方式的特点决定其靶基因不会只有一个，是一对多的方式，使得miRNA的功能究内容丰富；miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值。

尽管越来越多的miRNA作为人类疾病的生物标志物及治疗靶点被发现，但在心脏肥厚和心肌纤维化心脏疾病中的关键miRNA仍没有确定。

针对现有技术中存在的上述问题，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是确定或发现调控心肌细胞肥大的在心脏中表达的 miRNA，确定其在心肌肥大、冠心病、心肌纤维化等心脏疾病中的关键作用，将其应用到这些心脏疾病的诊断、防治中。所以本发明提供了一种 miR-142-3p在制备用于预防和/或治疗心脏疾病方面的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种用于预防和/或治疗心脏疾病的组合物。

本发明的第三个目的是提供一种用于预防和/或治疗心脏疾病的产品。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种用于预防和/或治疗心脏疾病的组合物，所述组合物含有如下任一种物质：

Ⅰ、miR-142-3p；

Ⅱ、含有miR-142-3p的编码基因的重组载体；

Ⅲ、含有miR-142-3p的编码基因的重组病毒；

Ⅳ、含有miR-142-3p的编码基因的重组病毒载体。

优选地，所述miR-142-3p的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述SEQ ID No.1的序列如下：

UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA。

上述的组合物在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的药物中的应用。

优选地，所述组合物还包括药学上可接受的载体或辅料。

优选地，所述药学上可接受的载体或辅料选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或几种。

优选地，所述药物的剂型包括口服制剂、注射制剂、片剂和干粉剂中的一种或几种。

优选地，所述心脏疾病包括心机肥厚、心机纤维化、冠心病或心衰。

优选地，所述诊断和/或预防和/或治疗心脏疾病是通过miR-142-3p过表达能抑制心肌细胞肥大的发生实现的。

一种用于预防和/或治疗心脏疾病的产品，所述产品含有如下任一种物质：

Ⅰ、miR-142-3p；

Ⅱ、含有miR-142-3p的编码基因的重组载体；

Ⅲ、含有miR-142-3p的编码基因的重组病毒；

Ⅳ、含有miR-142-3p的编码基因的重组病毒载体；

其中，所述miR-142-3p的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述产品包括药物。

本发明的有益效果如下：

本发明在大量实验的基础上，证明miR-142-3p通过抑制心肌细胞肥大对心脏具有保护作用，它对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值，可成为一种治疗心肌肥大，预防心肌纤维化的药物。具体的，可以合成 miR-142-3p的核苷酸并与适当载体如胆固醇，纳米颗粒，脂质体等连接形成药物，通过口服，静脉或肌肉注射的方式，心肌肥大和心肌纤维化等心脏疾病进行治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为心脏肥大刺激因子Ang Ⅱ(血管紧张素)诱导的心肌细胞肥大过程中miR-142-3p表达水平的变化情况；

图2A为原代心肌细胞转染Ang Ⅱ mimics后对心肌细胞表面积的抑制情况；

图2B为原代心肌细胞转染Ang Ⅱ mimics后其蛋白/DNA比率的变化情况；

图2C为原代心肌细胞转染Ang Ⅱ mimics后肥大标志基因ANF表达的变化情况；

图3表明原代心肌细胞转染Ang Ⅱ mimics其肌小节重排的情况。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的发明人发现，miR-142-3p在肥大的心肌细胞中表达显著下调。通过脂质体转染miR-142-3p模拟物(mimics)发现，miR-142-3p过表达在细胞水平能抑制心肌细胞肥大的发生，大鼠乳鼠心肌原代细胞过表达miR-142-3p后在用肥大刺激因子处理后与对照组相比有了明显的肥大表型及纤维化程度的降低，同时一些肥大基因的表达也与对照组相比有了明显的降低。

具体的，本发明发现miR-142-3p在肥大的心肌细胞中与对照组相比有了明显的下降，对其进行肥大指标的检测发现，心肌肥大的指标如细胞表面积，蛋白/DNA的比值及肌小节的重组也与对照组相比都有了明显的下降。以上实验说明miR-142-3p能够抑制心肌肥大的发生，这意味着 miR-142-3p可作为一种早期诊断和早期预防心肌肥大，心肌纤维化等心脏疾病的生物标志物。

