CN112567244A - 靶向gasp-1颗粒的结合蛋白和嵌合抗原受体t细胞及其用途 - Google Patents

靶向gasp-1颗粒的结合蛋白和嵌合抗原受体t细胞及其用途 Download PDF

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Abstract

提供了检测具有表达G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP‑1)或其片段的颗粒的细胞的方法。所述检测方法可以包括：(a)使所述细胞与有效量所述的结合蛋白接触，其中所述结合蛋白包含特异性结合GASP‑1的抗原结合片段；以及(b)鉴定具有与所述结合蛋白结合的颗粒的细胞。GASP‑1颗粒可以在细胞的细胞质中或在细胞表面上。还提供了产生包含嵌合抗原受体、抗GASP‑1抗体或双特异性结合蛋白的T细胞的方法。还提供了用于治疗GASP‑1介导的疾病或使外泌体、微囊泡或癌小体失活的方法。

Description

靶向GASP-1颗粒的结合蛋白和嵌合抗原受体T细胞及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年5月11日提交的美国临时申请第62/670,182号和2018年11月16日提交的美国临时申请第62/768,325号的权益，出于所有目的，将它们各自的内容通过引用整体并入本文中。
发明领域
本发明涉及表达G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)的颗粒(也被称为GASP-1颗粒)、靶向所述GASP-1颗粒的结合蛋白和嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞、以及所述结合蛋白和所述CAR-T细胞在癌症检测和治疗中的用途。
发明背景
在美国，癌症是第二最常见的死亡原因，并且仅被心脏病超过。如果在其进展早期未检测到癌症发病，则其显著增加。在症状出现之前，对癌症进行早期检测是最有效的癌症阻遏剂。例如，在过去的二十年中，结肠直肠癌的发生率一直在下降(从1985年的每100万人中66.3例降至2007年的45.3例)，这是由于结肠直肠癌筛查检测可以在结肠直肠息肉进展成癌症之前检测并去除结肠直肠息肉。
从癌细胞释放的细胞外囊泡(EV)已经参与癌症的进展和转移。EV包括外泌体(直径约30-100nm)、微囊泡(直径约100-1000nm)和大的癌小体(直径约1-10μm)。外泌体来源于晚期内吞途径的多囊泡体(MVB)并且通过与细胞膜融合而被释放。另一方面，微囊泡和癌小体通过从细胞膜出芽而被释放。
GASP-1的过表达是癌症发生和进展所必需的。例如，在使用三阴性乳腺癌(TNBC)细胞的敲低实验中，表达低水平GASP-1的细胞比野生型细胞生长慢得多。当GASP-1被完全下调时，细胞死亡并且不能增殖。
为了寻求安全和有效的癌症疗法，研究人员已经寻求鉴定仅在癌细胞上发现而不是在健康细胞上发现的抗原。对此类肿瘤特异性抗原(TSA)的探索尚未成功。目前的CAR-T疗法是靶向仅优先存在于癌细胞表面上的生物标志物，这意味着它们也存在于正常细胞上。这导致不希望的和严重的副作用。另外，目前的CAR-T治疗仅对血液肿瘤有效，而对实体瘤无效。几个原因导致目前针对实体瘤的CAR-T疗法无效。首先，实体瘤是异质性的。与在其表面上全面具有大量CD19的癌性B细胞不同，不是所有的实体瘤细胞都必须携带设计的CAR-T细胞攻击的抗原。其次，即使单靶点CAR-T疗法成功地根除了肿瘤，但在去除该抗原后，癌症有时仍可能复发。第三，实体瘤含有数百层或甚至数千层厚的固体细胞团，这使得CAR-T细胞难以浸润。
仍然需要通过靶向癌细胞(特别是实体瘤中的那些癌细胞)进行有效的癌症治疗，对正常细胞具有最小的副作用。
发明概述
本发明提供了通过靶向例如在细胞的细胞质中或在细胞的表面上的表达G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)的颗粒(也被称为GASP-1颗粒)来鉴定和治疗癌症患者的新方法。
提供了检测具有表达G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)或其片段的颗粒的细胞的方法。该检测方法包括使所述细胞与有效量的结合蛋白接触，并鉴定具有与结合蛋白结合的颗粒的细胞。所述结合蛋白包含特异性结合GASP-1的抗原结合片段。所鉴定的细胞是具有GASP-1颗粒的细胞。结合蛋白可以是人源化抗体或嵌合抗原受体(CAR)。
根据该检测方法，所述细胞中的GASP-1颗粒的直径范围可以为0.1至5.0μm。所述细胞中的GASP-1颗粒的平均数量范围可以为每个细胞20至150个。所述GASP-1颗粒可以在细胞的细胞质中或在细胞的表面上。
根据该检测方法，所述细胞可以是在肿瘤中的细胞。所述肿瘤可以是实体瘤或血液瘤。所述细胞可以是癌细胞。
