CN109666695A - 一种靶向整合素αvβ3的外泌体载体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向整合素αvβ3的外泌体载体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是一种靶向整合素αvβ3外泌体载体及其制备方法和应用。本发明的外泌体载体采用单核悬浮细胞THP‑1在适宜浓度PMA刺激下所得，所分离得到的外泌体表面含有RGD靶向分子金属蛋白酶解离素家族15，可以靶向整合素受体αvβ3，体外释放实验表明，制备的外泌体可以缓慢释放所载化疗药，同时又有较好的共载基因与化疗药的能力，本发明的外泌体能在肿瘤治疗中能特异性靶向过表达整合素αvβ3的细胞增强化疗药或者基因药物对肿瘤细胞的作用，促进肿瘤细胞凋亡，从而成为肿瘤治疗的一种靶向、高效、低毒的仿生纳米级递送系统。

Description

一种靶向整合素αvβ3的外泌体载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种靶向整合素αvβ3的外泌体载体及其制备方法和应用。
背景技术
随着分子生物学、免疫学及相关学科的发展，以及在治疗前列腺癌对雄激素撤退产生抵抗和化疗药耐药等分子机制的研究中，基因治疗逐渐显示了其巨大的优势，具有靶向性好、毒副作用小及可特异性地杀伤肿瘤细胞等特点(Yap,T.A.,et al.,Drugdiscovery in advanced prostate cancer:translating biology into therapy.NatRev Drug Discov,2016.15(10):p.699-718.)。但是外源基因容易发生体内降解，因此基因治疗应用于临床还需要一种安全、高效、稳定的传递载体进行递送(Milcovich,G.,et al.,Recent advances in smart biotechnology:Hydrogels and nanocarriers fortailored bioactive molecules depot.Adv Colloid Interface Sci,2017.249:p.163-180.)。随着近年来纳米靶向递药系统的发展，将纳米靶向载药系统与基因治疗技术联合应用已逐渐成为生物技术药物领域的研究热点，也被认为是癌症治疗中最具前景的方向。
传统递药系统包括：小分子药物传递系统、基因药物传递系统等，其中小分子药物传递系统存在无组织选择性以及快速肾排泄的缺点(Takagi,A.,et al.,Effect of co-administration of cationic macromolecules on the in vivo disposition and insitu renal disposition characteristics of rhIL-11.Drug Metab Pharmacokinet,2002.17(2):p.136-41.)。基因药物传递系统分为病毒类载体和非病毒类载体，前者虽然转染效率高，但是潜在毒性大，后者主要包括阳离子脂质体及聚合物，也存在着转染效率低和潜在毒性(Mehier-Humbert,S.and R.H.Guy,Physical methods for gene transfer:improving the kinetics of gene delivery into cells.Adv Drug Deliv Rev,2005.57(5):p.733-53.)。
细胞外囊泡(Extracellular vesicle,EV)是一种由细胞分泌的通过介导细胞间信号交流参与很多生理过程及病理过程的双层膜包被的囊泡。主要包括凋亡小体、微泡和外泌体三类，而外泌体(Exosome，Exo)是目前人们广泛关注的一类细胞外囊泡。外泌体的大小40-100nm之间，外泌体可携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。