发明人提出了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的组合物，该组合物含有如下任一种物质：

Ⅰ、miR-142-3p；

Ⅱ、含有miR-142-3p的编码基因的重组载体；

Ⅲ、含有miR-142-3p的编码基因的重组病毒；

Ⅳ、含有miR-142-3p的编码基因的重组病毒载体；

其中，所述miR-142-3p的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

发明人将上述的组合物用于制备预防和/或治疗心脏疾病的药物；所述组合物还包括药学上可接受的载体或辅料；所述心脏疾病包括心机肥厚、心机纤维化、冠心病或心衰。

在一个优选的实施例中，药学上可接受的载体或辅料选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或几种。

在另一个优选的实施例中，药物的剂型可以为口服制剂、注射制剂、片剂和干粉剂中的一种或几种。

上述的预防和/或治疗心脏疾病是通过miR-142-3p过表达能抑制心肌细胞肥大的发生实现的。

或者还可以将下述任一种物质用于预防和/或治疗心脏疾病的产品，

Ⅰ、miR-142-3p；

Ⅱ、含有miR-142-3p的编码基因的重组载体；

Ⅲ、含有miR-142-3p的编码基因的重组病毒；

Ⅳ、含有miR-142-3p的编码基因的重组病毒载体；

其中，所述miR-142-3p的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例1

在Ang Ⅱ(血管紧张素)刺激下miR-142-3p表达水平的变化

1.制备大鼠乳鼠原代心肌细胞

1)高压灭菌实验用的器材，包括剪刀、镊子、刀片、玻璃平皿、260目过滤网、50mL锥形瓶、小转子、枪头、移液管，准备好实验用所有试剂；准备好冰盒、37℃气浴摇床；

2)用Poly-L-lysin处理最终要培养心肌细胞的培养皿，37℃，1小时然后用无菌三蒸水洗2-3次，晾干；Poly-L-lysin的作用是使培养皿利于心肌细胞贴壁；

3)在超净台中准备好一个冰盒，将4个盛有1×ADS buffer的培养皿放在冰盒上预冷；

4)将1-2天的SD大鼠乳鼠，不分雌雄，放进75％酒精中清洗消毒2次；

5)左手将小鼠抓住，暴露前胸，右手用剪刀在小鼠左胸剪一刀，左手轻轻一捏，将小鼠心脏挤出胸腔，拿无菌镊子将心脏心尖大部分夹下来，在1 ×ADS buffer中清洗3次，镊子轻轻挤压心脏，将血挤尽；最后放在干净预冷的5mL 1×ADS buffer中。按照这个方法，取出所有小鼠的心脏；

6)用刀片将切碎所有心脏组织，大约切15min，最终心脏组织块约 1mm*3mm大小，注意心脏组织块不宜太大或太小，否则会影响后面的消化效果；

7)用移液器将组织块和ADS缓冲液转移至50mL锥形瓶，加入8mL消化液，37℃气浴摇床中摇晃消化5min；取出锥形瓶，静止1min，将上清全部弃掉，此时上清中大部分为残留的血细胞和杂质；

8)加入10mL消化液，吸打混匀，37℃气浴摇床,摇晃消化15min，取出锥形瓶，静止1min，吸取上清转移至盛有3mL马血清的50mL离心管中，终止消化，终止消化的细胞放在冰上；

9)组织块中继续加入8mL消化液，吸打混匀，37℃气浴摇床中摇晃消化10min；取出锥形瓶，静止1min，吸出上清转移至盛有马血清的离心管中，终止消化；

10)重复以上步骤，每次的消化液体积和消化时间分别为：8mL/10min； 8mL/10min；8mL/10min；8mL/10min；8mL/10min；5mL/5min至结束，结束标志为心脏组织几乎完全消失；

11)将收集的细胞离心，800rpm，5min，弃上清；

12)加入含5％马血清的DMEM/F12，吸打混匀细胞进行清洗，800rpm 离心5min；弃上清；

13)重复上述步骤一次；

14)加入10mL含5％马血清的DMEM/F12重悬细胞，然后用260目细胞筛过滤到10cm培养皿中，37℃培养箱中培养1小时；

15)根据心肌细胞贴壁慢，非心肌细胞贴壁快的原理，差速贴壁1小时后，将上清吸出转移至50mL离心管中；

16)在上清细胞中，加入10-4M的Brdu，混匀，分装到Poly-L-lysin处理过的培养皿中，细胞浓度约为1×105/mL，37℃培养箱中培养过夜，Brdu 的作用是抑制非心肌细胞生长，进一步去除非心肌细胞；

