CN110652492A - 一种载药外泌体及其应用、肝脏疾病药物 - Google Patents

一种载药外泌体及其应用、肝脏疾病药物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种载药红细胞外泌体及其应用、肝脏疾病药物。所述载药红细胞外泌体由用于治疗肝脏疾病的药物导入到红细胞外泌体中获得。本发明研究发现红细胞外泌体不需要作任何修饰就具有肝脏趋化性，用红细胞来源的外泌体，不仅解决了外泌体产量的问题，且红细胞不含DNA与RNA，在临床输血使用了几十年，比其他细胞来源的外泌体更加安全，具有很好的应用前景，而且能通过靶向给药，提高治疗肝脏相关疾病的疗效，降低药物毒副作用。

Description

一种载药外泌体及其应用、肝脏疾病药物
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种载药外泌体及其应用、肝脏疾病药物。
背景技术
近年来，世界范围内肝病的发病率和死亡率仍居高不下。根据不同的病因，肝病可分为病毒性肝炎、急性肝衰竭、酒精性或非酒精性肝病、胆汁淤积性肝病、胆管病、自身免疫性肝病、肝硬化和肝脏恶性肿瘤等。目前，肝脏疾病的治疗仍具有相当的挑战性，尤其是急性肝损伤和肝脏恶性肿瘤。由于肝功能突然丧失，急性肝损伤的死亡率很高。目前临床上对急性肝损伤的治疗仅限于原位肝移植和人工肝，然而，供体肝脏的严重缺乏以及术后的多种并发症，限制了两者在临床上的广泛应用，人工肝治疗的效果也相对有限。肝癌是全球第三大癌症相关死亡原因。尽管肝癌的治疗取得了进展，但它仍然是最难治疗的癌症之一。近年来，外泌体以“天然纳米粒子”作为药物的载体使用，已成为人们关注的焦点。国内外研究发现，向外泌体中载入相关的microRNA，siRNA，抗肿瘤药物等均表现出高效的靶向性及药物传递功能，为治疗各种疾病提供了有效的手段。有研究证实，在异种肿瘤移植的裸鼠肺癌模型中,以外泌体作为紫杉醇的药物载体进行干预，既明显抑制了肿瘤的生长，又显著降低了药物本身的毒性。通过基因工程使小鼠未成熟树突状细胞来源的外泌体表达一种特异性外泌体膜蛋白(Lamp2b)，使其与av整合素特异性IRGD肽融合或将其融合到神经元特异性RVG肽上，均表现出高效的靶向性及药物传递。
miR-155与NF-κb调控炎症反应密切相关。在内毒素血症小鼠模型中，使用反义寡核苷酸抑制miR-155，调节炎症负向调控因子(如SHIP1和SOCS1)的表达，可降低内毒素血症的严重程度。有研究表明，降低miR-155，导致Mcl1表达上调，进而阻止Fas诱导的肝细胞凋亡和肝损伤。目前临床上恶性肿瘤的治疗方法主要包括手术切除、放疗和化疗，化疗是最常用的治疗方法。在化疗过程中，抗肿瘤药物血药浓度越高，抗肿瘤效果越好。但与此同时，由于化疗药物选择性较差，高浓度的抗肿瘤药物对正常组织细胞杀伤作用也越大，毒副作用也越强。阿霉素是一种广谱的抗肿瘤药物，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞均有杀灭作用，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强。但阿霉素具有强烈的细胞毒性作用，对机体可产生广泛的生物化学效应，其主要的毒性反应为髓系抑制及心脏毒性。索拉菲尼作为一种新型多靶向性治疗肝癌的一线药物，具有直接抑制肿瘤细胞的增值和阻断肿瘤新生血管生成作用，主要用于治疗无法手术或远处转移的肝细胞癌，其主要的毒性反应为对皮肤的影响。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种降低毒副作用的肝脏疾病药物，由药物导入到外泌体中获得。
一种载药外泌体，由用于治疗肝脏疾病的药物导入到外泌体中获得。外泌体来源于红细胞。所述肝脏疾病为急性肝损伤或肝癌。所述药物为miR-155-ASO、阿霉素或索拉菲尼。
