CN114848610A - 一种外泌体-vegf-a纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种外泌体—VEGF‑A纳米药物及其制备方法和应用,所述药物包括源自肾小管上皮细胞的外泌体和外泌体内包裹的VEGF‑A,VEGF‑A为所述药物的有效成分。本发明的纳米药物通过VEGF‑A和CD63过表达质粒转染肾小管上皮细胞,再从细胞培养液中提纯外泌体得到。本发明提供的外泌体—VEGF‑A纳米药物可以应用在制备急性肾损伤药物或制剂中,提高了VEGF‑A的稳定性,促进急性肾损伤后管周毛细血管的增殖修复,有助于治疗急性肾损伤向慢性肾损伤转化,保护肾脏,缓解肾脏纤维化,在肾脏病的治疗中具有非常可观的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域技术领域,具体是一种外泌体—VEGF-A纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术
管周毛细血管在结构和功能上与肾小管密切相关,损伤后管周毛细血管稀疏化和肾小管的不完全修复是导致急性肾损伤向慢性肾脏病/肾脏纤维化转化和进展的关键因素。管周毛细血管稀疏化可引起肾脏缺氧,进而影响肾小管上皮细胞的修复,导致肌成纤维细胞以及炎症细胞的活化,最终发展导致肾小管间质纤维化,进展为慢性肾脏病。因此,如何防治管周毛血管稀疏化一直是肾脏病研究领域的热点及难点。
Senger等人在1983年最早在肿瘤组织中发现一种蛋白可以增加血管通透性,并将其称作血管通透因子(Vascular Permeability Factor),即血管内皮生长因子(VascularEndothelial Growth Factor,VEGF-A)。VEGF-A不仅仅能够促进血管通透性增加,在促进血管内皮细胞增生、迁移和存活中也起到至关重要的作用,是目前促进血管生成专一性最高、活性最强的促血管新生因子之一。基础研究发现,VEGF-A对维持管周毛细血管的正常结构和功能至关重要。特异性敲除肾小管VEGF-A导致小鼠管周围毛细血管密度显著降低,而小管特异性VEGFA的过表达导致小管周毛细血管分布增多。此外,在多种肾脏病如5/6肾切模型、RAS诱导的肾脏血管病变、肾脏缺血再灌注模型中,VEGF-A 均能显著缓解管周毛细血管稀疏化的进展,保护肾脏功能,提示其在慢性肾脏病的预防和治疗中有着广阔的应用前景。然而,VEGF-A在循环中,容易与循环中存在的“诱饵受体”即可溶性VEGFR1结合,不能正常发挥功能,影响其疗效。此外,VEGF-A作为细胞因子制剂用于疾病治疗,存在循环不稳定性、作用周期短暂的局限。所以,构建适宜的具有保护作用的运输载体能够更有效的补充 VEGF-A至病变肾脏。
细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)作为细胞间信号交流的新载体,近年的研究发现,EVs能够通过传递功能性物质至受体细胞调节细胞间交流,在多种生理和病理过程中发挥着至关重要的作用。根据大小和产生方式不同的不同,细胞外囊泡分为外泌体(exosome)和微囊泡(microvesicles,MV)。外泌体作为天然稳定的纳米级膜囊泡,它的天然生物相容性是克服大部分体内递送的障碍的解决方案,与其他常用的治疗载体如病毒、脂质体等相比,外泌体具有低免疫原性、无细胞毒性等优点。显然,外泌体作为一种新型天然的药物载体为疾病的治疗提供了新的策略。本申请的发明人/课题组的前期研究证实,细胞外囊泡能够作为运输载体,搭载地塞米松/IL-10实现肾脏病抗炎治疗。目前还未有通过外泌体搭载VEGF-A治疗急性肾损伤的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种外泌体—VEGF-A纳米药物及其制备方法和应用,通过将源自肾小管上皮细胞的外泌体首次作为有效成分VEGF-A的运输载体,提高了VEGF-A的稳定性,从而获得良好的促进管周内皮细胞增殖修复的效果,在肾脏病的治疗中具有非常可观的应用前景。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
一种外泌体—VEGF-A纳米药物,所述药物包括源自肾小管上皮细胞的外泌体和外泌体内包裹的VEGF-A,VEGF-A为所述药物的有效成分。
一种外泌体—VEGF-A纳米药物制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
S1:体外培养肾小管上皮细胞。
S2:通过VEGF-A过表达质粒和CD63过表达质粒转染肾小管上皮细胞,得到VEGFA和CD63表达上调的肾小管上皮细胞。
S3:收集S1中肾小管上皮细胞的细胞培养液,对外泌体进行分离提取,即得外泌体—VEGF-A纳米药物。
