CN114736956B

CN114736956B - piRNA作为诊断标志物在法医鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间中的应用

Info

Publication number: CN114736956B
Application number: CN202210362217.1A
Authority: CN
Inventors: 周鹏; 方晨; 左柏伊; 严江伟; 郭艺琳; 王瑞祺; 李敏; 孟德萍; 孙文平; 刘敏
Original assignee: Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Current assignee: Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Priority date: 2022-04-07
Filing date: 2022-04-07
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2042-04-07
Also published as: CN114736956A

Abstract

本发明提供了piRNA作为诊断标志物在法医鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间中的应用，属于法医学鉴定技术领域；piRNA包括rno＿piR＿003035和rno＿piR＿005736。本发明的piRNA适用于急性心梗的鉴别，两种piRNA在心梗初期表达量就发生显著变化，因此能够应用本发明的piRNA实现对心梗急性或超急性期进行鉴定。此外，rno＿piR＿003035和rno＿piR＿005736还可以用于急性心梗持续时间的推断，对心梗4h内的个体进行心梗时间推断，误差在0.5h内，弥补了以往急性心梗时间难以推断的难题。

Description

piRNA作为诊断标志物在法医鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间中的应用

技术领域

本发明属于法医学鉴定技术领域，具体涉及piRNA作为诊断标志物在法医鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间中的应用。

背景技术

急性心梗(acute myocardial infarction，AMI)是心源性猝死的主要原因，且发病率呈逐年上升的趋势。对于AMI的急性期和超急性期，难以通过传统的病理形态学方法进行鉴别，因此急性心梗的鉴定是目前法医病理学鉴定的难点。

piRNA(Piwi-interacting RNA)是一类长约24～32nt的单链非编码RNA，作为重要的转录因子参与生命活动的调控，在心肌组织中表达丰度较高，具有应用于AMI鉴别的潜在价值。它具有以下优势：在人类基因组中已鉴定出超过3万种的piRNA，数量远多于其他非编码RNA；在多种组织器官中高丰度表达，具有组织特异性；在不同发育时期和不同疾病状态下也表现出时间和空间特异性；piRNA的5’端具有强烈的单磷酸尿嘧啶核苷酸倾向性， 3’端(2′-O-methyl)进行了甲基化修饰，使其具有相对较强的稳定性。近年来已有多项研究表明piRNA参与心血管疾病的调控，Min Li等研究发现piRNA 参与心肌分化，K.ShanmughaRajan1等研究发现了与心肌肥大相关的 piRNA。

目前，还没有关于将piRNA有作为心肌梗死鉴定标记物的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供piRNA作为诊断标志物在法医鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间中的应用。

本发明提供了piRNA作为诊断标志物在法医鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间中的应用；所述piRNA包括rno＿piR＿003035和rno ＿piR＿005736；所述rno＿piR＿003035的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述rno＿piR＿005736的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了piRNA作为诊断标志物在制备鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间的试剂或试剂盒中的应用；所述piRNA包括rno＿piR ＿003035和rno＿piR＿005736；所述rno＿piR＿003035的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述rno＿piR＿005736的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述急性心梗包括发病5min～4h内的急性心梗。

优选的，所述piRNA在急性心梗大鼠心肌组织中的表达水平上调。

本发明还提供了一种用于鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间的引物组，所述引物组包括第一引物和第二引物；

所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种用于鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间的试剂盒，包括上述方案所述的引物组和miRcute增强型miRNA荧光定量检测用试剂。

本发明还提供了一种用于法医鉴定急性心梗的方法，包括以下步骤：

1)分别提取待检心肌组织和正常心肌组织的piRNA，分别反转录得到待检心肌组织的cDNA和正常心肌组织的piRNA；

2)分别以所述待检心肌组织的cDNA和正常心肌组织的piRNA为模板，利用上述方案所述的引物组分别进行荧光定量PCR扩增，分别计算待检心肌组织和正常心肌组织的rno-piR-005736和rno-piR-003035的Ct值；