所述药物导入到外泌体中的方法为：使用电转方法将药物导入外泌体中。
其中，电转方法包括以下步骤：
(1)将药物和外泌体放入电转杯中；
(2)采用指数波，将电阻设置为100μF，使用50V～400V电压对药物和外泌体进行电转；
(3)将电转产物于37℃中水浴30min后，100000g×90min超离去除游离的药物，得到纯化后导入了药物的外泌体。
本发明又提供了所述载药外泌体在药物制备中的应用。
本发明还提供了一种肝脏疾病药物，有效成分为所述载药外泌体。所述肝脏疾病药物的使用方式为静脉注射。
本发明研究发现外泌体不需要作任何修饰就具有肝脏趋化性，用红细胞来源的外泌体，不仅解决了外泌体产量的问题，且红细胞不含DNA与RNA，在临床输血使用了几十年，比其他细胞来源的外泌体更加安全，具有很好的应用前景，而且能通过靶向给药，提高治疗肝脏相关疾病的疗效，降低药物毒副作用。
附图说明：
图1为100μg Vivotrack680标记过的红细胞外泌体，4T1细胞的外泌体及树突状细胞的外泌体，-经尾静脉注射入小鼠体内后在体内的生物分布图，其中图A为静脉注射红细胞外泌体后小动物活体成像结果图，图B为统计结果图，图C为静脉注射4T1细胞的外泌体(4T1-Exo)及树突状细胞的外泌体(DC-Exo)后的小动物活体成像结果图，图D为统计结果图。
图2为100μg PKH26标记过的红细胞外泌体经尾静脉注射入小鼠体内后在体内的生物分布图。
图3为miR-155-ASO载入红细胞外泌体后的稳定性检测结果图。
图4为将抗肿瘤药物阿霉素或索拉非尼成功载入红细胞外泌体及载入后的稳定性检测结果图，其中图A为阿霉素与红细胞外泌体电转后的高效液相色谱结果图；图B为索拉非尼与红细胞外泌体电转后的高效液相色谱结果图；图C为阿霉素载入红细胞外泌体后，流式细胞学检测其稳定性。
图5为急性肝损伤小鼠模型中用载入miR155-ASO的红细胞外泌体作用后，肝功能的检测结果图，其中图A为ALT的结果，图B为AST的结果。
图6为急性肝损伤小鼠模型中用载入miR155-ASO的红细胞外泌体作用后，体内炎症因子的检测结果图，其中图A为IL-1β的结果，图B为IL-6的结果，图C为TNF的结果。
图7为急性肝损伤小鼠模型中用载入miR155-ASO的红细胞外泌体作用后，肝脏组织的病理变化结果图。
图8为在正常小鼠中，载入miR155-ASO的红细胞外泌体(RBC-Exo/miR155-ASOs)作用后，肝功能与各组织的病理变化结果图，其中，图A为各组织的HE结果图，图B为肝功能的结果图。
图9为体外实验中，载入阿霉素或索拉菲尼的红细胞外泌体(RBC-Exo/Dox或RBC-Exo/SRF)与等剂量的游离阿霉素(SA/Dox)或索菲拉尼(SA/SRF)杀伤肿瘤细胞HCC-LM 3效果比较结果图，其中图A为阿霉素的治疗效果，图B为索菲拉尼的治疗效果。
图10为注射载入阿霉素的红细胞外泌体治疗肝癌的结果图，其中图A为小动物活体成像检测治疗27天后肿瘤的大小，图B为统计结果图。
图11为注射载入索拉菲尼的红细胞外泌体治疗肝癌的结果图，其中图A为小动物活体成像检测治疗27天后肿瘤的大小，图B为统计结果图。
图12为注射载入索拉菲尼的红细胞外泌体对肿瘤组织血管生成的影响检测图，其中图A为组织切片结果，图B为统计结果图。
图13为在肝癌小鼠模型中，检测载入阿霉素的红细胞外泌体(RBC-Exo/Dox)与临床上常规剂量的游离阿霉素(RD/Dox)相比，小鼠各组织器官的病理结果图。
图14为在肝癌小鼠模型中，载入阿霉素的红细胞外泌体(RBC-Exo/Dox)与临床上常规剂量的游离阿霉素(RD/Dox)相比，对小鼠心功能和肝功能的影响结果图。
图15为在肝癌小鼠模型中，载入阿霉素的红细胞外泌体(RBC-Exo/Dox)与临床上常规剂量的游离阿霉素(RD/Dox)相比，对小鼠体重影响检测结果图。
图16为在肝癌小鼠模型中，载入阿霉素的红细胞外泌体(RBC-Exo/Dox)与临床上常规剂量的游离阿霉素(RD/Dox)相比，对小鼠状态的影响结果图。