由于其相对较小的分子结构、天然的分子转运特性以及良好的生物相容性和血液中稳定性高等优势已经被广泛用于体内输送各种“货物”，主要包括基因类(miRNA、siRNA、mRNA等)、抗癌症药物类(紫杉醇，阿霉素等)以及抗炎药类、能增强免疫的抗原和蛋白质等其他类型药物(S,E.L.A.,et al.,Extracellular vesicles:biology andemerging therapeutic opportunities.Nat Rev Drug Discov,2013.12(5):p.347-57.Van der Pol,E.,et al.,Particle size distribution of exosomes andmicrovesicles determined by transmission electron microscopy,flow cytometry,nanoparticle tracking analysis,and resistive pulse sensing.J Thromb Haemost,2014.12(7):p.1182-92.Tian,Y.,et al.,A doxorubicin delivery platform usingengineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumortherapy.Biomaterials,2014.35(7):p.2383-90.Jang,S.C.,et al.,Bioinspiredexosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics tomalignant tumors.ACS Nano,2013.7(9):p.7698-710.)。外泌体作为药物载体的优势有以下优点：1)集合了内源性细胞载体和合成纳米载体的优势；2)与传统纳米载体相比：蛋白和基因的天然载体、免疫原性低、长循环、生物膜穿透性好(如BBB)、天然靶向性、安全性好、可包载亲水疏水药物；3)与内源性细胞载体相比：稳定易存储、纳米级别粒径(可利用高渗透强滞留效应)、根据目的不同可选择多种供体细胞。外泌体的表面存在区别于普通合成脂质体的复杂而特殊的蛋白及磷脂双分子层结构，该结构不仅有利于外泌体对所负载的药物的有效保护，更可使其避免被网状内皮系统捕获，获得更长的体内循环时间，实现被动靶向效应；更重要的是使外泌体易于与受体细胞融合，从而将药物释放到受体细胞内(Shahabipour,F.,M.Banach,and A.Sahebkar,Exosomes as nanocarriers for siRNAdelivery:paradigms and challenges.Arch Med Sci,2016.12(6):p.1324-1326.)。外泌体的这种天然结构特点决定了细胞对其所负载药物的接收明显强于其他载体。目前外泌体作为载体载药的方法主要包括共孵育、电穿孔、挤出、辅助超声、低渗透析、化学转染试剂等。根据所包载药物的不同选择不同的方法，例如共孵育主要用于亲脂性药物的包载，化学转染试剂和电穿孔主要用于基因药物的包载。当然载药方法并不绝对，需要进一步比较，进而选出高包载率的方法。为增强外泌体在肿瘤治疗上的靶向性，可通过对供体细胞进行基因工程改造或者在外泌体表面直接化学偶联靶向分子(Shahabipour,F.,M.Banach,andA.Sahebkar,Exosomes as nanocarriers for siRNA delivery:paradigms andchallenges.Arch Med Sci,2016.12(6):p.1324-1326.Alvarez-Erviti,L.,et al.,Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targetedexosomes.Nat Biotechnol,2011.29(4):p.341-5.)。因此如何使得外泌体靶向性好、产量和包封率高是一个难点。