若待检心肌组织相对于正常心肌组织的rno_piR_005736表达水平上升 2.38倍及以上、且piRNA-003035的表达水平上升2.14倍及以上，则判定发生急性心梗；否则，没有发生急性心梗。

优选的，步骤2)中所述荧光定量PCR扩增的扩增体系以20μl计，包括以下组分：10μL2×miRcute Plus miRNAPreMix、0.4μL上游引物、0.4μL 下游引物、2μLcDNA和7.2μLddH₂O；所述荧光定量PCR扩增的程序为： 95℃、15min；94℃、20sec，64℃、30sec，72℃、34sec，5个循环；94℃、 20sec，60℃、34sec，40个循环。

本发明还提供了一种用于推断急性心梗持续发病时间的模型的构建方法，包括以下步骤：

测定不同急性心梗持续发病时间的心肌组织的rno-piR-005736和rno-piR-003035的表达量；

以不同急性心梗持续发病时间的rno-piR-005736和rno-piR-003035的表达量为自变量、以急性心梗持续发病时间为因变量，使用随机森林模型建立得到急性心梗持续时间推断模型。

本发明还提供了一种法医推断急性心梗持续发病时间的方法，包括以下步骤：

测定待检心肌组织的rno-piR-005736和rno-piR-003035的表达量，导入上述方案所述构建方法构建得到的急性心梗持续时间推断模型，输出急性心梗持续发病时间。

本发明提供了piRNA作为诊断标志物在法医鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间中的应用；所述piRNA包括rno＿piR＿003035和rno ＿piR＿005736。本发明的piRNA适用于急性心梗的鉴别，两种piRNA在心梗初期表达量就发生显著变化。在心梗5min后表达水平分别是对照组的2.38 倍和2.14倍。因此本发明的piRNA能够用于心梗急性或超急性期进行鉴定。此外，随心梗持续时间延长两种piRNA表达水平进一步提升，与心梗5min组相比，心梗4h表达水平上升了416％和308％，因此，rno＿piR＿003035 和rno＿piR＿005736还可以用于急性心梗持续时间的推断，对急性心梗 5min～4h内(早期超急性损伤期)的个体进行心梗时间推断，误差在0.5h内，弥补了以往急性心梗时间难以推断的难题。

附图说明

图1为rno-piR-003035在心梗后的变化趋势；

图2为rno-piR-005736在心梗后的变化趋势。

具体实施方式

本发明提供了piRNA作为诊断标志物在法医鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间中的应用；所述piRNA包括rno＿piR＿003035和rno ＿piR＿005736；所述rno＿piR＿003035的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：TGAGACTCTTAATCTCAGGGTCGTGGGT；所述rno＿piR＿005736 的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：GGCCCTATAGCTCAGGGGTTAGAGCACTG。

在本发明中，所述piRNA为鼠源piRNA；所述rno＿piR＿003035在大鼠染色体上的位置为：gb|DQ608296|Rattus norvegicus:9:65098666:65098693:Plus；所述rno＿piR＿005736在大鼠染色体上的位置为：gb|DQ614335|Rattus norvegicus:15:27071309:27071337:Plus。

在本发明中，所述急性心梗包括发病5min～4h内的急性心梗，这一时期为早期超急性损伤期。

在本发明中，所述piRNA在急性心梗大鼠心肌组织中的表达水平上调。在心梗5min后，rno_piR_005736和piRNA-003035在AMI损伤发生后表达水平显著上升，是对照的2.38倍和2.14倍。随心梗持续时间延长两种piRNA 表达水平进一步提升，与心梗5min组相比，心梗4h表达水平上升了416％和308％。

本发明优选的通过使用qRT-PCR来检测所述piRNA的水平以鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间。qRT-PCR具有灵敏度高的优点，基于qRT-PCR的方法仅使用50mg的心脏组织就能实现检测piRNA分析，因而适用于法医学微量样本的分析。

