CN114306277A - 一种靶向psma的巨噬细胞膜包裹的仿生纳米药物载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向PSMA的巨噬细胞膜包裹的仿生纳米药物载体及应用，将巨噬细胞膜包裹纳米金载体，其中巨噬细胞膜上跨膜表达基于SEQ.ID.NO.1所示序列的靶向PSMA的抗体；该抗体为gy‑1单链抗体，通过与CD8a铰链区和CD8a跨膜区的融合表达使其跨膜表达于巨噬细胞膜上。本发明利用基因工程的方法，构建表达跨膜单链抗体的慢病毒载体，包装成慢病毒后用于感染巨噬细胞使其表达跨膜单链抗体，提取此细胞膜进行纳米载体的仿生化修饰；所制备的纳米载体有望克服传统纳米药物载体外源性强、靶向性弱这两大难题，可用于前列腺癌的靶向诊疗试剂、药物的制备。

Description

一种靶向PSMA的巨噬细胞膜包裹的仿生纳米药物载体及应用

技术领域

本发明属于生物靶向技术领域，涉及针对前列腺癌的特异性靶向，特别涉及一种靶向PSMA的 巨噬细胞膜包裹的仿生纳米药物载体及应用。

技术背景

纳米医学被认为是21世纪最有前景的抗肿瘤策略之一，逐渐成为肿瘤新药研发的热点和焦点， 其中纳米药物载体不仅能够通过多样、可靠的载药方式，增加药物递送的稳定性、改善药物的水溶 性；还有望将抗肿瘤活性好但药代动力学差的药物纳入备选范畴，增加临床用药的灵活性，为肿瘤 的临床诊疗提供新动力。然而，传统的纳米药物递送系统，如FDA批准的脂质体、高分子聚合物、 白蛋白等，均存在“外源性强”、“靶向性差”这两个关键的瓶颈问题。

首先，传统纳米载体作为外源性物质，进入人体后会被单核巨噬细胞系统识别清除或通过吸附 血清蛋白间接激活免疫系统而被清除；其次，尽管肿瘤血管具有结构特殊、渗透性高的特点，使得 肿瘤组织具有增强的渗透和保留(Enhanced permeation andretention,EPR)效应，可使纳米载体在肿 瘤组织有一定程度的富集，然而EPR效应获得的特异性仍不够理想；研究表明，只有0.7％注射剂量 的纳米颗粒可达到肿瘤组织，考虑到纳米颗粒还需要穿过细胞外基质等层层屏障，因此真正到达肿 瘤细胞的量可能还不到0.7％。因此，急需探索并发明减少外源性而增强靶向性的新型纳米药物递送 系统，以促进其临床转化并增强药物的临床疗效。

为了克服上述传统纳米药物递送系统的两个瓶颈问题，国内外学者进行了广泛探索。首先，针 对“外源性强”的难题，可使用聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)对纳米载体进行表面改性，利用 PEG在纳米载体表面形成的一层水化膜，可以有效避免巨噬细胞与其接触，从而实现免疫逃逸。所 以，PEG化逐渐成为纳米载体表面修饰的主要策略。然而后续研究表明，首次注射这种PEG化的纳 米载体后，机体会产生“抗PEG”的免疫反应，再次注射时PEG化的纳米载体仍然会被快速清除。

近年来新兴的细胞膜仿生纳米技术可更有效地克服纳米载体的“外源性”难题。通过提取红细胞 膜并将其包覆于纳米载体表面，能够通过“自上而下”的方式使其获得红细胞表面的脂类分子和膜蛋 白，从而实现“类细胞样”的伪装和逃避单核巨噬系统的清除，并且与PEG修饰相比，这种仿生化修 饰的纳米载体在血液中的循环时间明显延长。红细胞具有数量丰富、易获取、没有细胞器容易提取 细胞膜等特点，使得红细胞膜成为纳米载体仿生化修饰中最常用的一类细胞膜。然而，由于红细胞 无法实现外源基因的转染和表达，难以实现靶向性，因此其进一步应用也受到了很大限制。与红细 胞膜相比，巨噬细胞膜可能更具优势：一方面巨噬细胞是介导免疫清除的主要细胞，因此使用巨噬 细胞膜进行仿生化修饰可望获得更好的伪装效果，从而更有效地逃避免疫清除；另一方面，巨噬细 胞具备完成的亚细胞结构，拥有外源基因的转染、表达及可细胞膜进行靶向改造等基础条件。

