CN111603454A - 一种多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统及其制备方法与应用。所述多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统,包括融合细胞膜和所述融合细胞膜包裹的负电纳米内核;所述融合细胞膜为巨噬细胞膜与癌细胞膜经融合得到的;所述负电纳米内核携载有疏水性药物。本发明的融合细胞膜表面含有巨噬细胞膜和癌细胞膜表面的蛋白,具有靶向黏附识别功能,赋予所修饰的纳米载药体系多重靶向肿瘤的功能。本发明的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统可以递送化疗药,具有稳定性好、免疫原性低和生物相容性好的特点,为肿瘤靶向治疗中的疏水性治疗药物递送提供一种有效的手段。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,尤其涉及一种多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统及其制备方法与应用。
背景技术
全球每年有上千万人死于各种癌症,人们希望通过纳米载体靶向肿瘤部位来选择性抑制肿瘤生长。然而,纳米药物载体从静脉注射到癌细胞内释放药物的过程比较复杂,存在巨噬细胞吞噬、癌细胞膜穿透,内涵体/溶酶体逃逸等各种障碍,导致治疗结果受到影响。尽管国内外已有各种各样的纳米药物载体报道,研究有临床应用前景的肿瘤治疗纳米药物载体仍然是严峻的挑战。
体循环及免疫系统的快速清除作用已被证实是纳米药物靶向肿瘤部位递送失败的首要因素。而且,当纳米粒暴露在体液中时,一些非特异性的蛋白质和生物分子较易黏附到纳米粒表面,形成一种蛋白质环结构。这种结构很大程度上干扰了纳米粒与生物系统之间的相互作用,并且加快了纳米粒被免疫系统清除的速度。
为避开网状内皮系统的吞噬,除改变纳米粒物理性质的方法外,还可以通过修饰纳米载体使其表面具有抗蛋白非特异性吸附性能。所以,纳米载体表面修饰抗蛋白吸附材料,已经成为解决体循环快速清楚的只要解决手段。在众多高分子材料中,聚乙二醇(PEG)可在一定程度上减少非特异性蛋白质的吸附,同时抑制絮凝、调理素作用和随后的补体激活,因此PEG是最常用的纳米粒表面修饰材料。尽管如此,已有研究[Ishida T,et al.JControl Release,2005.105(3):305-17;Ishida T,et al.J Control Release,2006.112(1):15-25]显示PEG表面修饰的纳米载体能够诱导加速血液清除(Accelerated bloodclearance,ABC)效应,使得循环时间显著缩短。这都使得PEG化纳米载体的发展和临床应用受限。
因此,亟需提供一种纳米载体表面修饰的新技术来开发高效的长循环纳米载体,具有稳定性好、免疫原性低和生物相容性好等的特点,实现肿瘤治疗药物的靶向递送,并克服纳米载体递送的屏障,为肿瘤靶向治疗中的疏水性治疗药物递送提供一种有效的手段。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统,具有稳定性好、免疫原性低和生物相容性好的特点,并能实现肿瘤治疗药物的靶向递送,使得所递送药物到达肿瘤部位并进入肿瘤细胞发挥作用。
为了实现上述目的,本发明采取了以下技术方案。
本发明提供了一种多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统,包括融合细胞膜和所述融合细胞膜包裹的负电纳米内核;所述融合细胞膜为巨噬细胞膜与癌细胞膜融合得到的细胞膜;所述负电纳米内核携载有疏水性药物。
进一步,所述巨噬细胞膜与所述癌细胞膜的质量比为1:1。
进一步,所述融合细胞膜与所述携载有疏水性药物的负电纳米内核的质量比为1:1。
进一步,所述疏水性药物为疏水性化疗药或疏水性小分子药物。
进一步,所述疏水性化疗药为脂溶性的阿霉素、多西他赛、环磷酰胺中的至少一种。
进一步,所述疏水性小分子药物为免疫小分子治疗药物。
进一步,所述疏水性小分子药物可以为吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)抑制剂。
进一步,所述吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)抑制剂可以为1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan,1-MT)。
