CN115725500A - 脂肪间充质干细胞外泌体、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞外泌体、其制备方法及其应用。所述外泌体的制备方法包括：采用含有DSPE‑PEG‑RGD的培养基培养脂肪间充质干细胞，之后收集并纯化培养基中的外泌体；其中，所述DSPE‑PEG‑RGD的结构如下式所示：

本发明的外泌体能够增强脂肪间充质干细胞靶向并促进血管生成，显著提升靶向归巢到受损的肾组织的能力，在改善纤维化损伤方面发挥了更加明显的治疗效果。

Description

脂肪间充质干细胞外泌体、其制备方法及其应用

技术领域

本发明具体涉及一种脂肪间充质干细胞外泌体、其制备方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

慢性肾脏病(CKD)是由多种原因引起的慢性疾病，主要是肾脏结构的损伤以及功能的障碍，据以往研究表明，尚未存在有效的方法阻止CKD的进展，肾间质纤维化是由于各种原因引起的肾脏疾病不断进展的共同通路，也是终末期肾脏病共同的病理状态，而肾小管周围毛细血管(peritubular capillary，PTCs)的减少以及继发的组织缺血、缺氧以及营养障碍与肾间质纤维化的发生发展密切相关，也进一步导致CKD病情的不断恶化，因此干预肾间质纤维化为治疗CKD以及后续发展起到了至关重要的作用。干细胞是一类具有自我更新、多向分化潜能的细胞，而间充质干细胞(MSCs)是多能体细胞干细胞的一个亚群，基于MSCs的干细胞治疗在心肌缺血和再灌注损伤，减轻肝脏纤维化、2型糖尿病胰岛素抵抗和急性肾损伤等的诊断和治疗提供了新策略，而在慢性肾脏病的治疗中也提供了新的靶向治疗依据。在各种新型的药物传递系统中，外泌体因为具有生物相容性好、免疫原性低和屏障通透性高等优点，成为这个领域研究的前沿热点。然而，基于外泌体给药系统的研究在临床转化方面存在着一些障碍，如循环半衰期相对较短、脱靶效应和生物利用度低等，而工程化的外泌体通过改善药代动力学特性，降低不必要的生物效应，可以更好地靶向病变器官，对发挥关键作用的特定类型的细胞靶向传递生物活性分子，因而有望成为新型的药物递送方式，尤其是在基因和生物治疗方面体现出巨大潜力。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种脂肪间充质干细胞外泌体、其制备方法及其应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明的一个方面提供的一种脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法包括：采用含有DSPE-PEG-RGD的培养基培养脂肪间充质干细胞，之后收集并纯化培养基中的外泌体；其中，所述DSPE-PEG-RGD的结构如下式所示：

在一个实施例中，所述的制备方法具体包括：以含1％干细胞生长因子、5％FBS和1％青-链霉素的MSCM培养基培养脂肪间充质干细胞，待细胞生长至50％～60％汇合度时，将培养基更换为含有50μg/mlDSPE-PEG-RGD的新鲜MSCM培养基，并在5％CO₂、饱和湿度及37℃恒温条件下继续培养48h，当细胞生长至70％～80％汇合度时，将细胞消化成单细胞悬液并继续培养，待细胞生长至70％～80％汇合度时，更换为MCSM基础培养基继续培养48小时，之后收集细胞上清液，再分离获得工程化外泌体，即DSPE-PEG-RGD修饰的脂肪间充质干细胞外泌体。