其次是“靶向性差”的难题。虽然巨噬细胞仿生纳米技术能够有效克服传统纳米载体“外源性强” 的短板，但其仍不具备对肿瘤细胞的特异性识别和结合能力。因此，增强仿生纳米载体的靶向性是 当前仿生纳米药物递送系统亟待解决的难题。目前，不少学者开展了增加纳米载体靶向性的尝试， 例如，使用脂质插入的方法可将特异性识别肿瘤的小分子多肽或寡核苷酸适配子插入到红细胞膜， 用这种细胞膜包裹的纳米粒可实现对肿瘤细胞的靶向性。然而这种方法插入的分子大小受限，目前 只能实现9kD大小的配体插入，无法实现特异性更高的大分子配体如抗体分子的插入。其次，使用 混合细胞膜的方法，将具备肿瘤靶向性的血小板膜、肿瘤细胞膜等与红细胞膜进行一定比例的混合， 之后进行纳米载体的仿生化修饰。虽然这种方法能够一定程度的提升靶向性，但受限于母体细胞本 身的靶向能力，改造效果不甚理想。再次，利用细胞膜表面蛋白分子的功能基团，通过化学方式将 小分子配体与之偶联也是一种靶向修饰策略，然而目前该策略效果也欠佳，甚至存在细胞膜变性丧 失免疫逃逸功能的风险。通过化学诱导的方式，使母体细胞膜上调表达靶向分子也能在一定程度上 增强仿生纳米载体的肿瘤靶向性，但诱导表达的靶向分子通常缺乏肿瘤特异性。因此，仍需要寻找 更有效的靶向策略。

前列腺癌是西方国家男性发病率第一，死亡率第二的恶性肿瘤。在我国，随着人口结构的老龄 化和生活方式的改变，前列腺癌的发病呈井喷式增长，已成为我国男性发病率第六位的恶性肿瘤。 目前，对于进展至晚期的转移性前列腺癌缺乏有效的临床治疗手段，因此亟需寻找有效的治疗策略。

发明内容

本发明将仿生纳米技术、基因工程技术和抗体技术有机结合，构建一种靶向PSMA的巨噬细胞 膜包裹的仿生纳米药物载体，克服传统纳米药物载体外源性强、靶向性弱的缺陷，为前列腺癌的靶 向诊疗提供一种新策略，为纳米药物研发提供一种新思路。

为了达到上述目的，本发明采用的解决方案是：

建立一种靶向PSMA的巨噬细胞膜包裹的仿生纳米药物载体，将巨噬细胞膜包裹纳米金载体， 其中巨噬细胞膜上跨膜表达基于SEQ.ID.NO.1所示序列的靶向PSMA的抗体；

该抗体为gy-1单链抗体，通过与CD8a铰链区、CD8a跨膜区融合表达使其跨膜表达于巨噬细 胞膜上。

所述巨噬细胞膜上跨膜表达的靶向PSMA的抗体，由慢病毒感染巨噬细胞并表达之后提取细胞 膜而得；

所述慢病毒是由重组GV218慢病毒载体以慢病毒三质粒系统包装而得；

所述重组GV218慢病毒载体中含有SEQ.ID.NO.1所示的基因片段。

所述的纳米金载体为核壳结构的Fe₃O₄@Au纳米粒；

巨噬细胞膜与纳米粒的质量比为2:1～10:1；

两者经超声分散、脂质体挤出器反复挤压而实现包裹。

一种靶向PSMA的跨膜抗体表达载体，该载体为重组GV218慢病毒载体，其中含有SEQ.ID.NO.1 所示的基因片段。

所述的靶向PSMA的巨噬细胞膜包裹的仿生纳米药物载体在制备前列腺癌诊断试剂、药物中的 应用。

所述的靶向PSMA的跨膜抗体表达载体在制备前列腺癌诊断试剂、药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明将仿生纳米技术、基因工程技术和抗体技术有机结合，构建一种靶向PSMA的巨噬细胞 膜包裹的仿生纳米载体；利用基因工程的方法，构建表达跨膜单链抗体的慢病毒载体，包装成慢病 毒后用于感染巨噬细胞使其表达跨膜单链抗体，提取此细胞膜进行纳米载体的仿生化修饰；所制备 的载体有望克服传统纳米药物载体外源性强、靶向性弱这两大难题，可用于前列腺癌的靶向诊疗 (PSMA是前列腺癌特异性的靶分子)。

