CN103936865B

CN103936865B - 一种抗血栓融合蛋白及编码该融合蛋白的基因

Info

Publication number: CN103936865B
Application number: CN201410198379.1A
Authority: CN
Inventors: 郭玲
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Health Health Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2014-05-12
Filing date: 2014-05-12
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2034-05-12
Also published as: CN103936865A

Abstract

一种抗血栓融合蛋白及编码该融合蛋白的基因。它涉及一种融合蛋白及编码该融合蛋白的基因。能达到良好的抗血栓效果，不易产生拮抗作用，使用禁忌少，而且有利于患者康复。抗血栓融合蛋白的氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示。该基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1中核苷酸序列所示。本发明可用于抗血栓的研究和治疗。

Description

一种抗血栓融合蛋白及编码该融合蛋白的基因

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及编码该融合蛋白的基因。

背景技术

心脑血管疾病(cardio-vasculardisease，CVD)简称心血管病，是心血管病与脑血管病的统称。泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生缺血性或出血性疾病的通称。其中对人类健康危害最为严重的是高血压、脑卒中、冠心病。据2000年世界卫生组织报告，全球每三个死亡的人中就有一人死于心脑血管疾病。我国每年死于心血管病的人数约300万，占总死亡人数的45％。

心脑血管疾病具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多”，即“四高一多”的特点，已成为中国居民健康的头号杀手。因血液粘稠、小板聚集形成血栓导致的心脑血管疾病又是最为常见的。

目前抗血栓药物多种多样，从治疗机理上可分为三类：1)抗血小板药；2)抗凝血药物；3)血栓溶解剂。抗血栓药物中含有的抗血栓活性成分种类越多，便可以从不同方面更好的消除血栓，抗血栓效果越好。但是，随之而来的是药物成分越多越复杂，相互之间越容易产生拮抗作用，而且用药患者所要留意的注意事项越多，造成很多不便和不良后果。

发明内容

本发明提供一种抗血栓融合蛋白及编码该融合蛋白的基因，仅使用本发明抗血栓融合蛋白既能达到良好的抗血栓效果，不易产生拮抗作用，使用禁忌少，而且有利于患者康复。

本发明抗血栓融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

本发明上述抗血栓融合蛋白的基因序列如SEQIDNO：1中核苷酸序列所示。

本发明抗血栓融合蛋白采用人为改造的抗栓肽和水蛭素基因编码翻译而成，共79个氨基酸，能够明显高效抗血栓。而且不产生拮抗反应，使用安全。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式抗血栓融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

本实施方式抗血栓融合蛋白的基因序列如SEQIDNO：1中核苷酸序列所示，该核苷酸序列由生物工程公司合成，制成含有融合蛋白基因的T载体(pMD18-T或pMD19-T)。将T载体用BamHI和NotI双酶切出来(酶切反应体系如表1所示，酶切反应在37℃条件下反应3h，然后1.5％琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNAGELEXTRACTIONKIT纯化回收)，并用BamHI和NotI双酶切pcDNA3.1/V5-HisC(酶切反应体系如表2所示，酶切反应在37℃条件下反应3h，然后1.5％琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNAGELEXTRACTIONKIT纯化回收)；再将本实施方式抗血栓融合蛋白的DAN片段(D39/H12)与经过双酶切的载体pcDNA3.1/V5-His的连接(连接反应体系如表3所示)。

表1

表2

表3

融合蛋白的DAN片段与载体pcDNA3.1/V5-His16℃放置连接过夜，得到质粒pcDNA3.1/V5-His-C-D39-H12；然后将质粒pcDNA3.1/V5-His-C-D39-H12与质粒pDCH1P11共转染CHO-dhfr^-细胞，其中CHO-dhfr^-细胞用含100mL/L胎牛血清(FBS)、NAA和1×HT的DMEM培养基培养。24孔板中进行转染，细胞达到95％融合时，更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFMⅡ500uL/孔；按照LF2000说明书进行操作，转染6h后换成含100mL/LFBS的CHO-S-SFMⅡ(不含HT、NAA)1mL/孔，继续培养48h；ELISA鉴定阳性转染的细胞按1：10传代，24h细胞贴壁后换成含选择性培养基(不含HT、NAA，但含G418mg/L，FBS100mL/L)。14～16天后有阳性克隆形成；因培养基中不含HT，故存活细胞为成功共转染的细胞，得到阳性细胞克隆用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经ELISA测定对其中高表达的细胞克隆进行扩大培养。