根据该检测方法，所述细胞可以是患有癌症的对象的细胞。所述癌症可以选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、神经胶质瘤、头癌、肝细胞癌、浸润性导管乳腺癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢粘液性囊腺癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小肠恶性间质瘤和胃腺癌。所述癌症可以选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。所述乳腺癌可以是高级别原位导管癌(DCIS)乳腺癌或三阴性乳腺癌。所述肺癌可以是非小细胞肺癌(NSCLC)。所述对象可以已经接受了癌症的治疗。
所述检测方法还可以包括检测细胞中的癌症生物标志物。所述癌症生物标志物可以选自：CA125、CA19-9、CA15-3、CA27.29、AFP、BRCA1/BRCA2、EGFR、HER-2、KIT和CEA。
提供了结合蛋白。所述结合蛋白包括抗GASP-1单链可变片段(抗GASP-1scFv)。所述抗GASP-1scFv可以包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)。
所述VH链可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。所述VH链可以包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的第一互补决定区1(VHCDR1)、由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的第二互补决定区2(VHCDR2)、由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的第三互补决定区3(VCCDR3)、或它们的组合。
所述VL链可以包含SEQ ID NO:9或17。所述VL链可以包含由SEQ ID NO:10或18的氨基酸序列组成的第一互决定区(VL1CDR1)、由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的第二互补决定区(VL1CDR2)、和由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的第三互补决定区(VL1CDR3)。
在所述结合蛋白中，所述VH链可以通过连接子与所述VL链连接。所述连接子可以包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
所述抗GASP-1scFv可以特异性结合GASP-1的免疫显性表位，并且所述免疫显性表位可以包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
所述结合蛋白可以是选自以下的抗体：重组单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体及其抗原结合片段。所述结合蛋白可以是人源化抗体。
所述结合蛋白可以是包含抗GASP-1scFv的嵌合抗原受体(CAR)。所述抗GASP-1scFv可以包含选自SEQ ID NO:36和43的氨基酸序列。
所述结合蛋白可以包含选自SEQ ID NO:1-4、9-12和17-18中的至少一个氨基酸序列。
所述结合蛋白可以与化学治疗剂缀合。所述化学治疗剂可以选自：阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、帕博西尼、瑞博西尼、来那替尼、阿贝西利、奥拉帕尼、瑞戈非尼、维甲酸、axicabtagene ciloleucel、达沙替尼、尼洛替尼、博舒替尼、依鲁替尼、艾代拉利司、维奈托克、普纳替尼、米哚妥林、恩西地平、Tisagenlecleucel、艾伏尼布、杜韦利西布、伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、索拉非尼、阿比特龙、克里唑替尼、维莫非尼、放射性同位素如111In和90Y、毒素如auristatins、美登木素生物碱、阿霉素、紫杉醇、顺铂、长春花碱、加利车霉素和假单胞菌外毒素A。
提供了产生包含嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的方法。所述CAR-T细胞产生方法包括将编码包含抗GASP-1单链可变片段(抗GASP-1scFv)的CAR的基因引入T细胞，由所述T细胞表达所述抗GASP-1scFv，并且分离表达所述抗GASP-1scFv的T细胞。所述抗GASP-1scFv可以包含选自SEQ ID NO:36和43的氨基酸序列。
提供了产生抗GASP-1抗体的方法。所述抗GASP-1抗体产生方法包括用GASP-1肽作为免疫原免疫宿主。所述GASP-1肽可以包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