本发明能够显著提高仿生纳米载体靶向修饰的稳定性，本仿生纳米粒在冻融前后具有优异的粒 径稳定性，且巨噬细胞膜蛋白的生物活性及跨膜表达的gy-1单链抗体结合能力依旧存在，提示本发 明采用的基因工程的靶向修饰效果可靠；本发明能够通过逃避巨噬细胞和肝脾网状内皮系统介导的 免疫吞噬，显著延长仿生纳米粒的体内半衰期。与传统纳米载体相比，本发明的体内半衰期能够达 到10h，延长超过3倍。

本发明的纳米载体能够通过跨膜表达的gy-1单链抗体实现与PSMA⁺前列腺癌细胞的特异性结 合和内化；具备前列腺癌近红外成像、MRI成像、CT成像的多模态靶向成像能力，与传统的仿生纳 米载体相比，本发明的靶向成像能力提升超过10倍；本发明能够对前列腺癌皮下瘤、骨转移瘤、肿 瘤转移淋巴结或2mm左右的肿瘤微小病灶实现精准成像和定位，这在传统的仿生纳米载体中几乎难 以实现。

本发明的纳米载体负载化疗药物后，具备精准的PSMA⁺前列腺癌细胞杀伤效果，对PSMA^-细胞 几乎没有脱靶损伤，提示本发明具有优异的治疗安全性，也进一步证明了上述靶向性的突出优势。 同时，本纳米载体能够实现化疗与光热治疗的协同增效作用，发挥更强的对前列腺癌皮下瘤和骨转 移瘤的抗肿瘤效果。本发明中包裹金纳米粒的巨噬细胞膜能够通过膜受体吸附肿瘤局部的细胞因子， 以阻断细胞因子介导的促肿瘤作用，实现对中立路免疫微环境的调节和对肿瘤生长的抑制。所以， 本发明的仿生纳米载体能够在增强肿瘤靶向性的基础上，实现前列腺癌精准诊断和联合治疗，这对 传统纳米载体来说是极难实现的。

附图说明

图1为慢病毒构建流程；

图2为用于慢病毒包装的三质粒系统；

图3为GV218重组质粒构建；

图4为靶向PSMA的巨噬细胞仿生纳米载体的构建流程；

图5为成功制备的具备PSMA靶向能力的跨膜表达gy-1单链抗体的Raw264.7^gy-1细胞；

图6为成功制备的核壳结构的Fe₃O₄@Au纳米粒；

图7为成功制备的Raw264.7^gy-1巨噬细胞膜包裹的Fe₃O₄@Au纳米粒M^gy-1-NPs；

图8为M^gy-1-NPs能够逃避巨噬细胞的吞噬；

图9为M^gy-1-NPs能够逃避肝、脾网状内皮系统的吞噬清除；

图10为M^gy-1-NPs能够特异性结合并内化入PSMA⁺前列腺癌细胞；

图11为M^gy-1-NPs在PC3^PSMA+细胞的皮下荷瘤小鼠中的靶向成像情况；

图12为M^gy-1-NPs在PC3^PSMA+细胞的骨转移模型伴随淋巴结转移的小鼠中的靶向成像情况；

图13为M^gy-1-NPs能够特异性杀伤PC3^PSMA+前列腺癌细胞；

图14为M^gy-1-NPs在PC3^PSMA+细胞的荷瘤小鼠中的抗肿瘤效果。

具体实施方式

要实现仿生纳米载体的特异性，靶分子的选择至关重要，前列腺特异性膜抗原(Prostate-specific membrane antigen,PSMA)是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，它几乎特异性地表达于所有前列腺癌细胞，且其 表达水平与前列腺癌的恶性程度密切相关，在晚期转移性前列腺癌中的表达尤其高。因此，PSMA 被认为是前列腺癌诊断和治疗的理想靶点。目前，以PSMA为靶点的抗体偶联药(Antibody-drug conjugate,ADC)在Ⅰ期和Ⅱ期临床试验中均显示出优异的前列腺癌靶向性和抗肿瘤活性。因此，利 用PSMA抗体进行巨噬细胞膜的工程化改造并进行纳米载体的仿生化修饰极具应用前景。