用氨甲喋呤(MTX)加压筛选高表达的细胞，待细胞长成单层，取培养3天的上清进行ELISA检测。以MTX加压筛选，浓度依次为2×10^-8mmol/L、1×10^-7mmol/L和5×10^-7mmol/L，筛选出高表达株。MTX加压筛选出的高表达株72h培养上清用ELISA法测定蛋白含量，按ELISA法说明书进行操作，表达量结果如表4所示。筛选出的高表达株表达量出现了大幅提高，最高可达19.5mg/L·72h。

表4

MTX浓度(mmol/L)	抗血栓融合蛋白表达量(mg/L·72h)
		0	0.1～0.8
2×10^-8	2.5～4.0
		1×10^-7	5.0～7.5
5×10^-7	9.0～19.5

高表达株RT-PCR鉴定：

收集MTX加压筛选出的高表达株，以TRIzol进行细胞总RNA的提取，RNA反转录后以上游引物P1(5’-ATGGAGACCGACACCCTG-3’)和下游引物P2(5’-TTAGTCGCCGCGCTGGA-3’)为引物进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃30s，5l℃30s，72℃30s，共30个循环；再72℃最终延伸5min。将获得的长度为280bp的条带进行测序，测序工作委托生物公司进行，高表达株内含有SEQIDNO：1所示DNA。

抗血栓融合蛋白抗血栓活性实验：

取SD大鼠64只，随机分为8组——对照组(模型)、阳性药对照组1(用肝素钠注射液，给药剂量为1650U/kg)、阳性药对照组2(用抗栓肽Decorsin——39肽，给药剂量为200μg/kg)、阳性药对照组3(用水蛭素——12肽，给药剂量为200μg/kg)、阳性药对照组4(用抗栓肽Decorsin——39肽和水蛭素——12肽，每种多肽给药剂量均为100μg/kg)、抗血栓融合蛋白低剂量组(40μg/kg)、抗血栓融合蛋白中剂量组(200μg/kg)、抗血栓融合蛋白高剂量组(1mg/kg)、全部由静脉注射给药。经静脉注射给药后立即将分离好的颈动脉置于YLS-14B小动物血栓生成仪的探测接头内，启动血栓生成仪，用恒流直流电刺激(1mA)。记录探头通过红外扫描测量血液的流通量并换算出血管堵塞程度(测量的时间间隔为4s，以百分数表示数据，全部过程持续5min)。抗血栓实验结果如表5所示，本实施方式抗血栓融合蛋白抗血栓效果明显优于同等剂量的抗栓肽和水蛭素。

表5

组别	n	给药剂量	颈总动脉的堵塞程度(％)
				模型对照组	8	0μg/kg	100.00±0.00
阳性药对照组1	8	1650U/kg	48.68±42.88
				阳性药对照组2	8	200μg/kg	39.28±28.82
阳性药对照组3	8	200μg/kg	38.43±28.72
				阳性药对照组4	8	200μg/kg	38.75±27.95
抗血栓融合蛋白低剂量组	8	40μg/kg	33.28±41.11
				抗血栓融合蛋白中剂量组	8	200μg/kg	25.38±39.63
抗血栓融合蛋白高剂量组	8	1mg/kg	10.89±11.56

本实施方式抗血栓融合蛋白毒性实验：

哈尔滨医科大学实验动物中心提供SPF级昆明小鼠。取60只6周龄、雌雄各半、体质量为18±2g的小鼠作为实验对象。采用最大耐药量给药(根据临床干扰素用量50ug/kg)。实验组注射总剂量1mg/kg，一次性给药0.02mL。对照组小鼠注射同等剂量生理盐水。

给药过程中小鼠表现正常，进食、饮水正常、尿粪正常、毛色顺白而有光泽、活动自如、反应性好、小鼠之间无相互撕咬现象。连续饲养14天和30天，小鼠均未出现死亡。

抗血栓融合蛋白给药14天、30天后，处死小鼠，摘眼球取血，3000r/min，离心5min，吸取血清，用Beckman全自动生化分析仪检测主要生化指标：天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)、尿酸(URCA)、总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)。血生化指标如表6所示。