本发明还提供一种多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统在靶向肿瘤治疗中的应用。
进一步,所述靶向肿瘤的种类与所述融合细胞膜中的癌细胞膜为同一个种类的肿瘤。
本发明还提供一种多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的制备方法,包括如下步骤:
融合细胞膜的制备:将所述巨噬细胞膜与所述癌细胞膜混合,水浴超声,获得融合细胞膜;
仿生纳米递送系统的制备:将所述融合细胞膜进行超声预处理,后与携载有疏水性药物的负电纳米内核混合,水浴超声,使所述融合细胞膜包裹所述携载有疏水性药物的负电纳米内核,即得所述多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统。
进一步,所述巨噬细胞膜与所述癌细胞膜的质量比为1:1。
进一步,所述融合细胞膜与所述携载有疏水性药物的负电纳米内核的质量比为1:1。
进一步,所述融合细胞膜的制备:将所述巨噬细胞膜与所述癌细胞膜混合,水浴超声10min,即可制备得到融合细胞膜;
所述仿生纳米递送系统的制备:将所述融合细胞膜进行超声预处理20min,后与携载有疏水性药物的负电纳米内核混合,水浴超声2min,即得。
进一步,所述巨噬细胞膜和所述癌细胞膜的提取,包括如下步骤:
把1ml的膜蛋白抽提试剂A加入至2~5×107的目标细胞中,并充分悬浮细胞,冰浴放置10-15min;采用冻融法将冰浴后的目的细胞放在液氮和室温中依次反复冻融,破碎细胞,第一次离心,得到细胞膜碎片;所述目标细胞为巨噬细胞或癌细胞,即最终得到巨噬细胞膜或癌细胞膜;
其中,所述膜蛋白抽提试剂A在临加入到所述目标细胞中前添加了苯甲基磺酰氟(PMSF)。
进一步,所述第一次离心的步骤包括:在4℃、700×g的条件下离心10min,去除细胞核和未破碎的细胞,收集上清液,后在4℃、14000×g的条件下离心30min。
进一步,所述携载有疏水性药物的负电纳米内核采用沉淀法制备得到。
进一步,制备所述携载有疏水性药物的负电纳米内核的步骤包括:称取负电纳米内核的材料,溶解于丙酮中,加入疏水性药物,于搅拌下逐滴注入到纯水中,搅拌2h后,在通风条件下继续搅拌以挥发掉丙酮,然后用超滤法洗涤(500μL,30k MWCO,Millipore,USA)3000rpm、30min除去未载进去的疏水性药物,即得。
进一步,所述巨噬细胞和癌细胞的获取,包括如下步骤:
分别培养巨噬细胞和癌细胞至对数生长期,细胞密度为6×105/ml,刮取细胞并用PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤,离心收集细胞;分别用适量冰浴预冷的PBS轻轻重悬沉淀细胞,第二次离心,沉淀细胞,即得巨噬细胞或癌细胞,备用;
所述用PBS洗涤细胞后,用含有EDTA(乙二胺四乙酸)但不含胰酶的细胞消化液处理细胞,使细胞不贴壁;还可用移液器吹打下细胞使细胞不贴壁。
进一步,所述第二次离心的步骤具体为:于4℃、600×g条件下离心5min,沉淀细胞,弃除上清液,随后在4℃、600×g条件下离心1min,进一步除去残留液体及沉淀细胞。
本发明中,所述负电纳米内核的材料可以为PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)、明胶。所述负电纳米内核不仅可以起到支撑作用,还可以荷载药物或进行结构修饰。
本发明中,所述肿瘤细胞膜的种类为本领域常见的肿瘤种类。
本发明中,所述携载有疏水性药物的负电纳米内核可以采用本领域可以常规的方法制备得到。
本发明一实施例中,所述携载有疏水性药物的负电纳米内核的制备,可以采用以下方法(以所述疏水性药物为阿霉素、所述负电纳米内核为PLGA为例):
利用纳米粒淀法制备PLGA纳米载阿霉素纳米粒,步骤为:精密称定PLGA 10mg,丙酮1mL溶解,加入0.5mL的2mg/mL Dox(阿霉素),搅拌下逐滴注入4ml纯水中,搅拌2h后,放通风橱中继续搅拌一夜,挥发掉丙酮,然后用超滤法洗涤(500μL,30k MWCO,Millipore,USA):3000rpm、30min,除去未载进去的Dox。
将制备得到PLGA载阿霉素纳米粒NP与融合细胞膜以质量比1:1混合,超声2min,即可得到融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统。