本发明选择特异性识别PSMA的单链抗体gy-1，并将其轻、重链可变区基因分别与CD8a铰链 区、CD8a跨膜区拼接；随后通过基因工程的方法，借助细胞自身的蛋白合成过程，使PSMA单链 抗体gy-1跨膜表达在小鼠巨噬细胞Raw264.7上，构建成具备PSMA靶向能力的跨膜表达gy-1的 Raw264.7^gy-1细胞。这种细胞固有的蛋白合成过程能够确保gy-1以合理的密度分布在细胞膜上，从而 避免密度过高造成的空间位阻增大和竞争性亲和力减低；能够避免化学偶联造成的细胞膜蛋白变性， 免疫逃逸效果丧失，化学偶联位点不确定、偶联配体分子量不能太大等问题；此外，还能克服抗体 偶联不稳定、易脱落的问题，因为本发明中gy-1单链抗体通过CD8a跨膜区嵌合表达在巨噬细胞膜 上，这种天然的蛋白跨膜表达的方式具有高度的稳定性，极难通过人工物理化学的方式实现。

下面结合具体的实施过程对本发明做进一步说明。

1、采用GV218慢病毒载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体的三质粒系统包装慢病毒

(1)目的基因序列如SEQ.ID.NO.1所示，其中，1-65bp、1127-1148bp为GV218重组质粒的部 分载体序列，66-71bp、1122-1126为Age I酶切序列；72-77bp为SPe I酶切序列；78-1121bp为目的 基因序列，包括Kozak-信号肽-gy-1单链抗体-CD8a铰链区-CD8a跨膜区；78-83bp为Kozak序列； 84-146bp为信号肽序列；147-152bp为Xba I酶切序列；153-908bp为gy-1单链抗体序列；909-914bp 为突变失效的BamH I酶切序列(发挥连接作用)；915-1049bp为CD8a铰链区序列；1050-1121bp 为CD8a跨膜区序列。

目的基因通过体外人工合成的方法获取，以确保碱基序列的正确和稳定，避免错配、突变；

如图1所示，使用Age I限制性内切酶将GV218慢病毒载体酶切为线性载体；

之后使用引物gene(49811-11)-p1和gene(49811-11)-p2，通过PCR的方法，在目的基因(gy-1单 链抗体-CD8a铰链区-CD8a跨膜区)两侧分别加入线性载体的交换配对碱基和Age I酶切位点，进而 构建融合基因；

引物序列：

gene(49811-11)-p1：5’-gaggatcccc gggtaccggt actagtgcca ccatggcctt acc-3’

gene(49811-11)-p2：5’-tcaccatggt ggcgaccggg cagtaaaggg tgataaccag-3’

gene(49811-11)-p1序列中，1-14bp为同源重组的交换配对碱基、15-20bp为Age I酶切位点， 16-43bp为目的基因钓取序列；

接着通过Age I酶切后的粘性末端将上述融合基因产物，以同源重组的方式交换入线性化表达载 体，以构建重组质粒；参见图1，酶切后的融合基因5’和3’末端的序列分别与线性载体两末端的序 列完全一致，即具有同源选择序列CCGGT，因此，以线性载体和融合基因配制反应体系，进行重组 反应，能够实现线性载体和融合基因片段的体外环化，最终形成重组质粒。

将重组质粒转化入感受态细胞扩增，使用引物gene(49811-11)-p3和gene(49811-11)-p4进行PCR 鉴定，并通过基因测序明确重组质粒构建成功。

gene(49811-11)-p3：5’-gggtcaatat gtaattttca gtg-3’

gene(49811-11)-p4：5’-cgtcgccgtc cagctcgacc ag-3’

所构建的重组质粒如图2所示，其中，图2中A：线性化表达载体构建成功；B：融合基因表达 成功；C：重组质粒转化成功并表达。

(2)如图3所示，使用纯化、浓缩后的重组质粒与慢病毒包装质粒(pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体)共转染293T细胞；从细胞上清中离心收获慢病毒，经浓缩、纯化及质量检测(颜色、黏 稠度等物理指标检测，无菌检测，病毒滴度检测)合格后备用。