在一个实施例中，可以通过超速离心方式从所述细胞上清液中分离获得所述工程化外泌体。

本发明的一个方面提供的一种脂肪间充质干细胞外泌体是由本发明所述的制备方法制得。

本发明的一个方面提供的一种工程化外泌体包括脂肪间充质干细胞外泌体以及配体，所述配体用于对所述外泌体进行膜修饰，并且包括具有下式所示结构的化合物：

进一步的，所述配体用于对所述外泌体的磷脂膜进行修饰。

本发明的一个方面还提供了所述脂肪间充质干细胞外泌体或所述工程化外泌体在制备预防或治疗肾脏疾病的药物中的用途。

本发明的一个方面还提供了所述脂肪间充质干细胞外泌体或所述工程化外泌体在制备预防或治疗肾间质纤维化的药物中的用途。

本发明的一个方面还提供了所述脂肪间充质干细胞外泌体或所述工程化外泌体在制备具有血管内皮损伤修复功能的产品中的用途。

本发明的一个方面还提供了所述脂肪间充质干细胞外泌体或所述工程化外泌体在制备具有促进血管生成功能的产品中的用途。

本发明的一个方面还提供了一种药物组合物，其括所述脂肪间充质干细胞外泌体或所述工程化外泌体。

在一个实施例中，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。

相较于现有技术，本发明技术方案的优点至少在于：利用RGD多肽基序列对外泌体进行膜修饰，最终得到工程化的线性外泌体(RGD-AMSCs-exos)，其能够增强脂肪间充质干细胞靶向并促进血管生成，显著提升靶向归巢到受损的肾组织的能力，与天然AMSCs-exos相比较，在改善纤维化损伤方面发挥了更加明显的治疗效果，可以为干细胞治疗慢性肾脏病的方法提供新策略。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A示出了本发明一实施例中RGD-AMSCs-exos的透射电镜照片；

图1B示出了本发明一实施例中RGD-AMSCs-exos粒径分析结果；

图1C示出了本发明一实施例中Western Blotting对外泌体相关标记蛋白的结果；

图1D示出了本发明一实施例中在激光共聚焦显微镜下，内皮细胞对两种外泌体的摄取结果；

图1E示出了本发明一实施例中内皮细胞对两种外泌体摄取结果的统计图；

图2A示出了本发明一实施例中RGD-AMSCs-exos在促进细胞迁移中的作用；

图2B示出了本发明一实施例中RGD-AMSCs-exos在促进细胞迁移中的统计结果；

图2C示出了本发明一实施例中RGD-AMSCs-exos在促进小管形成中的作用；

图2D示出了本发明一实施例中RGD-AMSCs-exos在促进小管形成中的统计结果：

图2E示出了本发明一实施例中Western Blotting检测内皮细胞中HIF-1α、VEGF蛋白表达水平的结果；

图2F示出了本发明一实施例中Western Blotting检测内皮细胞中HIF-1α蛋白表达水平的统计结果；

图2G示出了本发明一实施例中Western Blotting检测内皮细胞中VEGF蛋白表达水平的统计结果；

图3A示出了本发明一实施例中近红外光谱成像IVIS系统定量检测两种外泌体在心、肺、肝、脾、肾分布的结果；

图3B示出了本发明一实施例中近红外光谱成像IVIS系统定量检测两种外泌体在病理组的肾脏以及正常肾脏的分布结果；

图3C示出了本发明一实施例中近红外光谱成像IVIS系统定量检测两种外泌体在心、肺、肝、脾、肾分布的结果的统计图；

图3D示出了本发明一实施例中近红外光谱成像IVIS系统定量检测两种外泌体在病理组的肾脏以及正常肾脏的分布结果的统计图；

图4A示出了本发明一实施例中FMA检测管周PTCs密度和灌注范围的结果：

图4B示出了本发明一实施例中统计分析比较各组肾组织管周毛细血管数；

图4C示出了本发明一实施例中统计分析各组肾组织灌注面积的结果；

图5A示出了本发明一实施例中肾脏组织的HE和Masson染色结果；

图5B示出了本发明一实施例中Western Blotting检测肾脏组织中HIF-1α、VEGF蛋白水平实验结果；

图5C示出了本发明一实施例中肾脏组织纤维化面积的统计结果；

图5D示出了本发明一实施例中HIF-1α蛋白水平表达的统计结果；

图5E示出了本发明一实施例中VEGF蛋白水平表达的统计结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1、DSPE-PEG-RGD的合成与表征

1，2-二硬脂酰-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇-精氨酰甘氨酰天冬氨酸(1，2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Polyethyleneglycol-ARG-GLY-ASP，DSPE-PEG-RGD)是由上海MeloPEG科技有限公司完成(合成方法可以参考文献1)。其中RGD模体是由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸三个氨基酸残基连接而成的三肽模体。该DSPE-PEG-RGD的结构式如下：