表6

抗血栓融合蛋白给药14天、30天后处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾，观察脏器颜色、形态，计算各脏器系数。根据统计学样本估计，在每组中随机抽取7只小鼠，取心、肝、脾、肺、肾HE染色做病理组织学检查；取骨髓组织瑞氏染色观察细胞有无水肿、变性、坏死等。主要脏器的病理观察结果如表7所示。

表7

组别

天数

心

肝

脾

肺

肾

对照组

14

3.59±0.63

32.11±2.37

4.46±0.90

2.71±0.92

7.72±0.93

实验组

14

3.48±0.89

30.61±3.21

4.68±0.73

2.92±0.79

7.71±0.88

对照组

30

3.61±0.67

32.12±2.22

4.59±0.88

2.92±0.63

7.85±0.78

实验组

30

3.53±0.88

30.66±3.18

4.48±0.61

2.95±0.58

7.84±0.81

实验组与对照组主要脏器心、肝、脾、肺、肾的HE染色及骨髓Wright染色对比观察发现：各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和骨髓均无水肿、变性、坏死等异常改变。

本实验对心、脾、肺、肾的病理切片和骨髓涂片进行了观察，均未见明显的损伤性改变。对5种脏器的脏器系数统计学分析得出各组间差异无显著性。均说明抗血栓融合蛋白及其代谢产物未对脏器产生器质性损害。血生化指标检测各组间差异性无显著说明抗血栓融合蛋白对肝脏、肾脏无功能性损害。抗血栓融合蛋白较好的生物相容性，对小鼠无急性毒性、长期毒性。

抗栓肽(Decorsin)是一种由39个氨基酸组成的小肽，最先由Seymour等从北美巨蜥(LeechMacrobdellaDecora)中发现。具有抗血小板聚集的功能，可阻断血栓的最终形成。是血小板聚集的抑制剂。

1955年Mark-wardt等从医用水蛭中分离出水蛭素(hirudin,HV)，共有7种异构体。Dodt在1984年首先测出其一级结构，确认HV是一条含65个左右氨基酸的多肽。John等人用同样的方法证明了羧端12肽水蛭素是具有最大抗凝活性的最小肽段。

本实施方式通过DNA重组技术将RGD基序(motif)组装到抗血栓融合蛋白中合适的位置，使之具有细胞粘附活性，得到具有抑制凝血或细胞迁移的多功能的分子。本实施方式抗血栓融合蛋白中包含抗栓肽和水蛭素氨基酸片段，具备抗血小板聚集和抗凝血两种抗血栓作用。本实施方式抗血栓融合蛋白将FXa(Ile-Glu-Gly-Arg)识别序列融合到水蛭素12肽N端以及抗栓肽39肽的C端，使其在被切割前封闭水蛭素12肽，被特异识别切割后释放水蛭素的抗凝功能，增加靶向性而降低出血的副作用；将RGD(Arg-Gly-Asp)三肽序列融合在水蛭素12肽C端，增强抗血小板聚集作用而增加其防治动脉血栓的活性，从而构建一种功能全面即从多个途径抑制血栓的形成及发展并且具有一定靶向性抗血栓形成的融合蛋白，此融合蛋白共有79个氨基酸残基。

本实施方式抗血栓融合蛋白通过注射方式进行给药，不存在首过效应。

蛋白融合后二级结构的改变没有产生体内毒性，本实施方式融合蛋白具有安全性；而且二级结构的改变不影响层析和纯化，本实施方式融合蛋白具有分离纯化容易的特点。

本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均购买获得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。

具体实施方式二：本实施方式抗血栓融合蛋白的基因序列如SEQIDNO：1中核苷酸序列所示。

本实施方式抗血栓融合蛋白的基因序列是根据表达系统的特点选择CHO-dhft-偏爱密码子的特点，重新设计了融合蛋白基因编码碱基序列，并由生物工程公司合成。本实施方式抗血栓融合蛋白的基因序列中CG含量高。

本实施方式为进一步深入研究抗血栓融合蛋白奠定了物质基础。

Claims

1.一种抗血栓融合蛋白，其特征在于抗血栓融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

2.编码权利要求1抗血栓融合蛋白的基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1中核苷酸序列所示。