图17为在肝癌小鼠模型中，载入索菲拉尼的红细胞外泌体(RBC-Exo/SRF)与临床上常规剂量的游离索菲拉尼(RD/SRF)相比，对小鼠皮肤的影响检测结果图，其中图A为HE结果图，图B为统计结果图。
图18为在肝癌小鼠模型中，载入索菲拉尼的红细胞外泌体(RBC-Exo/SRF)与临床上常规剂量的游离索菲拉尼(RD/SRF)相比，对小鼠各器官血管形成的影响检测结果图，其中，图A为各组织的血管新生结果图，图B为统计结果图。
具体实施方式
雄性C57bl/6(6-8周)小鼠及Balb/c nude小鼠(6-8周)购买于上海斯莱克实验动物有限公司，所有小鼠均培育于SPF级设施。
miR-155反义寡核苷酸链(antisense oligonucleotide，miR-155-ASO)序列为：ACCCCUAUCACAAUUAGCAUUAA，合成于上海吉玛公司；阿霉素与索拉菲尼购买于浙江大学医学院附属第二医院。
实施例1
取红细胞外泌体及4T1和树突状细胞的外泌体，分别用Vivotrack680和PKH26染色，对红细胞及4T1和树突状细胞的外泌体在体内的分布进行示踪。
具体步骤如下：
(1)红细胞外泌体的提取：O型健康志愿者签署知情同意书后，抽取志愿者的新鲜血液(浙江大学医学院伦理委员会，伦理审批号：2019-084)，3000rpm×20min离心，取下层红细胞经白细胞滤器(Terumo Japan)过滤，分离的红细胞在PBS中稀释，用钙离子载体(#21186，Sigma-Aldrich)37℃隔夜处理。600g离心20min，1600g离心15min，3260g离心15min，10,000g离心4℃去除红细胞和细胞碎片。上清液经0.22μm滤器过滤。采用超速离心法，100,000×g离心70min，沉淀用无菌PBS重悬收集，4℃短期保存。BCA法测取红细胞外泌体的浓度(3μg/μL)，对红细胞外泌体的质量进行定量分析。
(2)4T1及树突状细胞外泌体的提取：取4T1及树突状细胞的上清，2000rpm×4min去除细胞碎片，100,000g离心70min，沉淀用无菌PBS重悬收集，4℃短期保存。BCA法测取4T1及树突状细胞外泌体的浓度(分别为2.23μg/μL与4.26μg/μL)，对4T 1及树突状细胞外泌体的质量进行定量分析。
(2)取100μg的红细胞外泌体及4T1和树突状细胞的外泌体，与12.5μgVivotrack680(#680，Fluorescence)室温避光孵育20min，15,000rpm离心10min，弃掉上清，含1％胎牛血清的PBS清洗两次后，无菌PBS重悬红细胞外泌体，经尾静脉注射入C57bl/6小鼠体内。12h及24h后，麻醉小鼠，取小鼠的脑，心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏，胃和肠，小动物活体成像系统观察红细胞外泌体在小鼠各个器官的生物分布。
(3)取100μg的红细胞外泌体，与1μL PKH26(#MINI26，Sigma-Aldrich)室温避光孵育5min，15,000rpm离心10min，弃掉上清，含1％胎牛血清的PBS清洗两次后，无菌PBS重悬红细胞外泌体，经尾静脉注射入C57bl/6小鼠体内。24h后，麻醉小鼠，取小鼠的脑，心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏和肠做冰冻切片，DAPI(#H-1800，Vector Laboratories)染细胞核后，观察红细胞外泌体在小鼠各个器官的生物分布。
结果为：(1)无论是红细胞外泌体，还是4T1(4T1-Exo)或树突状细胞外泌体(DC-Exo)，小动物活体成像系统均显示肝脏组织的荧光强度最高(图1)。(2)冰冻切片结果显示，肝脏组织中的红色荧光强度分布最多(图2)。
实施例2
将100μg红细胞外泌体与不同剂量的miR-155-ASO，阿霉素或索菲拉尼充分混匀后加入电转杯，100μL/次，应用BTX电转仪，运用指数波，使用不同的电压与电阻，进行电转。具体步骤如下：