2、靶向PSMA的巨噬细胞仿生纳米载体的构建(参见图4)

(1)将浓缩、纯化并质检合格的慢病毒按照MOI＝30感染Raw264.7巨噬细胞，使用3μg/ml 嘌呤酶素进行抗性筛选；

之后通过流式细胞术、荧光显微镜和Western blot蛋白电泳鉴定带有eGFP荧光标签的gy-1融合 蛋白的表达情况，并通过活细胞ELISA鉴定跨膜表达gy-1后的Raw264.7^gy-1细胞与PSMA蛋白的结 合能力。

检测结果如图5所示，其中A：荧光显微镜检测到Raw264.7^gy-1细胞表达与gy-1融合表达的eGFP 绿色荧光标签；B：Western blot蛋白电泳证实gy-1跨膜蛋白成功表达；C：流式细胞术证实Raw264.7^gy-1细胞表达与gy-1融合表达的eGFP绿色荧光标签；D：活细胞ELISA证实Raw264.7^gy-1细胞具备特 异性识别PSMA蛋白的能力。

(2)通过共沉淀法制备Fe₃O₄纳米粒，并通过“氯金酸-柠檬酸钠还原法”构建核壳结构的 Fe₃O₄@Au纳米粒；

检测结果如图6所示，其中A：透射电镜能谱点扫证实Fe₃O₄@Au纳米粒合成成功；B：能谱元 素分析证实Fe₃O₄@Au纳米粒合成成功；C：紫外吸收光谱证实Fe₃O₄@Au纳米粒具备金的特征性 吸收峰，提示Fe₃O₄@Au纳米粒合成成功。

通过低渗透压/物理破碎和差速离心法提取Raw264.7^gy-1巨噬细胞膜。

将提取的Raw264.7^gy-1巨噬细胞膜和Fe₃O₄@Au纳米粒按至少2:1的重量比混合(不超过10:1)， 在冰浴中以“30s开-30s关”的100W脉冲进行超声分散后，依次使用含有400nm和200nm聚碳酸 纤维脂微孔滤膜的脂质体挤出器进行反复挤压，挤压次数不少于20次。这样通过物理包裹的方式， 实现Raw264.7^gy-1巨噬细胞膜对Fe₃O₄@Au纳米粒的充分包裹，制备出具备前列腺癌靶向性的巨噬细 胞仿生纳米载体(M^gy-1-NPs)。

经透射电镜、扫描电镜、纳米粒度仪和蛋白电泳检测证实，M^gy-1-NPs构建成功，粒径均一，平 均粒径约120nm；分散性优异，冻融稳定性能好，能够继承巨噬细胞膜蛋白的生物活性。检测结果 分别参见图7，其中A：纳米粒示意图及透射电镜、扫描电镜结果，证实M^{gy -1}-NPs构建成功；B： M^gy-1-NPs平均粒径约120nm，比Fe₃O₄@Au纳米粒的粒径增加约19nm，差值与既往报道的8-10nm 的细胞膜厚度吻合，提示仿生化修饰成功；C：纳米粒度仪结果证实仿生化修饰成功；D：M^gy-1-NPs 冻融稳定性能良好；E：M^gy-1-NPs的巨噬细胞膜部分具备生物活性，能够与检测抗体结合。

3、M^gy-1-NPs能够逃避巨噬细胞吞噬，显著延长血液循环的半衰期

(1)利用金硫键将巯基化的罗丹明(Rho-SH)负载于Fe₃O₄@Au纳米粒表面(Rho-NPs)，再 用Raw264.7^gy-1巨噬细胞膜包裹构建M^gy-1-Rho-NPs。

将M^gy-1-Rho-NPs与eGFP标记的Raw264.7 ^gy-1巨噬细胞共孵育，通过荧光共聚焦显微镜和流式 细胞术均证实M^gy-1-NPs能够显著逃避巨噬细胞的吞噬，但传统的对照纳米粒(NPs)被大量吞噬。