2、工程化外泌体(RGD-AMSCs-exos)的制备

在10cm²培养皿中加入含1％(如下若非特别说明，均为体积百分比)干细胞生长因子、5％FBS和1％青-链霉素的MSCM培养基中，并按常规方式培养脂肪间充质干细胞(AMSCs)，待细胞生长至50％～60％汇合度时，将培养基更换为含有50μg/ml DSPE-PEG-RGD的新鲜MSCM培养基，置于5％CO₂、饱和湿度、37℃恒温培养箱中继续培养48h。当细胞生长至汇合度约70％～80％时，将按照常规方式培养的AMSCs和使用含DSPE-PEG-RGD的MCSM培养基培养的AMSCs分别消化成单细胞悬液，并分别接种于10cm²培养皿，每个皿接种1×10⁶个细胞，在培养箱内培养至70％～80％汇合度时，换用MCSM基础培养基继续培养48小时，收集各个皿内细胞上清液，4℃条件下差速离心，分别为200×g离心5min、2000×g离心20min，每次离心后弃沉淀；16000×g离心30min，离心后再次弃沉淀；100000×g超速离心前使用0.22μm过滤器过滤；得到滤液后进行100000×g超速离心3h，小心吸弃上清并使用1ml无菌PBS轻轻洗涤沉淀，小心吸弃PBS，加入50μl无菌PBS重悬沉淀，所有操作在4℃条件下进行或冰上操作。最后将获得的原始外泌体(AMSCs-exos)及工程化外泌体(RGD-AMSCs-exos)分装入于EP管内进行后续实验。

请参阅图1A-图1E示出了RGD-AMSCs-exos的鉴定结果。其中图1A示出了RGD-AMSC-exos透射电镜的结果，图1B示出了RGD-AMSC-exos粒径分析，图1C示出了Western Blotting分析外泌体相关的蛋白，图1D示出了在激光共聚焦显微镜下观察缺氧处理后的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对两种外泌体的摄取情况，可以观察到HUVEC细胞核周围明显聚集更多的RGD-AMSCs-exos，图1E示出了RGD-AMSC-exos与AMSC-exos组外泌体靶向结合能力的统计图，两组比较有统计学意义(P＜0.001)。证明在该RGD-AMSCs-exos中，DSPE-PEG-RGD已被成功地固定在外泌体上。

3、RGD-AMSCs-exos在内皮损伤修复以及促进血管生成中的作用

3.1人脐静脉内皮细胞(HUVEC)建立缺血缺氧模型以及AMSCs-exos与RGD-AMSCs-exos处理。

其中缺血缺氧模型可以参考文献2等建立。

按照常规方式培养HUVEC(参考文献3)，待HUVEC贴壁后，将培养基更换为DMEM基础培养基，并在低氧培养箱(1％O₂，5％CO₂，95％N₂)中培养，且在培养基中分别加入50μg/mlAMSCs-exos、50μg/ml RGD-AMSCs-exos，进行外泌体与缺氧细胞的共培养。

请参阅图2A-图2G示出了本发明一实施例中RGD-AMSCs-exos在促进细胞迁移中的作用以及统计结果。其中图2A示出了细胞的迁移实验结果，可以观察到RGD-AMSCs-exos表现出更高的迁移能力；图2B示出了细胞迁移实验的统计图，两组比较有统计学意义(P＜0.001)；图2C示出了小管形成实验结果，在H/SD处理后，与正常对照组相比，H/SD组的小管成型的节点数及长度缩减，外泌体干预的两组的小管长度与H/SD组相比有所增加，且RGD-AMSCs-exos组增长更为显著；图2D示出了小管形成实验的统计图，差异均具有统计学意义；图2E示出了Western Blotting结果，H/SD组与Control组比较，VEGF表达水平下降，外泌体干预的两组VEGF表达较H/SD组上调；RGD-AMSCs-exos组VEGF表达较AMSCs-exos组更高，HIF-1α在各组中的表达情况与VEGF的表达变化相反；图2F示出了Western Blotting中VEGF结果的统计图，差异均有统计学意义；图2G示出了Western Blotting中HIF-1α结果的统计图，差异均有统计学意义。体外细胞相关实验证明，RGD-AMSCs-exos能够更好的促进血管生成。通过对HUVEC缺血清以及缺氧环境的处理，可以模拟人体内肾脏血管中的缺血缺氧环境，将干细胞外泌体与缺血缺氧的内皮细胞共培养，其缺氧损伤指标(HIF-1α，P＜0.05)显著降低，促血管生成因子(VEGF，P＜0.05)显著升高。差异均有统计学意义。经RGD多肽基序修饰的脂肪间充质干细胞与天然脂肪间充质干细胞相比，内皮细胞缺血缺氧状况更为明显改善，说明RGD-AMSCs-exos能够增强提高内皮细胞血管形成能力。

3.2构建单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型，使用近红外光谱(IVIS Lumina S5)成像系统检测外泌体在体内的分布