整合素αvβ3在肿瘤细胞(例如前列腺癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌)中过量表达(Albelda,S.M.,et al.,Integrin distribution in malignant melanoma:association of the beta 3subunit with tumor progression.Cancer Res,1990.50(20):p.6757-64.Gingras,M.C.,et al.,Comparison of cell adhesion moleculeexpression between glioblastoma multiforme and autologous normal braintissue.J Neuroimmunol,1995.57(1-2):p.143-53.Natali,P.G.,et al.,Clinicalsignificance of alpha(v)beta3integrin and intercellular adhesion molecule-1expression in cutaneous malignant melanoma lesions.Cancer Res,1997.57(8):p.1554-60.Graf,N.,et al.,alpha(V)beta(3)integrin-targeted PLGA-PEGnanoparticles for enhanced anti-tumor efficacy of a Pt(IV)prodrug.ACS Nano,2012.6(5):p.4530-9.)及肿瘤血管内皮细胞中高表达，Arg-Gly-Asp(RGD)序列作为其配体，可与其进行特异性结合，为肿瘤的诊断和靶向治疗提供了理论基础。RGD诊断试剂的前期研究和临床试验数据表明其具有良好的肿瘤组织靶向性。RGD-纳米抗肿瘤制剂(RGD-脂质体、RGD-胶束和RGD-纳米粒)在体外可提高细胞对药物的吸收率，增强细胞毒性；在动物移植瘤模型中，能更好地抑制肿瘤的生长，延长了动物的生存时间。在肿瘤发病率居高不下，治疗手段和疗效都较为有限的今天，RGD靶向制剂在肿瘤诊断和治疗中所具有的优势值得特别关注。
Doo-Sik Kim(Lee,H.D.,et al.,Exosome release of ADAM15and thefunctional implications of human macrophage-derived ADAM15exosomes.Faseb j,2012.26(7):p.3084-95.Lastres,P.,et al.,Regulated expression on humanmacrophages of endoglin,an Arg-Gly-Asp-containing surface antigen.Eur JImmunol,1992.22(2):p.393-7.)等报道了人白血病单核细胞THP-1在蛋白激酶C激活剂佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)的刺激过程中会分泌一种含有Arg-Gly-Asp(RGD)靶向分子金属蛋白酶解离素家族15(A disintegrin and metalloproteinase，A15)，那么通过分离所得到的外泌体可以用来靶向高表达整合素受体αvβ3，并实现化疗药和基因药物的递送。
目前尚无一种靶向整合素αvβ3过表达肿瘤细胞的外泌体，并且能够实现化疗药物和基因药物的靶向递送。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫原性低、长循环、安全性好、可包载亲水疏水药物和基因药物的内源性载体，通过将基因药物进行疏水基团修饰然后嵌入到外泌体膜上。本发明的第二个目的是提供该外泌体载体的分离制备方法。本发明的第三个目的是提供该外泌体载体在靶向递送化疗药与基因药物至肿瘤部位的应用。
本发明所要解决的主要技术问题是：如何通过对外泌体来源细胞进行处理后分离得到具有靶向性的外泌体纳米载体，如何通过外泌体实现基因药物和化疗药的共载和靶向递送。
本发明设计了一种表面含有金属蛋白酶解离素家族15(A disintegrin andmetalloproteinase，A15)分子可以靶向整合素αvβ3外泌体载体，利用外泌体疏水性的膜实现疏水性化疗药和疏水性基团修饰的基因药物，可以靶向整合素αvβ3，整合素αvβ3在肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞中高表达，已有研究表明整合素αvβ3在黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌等肿瘤中高表达。外泌体载体部分可以实现靶向性和载体低免疫原性和安全性并可包载化疗药物和基因药物实现共载。
