CN110229879A

CN110229879A - 一种piRNA-500核苷酸类似物及其反义核苷酸的应用和应用其的产品

Info

Publication number: CN110229879A
Application number: CN201910583881.7A
Authority: CN
Inventors: 董妍涵; 王昆; 李培峰; 刘靖
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2019-07-01
Filing date: 2019-07-01
Publication date: 2019-09-13
Anticipated expiration: 2039-07-01
Also published as: CN110229879B

Abstract

本发明属于医学工程技术领域，具体涉及一种piRNA‑500核苷酸类似物及其反义核苷酸的应用和应用其的产品；所述piRNA‑500核苷酸类似物含有SEQ ID NO.1所示的序列，piRNA‑500反义核苷酸含有SEQ ID NO.2所示的序列；piRNA‑500核苷酸类似物或其生物活性功能片段或变体在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的产品中的应用，通过检测外周血血浆中piRNA‑500核苷酸的表达水平，用于对许多心脏疾病具有诊断和/或预后评估的潜在价值；通过piRNA‑500反义核苷酸在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的产品中的应用，对许多心脏疾病的预防和/或治疗提供基础。

Description

一种piRNA-500核苷酸类似物及其反义核苷酸的应用和应用其的产品

技术领域：

本发明属于医学工程技术领域，涉及一种piRNA-500核苷酸类似物及其反义核苷酸在心脏疾病中的应用和应用其的产品。

背景技术：

世界卫生组织发布的《全球疾病负担》报告指出，心血管疾病已经成为全球人类死亡的主要原因。据我国2014年的统计数据，我国患心血管疾病的人数已超过2.7亿，每年300万人死于心血管疾病。心血管疾病在中老年人群的发病率和死亡率显著升高，因此，面对我国人口老龄化的现状，对心脏疾病进行发病机制和临床研究具有重要的理论和实践意义。心肌肥大是心肌细胞针对血液动力学增加的一种应答反应，通常表现为组织水平上心肌组织的增厚和细胞水平上心肌细胞体积的增大，是许多心血管疾病(高血压、急性心肌梗塞、先天性心脏疾病等)发生发展过程中共有的病理变化。诱发心肌肥大的刺激因素主要包括机械张力和多种神经体液因子，如血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)、异丙肾上腺素(Isoproteronol,Iso)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白介素-1(IL-1)等。

piRNA(piwi-interacting RNA)是继siRNA和miRNA两类小RNA之后，2006年首次在雄性生殖细胞中发现的一类新的非编码小RNA，长度通常在26～31nt，5’端具有强烈的尿嘧啶偏向性，种类超过50,000个。过去的研究曾一度认为piRNA是生殖细胞所特有，因此主要集中于生殖细胞中piRNA的功能研究，已有的研究结果表明piRNA主要参与生殖细胞的发育、转座子的沉默、异染色质的形成和生殖细胞DNA完整性的维持等过程。2012年，在Cell杂志发表的一项研究发现了在海兔大脑中表达的piRNA，通过调控CREB蛋白的DNA甲基化来调控神经细胞的记忆功能。由此，吸引了研究人员对于piRNA在非生殖细胞中进行功能研究的兴趣。

目前，在心脏肥厚和心肌纤维化等心脏疾病中的关键piRNA现在尚无报道，其所发挥的功能是对该领域科研人员的挑战。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，本发明的第一个目的在于提供piRNA-500核苷酸类似物或其生物活性功能片段或变体在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的产品中的应用；本发明的第二个目的在于提供一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的药物；本发明的第三个目的在于提供一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒；本发明的第四个目的在于提供piRNA-500反义核苷酸在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的产品中的应用；本发明的第五个目的在于提供一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，以缓解现有技术中存在的对在心脏肥厚和心肌纤维化等心脏疾病中的关键piRNA研究尚属空白的技术问题。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了piRNA-500核苷酸类似物或其生物活性功能片段或变体在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的产品中的应用；

所述piRNA-500核苷酸类似物含有SEQ ID NO.1所示的序列。

进一步地，所述产品为药物或试剂盒。

进一步地，所述piRNA-500核苷酸类似物的核苷酸序列中每个碱基均进行了化学修饰。

本发明还提供了一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的药物，所述药物包括有效剂量的piRNA-500核苷酸类似物或其生物活性功能片段或变体。

本发明还提供了一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测piRNA-500核苷酸类似物的引物。

本发明还提供了piRNA-500反义核苷酸在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的产品中的应用；

所述piRNA-500反义核苷酸含有SEQ ID NO.2所示的序列。

进一步地，所述产品为药物。

另外，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，所述药物包括有效剂量的piRNA-500反义核苷酸。