本发明利用心肌细胞piRNA提取和qRT-PCR，分析效率高所需时间仅需3h即可全部实验，一次检测最多可实现96个样本的分析。同时检测成本低，单个样本的全部成本在50元以内。

本发明还提供了一种用于鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间的引物组，所述引物组为上述方案所述piRNA的检测引物组；所述引物组包括第一引物和第二引物；

所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：GAGACTCTTAATCTCAGGGTCGTGGGT，所述第一引物为用于检测rno＿ piR＿003035的上游引物；所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：GCCCTATAGCTCAGGGGTTAGAGCACT，所述第二引物为用于检测rno＿piR＿005736的上游引物。

在本发明中，所述引物组与miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒中自带的下游引物配套使用。在本发明中，所述miRcute增强型miRNA 荧光定量检测试剂盒购自于天根生化科技(北京)有限公司。

本发明首先分别提取待检心肌组织和正常心肌组织的piRNA，分别反转录得到待检心肌组织的cDNA和正常心肌组织的piRNA。本发明对提取 piRNA的方法没有特殊限制，采用本领域的常规提取piRNA的方法或者试剂盒即可。本发明对所述反转录的方法也没有特殊限制，采用本领域的常规反转录的方法或者试剂盒即可。

得到待检心肌组织的cDNA和正常心肌组织的piRNA后，本发明分别以所述待检心肌组织的cDNA和正常心肌组织的piRNA为模板，利用上述方案所述的引物组分别进行荧光定量PCR扩增，分别计算待检心肌组织和正常心肌组织的rno-piR-005736和rno-piR-003035的Ct值；若待检心肌组织相对于正常心肌组织的rno_piR_005736表达水平上升2.38倍及以上、且 piRNA-003035的表达水平上升2.14倍及以上，则判定发生急性心梗；否则，没有发生急性心梗。在本发明中，所述荧光定量PCR扩增的扩增体系以20 μl计，优选的包括以下组分：10μL2×miRcute Plus miRNA PreMix、0.4μL 上游引物、0.4μL下游引物、2μLcDNA和7.2μLddH₂O；所述荧光定量PCR 扩增的程序为：95℃、15min；94℃、20sec，64℃、30sec，72℃、34sec， 5个循环；94℃、20sec，60℃、34sec，40个循环。

测定不同急性心梗持续发病时间的心肌组织的rno-piR-005736和 rno-piR-003035的表达量；

在本发明中，所述不同急性心梗持续发病时间的心肌组织的 rno-piR-005736和rno-piR-003035的表达量优选的如表2所示：

表2建立模型所使用的数据集

。

在本发明中，建立AMI持续时间推断模型优选的利用orange软件 (https://orange.biolab.si/)进行。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

一、急性心梗动物模型的构建

1.实验前的分组建模

1.1分组

选取体重220～250g的Wistar雄性成年大鼠90只，随机分成2组，分别为 AMI组和对照组，大鼠置于12h昼夜交替恒温条件下培养。

AMI组：取75只Wistar大鼠，再随机分为5个亚组，每组15只进行心梗手术。分别于手术后5min、1h、2h、3h、4h拔出气管插管使大鼠窒息而死，取心脏样本。

对照组：取15只Wistar大鼠，进行假手术，手术后拔出气管插管使大鼠窒息而死，取心脏样本。

1.2建模

①制作前准备：

动物：选择体重220～250g的Wistar雄性成年大鼠90只。

器械：电子秤、10ml注射器、BL-420生物信号采集系统、动物手术器械 (含手术剪、手术镊、止血钳、缝合针线等)、大鼠手术台、动物呼吸机、气管插管等。

②实验步骤：

称重：右手抓住尾巴，左手拇指与其他四指抓住大鼠项背部皮肤，放到天平上称重。(大鼠术前要禁食12h，自由饮水。)