(1)取100μg红细胞外泌体与不同剂量的带有荧光的miR-155-ASO(5μg，10μg，15μg，20μg)，阿霉素(25μg，50μg，75μg，100μg，125μg)或索拉菲尼(5μg，10μg，15μg，20μg，25μg)混合，电转缓冲液(#47-0001，BTX)将其补足至100μL，转移至0.1cm电转杯中。
(2)采用指数波，将电阻设置为100μF，使用不同的电压(50V，100V，200V，400V)对外泌体及miR-155-ASO，阿霉素或索拉菲尼进行电转。
(3)将电转产物于37℃中水浴30min后，100,000g×90min超离去除游离的miR-155-ASO，阿霉素或索拉菲尼，得到纯化后的电转产物。
(4)取200μL纯化的带有荧光的miR-155-ASO电转产物加入96孔板(黑壁白底)，向其中加入1个单位的Rase I(#EN0601，Thermo Fisher Scientific)，37℃孵育4h，M5酶标仪(SynergyMx M5，Molecular Devices)测量荧光强度的变化。取200μL阿霉素的电转产物行高效液相色谱检测，确定阿霉素转入红细胞外泌体中的剂量。
结果：(1)对于miR-155-ASO，100μg红细胞外泌体与15μg miR-155-ASO在200V的电压下进行电转，可达到饱和，效率最高。M5酶标仪荧光结果显示：miR-155-ASO成功载入了红细胞外泌体中(RBC-Exo/miR-155-ASOs)，并在红细胞外泌体中稳定存在，与未经过红细胞外泌体电转的等量miR-155-ASO(SA/miR-155-ASOs)相比，并不会因为Rase I的加入，荧光强度而显著下降(图3)。
(2)对于阿霉素，100μg红细胞外泌体与100μg阿霉素在350V的电压下进行电转，可达到饱和，效率最高。对于索拉菲尼，100μg红细胞外泌体与100μg索拉菲尼在350V的电压下进行电转，可达到饱和，效率最高。高效液相色谱结果显示阿霉素与索拉菲尼经电转成功载入了红细胞外泌体，并可在红细胞外泌体中稳定存在至少90天(图4)
实施例3
建立急性肝损伤模型，以载入了miR-155-ASO的红细胞外泌体进行治疗，观察其治疗效果及有无毒副作用。具体步骤如下：
(1)以2μg LPS(#L2630，Sigma-Aldrich)+8mg D-GaIN(#G1639，Sigma-Aldrich)腹腔注射建立急性肝损伤模型。
(2)尾静脉注射载入miR-155-ASO的红细胞外泌体，一次100μg，连续注射3天，一天一次。
(3)4天后，腹腔麻醉小鼠，眼球取血，3000rpm×10min离心，取上清，Elisa检测TNF-α，IL-1β，IL-6等炎性指标的变化，ALT及AST试剂盒检测肝功能的变化。取肝脏组织，福尔马林中浸泡，HE染色观察病理变化，以确定载药红细胞外泌体对急性肝损伤的治疗效果。
结果显示，载入了miR-155-ASO的红细胞外泌体(RBC-Exo/miR-155-ASOs)，较同等剂量的游离miR-155-ASO(SA/miR-155-ASOs)，阴性对照组(RBC-Exo/miR-NC-ASOs)及未治疗组(PBS)，可以显著的改善急性肝损伤的肝功能指标(图5)。
载入了miR-155-ASO的红细胞外泌体(RBC-Exo/miR-155-ASOs)，较同等剂量的游离miR-155-ASO(SA/miR-155-ASOs)，阴性对照组(RBC-Exo/miR-NC-ASOs)及未治疗组(PBS)，可以显著的降低急性肝损伤的炎性因子(图6)。
载入了miR-155-ASO的红细胞外泌体(RBC-Exo/miR-155-ASOs)，较同等剂量的游离miR-155-ASO(SA/miR-155-ASOs)，阴性对照组(RBC-Exo/miR-NC-ASOs)及未治疗组(PBS)，可以显著的改善急性肝损伤的病理变化，具体表现为炎性细胞浸润减少，肝细胞坏死减少，肝淤血减轻(图7)。