进一步地，所述药物的给药方式包括口服给药或注射给药。

进一步地，所述心脏疾病包括心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病、心肌炎、心瓣膜疾病、高血压和心衰的一种或多种。本发明与现有技术相比，通过实验发现，piRNA-500核苷酸类似物在肥大的心肌细胞中表达显著下调，过表达piRNA-500能显著抑制由Iso诱导的心肌细胞表面积增大，piRNA-500能够抑制心肌肥大的发生，这意味着piRNA-500能够作为一种早期诊断和早期预防心肌肥大，心肌纤维化等心脏疾病的生物标志物；因此，通过检测外周血血浆中piRNA-500核苷酸的表达水平，用于对许多心脏疾病具有诊断和/或预后评估的潜在价值；其应用原理科学可靠，使用操作简便，安全性好，应用环境友好。

附图说明：

图1为本发明涉及的使用异丙肾上腺素(Iso)诱导的心肌肥大疾病模型小鼠与对照小鼠的心脏中，piRNA-500表达水平的变化结果图。

图2为本发明涉及的心脏肥大刺激及异丙肾上腺素(Iso)诱导的心肌细胞肥大过程piRNA-500表达水平的变化结果图。

图3为本发明涉及的原代心肌细胞转染piRNA-500核苷酸类似物后对心肌细胞表面积的影响结果图。

具体实施方式：

下面通过具体实施例并结合附图对本发明进行详细说明。

除非特别指出，以下实施例中涉及的试剂均为分析纯级试剂，涉及的试剂或仪器均可从正规渠道商购获得；

除非特别指出，涉及的各种实验方法和操作，包括细胞培养，RNA的提取，RCR扩增，荧光定量PCR，细胞染色等等，均可参见以下文献：Wang K,etal,miR-361-regulatedprohibitin inhibits mitochondrial fission and apoptosis and protects heartfrom ischemia injury.Cell Death Differ.2015Jun；22(6):1058-68.W.-Q.Tan,etal,Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase JBiol Chem.2008 October 31；283(44):29730-29739；Wang K,etal,miR-9andNFATc3regulate myocardin in cardiac hypertrophy,J Biol Chem.2010Apr16；285(16):11903-12；Lin Z,etal,miR-23a functions downstream of NFATc3toregulatecardiac hypertrophy,PNAS,2009,106(29):12103-12108)，上述文献在此全文引入作为参考。

实施例1：

本实施例涉及一种piRNA-500核苷酸类似物或其生物活性功能片段或变体在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的产品中的应用，piRNA-500核苷酸类似物的序列如下(SEQ ID NO：1)：

5’-CGUUCAACUGCUGUUCACAUGGAACCC-3’；

其中，piRNA-500核苷酸类似物的生物活性功能片段或变体为以下(1)-(3)或其他piRNA-500核苷酸类似物的生物活性功能片段或变体：

(1)含有piRNA-500核苷酸类似物的编码基因的重组载体；

(2)含有piRNA-500核苷酸类似物的编码基因的重组病毒；

(3)含有piRNA-500核苷酸类似物的编码基因的重组病毒载体。

本实施例涉及的piRNA-500核苷酸类似物的核苷酸序列中每个碱基均进行化学修饰，其中，化学修饰包括核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰。

在一个优选的实施方式中，piRNA-500核苷酸类似物的核苷酸序列中每个碱基均进行了2’-甲氧基修饰。

本实施例还提供了一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的药物和试剂盒，所述药物包括有效剂量的piRNA-500核苷酸类似物或其生物活性功能片段或变体；所述试剂盒包括用于特异性检测piRNA-500核苷酸类似物的探针或引物，其中，用于特异性检测piRNA-500核苷酸类似物的引物序列为：

反转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGGTTCCA-3’(SEQ IDNO：3)；

上游引物：5’-CGGGCCGTTCAACTGCTGTTCACATG-3’(SEQ ID NO：4)；

下游引物：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’(SEQ ID NO：5)。

本实施例还提供了piRNA-500反义核苷酸在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的产品中的应用，piRNA-500反义核苷酸的序列如下(SEQ ID NO：2)：

5’-GGGUUCCAUGUGAACAGCAGUUGAACG-3’。

本实施例还提供了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，包括有效剂量的上述的piRNA-500反义核苷酸。

本实施例中，用于预防和/或治疗心脏疾病的药物还包括药学上可接受的载剂或辅料，其中，载剂或辅料为壳聚糖、胆固醇、脂质体、环糊精、微球、微囊中的一种或多种。

本实施例中，用于预防和/或治疗心脏疾病的药物的给药方式，包括口服给药或注射给药；其中，注射给药的方式包括静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射和心肌注射。

本实施例所述的心脏疾病包括心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病、心肌炎、心瓣膜疾病、高血压和心衰的一种或多种。

实施例2：

本实施例为使用异丙肾上腺素(简称Iso)诱导的心肌肥大疾病模型小鼠与对照小鼠的心脏中，piRNA-500表达水平变化的检测实验。

本实施例选取C57BL/6J公鼠20只，随机分成对照组(10只)和模型组(10只)，模型组通过植入式胶囊渗透泵渗透Iso，Iso的用量为30mg/kg/d，构建心肌肥大的小鼠模型；对照组通过相同方法渗透等量的生理盐水，分别提取两组小鼠心脏的总RNA，实时荧光定量PCR技术检测piRNA-500的表达水平，具体实验结果如图1所示；

