CN115025063A - 一种脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统及其制备方法与应用，本发明利用了脂质体类膜和干细胞膜两种膜成分的相容性，构建了脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统，所述脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统包含融合的干细胞膜与脂质体，其中干细胞膜表达有VLA‑4分子，该纳米递送系统具备仿生物囊泡结构和磷脂双分子层，具有向受损脑内皮细胞靶向作用，可负载血脑屏障破坏相关疾病药物进行靶向递送，所涉及的制备方法简便，条件可控，具有良好的临床转化可能性。
Description
技术领域
本发明属于药物递送系统制备领域，尤其涉及一种脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统及其制备方法与应用。
背景技术
血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)是由软脑膜、脉络丛、脑微血管和星状胶质组织所组成的生物屏障。其分隔了脑组织与循环系统，可有效防止外周循环系统中的细胞、细菌和内毒素等进入脑内，维持脑内稳态。BBB的内皮细胞通过紧密连接相互串联，其紧密连接属于不通透连接，由紧密连接蛋白形成的索状结构将两相邻细胞连接起来，从而封闭细胞间隙。因此。BBB的高选择性和低渗透性也阻碍了疾病发生后向脑部的药物传递，限制了疗效发挥。脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells，BMECs)是血脑屏障的基础，在脑卒中发生后，由于大量炎症因子的产生和流体剪切力的改变，脑微血管内皮细胞的细胞骨架和形态发生变化，紧密连接(Tight junction，TJ)打开进而导致血脑屏障完整性被破坏，因此为靶向递送系统的构建提供了基础。炎症环境下，内皮细胞表面的黏附分子的表达水平被上调，循环系统中的单核细胞、中性粒细胞等可通过黏附分子黏附在受损内皮细胞表面，进而发生变形并浸润至病灶中。因而，此类黏附分子可以作为脑和受损血脑屏障靶向递送系统设计的备选靶标。
近年来，基于纳米制备技术的纳米递送系统在靶向药物递送中展现出独特的优势。其中脂质体作为商品化程度最高的纳米制剂之一，因其具有较高的生物相容性，灵活的修饰能力和较为简易的制备方法而受到研究者的青睐。如公开号为CN111920768A的中国专利公开了一种包载分子靶向药物的脂质体及其在制备治疗肿瘤药物中的用途。本发明的分子靶向药物脂质体由分子靶向药物、脂质体成分如磷脂、胆固醇mPEG-DSPE和/或靶向分子修饰的PEG-DSPE等组成。该发明通过主动或被动载药方式将分子靶向药物包载入脂质体内水相或磷脂双分子层制备而成，显著增强分子靶向药物抗肿瘤尤其是抗脑部肿瘤的效果。进一步所述分子靶向药物脂质体与药学上可接受的药用成分和/或稀释剂的组合制成各种剂型，具有潜在临床应用。随着对天然来源生物材料的研究不断深入，可将生物天然功能嫁接至纳米递送系统中。如申请号为ZL201710686283.3的中国专利公开了一种利用干细胞携载治疗基因实现了对缺血性脑卒中的有效治疗。该发明将干细胞作为药物的载体，能够将药物靶向递送至病灶部位，实现靶向递送药物。然而，细胞载体在制备、载药、储存等环节要求较高，且其载药量和载药种类受限，整体成本较高。此外，由于细胞载体仍具有一定活性，在体内循环中可能存在一定的安全隐患，因此，如何进一步提高递药系统的治疗效果是目前本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统及其制备方法和应用，该脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统可提升脂质体递送系统对受损血脑屏障的靶向性，并改善细胞载药存在的载药量低、药物种类有限的问题，从而提高药物对受损血脑屏障的靶向治疗效果。
本发明采用的技术方案如下：
一种脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统，所述脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统包含融合的干细胞膜与脂质体，其中干细胞膜表达有VLA-4分子。
上述脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统具备仿生物囊泡结构和磷脂双分子层，具有向受损脑内皮细胞靶向递送药物的作用。上述仿生物囊泡的纳米递送系统充分结合了两种成分的优势：一方面，脂质体具有灵活的载药能力，提高载药量；另一方面，干细胞膜保有向受损内皮细胞靶向的主要功能蛋白VLA-4，赋予整个递送系统具有与干细胞膜类似的受损内皮细胞亲和力。
优选的，所述纳米递送系统粒径为100～250nm。
优选的，所述干细胞膜选自间充质干细胞膜和神经干细胞膜的一种或多种。
优选的，所述磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱中的一种或多种。
优选的，脂质体与干细胞膜蛋白的质量比例为1:0.1～4。
本发明还提供一种上述的纳米递送系统的制备方法，利用了两种膜成分的相容性将表达有VLA-4分子的干细胞膜与脂质体采用机械共挤出法或超声法使两者融合，得到脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统。
具体包括如下步骤：
1)将磷脂溶于乙醇或氯仿，采用薄膜分散法或逆向蒸发法制备脂质体。
2)干细胞膜采用反复冻融法并通过离心得到干细胞膜。
3)利用蛋白印迹法检测2)中得到的干细胞膜表面的VLA-4的表达
4)将步骤1)中得到的脂质体与步骤2)中得到干细胞膜混合，采用机械共挤出法或超声融合法使两者交互融合，得到脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统。
优选的，所述步骤1)中薄膜分散法或逆向蒸发法可以采用现有的方法，根据需要携载的药物的亲疏水性选择合适的方法以保证载药量。