本发明的第一方面，提供一种靶向整合素αvβ3的外泌体载体，是通过对外泌体来源的THP-1单核细胞进行蛋白激酶C激活剂佛波酯(PMA)刺激分化，然后分离得到表面含有金属蛋白酶解离素家族15(A d isintegrin and metalloproteinase，A15)分子，可以靶向整合素αvβ3的外泌体载体。
进一步的，所述的A15分子，是可以靶向整合素受体αvβ3的分子。
进一步的，所述的外泌体载体为来源于THP-1单核细胞在刺激分化过程中的，所述的刺激分化是通过PMA进行刺激分化后对THP-1细胞的培养基进行分离所得的。
进一步的，所述的刺激分化是指PMA在浓度为50ng/mL条件下刺激培养THP-1细胞24h后，PBS洗涤之后继续用不含有PMA的培养基继续培养1-5天。产量为无PMA刺激的THP-1细胞分泌的外泌体的2.97倍，所用分析方法为BCA蛋白试剂盒法。
本发明的第二方面，是提供了一种如上所述的靶向整合素αvβ3的外泌体载体的制备方法，包括如下步骤(如图1)：
(A)培养单核悬浮细胞THP-1细胞，保证培养密度5×105-106/ml；
(B)调整细胞密度为6×105/ml，加入浓度为50ng/ml的PMA，刺激分化培养24后，PBS洗涤细胞后，更换为不含有PMA的培养基继续培养1-5天；
(C)转速为1500rpm，离心3min分离得到刺激分化后的THP-1细胞的培养基；
(D)通过梯度离心去除细胞碎片：300×g离心10min，1200×g离心20min，10,000×g离心30min，然后上清液用0.22μm微孔滤膜过滤；
(E)将过滤后的培养基用超滤管进行浓缩，所用超滤离心管的截留分子量为10000-30000MW，离心速度为4000×g，30min，收集浓缩后的培养基。
(F)将浓缩后的培养基进一步用超高速离心机，在100,000×g离心力，4℃温度的条件下离心70min，弃去上清液，PBS重悬沉淀后同样离心条件继续离心70min，所得沉淀即为所述的外泌体载体。
进一步的，为维持外泌体载体较高的活性，所述的步骤E得到的外泌体载体，用PBS重悬后，并保存于-80℃超低温冰箱。
本发明的第三方面，提供一种如上所述的靶向整合素αvβ3外泌体载体在制备化疗药物或基因药物中的应用。
进一步的，本发明提供上述的靶向整合素αvβ3外泌体载体在制备靶向高表达整合素αvβ3的肿瘤的药物中的应用。
进一步的，所述的高表达整合素αvβ3的肿瘤为乳腺癌或黑色素瘤。
进一步的，本发明提供上述的靶向整合素αvβ3外泌体载体装载化疗药物或基因药物，在制备靶向高表达整合素αvβ3的肿瘤的药物中的应用。
所述的应用，是所述的外泌体载体的表面膜性结构可以装载疏水性药物。
所述的应用，是所述的外泌体载体的表面膜性结构可以装载疏水性基团修饰的基因药物。
所述的基因，为miRNA，也可以是siRNA，pDNA。
所述的化疗药物，为脂溶性的阿霉素，也可以是多西他赛、环磷酰胺等。
进一步的，所述的靶向整合素αvβ3外泌体载体共载基因药物和化疗药物。
所述的应用具体为：
将所述的外泌体载体与化疗药物和基因药物混合，制得共载体系。
所述的化疗药物在外泌体中的载药情况为1μg外泌体可以载160ng阿霉素，基因药物miRNA的载药率为5.33％。
所述的外泌体载体包载阿霉素的能力，是外泌体外环境中阿霉素浓度为200μg/ml时，具有较好的载药量和包封率。
所述的外泌体载体与胆固醇修饰的miRNA在缓冲液中混合，室温孵育90分钟，可确保了基因转染体系的形成。
本发明提供的外泌体载体适用于实验所需的治疗性miRNA及化疗药。
本发明优点在于：
1、本发明所得到的外泌体可以在体外实现靶向过表达整合素受体αvβ3的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞和黑色素瘤B16细胞，体外释放实验表明，制备的外泌体可以缓慢释放所载化疗药，同时又有较好的共载基因与化疗药的能力，本发明的外泌体能在肿瘤治疗中能特异性靶向过表达整合素αvβ3的细胞增强化疗药或者基因药物对肿瘤细胞的作用，促进肿瘤细胞凋亡，从而成为肿瘤治疗的一种靶向、高效、低毒的仿生纳米级递送系统；