本发明中,所述融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统不仅仅具有靶向炎症部位的能力,还具有靶向高表达VCAM-1的肿瘤中的应用。所述的高表达整合素VCAM-1的肿瘤可以为乳腺癌。
本发明中,所述巨噬细胞是一种在肿瘤微环境中大量存在的一类细胞,直接与肿瘤进展与转移有关。
本发明的有益效果在于:
1)本发明的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统可以递送化疗药,具有稳定性好、免疫原性低和生物相容性好的特点,为肿瘤靶向治疗中的疏水性治疗药物递送提供一种有效的手段。
本发明所得到的融合细胞膜可以在体内外实现肿瘤靶向,同时又有较好的包裹纳米递送体系,避免免疫清除的优势。本发明的仿生纳米递送体系能在肿瘤治疗中能特异性靶向富集于肿瘤部位并靶向肿瘤细胞,增强抗肿瘤治疗药物对肿瘤细胞的作用,促进肿瘤细胞的凋亡,从而成为肿瘤治疗的一种靶向、高效、低毒的仿生纳米级递送系统。
2)所述多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统,采用巨噬细胞膜与癌细胞膜的融合细胞膜,融合细胞膜表面含有巨噬细胞膜和癌细胞膜表面的蛋白,不仅具有炎症趋向的功能,还具有靶向黏附识别的功能,其表面具有α4整联蛋白,α4整联蛋白可以靶向识别血管细胞粘附分子-1(VCAM-1),癌细胞膜具有同源靶向的功能,使其可以靶向识别同类肿瘤细胞的功能。本发明通过将疏水性治疗药物包载在带负电的纳米粒内,然后将负电内核用所述融合细胞膜进行包裹,使其具有靶向炎症部位的能力和靶向高表达VCAM-1的肿瘤,从而进一步赋予所修饰的纳米载药体系多重靶向肿瘤的功能。
肿瘤细胞表面所特有的起相互识别并粘附的分子(如神经-钙粘素,半乳糖凝集素-3,上皮细胞黏附分子),它们具有同源黏附域,也是多细胞聚集形成的原因。本发明通过癌细胞之间具有细胞间的同源结合能力,利用其表面起识别和黏附功能的蛋白修饰纳米粒,使得纳米粒获得相应的靶向能力,实现肿瘤的靶向治疗。
3)本发明的仿生纳米递送体系为一种免疫原性低、长循环、安全性好、可包载疏水性治疗药物的仿生纳米载体,所形成的递送体系,可以实现疏水性治疗药物靶向进入肿瘤细胞中,能够很好地应用于靶向递送疏水性治疗药物至肿瘤部位中的应用;且本发明的递送系统非常适合于体内外的肿瘤治疗的研究与应用。
4)本发明的制备方法操作简单,不会对环境产生污染,反应条件温和,反应后得到的融合膜仿生递送载体制备简单,所得到的仿生纳米载体,免疫原性低、长循环、安全性好,易于装载药物,有利于大规模推广于研究和应用领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中的荧光共振能量转移法考察膜融合荧光强度图。
图2为本发明中免疫胶体金透射电镜图。
图3为本发明中融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的透射电镜图。
图4为本发明中融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的电位图。
图5为本发明中融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的粒径图。
图6为本发明中融合细胞膜的激光共聚焦共定位结果图。
图7为本发明中融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的聚丙烯酰胺电泳图。
图8为本发明中融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的Western Blot蛋白鉴定图。
图9为本发明中融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统在不同种类细胞中的激光共聚焦摄取结果图。
图10为本发明中融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统在乳腺癌细胞中胞内分布图。
图11为本发明中融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统在小动物活体成像实验-体内靶向实验的荧光分布图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统,包括融合细胞膜和所述融合细胞膜包裹的负电纳米内核;所述融合细胞膜为巨噬细胞膜与癌细胞膜融合得到的细胞膜;所述负电纳米内核携载有疏水性药物。
所述巨噬细胞膜与所述癌细胞膜的质量比为1:1。所述融合细胞膜与所述携载有疏水性药物的负电纳米内核的质量比为1:1。