与正常未处理组比较，注射miR-155-ASO的红细胞外泌体组别并未影响肝功能指标、炎症因子及病理的变化，说明载入了miR-155-ASO的红细胞外泌体本身不会对肝脏产生毒副作用(图8)。
实施例4：
体内外实验检测载有抗肿瘤药物阿霉素或索拉菲尼的红细胞外泌体对肝癌的治疗作用及毒副作用，具体步骤如下：
(1)将HCC-LM3肝癌细胞系铺于12孔板中，每孔4×105个细胞，向其中加入游离的阿霉素或索拉菲尼，载入阿霉素或索拉菲尼的红细胞外泌体，CCK8(#FC101，Transgen)检测载有抗肿瘤药物的红细胞外泌体对肝癌细胞系的杀伤作用。
(2)在体内实验中，建立转移性肝癌模型，将5×106个HCC-LM3细胞注射至裸鼠皮下。待其生长到3cm×3cm×3cm时，将肿瘤从皮下剥离，医用胶水(广东白云)将其粘贴到裸鼠的肝脏组织表面。7天后，待其转移成功后，尾静脉注射载入阿霉素或索拉菲尼的红细胞外泌体，每3天做一次小动物活体成像观察治疗效果。21天后，腹腔注射麻醉小鼠，取血清，Elisa测量心功能及肝功能指标。取各组织器官，HE染色比较游离的抗肿瘤药物及载入抗肿瘤药物的红细胞外泌体对机体各器官的病理变化。血管生成实验检测肿瘤组织及其他组织的血管生成情况。
结果显示，(1)在体外实验中，载入阿霉素或索拉菲尼的红细胞外泌体相较于游离的阿霉素或索拉菲尼可以更加有效的杀伤肿瘤细胞(图9)。
(2)在体内实验中，载入了阿霉素或索拉菲尼的红细胞外泌体(RBC-Exo/Dox或RBC-Exo/SRF)，较等剂量的游离抗肿瘤药物组(SA/Dox或SA/SRF)及临床治疗常规剂量的游离抗肿瘤药物组(RD/Dox或RD/SRF)可显著降低小鼠的肿瘤大小(图10、图11)。载入了索拉菲尼的红细胞外泌体还可显著改善肿瘤新生血管的形成(图12)。
(3)在肝癌小鼠模型中，检测载入了阿霉素或索拉菲尼抗肿瘤药物的红细胞外泌体对小鼠的毒副作用，结果如图13～18所示，载入了阿霉素的红细胞外泌体(RBC-Exo/Dox)较临床上常规剂量的游离阿霉素(RD/Dox)，减轻了对心功能的影响；虽然影响了小鼠的肝功能，但对肝组织的形态变化无影响，此外，对小鼠的整体状体及体重也未造成明显的副作用。载入了索拉菲尼的红细胞外泌体(RBC-Exo/SRF)较临床上常规剂量的游离索拉菲尼(RD/SRF)，减轻了对皮肤的副作用，且对正常组织的血管形成不会造成明显的副作用。说明与游离的阿霉素或索菲拉尼相比，载入红细胞外泌体的阿霉素或索拉菲尼减轻了肿瘤药物的毒副作用，对小鼠的其他各组织器官并无明显影响。

Claims (9)

1.一种载药外泌体，在特征在于，由用于治疗肝脏疾病的药物导入到外泌体中获得。
2.如权利要求1所述的载药外泌体，在特征在于，外泌体来源于红细胞。
3.如权利要求1所述的载药外泌体，在特征在于，所述肝脏疾病为急性肝损伤或肝癌。
4.如权利要求1所述的载药外泌体，在特征在于，所述药物为miR-155-ASO、阿霉素或索拉菲尼。
5.如权利要求1所述的载药外泌体，在特征在于，所述药物导入到外泌体中的方法为：使用电转方法将药物导入外泌体中。
6.如权利要求5所述的载药外泌体，在特征在于，电转方法包括以下步骤：
(1)将药物和外泌体放入电转杯中；
(2)采用指数波，将电阻设置为100μF，使用50V～400V电压对药物和外泌体进行电转；
(3)将电转产物于37℃中水浴30min后，100000g×90min超离去除游离的药物，得到纯化后导入了药物的外泌体。
7.如权利要求1～6任一所述载药外泌体在药物制备中的应用。
8.一种肝脏疾病药物，其特征在于，有效成分为如权利要求1～6任一所述载药外泌体。
9.如权利要求8所述肝脏疾病药物，其特征在于，所述肝脏疾病药物的使用方式为静脉注射。
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