2、本发明的外泌体载体为一种免疫原性低、长循环、安全性好、可包载亲水疏水药物和基因药物的内源性载体，所形成的共载体系，可以实现基因药物和化疗药靶向进入过表达整合素αvβ3的肿瘤细胞中，因此非常适合于体内外的化疗与基因治疗研究与应用。
3、本发明的制备方法操作简单，不会对环境产生污染，反应条件温和，反应后得到的外泌体载体制备简单，所得到的外泌体，免疫原性低、长循环、安全性好，易于装载药物，有利于大规模推广于研究和应用领域。
附图说明
图1为所述的靶向整合素αvβ3的外泌体载体的分离制备方法。
图2为未分化和分化后的THP-1细胞分泌的两种外泌体A15-Exo和Exo的透射电镜图；
图3为未分化和分化后的THP-1细胞分泌的外泌体的纳米颗粒跟踪分析浓度粒径图；
图4为未分化和分化后的THP-1细胞分泌的外泌体Western Blot鉴定图；
图5为A15-Exo载基因前后电位变化图；
图6为外泌体在不同外环境阿霉素浓度下的装载效率考察结果图；
图7为载阿霉素的外泌体在不同pH条件下的释放情况；
图8为A15-Exo和Exo外泌体在过表达整合素αvβ3的MDA-MB-231细胞和不表达整合素αvβ3的MCF-7细胞中的共聚焦胞内分布实验；
图9为载胆固醇修饰的miRNA的A15-Exo和Exo外泌体的体内活体成像实验结果。
图10 A15-Exo/DOX在MDA-MB-231细胞和B16细胞上的摄取实验
图11 Cy5-Cho-miRNA在A15-Exo介导下在MDA-MB231细胞和B16细胞上的摄取实验
图12为小动物活体成像实验-体内靶向实验
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：未分化和分化后的THP-1细胞分泌的外泌体的提取及透射电镜观察
培养单核悬浮细胞THP-1，保证培养密度5×105-106/ml。调整细胞密度为6×105/ml，加入浓度为50ng/ml的PMA，刺激培养24h后，PBS洗涤细胞后，更换为不含有PMA的培养基继续培养1-5天。为了快速从大体积的培养基中获得足够产量的且比较纯的外泌体，拟联合超滤法以及超速离心法对外泌体进行分离提取。首先通过离心获得不含细胞的培养基，再通过梯度离心：300×g离心10min，1200×g离心20min，10000×g离心30min去除细胞碎片及微泡等，再过0.22μm的微孔滤膜，然后用截留分子量为100,000或者300000MW的超滤管4000g离心30min进行浓缩处理，最后将大体积的培养基最终浓缩3-5倍，然后再用超速离心机100,000×g离心70min，再用PBS重悬，转移至1.5ml超滤EP管继续在100,000×g转速下离心70min,PBS溶解后，负八十度冰箱保存，为下一步实验用。为排除PBS的磷酸盐在透射电镜下形成的结晶干扰形态的观察，用双蒸水重悬，移液枪吸取少量滴于放在滤纸上的200目铜网上，5min后，滴pH＝6.5的磷钨酸染液进行负染，自然风干后，于生物型透射电镜上观察形态。透射电镜如图2，a)为未加PMA刺激的THP-1细胞培养基分离得到的外泌体，b)为加了PMA刺激的THP-1细胞培养基分离得到的外泌体。结果显示出明显的茶托样的结构。
实施例2：未分化和分化后的THP-1细胞分泌的外泌体的纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)考察所收集的外泌体的浓度粒径情况
取实施例1中分离得到的外泌体于NTA的方法对其浓度粒径进行分析，用1ml注射器取200ul稀释至1ml，上机分析样品浓度粒径。结果如图3，a)为未加PMA刺激的THP-1细胞培养基分离得到的外泌体的NTA结果，b)为加了PMA刺激的THP-1细胞培养基分离得到的外泌体的NTA结，结果显示未分化THP-1细胞分泌的外泌体平均粒径为179.4nm，分化后的THP-1细胞分泌的外泌体粒径为94.1nm。
实施例3：未分化和分化后的THP-1细胞分泌的外泌体的纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)考察所收集的外泌体的蛋白鉴定