麻醉：大鼠腹腔注射浓度为10％的水合氯醛(30mg/100g)，行腹腔注射麻醉。当大鼠肌张力减弱、呼吸变慢变深、角膜反射迟钝时认为麻醉完成。

固定：把固定带系4个活扣，分别套在鼠的四肢上，前肢套在腕关节以上，后肢套在踝关节以上，抽禁固定带的长头，最后固定鼠的头部，使鼠的颈部保持平直(固定牢，体位正)，便于手术操作。

剪毛：手术部位是颈部和胸部，把这两个部位的毛剃干净。剪毛的时候，用左手把皮肤绷紧，右手用剃毛器贴近皮肤剃毛。

气管插管：于颈部正中做约2cm的竖直切口，分离软组织和肌肉，暴露大鼠气管。于甲状软骨上1cm左右做倒“T”型切口，行气管插管，并连接微型动物呼吸机，频率60次/分，潮气量6ml/次，呼吸比1：2

开胸分离左冠状动脉：胸部剪毛，沿胸骨左缘约0.15cm处切开皮肤，逐层分离皮下组织，暴露胸骨。先用止血钳将肋间肌肉钝性分离，再用大剪刀在第3-5根肋骨与胸骨相连接的软骨部位剪断上述肋骨。用止血钳夹住暴露的胸壁边缘并固定，暴露胸腔。用镊子提起心包膜，接着用眼科剪小心剪开心包膜。找到左心耳，左冠状动脉从其后下缘发出。在左心耳下约3-4cm处即左冠状动脉前降支中上段约2mm处，用镊子轻轻将左冠状动脉附近的心肌提起，将弯针从左冠状动脉下方穿过，并且将缝线带过。

AMI组将线扎紧，对照组穿线但不结扎。

连接心脏电导联和BL-420信号采集系统。大鼠心电图由正常的QRS波转为S-T段抬高时，可初步认为AMI模型建造成功。

2.心肌组织的制备

AMI模型建立并达到预期后，拔出气管插管。开胸，迅速用剪刀摘除大鼠心脏，将大鼠心脏分为心尖、心中部和心底部三部分分别保存。后将大鼠心脏放置于固定液(每次实验前要提前制备)中固定，心脏组织一定要全部浸没。

获得心肌样本要求：要包括心肌梗死区组织，梗死的周围组织，以及正常心肌组织对照组。

二、心肌组织piRNA提取

在收集到急性心梗心肌组织材料之后，即可进行piRNA制备工作。若需暂时储存，则应低温保存(-20℃冰箱)。

1.在提取piRNA时，需要称取心肌组织50mg左右，剪碎至5mm²大小后放入1.5mlEP管中。加入1ml裂解液MZ，将样品在室温下(15～30℃)放置 min，使核酸蛋白复合物完全分离。

2.4℃，12,000rpm(～13,400×g)离心5min，取上清，转入新的无RNase的 EP管中

3.在上述EP管中，按照每1ml Trizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上 EP管盖子，在手中用力震荡15s，在室温下(15～30℃)放置5min后，4℃， 12,000rpm(～13,400×g)离心15min。离心后，样品分为三层：黄色有机相，中间层和无色水相，RNA在无色水相中，水相的体积约为所用裂解液MZ试剂的50％，

4.取上层水相置于新EP管中，缓慢加入转移液体积0.43倍的无水乙醇，混匀(可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入相吸附柱miRspin 中，室温，12,000rpm(～13,400×g)离心30s。离心后弃向吸附柱miRspin，保留流出液。

5.量取流出液体积，缓慢加入液体体积0.75倍的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute中，室温，12,000rpm(～13,400×g) 离心30s，离心后弃流出液，保留吸附柱miRelute。

6.向吸附柱miRelute中加入去蛋白液MRD，室温静置2min，室温，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，弃流出液。

7.向吸附柱miRelute中加入漂洗液RW，室温静置2min，室温， 12,000rpm(～13,400×g)离心30s，弃流出液。

8.重复步骤7

9.将吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室温，12,000rpm(～13,400×g) 离心1min，去除残液，室温放置15min晾干。