将RGD-AMSCs-exos尾静脉注射至单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠肾脏纤维化模型。使用DSPE-PEG-Cy5对两种外泌体进行标记：使用含有DSPE-PEG-Cy5(50μg/ml)的无血清培养基与提取两种外泌体混合，置于37℃水浴锅避光孵育30min。100000×g超速离心1h，弃掉上清，加入24ml清洗残余标记物，再次超速离心，弃掉上清，50μl PBS重悬外泌体沉淀，各组小鼠(UUO术后6d)通过鼠尾静脉分别注射DSPE-PEG-Cy5对RGD修饰的脂肪间充质干细胞外泌体和天然脂肪间充质干细胞外泌体。注射12h后处死小鼠，切除取出小鼠心脏、脾脏、肺脏、肝脏和肾脏，使用IVIS Lumina S5成像系统检测器官光子辐射值。请参阅图3A-图3D，其中图3A示出了近红外光谱成像IVIS系统，结果表明两组外泌体在肝脏中分布最多，在心脏分布最少，RGD-AMSCs-exos组在肝脏和肾脏的分布高于AMSCs-exos组；图3B示出了近红外光谱成像IVIS系统，结果显示在Sham组中RGD-AMSCs-exos组的光子辐射值明显高于AMSCs-exos组，在UUO组中RGD-AMSCs-exos组的光子辐射值同样高于AMSCs-exos组；图3C示出了两种外泌体分别在心、肝、肺、脾、肾分布的统计图，差异均有统计学意义；图3D示出了两种外泌体在病理组肾脏以及正常组肾脏的分布情况统计图，差异均有统计学意义。通过近红外光谱成像IVIS系统定量检测AMSCs-exos与RGD-AMSCs-exos在正常和病变小鼠肾脏的生物学分布，可以观察到RGD-AMSCs-exos组在肝脏和肾脏的分布高于AMSCs-exos组，说明RGD-AMSCs-exos能够增强外泌体靶向血管生成的能力，并且通过减少外泌体脱靶效应，促使更多的外泌体聚集在病变部位，降低潜在的副反应并进一步提高外泌体治疗的有效性和安全性。

3.3构建单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型，使用荧光造影剂进行微血管造影

将RGD-AMSCs-exos和AMSCs-exos分别通过尾静脉注射UUO以及正常小鼠体内，各组小鼠麻醉后，仰卧位对胸腹部备皮；腹正中向上剪开胸腔，暴露小鼠心脏；剪开右心房，心尖穿刺，灌注10ml生理盐水；继续灌注荧光造影剂；切除左肾，剥离包膜，冰浴10min；组织固定液4℃固定2h；OCT包埋，冰冻切片；使用荧光显微镜观察PTCs密度及灌注面积范围。请参阅图4A-图4C，其中图4A示出了荧光微血管造影结果，结果显示Sham组PTCs表达丰富，分布均匀，在大部分间质中连续排列，且血管充盈度高(白色方框内所示)，UUO组PTCs病变呈局灶性分布，PTCs密度逐渐降低，排列紊乱，血管内几乎无荧光剂充盈；图4B示出了外泌体组与UUO组相比，外泌体干预的两组毛细血管数量显著增加。与AMSCs-exos组相比，RGD-AMSCs-exos组毛细血管密度显著增高，差异均有统计学意义；图4C示出了外泌体组与UUO组相比，外泌体干预的两组总灌注皮质面积显著增加。与AMSCs-exos组相比，RGD-AMSCs-exos组灌注面积显著增高，差异均有统计学意义。通过荧光微血管造影技术(FMA)结果显示，与AMSCs-exos组相比，RGD-AMSCs-exos组毛细血管密度和灌注面积显著增高，说明通过RGD-AMSCs-exos能够更好的增加PTCs的密度与缺氧情况，有效的改善肾间质纤维化。