将实施例1中离心管底部收集到的两种外泌体，分别为未分化THP-1细胞分泌的外泌体(Exo)和分化后THP-1细胞分泌的外泌体(A15-Exo)。分别加入适量RIPA细胞裂解液，冰上裂解30min，充分裂解后，13000g离心15分钟，取上清。按照蛋白定量试剂盒进行蛋白定量(BCA法定量测蛋白)，取等量的蛋白和5X变性缓冲液混合，煮沸5min。配制10％分离胶，将蛋白进行SDS－PAGE电泳分离，先是恒压60V，电泳50min，然后是恒压120V，电泳2h。按照电泳胶剪裁PVDF膜，甲醇浸泡10s，将蛋白转移至PVDF膜上，在100V恒压条件下转膜2h；取出膜，TBST洗涤5min，去除TBST，5％脱脂牛奶室温封闭1h，加入相应的一抗(CD81,CD63和A15)，4℃孵育过夜，取出样本，至于恒温摇床1h，收集一抗，TBST洗涤3次，每次15min；同法准备二抗稀释液并与膜接触(1:2000稀释)，室温孵育2h，去除二抗，0.1％TBST室温下脱色摇床洗三次，每次10min；将膜置于保鲜膜上，ECL化学发光液A和B两种试剂等体积混合，滴在膜上，曝光拍照并记录。
结果见图4，外泌体膜上的标志性蛋白CD81，CD63均可以在所分离的外泌体中检测到，以及具有靶向功能的A15蛋白也存，从蛋白的角度对所分离的外泌体进行了鉴定。
实施例4：A15-Exo载基因前后电位变化图
将收集得到的A15-Exo与胆固醇修饰的miRNA孵育90min前后，分别测定电位，结果见图5。载基因前A15-Exo的电位为–14.67±1.53mV，载基因后电位变成–9.68±0.29mV，这可能是因为基因所携带的电位为负电荷所致。
实施例5：外泌体在不同外环境阿霉素浓度下的装载效率考察结果图
取2mg阿霉素盐酸盐(DOX.HCL)，加入摩尔比3:1的乙二胺脱盐处理，配制成100,200,400,600,800,or 1000μg/mL的阿霉素浓度，分别与外泌体A15-Exo孵育过夜，然后用3500MW分子量的透析袋透析48h，去除掉未载入的阿霉素和三乙胺，计算1μg of A15-Exo可以载阿霉素的量。
结果见图6，100,200,400,600,800,or 1000μg/mL浓度的阿霉素外环境下1μg ofA15-Exo分别可以载74.5±12.9ng,160.6±15.4ng,109.5±4.2ng,127.9±9.9ng,107.2±6.4ng,or 119.6±10.0ng的阿霉素，结果表明，在200μg/mL阿霉素浓度条件下，可以实现1μg of A15-Exo外泌体对阿霉素的最优装载。
实施例6：载阿霉素的外泌体在不同pH条件下的释放情况
采用透析袋法(赵志娟等，肺靶向阿霉素微球的体外释放度测定方法的建立，山西医药杂志，2007,4(36):304-305.)考察阿霉素的体外释放情况，选取截留分子量为3500MW的透析袋，透析介质pH分别为7.4、5.0，37℃进行考察。取2mg阿霉素盐酸盐(DOX.HCL)，加入摩尔比3:1的乙二胺脱盐处理，配制成200ug/ml的浓度，与外泌体孵育过夜，然后用3500MW分子量的透析袋透析48h，去除掉未载入的阿霉素和三乙胺，制得载阿霉素的外泌体。将1ml载阿霉素的外泌体A15-Exo/DOX溶液于透析袋中，放置于含50mlPBS的缓冲液中，100r/min，37℃，分别于0,2,4,6,8,10,12,24,48时间点取500μl外液，并补加500μl，利用阿霉素自带荧光测定其吸收。绘制体外释放曲线如图7所示。
由图7可知，pH5.0条件下阿霉素的释放速度明显快于pH7.4条件下，且其在48小时时，其累计释放率将近90.5％。结果表明所述外泌体具有pH敏感行为，这可能跟阿霉素在酸性条件下溶解度增加所致，其为抗肿瘤药物在肿瘤酸性微环境下释放提供了条件。
实施例7：A15-Exo和Exo外泌体在过表达整合素αvβ3的MDA-MB-231细胞和B16细胞中的细胞摄取情况
用染料PKH-67标记A15-Exo和Exo，将MDA-MB-231、B16细胞按照30w/孔分别接种于12孔板上，加入1ml含10％FBS(Gibco公司，美国)的培养基培养24小时，使细胞汇合度达70-80％，将培养基更换为无血清培养基。将A15-Exo、Exo加入细胞孔中，孵育4小时，吸去培养基，PBS洗3遍，消化离心收集，利用流式细胞仪检测两种细胞对染料PKH-67标记A15-Exo和Exo的摄取情况。