10.将吸附柱miRelute转入新的RNase-Free 1.5ml离心管中，加入15～30μlRNase-Free ddH₂O，室温放置2min，室温，12,000rpm(～13,400×g)离心2min。

三、反转录反应

1.使用分光光度计检测所得溶液浓度，并将RNA浓度定在500μg/L。

配置20μL反转录反应体系：

反转录体系

(a)10μl 2×RT ReactionBuffer

(b)2μl RT Enzyme Mix

2.按以下条件进行反转录反应：

42℃ 60min

95℃ 5min

4℃ 5min

3.反转录产物分装后放于-20℃保存。

四、PCR反应

1.取适量cDNA，用无菌去离子水稀释100倍。

2.配置20μl PCR反应体系：

PCR反应体系

(a)10μL2×miRcute Plus miRNAPreMix(SYBR&ROX)

(b)0.4μL上游引物

(c)0.4μL下游引物

(d)2μL反转录产物(即三-3反转录反应后所得的产物)

(e)7.2μLddH₂O

3.使用荧光定量PCR仪完成实验，PCR反应实验按以下条件进行：

4.实验结束后计算每个样本的两种piRNA(rno-piR-005736和 rno-piR-003035)的Ct值。

五、结果分析和心梗时间预测

通过荧光定量PCR得到每组的Ct，其中U6作为内参照；△Ct是通过对2种AMI相关的piRNA(rno＿piR＿003035和rno＿piR＿005736)的 Ct减去内参的Ct得到，按照如下公式对不同组间的基因相对表达量进行比较：

其中对照(control)的2种年龄相关的piRNA的△Ct如表1：

表1

piRNA	△Ct
		rno＿piR＿003035	3.173273087
rno＿piR＿005736	5.585251808

结果表明在心梗5min后，rno_piR_005736和piRNA-003035在AMI损伤发生后表达水平显著上升，是假手术组的2.38倍和2.14倍。随心梗持续时间延长两种piRNA表达水平进一步提升，与心梗5min组相比，心梗4h 表达水平上升了416％和308％(图1,2)。

基于表2所示的数据集，利用orange软件(https://orange.biolab.si/)，使用随机森林模型建立AMI持续时间推断模型：

模型参数如下：

树的数目：10；

重复训练：是；

子集小于5时不可拆分；

模型平均误差：28.285min；

R²：0.793。

表2建立模型所使用的数据集

/>

实施例2

对6例心梗时间为0～4h的大鼠进行心梗时间预测，所得的预测结果平均误差为26.459min。结果参见表3。

表3

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 山东第一医科大学（山东省医学科学院）

<120> piRNA作为诊断标志物在法医鉴定急性心梗和/或推断急性心梗持续发病时间中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgagactctt aatctcaggg tcgtgggt 28

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggccctatag ctcaggggtt agagcactg 29

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagactctta atctcagggt cgtgggt 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccctatagc tcaggggtta gagcact 27

Claims

1.检测piRNA的引物组在制备鉴定急性心梗的试剂或试剂盒中的应用；所述piRNA为rno＿piR＿003035和rno＿piR＿005736；所述rno＿piR＿003035的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述rno＿piR＿005736的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述引物组包括第一引物和第二引物；所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述急性心梗包括发病5min～4h内的急性心梗。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述piRNA在急性心梗大鼠心肌组织中的表达水平上调。

3.一种用于推断急性心梗持续发病时间的模型的构建方法，包括以下步骤：测定不同急性心梗持续发病时间的心肌组织的rno-piR-005736和rno-piR-003035的表达量；以不同急性心梗持续发病时间的rno-piR-005736和rno-piR-003035的表达量为自变量、以急性心梗持续发病时间为因变量，使用随机森林模型建立得到急性心梗持续时间推断模型；

所述rno＿piR＿003035的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述rno＿piR＿005736的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。