优选的，所述步骤2)中收集干细胞膜的具体过程：将干细胞放入液氮中30～60s后置于37℃水浴中5min复融，如此反复3次后，转移至玻璃匀浆器于冰上匀浆10～100次。随后，将匀浆液离心(20000×g，30min，4℃)，弃去沉淀后将上清液再次离心(100000×g，30min，4℃)并收集沉淀，即得到干细胞膜。
优选的，步骤4)所述脂质体与干细胞膜的混合比例为1:0.1～2(磷脂：蛋白，质量比)。干细胞膜的含量会直接影响纳米递送系统的靶向能力，且不同混合比对递药系统的粒径和电位均有一定影响，会间接影响其靶向能力。进一步优选的，脂质体与干细胞膜的混合比例为1:0.5(磷脂：蛋白，质量比)。优选的，步骤4)所述超声法超声功率为60～200W，每工作3s，休息2s，总工作时间为1～6min。超声功率和时长会影响纳米递送系统中两种膜成分的融合程度、粒径大小以及产品的稳定性。进一步优选的，超声功率为100W，总工作时间为3min。
本发明还提供一种如上述的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统在血脑屏障破坏相关疾病药物靶向递送中的应用。由于其具有类似干细胞的炎症趋向特性和受损内皮细胞靶向能力，因而可以用于实现对血脑屏障破坏相关疾病药物靶向递送，提高治疗效果，降低相应毒副作用。
优选的，所述血脑屏障破坏相关疾病为出血性脑卒中、缺血性脑卒中、恶行脑胶质瘤、阿兹海默症和帕金森病的一种。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明利用了脂质体类膜和干细胞膜两种膜成分的相容性，构建了具有仿生物囊泡结构的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统，可负载血脑屏障破坏相关疾病药物进行靶向递送，所涉及的制备方法简便，条件可控，具有良好的临床转化可能性。
(2)本发明的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统，可用于血脑屏障破坏相关疾病药物靶向递送，充分结合了脂质体和细胞载体的优势而规避了各自存在的缺点，利用脂质体装载药物克服细胞载体载药困难的缺点，利用干细胞膜赋予了脂质体主动靶向的能力，两者结合有利于实现药物向受损血脑屏障的精准递送，改善治疗效果的同时减轻毒副作用，具有广大的应用前景。
附图说明
图1为实施例4中制备的不同比例的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的粒径结果图。
图2为实施例4中制备的不同比例的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的Zeta电位结果图。
图3为实施例4中制备的不同比例的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的干细胞膜与脂质体的荧光共定位图，标尺为10μm。
图4为实施例4中以1:0.5这一比例制备的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的粒径结果图。
图5为实施例4中以1:0.5这一比例制备的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的Zeta电位结果图。
图6为实施例4中以1:0.5这一比例制备的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的透射电镜图，标尺为100nm。
图7为实施例4中以1:0.5这一比例制备的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的表面总蛋白含量定性检测结果图。
图8为实施例4中以1:0.5这一比例制备的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的表面的VLA-4蛋白定性检测结果图。
图9为实施例4中以1:0.5这一比例制备的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的VCAM-1蛋白结合能力结果图。
图10为应用例1中正常和受损脑内皮细胞对脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统摄取结果图。
图11为应用例1中脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统对体外受损脑内皮细胞表面VCAM-1的靶向能力，标尺为10μm。
图12为应用例2中脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统在缺血性脑卒中再灌注模型中的全身脏器分布情况。
图13为应用例2中脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统在缺血性脑卒中再灌注模型中的脑靶向能力。
图14为应用例3中脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统对体内受损脑内皮细胞表面VCAM-1的靶向能力，标尺为50μm。
具体实施方式
下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步说明，除另有说明外，下面具体实施例中提及的化合物含量均为质量分数。
实施例1：间充质干细胞MSCs的获取
大鼠MSCs取自4周龄SD大鼠的股骨与胫骨，体外培养形式为贴壁培养。其具体方法如下：
将4周龄的SD大鼠处死，在无菌环境中分离双侧股骨与胫骨，使用1mL注射器吸取培养基反复冲洗股骨与胫骨，将得到的骨髓过200目细胞筛，1200rpm离心5min，弃去上清，使用培养基重悬沉淀获得MSCs，进行体外培养。使用含有1％青霉素-链霉素(100U/mL)双抗溶液，1％谷氨酰胺，10％胎牛血清的DMEM培养基作为完全培养基进行MSCs体外贴壁培养。
实施例2：神经干细胞NSCs的获取