检测结果如图8所示，其中A：荧光共聚焦显微镜证实M^gy-1-NPs能够逃避巨噬细胞的吞噬；B： 流式细胞术证实M^gy-1-NPs能够逃避巨噬细胞的吞噬。

(2)利用金硫键将巯基化的吲哚菁绿(ICG-SH)负载于Fe₃O₄@Au纳米粒表面(ICG-NPs)， 再用Raw264.7^gy-1巨噬细胞膜包裹构建M^gy-1-ICG-NPs。经尾静脉注射到小鼠体内发现，M^gy-1-ICG-NPs 因为巨噬细胞仿生介导的免疫逃逸，极少滞留于肝脏和脾脏(富含巨噬细胞)，主要经肾脏代谢；但 是传统的对照纳米粒(ICG-NPs)却在肝脏和脾脏大量滞留。

(3)将M^gy-1-Rho-NPs经尾静脉注射到小鼠体内发现，M^gy-1-Rho-NPs因为具备逃避免疫清除的 能力，在血液循环中的半衰期显著延长，约为10h，但是传统的对照纳米粒(Rho-NPs)半衰期仅为 3.3h。

检测结果如图9所示，其中A：M^gy-1-NPs主要经肾脏代谢，能够逃避肝脏和脾脏的免疫清除； B：M^gy-1-NPs能够逃避免疫清除，获得延长的血液循环半衰期。

4、M^gy-1-NPs具备良好的前列腺癌靶向性，可用于靶向诊断

(1)在细胞水平，将eGFP标记的M^gy-1-NPs分别与PC3^PSMA-细胞、PC3^PSMA+细胞和LNCaP细 胞(前列腺癌细胞)共孵育，通过流式细胞术检测细胞的绿色荧光强度发现，PSMA阳性的PC3^PSMA+细胞和LNCaP细胞能够与M^gy-1-NPs结合，但PSMA阴性的PC3^PSMA-细胞却不能与之结合，提示 M^gy-1-NPs能够与PSMA特异性结合。

之后，分别使用DIL染料和溶酶体探针对PC3细胞进行细胞膜和溶酶体的红色荧光标记，通过 荧光共聚焦显微镜发现，M^gy-1-NPs能够特异性结合并内化入PC3^PSMA+细胞，而并不与PC3^PSMA-细胞 结合。

检测结果如图10所示，其中A：流式细胞术检测证实，M^gy-1-NPs能够与PSMA阳性前列腺癌 细胞特异性结合；B：荧光共聚焦显微镜检测证实，M^gy-1-NPs能够与PSMA阳性前列腺癌细胞特异 性结合；C：荧光共聚焦显微镜检测证实，M^gy-1-NPs能够内化进入PSMA阳性前列腺癌细胞，且与 溶酶体存在共定位。

(2)在动物水平，借助ICG的近红外成像特性，将M^gy-1-ICG-NPs经尾静脉注射后，通过小动 物活体成像仪检测发现，M^gy-1-NPs能够在PC3^PSMA+细胞的皮下荷瘤小鼠中实现肿瘤的靶向成像，且 靶向能力与不具备靶向性的传统巨噬细胞膜仿生纳米载体(M-ICG-NPs)相比提升12倍。

此外，M^gy-1-NPs的纳米内核为Fe₃O₄@Au，鉴于Fe₃O₄可用于MRI成像，Au具备CT成像性能， 所以M^gy-1-NPs的靶向能力在CT和MRI中也进行了验证，结果提示，与传统的M-NPs相比，M^gy-1-NPs 的靶向成像性能显著提升，可用于靶向增强MRI的T1WI信号或降低T2WI信号，亦可用于增强CT 成像。

检测结果如图11所示，其中A：M^gy-1-NPs负载ICG后(M^gy-1-ICG-NPs)可用于前列腺癌的靶 向近红外成像；B：M^gy-1-NPs借助纳米内核Fe₃O₄的成分，可用于靶向MRI成像；C：M^gy-1-NPs借 助纳米外壳Au的成分，可用于靶向CT成像。

(3)在PC3^PSMA+细胞的骨转移瘤伴淋巴结转移的动物模型中，将M^gy-1-ICG-NPs经尾静脉注射 后，能够靶向到发生骨转移瘤所在的胫骨部位，同时可将肿瘤转移的直径约2mm的腹股沟淋巴结 显像。

分析显示，具备PSMA靶向性的M^gy-1-NPs靶向成像能力比不具备靶向性的传统仿生纳米载体M-NPs增强7-9倍，提示M^gy-1-NPs对于已经发生转移的前列腺癌及微小肿瘤灶也具备靶向成像性能。