所述疏水性药物为疏水性化疗药或疏水性小分子药物。
本实施例中,所述多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的制备方法,包括如下步骤:
融合细胞膜的制备:将所述巨噬细胞膜与所述癌细胞膜混合,水浴超声10min,即可制备得到融合细胞膜;
仿生纳米递送系统的制备:将所述融合细胞膜进行超声预处理20min,后与携载有疏水性药物的负电纳米内核混合,水浴超声2min,即得。
本实施例中,所述多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统可应用于肿瘤的靶向治疗中。
实施例2
本实施例提供了一种多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统,包括融合细胞膜和所述融合细胞膜包裹的负电纳米内核;所述融合细胞膜为巨噬细胞膜与癌细胞膜融合得到;所述负电纳米内核携载有疏水性药物。
所述融合细胞膜与所述携载有疏水性药物的负电纳米内核的质量比为1:1。所述巨噬细胞膜与所述癌细胞膜的质量比为1:1。
所述疏水性药物为疏水性化疗药。所述疏水性化疗药为脂溶性的阿霉素。
本实施例中,所述负电纳米内核的材料为PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)。
本实施例中,所述癌细胞膜为乳腺癌细胞膜。
本实施例中,所述多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的制备方法,包括如下步骤:
①所述巨噬细胞(RAW)和所述乳腺癌细胞(4T1)的获取:
分别培养巨噬细胞和癌细胞至对数生长期,细胞密度为6×105/ml,刮取细胞并用PBS洗涤,离心收集细胞;分别用适量冰浴预冷的PBS轻轻重悬沉淀细胞,于4℃、600×g条件下离心5min,沉淀细胞,弃除上清液,随后在4℃、600×g条件下离心1min,进一步除去残留液体及沉淀细胞,即得巨噬细胞或癌细胞,备用;
所述用PBS洗涤细胞后,用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞,使细胞不贴壁;
②所述巨噬细胞膜(RAWm)和所述乳腺癌细胞膜(4T1m)的提取:
把1ml的膜蛋白抽提试剂A加入至2~5×107的目标细胞中,并充分悬浮细胞,冰浴放置10-15min;采用冻融法将冰浴后的目的细胞放在液氮和室温中依次反复冻融,破碎细胞,第一次离心,得到细胞膜碎片;所述目标细胞为巨噬细胞或癌细胞,即最终得到巨噬细胞膜或癌细胞膜;
其中,所述膜蛋白抽提试剂A在临加入到所述目标细胞中前添加了PMSF。
所述第一次离心的步骤包括:在4℃、700×g的条件下离心10min,去除细胞核和未破碎的细胞,收集上清液,后在4℃、14000×g的条件下离心30min;
③融合细胞膜的制备:将所述巨噬细胞膜与所述癌细胞膜混合,水浴超声10min,即可制备得到融合细胞膜;
④载药纳米粒(NP)的制备:利用纳米粒沉淀法制备PLGA纳米载阿霉素纳米粒(NP),步骤为:
精密称定10mg的PLGA,溶解在1mL丙酮中,加入0.5mL的2mg/mL Dox(阿霉素),搅拌下逐滴注入4ml纯水中,搅拌2h后,放通风橱中继续搅拌一夜,挥发掉丙酮,然后用超滤法洗涤(500μL,30k MWCO,Millipore,USA)3000rpm,30min除去未载进去的Dox;
⑤仿生纳米递送系统的制备:将所述融合细胞膜进行超声预处理20min,与制备得到PLGA载阿霉素纳米粒(NP)以1:1的质量比混合,超声2min,即可得到[RAW-4T1]NP。
本实施例中,所述多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统在靶向肿瘤治疗中的应用。所述靶向肿瘤的种类与所述融合细胞膜中的癌细胞膜为同一个种类的肿瘤。
试验例1
本试验例采用荧光共振能量转移法对本发明的融合细胞膜的荧光强度进行考察。
本试验例以本发明实施例2中的所述融合细胞膜为实验例;
按照实施例2中的方法且所述巨噬细胞膜与所述乳腺癌细胞膜的质量比为5:1、4:1、3:1、2:1和0:1制得的融合细胞膜,作为对照例。
方法:采用荧光共振能量转移法进行荧光强度的检测,观察并记录荧光密度数据,结果见图1所示;
所述荧光共振能量转移法鉴定细胞膜融合比例的步骤包括:
(A)将DOPE-RhB/C-6NBD两种染料都溶解在三氯甲烷中,旋转蒸发成一层薄膜;