进一步的,所述S2中通过VEGF-A和CD63过表达质粒转染肾小管上皮细胞的具体方法为:用含有CMV-MCS-SV40-Neomycin VEGF-A质粒、 CMV-MCS-SV40-Neomycin CD63质粒和Lipofectamine 3000的Opti-MEM混合液转染mTEC肾小管上皮细胞8-12小时。更换无血清培养基继续培养24-48h。
进一步的,转染1×106个所述肾小管上皮细胞需要5-8μgVEGF-A质粒、 5-8μgCD63质粒和10-15μL Lipofectamine 3000。
进一步的,所述S1中体外培养肾小管上皮细胞的具体方法为:体外培养mTEC 肾小管上皮细胞于完全培养基中,待完全培养基中的细胞达到65%-80%融合时,用PBS清洗细胞。
进一步的,所述S3中对外泌体进行分离提取的具体方法为:
于4℃、2000g离心20分钟以去除细胞和碎片;小心将上清转移到新的无菌离心管中,于4℃、13500g离心20分钟以去除微粒;小心将上清转移到无菌离心管中,于4℃、200000g离心2小时获得沉淀,再用无菌PBS(pH7.4)重悬清洗一次,于4℃、200000g离心2小时获得沉淀即为外泌体—VEGF-A纳米药物。
本发明的有益效果:
1、本发明将源自肾小管上皮细胞的外泌体首次作为有效成分VEGF-A的运输载体,提高了VEGF-A的稳定性,从而获得良好的促进管周内皮细胞增殖修复的效果,在肾脏病的治疗中具有非常可观的应用前景;
2、本发明提供的外泌体—VEGF-A纳米药物的制备方法使所述外泌体良好的包裹了VEGF-A,为其他基于细胞因子的治疗提供了新的给药策略;
4、本发明的制备方法简单、方便、高效,作为载体的小管上皮细胞外泌体可更换为293细胞/间充质干细胞等其他已具外泌体临床治疗应用潜质的细胞作为载体,可以进行规模化生产。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为外泌体—VEGF-A纳米药物(缩写:Exo VEGF-A)的制备示意图:
其中,A为共聚焦显微镜观察VEGFA与MVB标志物CD63在mTEC细胞内共定位示意图;
B为结构光照明显超分辨率显微镜(SIM)观察源自图1A中mTEC肾小管上皮细胞上清中的提纯的外泌体—VEGF-A纳米药物Exo VEGF-A示意图;
图2为外泌体—VEGF-A纳米药物(Exo VEGF-A)对缺血再灌注损伤诱导的肾脏管周毛细血管稀疏化治疗作用示意图:
其中,A为实验设计示意图:构建单侧缺血再灌注小鼠模型,模型构建后立即给予外泌体—VEGF-A纳米药物(Exo VEGF-A)(200μg)尾静脉注射,每隔 12小时治疗一次,共7次;对照组通过尾静脉注射相同体积的生理盐水,所有小鼠在造模后30天处死;
B为ELISA检测外泌体—VEGF-A纳米药物(Exo VEGF-A)内VEGFA蛋白浓度折线图;
C为BOLD-MRI检测肾脏氧合水平示意图;
D为免疫荧光染色检测肾组织管周毛细血管密度示意图;
E和E’为PAS染色观察肾脏病理改变示意图;
F和F’为Masson trichrome染色观察肾脏间质纤维化改变示意图;
图3为外泌体—VEGF-A纳米药物(Exo VEGF-A)对缺血再灌注损伤诱导的肾脏纤维化以及肾间质炎症治疗作用示意图:
其中,A为RT-PCR检测肾组织中促炎以及促纤维化因子的mRNA水平示意图;
B为免疫组化染色检测肾脏纤维化标志物α-SMA的表达以及肾间质巨噬细胞(F480+)、淋巴细胞(CD4+和CD8+)浸润示意图;
图4为本发明实验原理图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
一种外泌体—VEGF-A纳米药物,所述药物包括包括源自肾小管上皮细胞的外泌体和外泌体内包裹的VEGF-A,VEGF-A为所述药物的有效成分。
上述外泌体—VEGF-A纳米药物的制备方法:
S1:体外培养肾小管上皮细胞
其方法具体为:体外培养mTEC肾小管上皮细胞(受赠于J.B.Kopp,美国国立研究所)于完全培养基中[DMEMF12基础培养基(美国Gibco)含体积分数10%胎牛血清(美国Gibco)],待完全培养基中的细胞达到70%融合时,用 PBS(pH7.4,美国Gibco)清洗细胞两次。
S2:通过VEGF-A过表达质粒和CD63过表达质粒转染肾小管上皮细胞,得到VEGFA和CD63表达上调的肾小管上皮细胞。