检测结果如图12所示，其中A：M^gy-1-NPs负载ICG后(M^gy-1-ICG-NPs)可用于前列腺癌骨转 移瘤的靶向近红外成像；B：M^gy-1-NPs能够靶向到发生骨转移瘤所在的胫骨部位；C：M^gy-1-NPs能 够靶向显示微小病灶(直径＝2mm)及肿瘤转移的淋巴结。

5、M^gy-1-NPs可用于前列腺癌的靶向协同治疗

(1)在细胞水平，通过金硫键将含有巯基的小分子细胞毒性药物DM1负载于仿生纳米载体， 所得的M^gy-1-DM1-NPs能够特异性杀伤PC3^PSMA+细胞，而对PC3^PSMA-细胞没有杀伤效果；同时 M^gy-1-NPs借助其纳米核心中Au壳的成分能够用于光热治疗，并且M^gy-1-NP仅对PC3^PSMA+细胞具有 光热杀伤效果。利用M^gy-1-DM1-NPs进行的DM1介导的细胞毒性和Au壳介导的光热损伤的联合治 疗，发现二者对PC3^PSMA+细胞具备协同增强抗肿瘤效果，提示M^gy-1-NP能够用于前列腺癌的靶向协 同治疗。

结果参见图13，其中A：M^gy-1-DM1-NPs对PC3^PSMA+细胞的特异性细胞毒性；B：M^gy-1-NPs对 PC3^PSMA+细胞的特异性光热损伤；C：M^gy-1-DM1-NPs对PC3^PSMA+细胞具有DM1介导的细胞毒性和 Au壳介导的光热损伤的协同增强抗肿瘤效果。

(2)在PC3^PSMA+细胞的皮下荷瘤小鼠中，M^gy-1-DM1-NPs能够通过DM1介导的毒性、Au壳介 导的光热损伤或二者的协同增强效果，特异性杀伤肿瘤细胞，缩小肿瘤体积。在PC3^PSMA+细胞的骨 转移瘤小鼠中，M^gy-1-DM1-NPs也具有相同的靶向抗肿瘤效果，并且能够恢复由骨质破坏造成的胫 骨力学性能的下降。同时，上述两种动物模型的治疗实验证实，单纯注射M^gy-1-NPs也具有对肿瘤生 长的抑制作用，这可能与其外包裹的巨噬细胞膜受体所介导的对促肿瘤细胞因子的吸附及对免疫微 环境的调节有关。

结果参见图14，其中A：M^gy-1-NPs治疗能够靶向缩小皮下瘤的体积；B：皮下瘤治疗过程中的 近红外成像结果显示，M^gy-1-NPs能够靶向缩小肿瘤体积；C：M^gy-1-NPs治疗皮下瘤24天后肿瘤体 积显著缩小；D：骨转移瘤治疗过程中的近红外成像结果显示，M^gy-1-NPs能够靶向治疗前列腺癌的 骨转移；E：M^gy-1-NPs靶向治疗后骨转移瘤体积显著缩小；F：M^gy-1-NPs靶向治疗能够恢复前列腺 癌骨转移瘤所在胫骨的力学性能。

进一步的，提取跨膜表达gy-1的巨噬细胞膜，并通过脂质体挤出器或微流控芯片等方法，将巨 噬细胞膜包裹于载药或载有成像元素的Fe₃O₄@Au纳米载体表面，实现纳米载体的靶向仿生化修饰。 其中，用于纳米载体仿生化修饰的装置不局限于脂质体挤出器或微流控芯片等，还可以是其他具有 类似功能的装置。而纳米载体不局限于Fe₃O₄@Au，也可以是其他具有载药功能的、其他形态的纳米 粒；载药方式也不局限于金硫键，其他载药方式也在此列。其中，纳米载体负载的药物或者成像元 素，包括但不局限于DM1、ICG，也可以是其他具备细胞毒性的药物，也可以是其他具备荧光、CT 或MRI成像性能的化合物。

构建好的靶向仿生化纳米载体可以冰冻保存备用。需要使用时，将靶向仿生纳米载体融化重悬， 经静脉注射入患者体内，实现对肿瘤原发灶、微小病灶或转移灶的靶向成像诊断，也可用于肿瘤病 灶的靶向协同治疗。