NSCs取自12.5天C57BL/6小鼠的海马区和脑室下区，以悬浮的神经球形式培养，具体如下：取出冻存的NSCs，于37℃水浴锅中快速融化，1000rpm离心5min后去掉上清，采用含有2％B27 SUPPLEMENT，1％青霉素-链霉素(100U/mL)双抗溶液，1％谷氨酰胺，20ng/mL小鼠bFGF-basic，10ng/mL小鼠EGF，4μg/mL肝素钠的DMEM/F12培养基作为完全培养液进行重悬，于37℃，5vol％CO2环境中培养。5天后传代，收集培养液，以800rpm离心10min，将神经干细胞球用ACCUTASE细胞分离液消化为单细胞，终止消化并弃去上清液，进行计数传代，以1×105cell/mL接种于培养瓶中。
实施例3：VLA-4分子表达的干细胞膜的制备
1)将间充质干细胞和神经干细胞分别在液氮和37℃水浴中反复冻融3次，转移至玻璃匀浆器于冰上匀浆20次。随后，将匀浆液离心(20000×g，25min，4℃)，弃去沉淀后将上清液再次离心(100000×g，35min，4℃)并收集沉淀，即得干细胞膜，通过蛋白检测试剂盒测定其蛋白浓度。
2)利用蛋白印迹法检测两种干细胞膜表面的VLA-4蛋白的表达，包括其α4和β1两个亚基。
3)利用等温量热滴定法检测干细胞膜与VCAM-1蛋白的结合能力。将200μg的干细胞膜分散在2mL的PBS缓冲液中，分别与含有20μM重组鼠VCAM-1蛋白的PBS缓冲液进行滴定，分离的间充质干细胞膜和神经干细胞膜都具备与VCAM-1蛋白特异性结合的能力。
实施例4：脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的制备
1)将神经干细胞在液氮和37℃水浴中反复冻融3次，转移至玻璃匀浆器于冰上匀浆20次。随后，将匀浆液离心(20000×g，25min，4℃)，弃去沉淀后将上清液再次离心(100000×g，35min，4℃)并收集沉淀，即得干细胞膜，通过蛋白检测试剂盒测定其蛋白浓度。
2)称取大豆卵磷脂8.4mg，加入20mL无水乙醇完全溶解后，在30℃条件下进行旋蒸2h。随后，向其中加入一定体积的磷酸缓冲液。水浴超声片刻后，分别调节干细胞膜(以蛋白量计)和大豆卵磷脂(500μg/ml)的混合比例，以1:0、1:0.125、1:0.25、1:0.5、1:0.75、1:1、1:2和0:1的比例(大豆卵磷脂和细胞膜蛋白质量比)将两者进行混合。冰浴条件下对混合液进行探头超声整粒，超声功率为100W，工作3s、休息2s，总工作时间为3min，最终得到不同比例的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统。
3)利用粒径电位测定仪对制备得到不同比例的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的粒径和Zeta电位进行检测，检测结果见图1和图2。粒径范围为150～300nm，且随着干细胞膜加入量的提高，粒径逐渐增加；电位呈负值，随着干细胞膜比例的增大，电位绝对值逐渐增大。
4)用荧光染料DiO标记干细胞膜，用荧光染料DiD标记大豆卵磷脂，得到不同比例的经荧光标记的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统。将其与BV-2细胞在37℃条件下共孵育2h后，用荧光染料DAPI对细胞核染色，通过激光扫描共聚焦显微镜观察脂质体类膜与干细胞膜的融合情况，观察结果见图3。当加入干细胞膜的比例增加时，DiO与DiD的荧光共定位比例逐渐增加；当比例增加至1:0.5时，两者基本上能完全共定位。
5)选定1:0.5的比例，对脂质体、脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统和干细胞膜囊泡的粒径和电位进行比较，并通过透射电镜对中性粒细胞膜嵌合仿生纳米递药系统的形貌特征进行观察，见图4-6。当投料比为1:0.5时，脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的粒径约为200nm，Zeta电位约为-18mV，具有明显的脂双层结构。
6)选定1:0.5的比例，将干细胞膜、脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统和空白脂质体用十二烷基硫酸钠溶解，经PAGE凝胶电泳之后采用考马斯亮蓝染色法对膜蛋白的完整性进行表征，结果见图7。脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统能够完整保留干细胞膜的膜蛋白成分，具有开发广泛应用的功能性基础。
7)选定1:0.5的比例，对脂质体、脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统和干细胞膜囊泡的VCAM-1蛋白进行结合测定，如图8至9，脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统能够与VCAM-1蛋白特异性结合，且结合常数与干细胞膜类似。单纯Liposome对VCAM-1蛋白不具备结合能力。
应用例1：脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的体外内皮受损内皮细胞靶向作用
将脑外周静脉内皮细胞使用无糖培养基并在1vol％的O2浓度下培养4h后，替换成正常培养基和正常O2浓度培养条件，构建体外受损脑内皮细胞模型。
向成功构建的体外受损脑内皮细胞模型中加入DiD标记的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统，利用流式细胞术检测受损脑内皮细胞对脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的摄取情况，图10结果显示受损的脑外周静脉内皮细胞对脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的摄取率显著提升。利用免疫荧光染色检测脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统与受损脑内皮细胞表面的VCAM-1蛋白共定位的情况，结果如图11所示，两者共定位情况较好，说明脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统对体外内皮受损内皮细胞具有靶向能力。