17)次日，在心肌细胞培养约20小时后，给细胞换液，用1×ADS buffer 清洗一次，换液后便可以进行实验了。

2.对心肌细胞用Ang Ⅱ进行处理

在培养的不同时间，提取细胞的总RNA，实时荧光定量PCR技术检测 miR-142-3p的表达水平，如图1所示，为大鼠乳鼠原代心肌细胞经Ang Ⅱ处理后miR-142-3p随时间的表达水平，纵坐标以未处理的大鼠原代心肌细胞中miR-142-3p的表达水平为基准，表示在AngⅡ处理过程中大鼠原代心肌细胞中miR-142-3p的表达水平。图1说明miR-142-3p表达水平在Ang Ⅱ处理12小时后显著降低。

实施例2

miR-142-3p能够在细胞水平上抑制Ang Ⅱ所诱导的肥大

1.制备大鼠乳鼠原代心肌细胞，操作步骤与实施例1相同，

2.对原代心肌细胞转染miR-142-3p mimics。

对原代心肌细胞转染miR-142-3p mimics后，能有效的增加miR-142-3p 的表达，同时细胞用Ang Ⅱ对心肌细胞进行处理，及同时用miR-142-3p的阴性对照(miR-NC)处理，经过48小时之后，对心肌细胞进行心肌肥大指标的检测，如图2所示，实验结果证明miR-142-3p能够有效的抑制Ang Ⅱ所诱导的心肌细胞肥大。

图2A至2C表明miR-142-3p能够在细胞水平上抑制Ang Ⅱ所诱导的肥大，其中图2A表明原代心肌细胞转染Ang Ⅱ mimics能够抑制心肌细胞的表面积，其中纵坐标表示在诱导心肌细胞肥大的过程中，每个样品与对照 (不存在任何物质的情况下心肌细胞面积)的百分比，图2B表明原代心肌细胞转染Ang Ⅱ mimics后其蛋白/DNA比率的变化，图2C表明原代心肌细胞转染Ang Ⅱ mimics后肥大标志基因ANF表达的变化情况。其中a-d 分别表示如下：

a为在Ang Ⅱ、miR-NC和miR-142-3p不存在的情况下处理心肌细胞的结果；

b为在Ang Ⅱ存在、miR-NC和miR-142-3p不存在的情况下处理心肌细胞的结果；

c为Ang Ⅱ和miR-142-3p存在，miR-NC不存在的情况下处理心肌细胞的结果；

d为Ang Ⅱ和miR-NC存在，miR-142-3p不存在的情况下处理心肌细胞的结果；

实施例3

miR-142-3p能够在细胞水平上抑制Ang Ⅱ所诱导的心肌细胞肌小节的重组

1.制备大鼠乳鼠原代心肌细胞，操作步骤与实施例1相同，

2.对原代心肌细胞转染miR-142-3p mimics。

对原代心肌细胞转染miR-142-3p mimics和阴性对照(miR-NC)后，用 Ang Ⅱ对心肌细胞进行处理，经过处理48小时之后，对心肌细胞进行肌小节的重组检测，如图3所示，图3表明原代心肌细胞转染Ang Ⅱ mimics其肌小节重排的情况，其中，对照为不存在任何物质的情况下心肌细胞小节排列的情况。实验结果证明miR-142-3p能够有效的抑制Ang Ⅱ所诱导的心肌细胞的肌小节的重组。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛大学

<120> 用于预防和/或治疗心脏疾病的组合物及应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

uguaguguuu ccuacuuuau gga 23

Claims (10)

1.一种用于预防和/或治疗心脏疾病的组合物，其特征在于，所述组合物含有如下任一种物质：

Ⅰ、miR-142-3p；

Ⅱ、含有miR-142-3p的编码基因的重组载体；

Ⅲ、含有miR-142-3p的编码基因的重组病毒；

Ⅳ、含有miR-142-3p的编码基因的重组病毒载体。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述miR-142-3p的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

3.如权利要求1所述的组合物在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述组合物还包括药学上可接受的载体或辅料。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或几种。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括口服制剂、注射制剂、片剂和干粉剂中的一种或几种。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述心脏疾病包括心机肥厚、心机纤维化、冠心病或心衰。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗心脏疾病是通过miR-142-3p过表达能抑制心肌细胞肥大的发生实现的。

9.一种用于预防和/或治疗心脏疾病的产品，其特征在于，所述产品含有如下任一种物质：

Ⅰ、miR-142-3p；

Ⅱ、含有miR-142-3p的编码基因的重组载体；

Ⅲ、含有miR-142-3p的编码基因的重组病毒；

Ⅳ、含有miR-142-3p的编码基因的重组病毒载体。

10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述miR-142-3p的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述产品为药物。