在上述方案的基础上，将任意来源的人体细胞经病毒感染后，使用CRISPR-Cas9等基因编辑技术 敲除任意来源的人体细胞的免疫原性分子，如MHC I分子等具有类似免疫排斥功能的分子，以构建 通用型的靶向仿生纳米载体，也在专利保护范围内。

序列表

<110> 一种靶向PSMA的巨噬细胞膜包裹的仿生纳米药物载体及应用

<120> 一种靶向PSMA的巨噬细胞膜包裹的仿生纳米药物载体及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1148

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequences)

<400> 1

gccgtttttg gcttttttgt tagacgaagc ttgggctgca ggtcgactct agaggatccc 60

cgggtaccgg tactagtgcc accatggcct taccagtgac cgccttgctc ctgccgctgg 120

ccttgctgct ccacgccgcc aggccgtcta gacagtctgt gctgactcag ccgccctcag 180

tgtctggggc cccagggcag agtgtcatta tctcctgcac tgggagcagc tccaacatcg 240

gggcaggttc tcatgtacac tggtaccagc aggttccagg aacagccccc aaactcctca 300

tctatgaaaa caccaatcgg ccctcagggg tccctgaccg attctctggc tccaagtctg 360

gcacctcagg ttccctggcc atcactggac tccagcctga ggatgaggct gattattatt 420

gtgcaacatg ggatgacagt ctgaatggtg taatattcgg cggagggacc aaggccaccg 480

tcctaggcgg atcctctagg tcaagttcca gcggcggcgg tggcagcgga ggcggcggtg 540

aggtgcagct ggtggagtct gggggagccc tggccaagcc tggggggtcc ctgagactct 600

cctgtgcagc ctctggattc accctcagtg gctatgctat gcactgggtc cgccaggctc 660

caggcaaggg gctggagtgg gtggcagtta tatcatatga tggaagcaat aaatactacg 720

cagactccgt gaagggccga ttcaccgtct ccagagacaa ttccaagaac acgctgtttc 780

tgcaaatgaa cagcctgaga cctgaggaca cggctgtgta ctattgtgct aaaggcctta 840

cctggggact cggtgacaat gatgctctcg atatctgggg ccccgggacc acggtcaccg 900

tctcctcaag atccaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg cccaccatcg 960

cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg ggcgcagtgc 1020

acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg gccgggactt 1080

gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg cccggtcgcc accatggtga 1140

gcaagggc 1148

Claims (6)

1.一种靶向PSMA的巨噬细胞膜包裹的仿生纳米药物载体，其特征在于，将巨噬细胞膜包裹纳米金载体，其中巨噬细胞膜上跨膜表达基于SEQ.ID.NO.1所示的序列的靶向PSMA的抗体；

该抗体为gy-1单链抗体，通过与CD8a铰链区、CD8a跨膜区的融合表达使其跨膜表达于巨噬细胞膜上。

2.如权利要求1所述的靶向PSMA的巨噬细胞膜包裹的仿生纳米药物载体，其特征在于，所述巨噬细胞膜上跨膜表达的靶向PSMA的单链抗体，由慢病毒感染巨噬细胞并表达之后提取细胞膜而得；

所述慢病毒是由重组GV218慢病毒载体以慢病毒三质粒系统包装而得；

所述重组GV218慢病毒载体中含有SEQ.ID.NO.1所示的基因片段。

3.如权利要求1所述的靶向PSMA的巨噬细胞膜包裹的仿生纳米药物载体，其特征在于，所述的纳米金载体为核壳结构的Fe₃O₄@Au纳米粒；

巨噬细胞膜与纳米粒的质量比为2:1～10:1；

两者经超声分散、脂质体挤出器反复挤压而实现包裹。

4.一种靶向PSMA的跨膜抗体表达载体，其特征在于，该载体为重组GV218慢病毒载体，其中含有SEQ.ID.NO.1所示的基因片段。

5.权利要求1所述的靶向PSMA的巨噬细胞膜包裹的仿生纳米药物载体在制备前列腺癌诊断试剂、药物中的应用。

6.权利要求4所述的靶向PSMA的跨膜抗体表达载体在制备前列腺癌诊断试剂、药物中的应用。

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