(B)将癌细胞膜与巨噬细胞膜质量百分比分别为0.17和1.74wt%,37℃搅拌50min,然后,残余的染料通过21000×g离心15min,洗涤四次;
(C)巨噬细胞膜再加入到掺杂4T1细胞膜的DOPE-RhB/C-6NBD混合溶液中,以下列蛋白比例添DOPE-RhB加:5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0:1,37℃条件下超声10min,加速膜融合;
(D)每个样品的荧光色谱图通过470nm的波长激发,接收波长为500到650nm。通过检测荧光供体C6-NBD的在发射波长534nm的荧光来看膜的融合程度。
图1为荧光共振能量转移法考察膜融合荧光强度图。
结果:根据图1可知,样品在534nm处的荧光强度的恢复说明了荧光共振能量转移效率的降低,显示着两种染料在一种4T1细胞膜上逐渐变成在两种细胞膜(4T1细胞膜和RAW264.7细胞膜,RAW264.7细胞膜以不同比例后续加入)的染料上,能量转移效率降低。可见,当两种细胞膜质量比为1:1时,能量转移效率最高,534nm的荧光强度并未恢复,预示着两种细胞膜融合最佳。
试验例2
本试验例对本发明中实施例2中得到的所述融合细胞膜或其修饰的仿生纳米递送系统进行免疫胶体金透射电镜检测,结果见图2所示。
本试验例采用免疫胶体金透射电镜鉴定融合细胞膜表面蛋白,以巨噬细胞膜与乳腺癌细胞膜融合为例,以整联蛋白α4为巨噬细胞膜表面标志性蛋白,以VCAM-1蛋白乳腺癌细胞膜表面标志性蛋白。
方法:本试验例中采用免疫胶体金透射电镜鉴定所述融合细胞膜的表面蛋白,其方法步骤如下:
(A)50μL的细胞膜或细胞膜包裹的纳米粒与50ul的4%多聚甲醛重悬混合(等体积混合);
(B)取5μL上述重悬液体于200目碳支持膜上,让碳支持膜吸收液滴20min,干燥;
(C)于保鲜膜上放置100μL PBS,用干净的镊子将碳支持膜在PBS里清洗,洗涤2次,用时3min;
(D)将碳支持膜转移至50mM甘氨酸中3min,再转移至50mM PBS中3次,总共洗涤4次,每次3min。甘氨酸是用来猝灭游离醛基团;
(E)将碳支持膜于5%BSA封闭液中封闭10min;
(F)将碳支持膜浸入5μL吸收后的一抗(1:20稀释,分别为VCAM-1抗体;IntegrinAlpha-4抗体),孵化30min;
(G)将碳支持膜用适当的0.1%(w/v)BSA/PBS洗液洗涤,洗1次,用时3min,然后继续将铜网转移至新鲜的0.1%(w/v)BSA/PBS洗液中5次,总共6次洗涤;
(H)在适当的封闭溶液中用稀释的二抗(1:20稀释,分别为山羊抗小鼠IgG H&L10nm Gold预吸附二抗;山羊抗兔IgG H&L 20nm Gold预吸附二抗)孵育30min;
(I)将碳支持膜在100μL的0.5%BSA封闭液中洗涤,3min,再于新鲜的0.5%BSA封闭液中重复5次,共计6次;
(J)将碳支持膜于100μL PBS液滴中洗涤2min,重复在新鲜的0.5%BSA封闭液中洗涤7次,共8次;
(K)将碳支持膜于50μL的1%戊二醛中5min;
(L)将碳支持膜于100μL去离子水中洗涤2min,重复在新鲜的去离子水中洗涤7次,共8次;
(M)双标样品重复步骤(C-L);
(N)磷钨酸染液染负染90s,于显微镜下观察并拍照,详见图2所示。
图2为免疫胶体金透射电镜图;其中,三角形标记为7nm金纳米预吸附二抗识别VCAM-1抗体;正方形标记为3nm金纳米预吸附二抗识别α4整联蛋白抗体;标尺:20nm。
结果:根据图2可知,结果表明RAW264.7细胞膜和4T1细胞膜融合成功,混合膜表达两种细胞膜分别携带的蛋白,制备方法可行,并且RAW264.7细胞膜和4T1细胞膜包裹的纳米粒都携带有所包裹的细胞膜表面的蛋白,以及融合膜包裹的纳米粒携带两种细胞膜分别携带的蛋白。可见,本发明制得的多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统,其表面具有α4整联蛋白,α4整联蛋白可以靶向识别血管细胞粘附分子-1(VCAM-1),融合细胞膜能够有效表达两种细胞膜分别携带的蛋白。
试验例3
本试验例对本发明实施例2中的所述多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统([RAW-4T1]NP)进行透射电镜观察,结果见图3所示。