VEGF-A过表达质粒和CD63过表达质粒转染肾小管上皮细胞的具体方法为:向S1的完全培养基中加入含有CMV-MCS-SV40-Neomycin VEGF-A质粒(中国吉凯基因)、CMV-MCS-SV40-Neomycin CD63质粒和Lipofectamine 3000(美国 Invitrogen)的Opti-MEM(美国Gibco)混合液,转染1×106个mTEC肾小管上皮细胞5μgCMV-MCS-SV40-Neomycin VEGF-A质粒、5μg CMV-MCS-SV40-Neomycin CD63质粒10μL Lipofectamine 3000,得到VEGFA和 CD63表达上调的肾小管上皮细胞。
待转染8时后,用PBS(pH7.4)清洗细胞两次,更换为DMEMF12基础培养基,24-48小时后,收集细胞培养液于无菌离心管中,通过超速离心法提取细胞外囊泡。
S3:收集S1中肾小管上皮细胞的细胞培养液,对外泌体进行分离提取,即得外泌体—VEGF-A纳米药物。
对外泌体进行分离提取的具体方法为:
于4℃、2000g离心20分钟以去除细胞和碎片;小心将上清转移到新的无菌离心管中,于4℃、13500g离心20分钟以去除微粒;小心将上清转移到无菌离心管中,于4℃、200000g离心2小时获得沉淀,再用无菌PBS(pH7.4)重悬清洗一次,于4℃、200000g离心2小时获得沉淀即为外泌体—VEGF-A纳米药物,结果如图1B所示,所制备的细胞外囊泡中含有丰富的VEGF-A。
用无菌PBS(pH7.4)或无菌生理盐水重悬用于后续实验。
本实施例结果说明,本发明所制备的外泌体—VEGF-A纳米药物中的有效成分能够被外泌体包裹,符合外泌体的一般特征,并且提供的制备方法使所述细胞外囊泡高效的包裹了VEGF-A。
为严重外泌体—VEGF-A纳米药物(ExoVEGF-A)对缺血再灌注损伤诱导的肾脏管周毛细血管稀疏化治疗作用,做如下实验:
实验所用C57BL/6小鼠,8-10周龄,购于北京维通利华实验动物技术有限公司。肾脏缺血再灌注损伤模型(IRI)的构建:小鼠经质量分数4%水合氯醛腹腔注射麻醉,背部去毛,消毒备皮。
在背部脊柱旁0.5cm、肋骨下缘0.5cm处剪开皮肤,钝性分离肌肉,清理周边的脂肪组织和结缔组织,小心暴露肾脏和肾蒂;用微型动脉夹夹闭肾蒂,可见肾脏由鲜红变紫黑色,表示夹闭成功。夹闭35分钟后去除动脉夹,恢复血流灌注,可见肾脏迅速恢复原来颜色。分两层缝合开口,待小鼠清醒后,将其放回洁净笼具饲养。
外泌体—VEGF-A纳米药物的治疗:在肾脏恢复血流后,即通过尾静脉注射的实施例1制备纳米靶向药物(200μg,外泌体—VEGF-A纳米药物),每隔12 小时治疗一次,共7次。对照组通过尾静脉注射相同体积的生理盐水。所有小鼠在造模后30天处死,如图2A所示。
外泌体中VEGF-A的测定,结果如图2B所示,通过VEGF-A Quantikine ELISA 试剂盒(美国R&D)定量外泌体中的VEGF-A。将外泌体沉淀用RIPA裂解液(美国Invitrogen)裂解后进行浓度测定,取100μg裂解后外泌体进行ELISA检测。结果如图2B所示,在每μg所制备的外泌体中含有约800pg的VEGFA。
通过BOLD-MRI观察肾脏氧合水平改变,结果如图2C所示,所制备的外泌体—VEGF-A纳米药物的治疗能改善肾脏的氧合水平。
通过CD31染色观察肾脏管周毛细血管稀疏化情况,结果如图2D所示,所制备的外泌体—VEGF-A纳米药物的治疗能改善肾脏管周毛细血管稀疏化。
通过PAS染色观察肾脏病理改变,结果如图2E所示,所制备的细胞外囊泡—外泌体—VEGF-A纳米药物的治疗能改善肾小管损伤。
通过Masson染色观察肾脏病理改变,结果如图2F所示,所制备的外泌体—VEGF-A纳米药物的治疗能改善肾小管间质纤维化。
通过RT-PCR检测肾组织中炎症因子TNF-α、MCP-1的以及纤维化因子α -SMA、Collagen I mRNA水平,结果如图3A所示,外泌体—VEGF-A纳米药物的治疗能降低促炎因子以及纤维化因子的表达。
此外,通过免疫组化染色检测肾脏纤维化标志物α-SMA的表达情况以及肾间质中巨噬细胞(F480+)、淋巴细胞(CD4+和CD8+)的浸润情况,结果如图3B 所示,所制备的外泌体—VEGF-A纳米药物的治疗能够显著改善肾脏纤维化,抑制巨噬细胞以及CD4+/CD8+淋巴细胞的浸润。
通过实验结果说明,本发明所制备的外泌体—VEGF-A纳米药物能够显著改善缺血再灌注损伤诱导的肾脏管周毛细血管稀疏化、纤维化以及炎症反应,表现为管周毛细血管稀疏化、肾脏氧合水平以及纤维化的改善、炎症因子的降低和巨噬细胞、淋巴细胞浸润减少。
统计学分析
统计数据以平均值±标准误的形式给出,SPSS 13.0统计软件处理数据,组件比较采用单因素方差分析,两组比较采用t检验,p<0.05为具有显著差异。实验结果均重复3次以上。
所述药物可用于制备急性肾损伤药物或制剂。
一种用于治疗急性肾损伤肾脏的药物组合物,其中含有上述的外泌体— VEGF-A纳米药物作为活性成分和药学上可接受的载体。