请参阅图5A-图5E，其中图5A示出了HE和Masson染色结果，Sham组肾组织结构完整，细胞形态正常，未见ECM过度沉积，UUO组可见肾脏部分肾小球硬化，肾小管扩张、炎性细胞浸润，间质纤维化程度较严重。外泌体治疗的两组较UUO组纤维化病变减轻，且RGD-AMSCs-exos的干预效果强于AMSCs-exos；图5B示出了UUO组与Sham组比较，VEGF表达水平下降；外泌体干预的两组VEGF表达较H/SD组上调：RGD-AMSCs-exos组VEGF表达较AMSCs-exos组更高；HIF-1α在各组中的表达情况与VEGF的表达变化相反；图5C示出了HE和Masson染色结果，肾脏间质纤维化程度的差异均有统计学意义；图5D示出了Western Blotting中HIF-1α结果的统计图，差异均有统计学意义；图5E示出了Western Blotting中VEGF结果的统计图，差异均有统计学意义。可见，干细胞外泌体治疗组(即RGD-AMSCs-exos组、AMSCs-exos组)相较于UUO组，其血管生成指标VEGF增加(P＜0.05)，而其缺氧HIF-1α以及纤维化指标α-SMA则明显降低(P＜0.05)，RGD-AMSCs-exos的治疗作用改善效果则更为明显，且差异均有统计学意义。

将RGD-AMSCs-exos通过尾静脉注射进入UUO小鼠体内，发现其能够更好的靶向并作用于肾脏的纤维化病变，特别是可以通过增加肾小管周围毛细血管的密度来改善肾脏缺血缺氧，进而达到阻止肾间质纤维化的进展的目的。

本发明通过将DSPE-PEG-RGD与脂肪间充质干细胞共培养，可以使DSPE-PEG-RGD对其分泌的外泌体进行膜修饰，从而更好的靶向以及促进血管生成，增加管周毛细血管的数量以及面积，减轻肾脏缺血缺氧状态来延缓肾脏纤维化的进展。

本发明中述及的参考文献的具体信息如下：

文献1：The use of RGD-engineered exosomes for enhanced targetingability and synergistic therapy toward angiogenesis。

文献2：Exosomes derived from GDNF-modified human adipose mesenchymalstem cells ameliorate peritubular capillary loss in tubulointerstitialfibrosis by activating the SIRT1/eNOS signaling pathway。

文献3：Exosomes derived from GDNF-modified human adipose mesenchymalstem cells ameliorate peritubular capillary loss in tubulointerstitialfibrosis by activating the SIRT1/eNOS signaling pathway。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施方式”、“一些实施方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本说明书实施方式的至少一个实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施方式或示例。

此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施方式或示例以及不同实施方式或示例的特征进行结合和组合。以上所述仅为本说明书实施方式的实施方式而已，并不用于限制本说明书实施方式。对于本领域技术人员来说，本说明书实施方式可以有各种更改和变化。凡在本说明书实施方式的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本说明书实施方式的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.一种脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于包括：采用含有DSPE-PEG-RGD的培养基培养脂肪间充质干细胞，之后收集并纯化培养基中的外泌体；其中，所述DSPE-PEG-RGD的结构如下式所示：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于具体包括：以含1％干细胞生长因子、5％FBS和1％青-链霉素的MSCM培养基培养脂肪间充质干细胞，待细胞生长至50％～60％汇合度时，将培养基更换为含有50μg/mlDSPE-PEG-RGD的新鲜MSCM培养基，并在5％CO₂、饱和湿度及37℃恒温条件下继续培养48h，当细胞生长至70％～80％汇合度时，将细胞消化成单细胞悬液并继续培养，待细胞生长至70％～80％汇合度时，更换为MCSM基础培养基继续培养48小时，之后收集细胞上清液，再分离获得工程化外泌体，即DSPE-PEG-RGD修饰的脂肪间充质干细胞外泌体。

3.一种脂肪间充质干细胞外泌体，其特征在于：它是由权利要求1-2中任一项所述方法制得。

4.一种工程化外泌体，其特征在于包括脂肪间充质干细胞外泌体以及配体，所述配体用于对所述外泌体进行膜修饰，并且包括具有下式所示结构的化合物：

5.权利要求3所述脂肪间充质干细胞外泌体或权利要求4所述工程化外泌体在制备预防或治疗肾脏疾病的药物中的用途。

6.权利要求3所述脂肪间充质干细胞外泌体或权利要求4所述工程化外泌体在制备预防或治疗肾间质纤维化的药物中的用途。

7.权利要求3所述脂肪间充质干细胞外泌体或权利要求4所述工程化外泌体在制备具有血管内皮损伤修复功能的产品中的用途。

8.权利要求3所述脂肪间充质干细胞外泌体或权利要求4所述工程化外泌体在制备具有促进血管生成功能的产品中的用途。

9.一种药物组合物，其特征在于包括权利要求3所述脂肪间充质干细胞外泌体或权利要求4所述工程化外泌体。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于还包括药学上可接受的载体。

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