结果如图8所示，4h后MDA-MB-231和B16对A15-Exo的摄取分别为78.60±1.15％和89.76±2.25％，明显高于Exo在MDA-MB-231细胞(15.23％)和B16细胞(24.13％)中的摄取。说明与Exo相比，A15-Exo可以更高效的靶向进入过表达整合素αvβ3的MDA-MB-231和B16细胞。
实施例8：A15-Exo和Exo外泌体在过表达整合素αvβ3的MDA-MB-231细胞和不表达整合素αvβ3的MCF-7细胞中的共聚焦胞内分布实验
细胞铺板前取圆形盖玻片于75％乙醇中浸泡5分钟，无菌超净台内吹干。将盖玻片置于24孔板内，每孔种入3万个MCF-7细胞MDA-MB-231细胞培养24小时，使细胞汇合度达到50％，更换培养基为无血清的培养基。将用PKH-67染料标记的A15-Exo，Exo外泌体，加入到24孔板的细胞孔中，一组在孵中培养4小时后吸取培养基，多聚甲醛固定后DAPI染色，制备观察用玻片。两组玻片均用激光共聚焦显微镜观察拍照。
见图9，PKH-67标记的A15-Exo外泌体可以靶向至过表达整合素的MDA-MB-231细胞，A15-Exo可以成功的靶向至表达整合素的MDA-MB-231细胞中，明显多于MCF-7细胞。
实施例9：考察A15-Exo/Dox和阿霉素Dox在过表达整合素αvβ3的MDA-MB-231细胞和B16细胞中的细胞摄取情况
按实施例6中制备载阿霉素Dox的外泌体A15-Dox/Dox，将MDA-MB-231、B16细胞按照30w/孔分别接种于12孔板上，加入1ml含10％FBS(Gibco公司，美国)的培养基培养24小时，使细胞汇合度达70-80％，将培养基更换为无血清培养基。将等浓度的A15-Exo/Dox、Dox加入细胞孔中，孵育4小时，吸去培养基，PBS洗3遍，消化离心收集，利用流式细胞仪检测两种细胞对阿霉素Dox的摄取情况。
结果如图10c)所示，4h后MDA-MB-231和B16对A15-Exo/Dox的摄取平均无论从平均荧光密度值还是阳性细胞百分数的比较中都明显高于单纯的Dox在MDA-MB-231细胞和B16细胞中的摄取。说明与Dox相比，A15-Exo可以更高效的递送Dox靶向进入过表达整合素αvβ3的MDA-MB-231和B16细胞。
实施例10：Exo/Cy5-Cho-miRNA,A15-Exo/Cy5-Cho-miRNA在过表达整合素αvβ3的MDA-MB-231细胞和B16细胞中的细胞摄取情况
将MDA-MB-231、B16细胞按照30w/孔分别接种于12孔板上，加入1ml含10％FBS(Gibco公司，美国)的培养基培养24小时，使细胞汇合度达70-80％，将培养基更换为无血清培养基。将Cy5-miRNA、Cy5-Cho-miRNA，Exo/Cy5-Cho-miRNA,A15-Exo/Cy5-Cho-miRNA加入细胞孔中，孵育4小时，吸去培养基，PBS洗3遍，消化离心收集，利用流式细胞仪检测两种细胞对Cy5-Cho-miRNA或Cy5-miRNA的摄取情况。
结果如图11c)所示，4h后MDA-MB-231和B16对A15-Exo/Cy5-Cho-miRNA的摄取明显高于Exo/Cy5-Cho-miRNA，且都高于单纯的Cy5-Cho-miRNA或Cy5-miRNA。说明与Exo相比，A15-Exo可以更高效的递送靶向Cy5-Cho-miRNA进入过表达整合素αvβ3的MDA-MB-231和B16细胞。
实施例11载胆固醇修饰的miRNA的A15-Exo和Exo外泌体的体内活体成像实验结果
实验采用MDA-MB-231细胞皮下注射法构建乳腺癌裸鼠移植瘤模型，培养细胞足量，消化，离心，计数，加入预冷的生理盐水重悬细胞并调整细胞密度至1×108个/ml。基质胶提前24小时4℃解冻，等体积加入至细胞悬液中，冰浴混匀即制得接种液。裸鼠右上肢背部皮肤消毒，每只裸鼠皮下注射150μl接种液，保证注射速度均一。裸鼠继续饲养2周，选取肿瘤圆润且体积大于100mm3的裸鼠进行下一步实验。