上述药物组合物是一种细胞外囊泡纳米药物注射制剂。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (9)
1.一种外泌体—VEGF-A纳米药物,其特征在于,所述药物包括源自肾小管上皮细胞的外泌体和外泌体内包裹的VEGF-A,VEGF-A为所述药物的有效成分。
2.根据权利要求1所述的一种外泌体—VEGF-A纳米药物制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
S1:体外培养肾小管上皮细胞;
S2:通过VEGF-A过表达质粒和CD63过表达质粒转染肾小管上皮细胞,得到VEGFA和CD63表达上调的肾小管上皮细胞;
S3:收集S1中肾小管上皮细胞的细胞培养液,对外泌体进行分离提取,即得外泌体—VEGF-A纳米药物。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述S2中通过VEGF-A和CD63过表达质粒转染肾小管上皮细胞的具体方法为:用含有CMV-MCS-SV40-Neomycin VEGF-A质粒、CMV-MCS-SV40-Neomycin CD63质粒和Lipofectamine 3000的Opti-MEM混合液转染mTEC肾小管上皮细胞8-12小时。更换无血清培养基继续培养24-48h。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,转染1×106个所述肾小管上皮细胞需要5-8μg VEGF-A质粒、5-8μg CD63质粒和10-15μL Lipofectamine 3000。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S1中体外培养肾小管上皮细胞的具体方法为:体外培养mTEC肾小管上皮细胞于完全培养基中,待完全培养基中的细胞达到65%-80%融合时,用PBS清洗细胞。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S3中对外泌体进行分离提取的具体方法为:
于4℃、2000g离心20分钟以去除细胞和碎片;小心将上清转移到新的无菌离心管中,于4℃、13500g离心20分钟以去除微粒;小心将上清转移到无菌离心管中,于4℃、200000g离心2小时获得沉淀,再用无菌PBS(pH7.4)重悬清洗一次,于4℃、200000g离心2小时获得沉淀即为外泌体—VEGF-A纳米药物。
7.一种如权利要求1所述的外泌体—VEGF-A纳米药物在制备急性肾损伤药物或制剂中的应用。
8.一种用于治疗急性肾损伤肾脏的药物组合物,其特征在于,其中含有如权利要求1所述的外泌体—VEGF-A纳米药物作为活性成分和药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物是一种细胞外囊泡纳米药物注射制剂。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116004724A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-04-25 | 暨南大学 | 过表达cd63基因的间充质干细胞及其制备方法、应用 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20150151006A1 (en) * | 2012-05-10 | 2015-06-04 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Compositions and Methods for Gene Therapy |
CN111249449A (zh) * | 2020-02-28 | 2020-06-09 | 东南大学 | 一种细胞外囊泡—白介素-10纳米靶向药物及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-05-18 CN CN202210551830.8A patent/CN114848610A/zh active Pending
Patent Citations (2)
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US20150151006A1 (en) * | 2012-05-10 | 2015-06-04 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Compositions and Methods for Gene Therapy |
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