本试验例中,以PLGA载药纳米粒(NP)、巨噬细胞膜(RAWm)、乳腺癌细胞膜(4T1m)、巨噬细胞膜包裹的PLGA载药纳米粒(RAWNP)、乳腺癌细胞膜包裹的PLGA载药纳米粒(4T1NP)为对照例,与本发明的所述融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统形成对比,有助于观察本发明的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的外观。
图3为融合膜仿生纳米复合物的透射电镜图。
根据图3可知,与对照例相比,本发明制得的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的外观更加规则,可见本发明的稳定性较好。
试验例4
本试验例对本发明实施例2中的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统([RAW-4T1]NP)进行电位测定。
本试验例中,以融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统([RAW-4T1]NP)为实验例,以PLGA载药纳米粒(NP)、巨噬细胞膜(RAWm)、乳腺癌细胞膜(4T1m)、巨噬细胞膜包裹的PLGA载药纳米粒(RAWNP)、乳腺癌细胞膜包裹的PLGA载药纳米粒(4T1NP)为对照例;进行电位测定,结果如图4所示。
图4为融合膜仿生纳米复合物电位图。
根据如4可以得出,本发明的纳米粒表面呈负电性,且经融合细胞膜[RAW-4T1]包裹后仿生纳米复合物呈与融合细胞膜[RAW-4T1]表面带同样大小的负电荷,电位在-35mv左右。
试验例5
本试验例对本发明试验例3或试验例4中的NP、RAWNP、4T1NP、[RAW-4T1]NP进行粒径检测,结果如图5所示。
图5为融合膜仿生纳米复合物粒径图。
根据图5可知,本发明的融合细胞膜仿生纳米复合物[RAW-4T1]NP的粒径在150nm左右,小于巨噬细胞膜或乳腺癌细胞膜单独包裹的PLGA载药纳米粒的粒径。
试验例6
本试验例对本发明实施例2中的细胞膜及细胞膜包裹的纳米粒进行激光共聚焦共定位观察。
具体方法如下:对实施例2中得到的巨噬细胞膜(RAWm)和癌细胞膜(4T1m)分别用DiO(绿色荧光)和DiL(红色荧光)标记,然后将二者分别包裹的纳米粒(RAWNP)和(4T1NP)以及二者的融合细胞膜包裹的纳米粒([RAW-4T1]NP)在激光共聚焦显微镜下观察,结果如图6所示。(其中,黄色荧光代表的是绿色荧光与红色荧光相重叠)
图6为融合膜激光共聚焦共定位结果图。其中,DiO(绿色荧光)标记巨噬细胞膜;DiL(红色荧光)标记癌细胞膜;黄色荧光标记融合细胞膜。
结果:根据图6可知,本发明的融合细胞膜包裹的纳米粒([RAW-4T1]NP)在激光共聚焦显微镜下出现黄色荧光,是两种细胞膜共定位后的荧光,说明融合膜制备较成功。
试验例7
本试验例对本发明实施例2中的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统([RAW-4T1]NP)进行聚丙烯酰胺电泳。
本试验例的具体试验方法如下:
安装垂直电泳槽,制备凝胶板,安装到电泳槽的支撑架上,对侧用塑料板同样固定,向内槽加入电泳缓冲液至没过包玻璃板上端,轻轻将模板梳向上垂直取出,确保取出过程中不要在加样空中产生气泡。
取蛋白质Marker和样品(巨噬细胞膜(RAWm)、乳腺癌细胞膜(4T1m)、融合细胞膜([RAW-4T1]m)和融合细胞膜仿生纳米复合物([RAW-4T1]NP)),加样;其中,蛋白质Marker、RAWm、4T1m、[RAW-4T1]m和[RAW-4T1]NP分别记为1、2、3、4和5。
调节电泳仪电压为80-100V,保持电流略大于20mA,观察样品浓缩成一条直线,当样品到达分离胶和浓缩胶的分界线时将电压调到120-150V,电流不变,30-40min后,等最前端的溴酚蓝染色液跑到凝胶的底部,Marker的条带都比较清晰的分离开时即可终止,关闭电泳仪,拆卸电泳槽,取下凝胶板,弃去浓缩胶,将凝胶转移到盛有足够多考马斯亮蓝染液的饭盒中,于微波炉中高火加热60s,然后在摇床上染色2-3min,回收考马斯亮蓝染液,然后向饭盒中加入适量的预先配制的脱色液,于微波炉中高火加热60s脱色,然后在摇床上脱色2-3min。重复脱色步骤3-4次,直到样本与Marker条带清晰呈现出来,然后将凝胶置于白瓷板上拍照并保存照片。结果见图7所示。
图7为融合膜仿生纳米复合物的聚丙烯酰胺电泳图。其中,1为Marker,2为RAW264.7细胞膜(RAWm),3为标记4T1细胞膜(4T1m),4为巨噬细胞膜与癌细胞膜融合膜([RAW-4T1]m),5为融合膜仿生纳米复合物([RAW-4T1]NP)。
试验结果:
根据图7可知,条带4([RAW-4T1]m)与条带5([RAW-4T1]NP)蛋白种类相同,并且是条带2(RAWm)、条带3(4T1m)的蛋白种类之和。
试验例8
本试验例对本发明的融合细胞膜仿生纳米复合物进行Western Blot蛋白鉴定试验。
方法:将实施例2中的4T1m、RAWm、[RAW-4T1]m、4T1NP、RAWNP、[RAW-4T1]NP作为样品,分别加入适量RIPA细胞裂解液,冰上裂解30min,充分裂解后,13000g离心15分钟,取上清。
按照蛋白定量试剂盒进行蛋白定量(BCA法定量测蛋白),取等量的蛋白和5X变性缓冲液混合,煮沸5min。配制10%分离胶,将蛋白进行SDS-PAGE电泳分离,先是恒压60V,电泳50min,然后是恒压120V,电泳2h。按照电泳胶剪裁PVDF膜,甲醇浸泡10s,将蛋白转移至PVDF膜上,在100V恒压条件下转膜2h;取出膜,TBST洗涤5min,去除TBST,5%脱脂牛奶室温封闭1h,加入相应的一抗(VCAM-1和α4),4℃孵育过夜,取出样本,至于恒温摇床1h,收集一抗,TBST洗涤3次,每次15min;同法准备二抗稀释液并与膜接触(1:2000稀释),室温孵育2h,去除二抗,0.1%TBST室温下脱色摇床洗三次,每次10min;将膜置于保鲜膜上,ECL化学发光液A和B两种试剂等体积混合,滴在膜上,曝光拍照并记录。结果如图8所示。
结果:见图8所示,巨噬细胞膜上的标志性蛋白α4均可以在所制备RAWm、[RAW-4T1]m、RAWNP、[RAW-4T1]NP样品中检测到,癌细胞膜上的标志性蛋白VCAM-1可以在所制备4T1m、[RAW-4T1]m、4T1NP、[RAW-4T1]NP样品中检测到,[RAW-4T1]m、[RAW-4T1]NP样本中α4和VCAM-1都可以检测到,结果从蛋白的角度对所分离制备的融合膜[RAW-4T1]m的表面蛋白进行了鉴定。
试验例9
本试验例对本发明的融合细胞膜仿生纳米复合物进行Western Blot蛋白鉴定试验。
本试验为了考察融合膜仿生纳米复合物在不同种类细胞中的体外靶向性。
选择鼠源巨噬细胞RAW264.7、鼠源神经胶质瘤细G422、鼠源前列腺癌细胞RM-1、鼠源乳腺癌细胞4T1考察仿生给药体系[RAW-4T1]NP的体外靶向性。
方法:将呈对数生长期的巨噬细胞RAW264.7、神经胶质瘤细G422、前列腺癌细胞RM-1、乳腺癌细胞4T1消化计数并以3万/孔的密度铺于24孔板,细胞铺板前取圆形盖玻片于75%乙醇中浸泡5分钟,无菌超净台内吹干。将盖玻片置于24孔板内,每孔种入3万个上述细胞培养24小时,使细胞汇合度达到50%,更换培养基为无血清的培养基。将用膜性染料DiL标记[RAW-4T1]NP,加入到24孔板的细胞孔中,一组在孵中培养4小时后吸取培养基,多聚甲醛固定后DAPI染色,制备观察用玻片。两组玻片均用激光共聚焦显微镜观察拍照;结果见图9所示。
根据图9可知,结果显示由于4T1乳腺癌细胞的同源靶向以及巨噬细胞的α4整联蛋白靶向使得4T1细胞对[RAW-4T1]NP的摄取最多。
试验例10
本试验例对本发明的融合细胞膜仿生纳米复合物在4T1细胞中胞内分布情况进行检测。
方法:将呈对数生长的4T1细胞消化计数并铺板,铺板前取圆形盖玻片于75%乙醇中浸泡5分钟,无菌超净台内吹干。将盖玻片置于24孔板内,每孔种入3万个4T1细胞培养24小时,使细胞汇合度达到50%,更换培养基为无血清的培养基。将用PKH-67染料标记的4T1m、RAWm、[RAW-4T1]m制备成对应的仿生纳米粒,将制备所得Dox、NP、4T1NP、RAWNP、[RAW-4T1]NP加入到24孔板的细胞孔中,一组在孵中培养4小时后吸取培养基,多聚甲醛固定后DAPI染色,制备观察用玻片。两组玻片均用激光共聚焦显微镜观察拍照;结果见图10所示。
根据图10可知,PKH-67标记的[RAW-4T1]NP可以通过同源靶向以及巨噬细胞的VCAM-1靶向双重靶向至4T1细胞。
试验例11
本试验例采用本发明的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统进行小动物活体成像实验-体内靶向实验。
方法:实验采用4T1细胞皮下注射法构建乳腺癌裸鼠移植瘤模型,培养细胞足量,消化,离心,计数,加入预冷的生理盐水重悬细胞并调整细胞密度至1×108个/ml。基质胶提前24小时4℃解冻,等体积加入至细胞悬液中,冰浴混匀即制得接种液。裸鼠右上肢背部皮肤消毒,每只裸鼠皮下注射150μl接种液,保证注射速度均一。裸鼠继续饲养2周,选取肿瘤圆润且体积大于100mm3的裸鼠进行下一步实验。