制备载含有的多肽胶束。挑选的荷瘤裸鼠随机分成三组，分组5只。分别通过尾静脉的方式注射PBS、单纯Cy-5标记的胆固醇修饰的miRNA(Cy-5-Cho-miRNA)，载Cy-5标记的胆固醇修饰的miRNA外泌体Exo(Exo-Cy5-Cho-miRNA)，载Cy-5标记的胆固醇修饰的miRNA外泌体A15-Exo(A15-Exo-Cy5-Cho-miRNA)。注射后的1h，2h，4h，8h使用小动物活体成像仪检测裸鼠体内的荧光分布。检测条件：激发波长为635nm，发射波长670nm，曝光时间为3s。并用小动物活体成像仪检测荧光分布，并拍照记录。
结果显示，2h后，A15-Exo-Cy5-Cho-miRNA与单纯Exo-Cy5-Cho-miRNA相比可以有效的将Cy5-Cho-miRNA靶向至肿瘤部位，见图12。
综合以上各项实施例，可见外泌体能有效地包载化疗药并携带胆固醇修饰的miRNA片段靶向递送至靶细胞，说明外泌体A15-Exo适合作为化疗药与基因药联合应用的载体。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (9)

1.一种靶向整合素αvβ3的外泌体载体，其特征在于，是通过对外泌体来源的THP-1单核细胞进行蛋白激酶C激活剂佛波酯刺激分化，然后分离得到表面含有金属蛋白酶解离素家族15分子，可以靶向整合素αvβ3的外泌体载体。
2.根据权利要求1所述的靶向整合素αvβ3的外泌体载体，其特征在于，所述的刺激分化是指PMA在浓度为50ng/mL条件下刺激培养THP-1细胞24h后，PBS洗涤之后继续用不含有PMA的培养基继续培养1-5天。
3.一种如权利要求1所述的靶向整合素αvβ3的外泌体载体的制备方法，包括如下步骤：
(A)培养单核悬浮细胞THP-1细胞，保证培养密度5×105-106/ml；
(B)调整细胞密度为6×105/ml，加入浓度为50ng/ml的PMA，刺激分化培养24后，PBS洗涤细胞后，更换为不含有PMA的培养基继续培养1-5天；
(C)转速为1500rpm，离心3min分离得到刺激分化后的THP-1细胞的培养基；
(D)通过梯度离心去除细胞碎片：300×g离心10min，1200×g离心20min，10,000×g离心30min，然后上清液用0.22μm微孔滤膜过滤；
(E)将过滤后的培养基用超滤管进行浓缩，所用超滤离心管的截留分子量为10 000-30000MW，离心速度为4000×g，30min，在100,000×g离心力，4℃温度的条件下离心70min，弃去上清液，PBS重悬沉淀后同样离心条件继续离心70min，所得沉淀即为所述的外泌体载体。
4.一种如权利要求1所述的靶向整合素αvβ3外泌体载体在制备化疗药物或基因药物中的应用。
5.一种如权利要求1所述的靶向整合素αvβ3外泌体载体在制备靶向高表达整合素αvβ3的肿瘤的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的靶向整合素αvβ3外泌体载体在制备靶向高表达整合素αvβ3的肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的高表达整合素αvβ3的肿瘤为乳腺癌或黑色素瘤。
7.根据权利要求5所述的靶向整合素αvβ3外泌体载体在制备靶向高表达整合素αvβ3的肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的外泌体载体装载化疗药物或基因药物在制备靶向高表达整合素αvβ3的肿瘤的药物中的应用。
8.根据权利要求5所述的靶向整合素αvβ3外泌体载体在制备靶向高表达整合素αvβ3的肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的外泌体载体共载基因药物和化疗药物。
9.根据权利要求8所述的靶向整合素αvβ3外泌体载体在制备靶向高表达整合素αvβ3的肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的应用具体为：将所述的外泌体载体与化疗药物和基因药物混合，制得共载体系。
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