由图1可以看出，与对照组相比，使用Iso诱导的心肌肥大模型组小鼠心脏中，piRNA-500表达下调，说明通过检测piRNA-500表达水平的变化可作为心肌肥大临床诊断的依据。

实施:3：

本实施例为使用异丙肾上腺素(Iso)诱导的心肌细胞肥大过程中piRNA-500表达水平变化的检测实验；对于心肌细胞肥大模型，采用本实验室已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞(大鼠乳鼠均购自青岛大任富城畜牧有限公司，大鼠品系为SD大鼠；制备大鼠乳鼠原代心肌细胞的具体步骤参见文献：W.-Q.Tan,Kun Wang,et al.,Foxo3aInhibitsCardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase.J BiolChem.2008 October31；283(44):29730-29739。)，对心肌细胞随机等量分成4组，4组心肌细胞分别用10μM异丙肾上腺素进行处理0小时、8小时、16小时、24小时后，使用TRIZOL试剂盒分别提取4组心脏的总RNA，实时荧光定量PCR检测piRNA-500在心脏中不同时间点的表达水平，具体实验结果如图2所示；

由图2可以看出，在Iso处理0、8、16、24小时后，piRNA-500的水平以时间依赖的方式逐渐下降，进一步说明piRNA-500可作为心肌肥大临床诊断的潜在标志物。

实施例4：

本实施例为过表达piRNA-500抑制原代心肌细胞细胞肥大的实验，采用的原代心肌细胞培养方法同实施例3，将原代心肌细胞分为四组，分别为空白组、Iso处理组、对照组和实验组，每组原代心肌细胞量约为1×10⁶，每组实验均设置3次重复实验；其中，空白组原代心肌细胞只使用正常细胞培养液进行培养；Iso处理组原代心肌细胞用10μM异丙肾上腺素进行处理；实验组对原代心肌细胞进行piRNA-500核苷酸类似物(其序列为5’-CGUUCAACUGCUGUUCACAUGGAACCC-3’，SEQ ID NO：1，委托上海吉玛制药技术有限公司合成)的转染后，用10μM异丙肾上腺素进行处理；对照组与实验组的处理方法相同，仅将piRNA-500核苷酸类似物替换为无意义序列的阴性对照RNA(agomir-control)；培养24h后利用鬼笔环肽染色方法检测心肌细胞肥大情况；具体实验结果如图3所示；由图3可以看出，piRNA-500agomir诱导的piRNA-500过表达能够降低Iso诱导增加的细胞表面积。

综上所述，piRNA-500能够抑制心肌肥大的发生，可作为一种早期诊断和早期预防心肌肥大，心肌纤维化等心脏疾病的生物标志物。因此，通过检测外周血血浆中piRNA-500的表达水平，用于对许多心脏疾病具有诊断和/或预后评估的潜在价值；通过检测抑制piRNA-500的表达水平，用于对心脏疾病具有预防和/或治疗的潜在价值。

序列表

<110> 青岛大学

<120> 一种piRNA-500核苷酸类似物及其反义核苷酸的应用和应用其的产品

<130> 2019

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列(多肽Artificial Sequence)

<400> 1

cguucaacug cuguucacau ggaaccc 27

<210> 2

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列(多肽Artificial Sequence)

<400> 2

ggguuccaug ugaacagcag uugaacg 27

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(多肽Artificial Sequence)

<400> 3

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgaggggt tcca 44

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(多肽Artificial Sequence)

<400> 4

cgggccgttc aactgctgtt cacatg 26

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(多肽Artificial Sequence)

<400> 5

tggtgtcgtg gagtcg 16

Claims

1.一种piRNA-500核苷酸类似物或其生物活性功能片段或变体在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的产品中的应用；

所述piRNA-500核苷酸类似物含有SEQ ID NO.1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为药物或试剂盒。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述piRNA-500核苷酸类似物的核苷酸序列中每个碱基均进行了化学修饰。

4.一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的药物，其特征在于，所述药物包括有效剂量的piRNA-500核苷酸类似物或其生物活性功能片段或变体。

5.一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于特异性检测piRNA-500核苷酸类似物的引物。

6.piRNA-500反义核苷酸在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的产品中的应用；

所述piRNA-500反义核苷酸含有SEQ ID NO.2所示的序列。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为药物。

8.一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，其特征在于，所述药物包括有效剂量的piRNA-500反义核苷酸。

9.根据权利要求4或8所述的药物，其特征在于，所述药物的给药方式包括口服给药或注射给药。

10.根据权利要求1或6所述的应用，权利要求4或8所述的药物或权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述心脏疾病包括心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病、心肌炎、心瓣膜疾病、高血压和心衰的一种或多种。