制备载含有DIR(亲脂性荧光染料)的PLGA纳米粒。挑选的荷瘤裸鼠随机分成三组,每组5只。分别通过尾静脉的方式注射PBS(Control组)、单纯游离的DIR、载DIR的PLGA纳米粒(PLGA@DIR)、融合细胞膜包裹的载DIR的PLGA纳米粒([RAW-4T1]-DIR-NP)。注射后的2h,4h,12h使用小动物活体成像仪检测裸鼠体内的荧光分布;并用小动物活体成像仪检测离体器官荧光分布,并拍照记录,见图11所示。
根据图11中的结果显示,注射2h后,[RAW-4T1]-DIR-NP与PLGA@DIR组相比可以有效的将DIR靶向至肿瘤部位,可见,本发明所述的融合细胞膜适合作为纳米粒外层靶向包衣递送治疗药物。
综上所述,本发明中的融合细胞膜能有效地包载纳米粒靶向递送至靶细胞,在肿瘤的靶向治疗中具有很高的应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统,其特征在于,包括融合细胞膜和所述融合细胞膜包裹的负电纳米内核;所述融合细胞膜为巨噬细胞膜与癌细胞膜融合得到的细胞膜;所述负电纳米内核携载有疏水性药物。
2.根据权利要求1所述的多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统,其特征在于,所述巨噬细胞膜与所述癌细胞膜的质量比为1:1。
3.根据权利要求1或2所述的多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统,其特征在于,所述融合细胞膜与所述携载有疏水性药物的负电纳米内核的质量比为1:1。
4.根据权利要求1所述的多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统,其特征在于,所述疏水性药物为疏水性化疗药或疏水性小分子药物。
5.一种根据权利要求1~4中任一项所述的多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统在靶向肿瘤治疗中的应用,能够携载药物靶向免疫炎症肿瘤部位。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述靶向肿瘤的种类与所述融合细胞膜中的癌细胞膜为同一种肿瘤。
7.一种根据权利要求1~4中任一项所述的多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
融合细胞膜的制备:将所述巨噬细胞膜与所述癌细胞膜混合,水浴超声,获得融合细胞膜;
仿生纳米递送系统的制备:将所述融合细胞膜进行超声预处理,后与携载有疏水性药物的负电纳米内核混合,水浴超声,使所述融合细胞膜包裹所述携载有疏水性药物的负电纳米内核,即得所述多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统。
8.根据权利要求7所述的多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的制备方法,其特征在于,在所述巨噬细胞膜和所述癌细胞膜的提取中包括如下步骤:
将膜蛋白抽提试剂A加入至2~5×107的目标细胞中,并充分悬浮细胞,冰浴放置10-15min;采用冻融法将冰浴后的目的细胞放在液氮和室温中依次反复冻融,破碎细胞,第一次离心,得到细胞膜碎片;所述目标细胞为巨噬细胞或癌细胞,即最终得到巨噬细胞膜或癌细胞膜;
其中,所述膜蛋白抽提试剂A在临加入到所述目标细胞中前添加了苯甲基磺酰氟。
9.根据权利要求8所述的多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的制备方法,其特征在于,所述第一次离心的步骤包括:在4℃、700×g的条件下离心10min,去除细胞核和未破碎的细胞,收集上清液,后在4℃、14000×g的条件下离心30min。
10.根据权利要求7所述的多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统的制备方法,其特征在于,制备所述携载有疏水性药物的负电纳米内核的步骤包括:
利用沉淀法制备PLGA纳米载阿霉素纳米粒:称取负电纳米内核的材料,溶解于丙酮中,加入所述疏水性药物,于搅拌下逐滴注入到纯水中,搅拌2h后,在通风条件下继续搅拌以挥发掉丙酮,然后用超滤法洗涤,在3000rpm、30min条件下除去未载进去的所述疏水性药物,即得。
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