应用例2：脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的血脑屏障破坏相关疾病的靶向作用
缺血性脑卒中再灌注模型MCAO：选择20-25g的雄性C57BL/6小鼠进行建模手术。用1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，将小鼠仰卧固定在手术台上，脖颈处用棉花垫高，方便寻找血管。颈部正中开口，分离肌肉和腺体，找到搏动的颈总动脉，分离迷走神经，结扎颈总动脉近心端，远心端打活结，上部用止血夹夹住。剪刀在颈总动脉开一个小口，插入线栓至止血夹处，系紧活结固定线栓，打开止血夹，继续推入线栓至进入颈内动脉约8-10mm，遇明显阻力时停。缝合伤口，将小鼠置于智能热板仪，37℃恒温保暖。在缺血1h后拔出线栓，进行再灌注。
将DiD染料的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统、脂质体通过尾静脉注射入MCAO小鼠体内，注射量为400μg/kg。在注射给药4、8、12和24h时，将各组小鼠麻醉进行心脏灌流，取出脑、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏，用活体荧光成像系统检测脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统在MCAO小鼠的体内分布，结果如图12-13所示，脑部的荧光信号在8h时达到顶峰，并且信号聚集在损伤侧半脑，未损伤侧半脑则几乎无荧光信号，说明脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统具有良好的损伤脑部靶向能力，且脑内荧光强度与肝脏荧光强度类似，进一步说明靶向效果较好。
应用例3：脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的体内内皮受损内皮细胞靶向作用
将DiD染料的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统通过尾静脉注射入MCAO小鼠体内。在注射给药4、8、12和24h后，将各组小鼠麻醉进行心脏灌流，取出脑组织，固定切片后进行免疫荧光染色。检测脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统与受损脑内皮细胞表面的VCAM-1蛋白共定位的情况，结果如图14所示，两者共定位情况较好，说明脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统对体内内皮受损内皮细胞具有靶向能力。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法把所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统，其特征在于，所述脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统包含融合的干细胞膜与脂质体，其中干细胞膜表达有VLA-4分子。
2.根据权利要求1所述的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统，其特征在于，所述干细胞膜选自间充质干细胞膜、神经干细胞膜和造血干细胞膜的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统，其特征在于，所述脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的粒径为50～300nm。
4.根据权利要求1所述的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统，其特征在于，所述脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统对受损并高表达VCAM-1分子的脑血管内皮细胞具有靶向能力。
5.根据权利要求1所述的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统，其特征在于，所述脂质体的组成为蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统，其特征在于，脂质体与干细胞膜蛋白的质量比例为1:0.1～4。
7.一种权利要求1-6任一所述的脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统的制备方法，其特征在于，具体为：将表达有VLA-4分子的干细胞膜与脂质体采用机械共挤出法或超声法使两者融合，得到脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述表达有VLA-4分子的干细胞膜通过如下方法获得：将干细胞放入液氮中60s速冻后迅速置于37℃水浴锅中进行复融，如此反复3次后，转移至玻璃匀浆器中并至于冰上匀浆10～100次。随后，将匀浆液在20000×g，30min，4℃条件下离心，收集上清液再在100000×g，30min，4℃条件下离心并收集沉淀，即得表达有VLA-4分子的干细胞膜。
9.一种权利要求1-6任一所述脑内皮细胞靶向仿生纳米递送系统在制备治疗血脑屏障破损相关疾病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述血脑屏障破损相关疾病包括出血性脑卒中、缺血性脑卒中、恶行脑胶质瘤和阿兹海默症和帕金森病。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220909 |
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