提供了产生双特异性结合蛋白的方法。所述双特异性结合蛋白产生方法包括将本发明的所述结合蛋白与另外的人源化抗体组合。所得双特异性结合蛋白显示出比人源化抗体更好的免疫治疗特异性和/或功效。所述结合蛋白可以是人源化GASP-1抗体或嵌合抗原受体(CAR)。所述另外的人源化抗体可以选自：利妥昔单抗、阿仑单抗、阿达木单抗、依法利珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、那他珠单抗、帕尼单抗、雷珠单抗、易普利姆玛、贝利单抗、奥滨尤妥珠单抗、帕妥珠单抗、维多珠单抗、雷莫芦单抗、依洛尤单抗、派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、瑞利珠单抗、耐昔妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、奥法木单抗、德瓦鲁单抗、硼替佐米、埃罗妥珠单抗、阿维鲁单抗、西米普利单抗和奥拉单抗。
对于每种双特异性结合蛋白制备方法，提供了如所制备的双特异性结合蛋白。
提供了药物组合物。所述药物组合物包含本发明的所述结合蛋白或双特异性结合蛋白，以及药学上可接受的载体。
提供了治疗有需要的对象的GASP-1介导的疾病或病症的方法。治疗方法包括向所述对象施用有效量的本发明的所述药物组合物。所述GASP-1介导的疾病或病症可以是肿瘤。所述肿瘤可以是实体瘤。所述肿瘤可以是血液肿瘤。所述GASP-1介导的疾病或病症可以是癌症。所述对象可能已经接受了癌症治疗。所述GASP-1可以在所述对象细胞中的颗粒中表达。所述GASP-1颗粒在细胞的细胞质中或在细胞的表面上。
提供了抑制表达GASP-1的细胞生长的方法。所述抑制方法包括向所述细胞施用有效量的本发明的所述药物组合物。所述细胞可以是癌细胞。所述细胞可以是患有癌症的患者的细胞。
提供了使表达GASP-1的外泌体、微囊泡或癌小体失活的方法。所述失活的方法包括向所述外泌体、微囊泡或癌小体施用有效量的本发明的所述药物组合物。所述外泌体、微囊泡或癌小体可以是患有癌症的对象的外泌体、微囊泡或癌小体。所述外泌体、微囊泡或癌小体是在所述对象的血液循环中的外泌体、微囊泡或癌小体。所述癌症可以选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、神经胶质瘤、头癌、肝细胞癌、浸润性导管乳腺癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢粘液性囊腺癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小肠恶性间质瘤和胃腺癌。所述癌症可以选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。所述乳腺癌可以是高级别原位导管癌(DCIS)乳腺癌或三阴性乳腺癌。所述肺癌可以是非小细胞肺癌(NSCLC)。
附图简述
图1显示了经由从细胞膜突出的膜泡从前列腺癌细胞(右图)而不是从正常前列腺细胞(左图)释放的细胞外癌小体。
图2显示了在高级DCIS乳腺癌细胞(右图)而不是正常乳腺细胞(左图)的细胞质中不同大小的GASP-1颗粒的积聚。
图3显示了附着于高级别DCIS乳腺癌细胞的细胞膜或膜片段的大量GASP-1颗粒。
图4显示了三阴性乳腺癌细胞的细胞膜上不同大小的GASP-1颗粒。
图5显示了在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞(右图)而不是正常肺细胞(左图)的细胞质中不同大小的GASP-1颗粒的积聚。
图6显示了在成胶质细胞瘤细胞(右图)而不是正常脑细胞中(左图)的细胞质中和细胞膜上GASP-1颗粒的积聚。
图7显示了使用VL特异性引物(泳道1)或VH特异性引物(泳道2)的PCR产物。泳道M:2000的DNA标志物，从上到下分别为：2000、1000、750、500、250、100bp。
图8显示了4911bp的scFv1-Fc或scFv2-Fc表达载体的示意图，所述scFv1-Fc或scFv2-Fc表达载体包括信号序列、可变轻链(VL)、连接子、可变重链(VH)和人IgG1 Fc(HIgG1-Fc)。
图9显示了用scFv1-Fc(右图)或scFv2-Fc(左图)作为初级抗体并用PE-抗人IgGFc抗体作为次级抗体染色的PC3细胞的流式细胞术分析(FACS)。
图10显示了用GASP-1单克隆抗体作为初级抗体并用Alexa Fluor-A-抗人IgG Fc抗体作为次级抗体染色的A549肺癌细胞(左图)或SKOV3卵巢癌细胞(右图)的流式细胞术分析(FACS)。
图11显示了10,228bp的嵌合抗原受体(CAR)Lenti-EF1a-scFv1-CD28-CD3z-T2A-EGFRt的示意图。
图12显示了34.9％的T细胞是CAR阳性的。
图13显示了一经暴露于CAR-10217-SIA-CAR-T细胞，由癌细胞释放的IFN-γ(左图)和IL-2(右图)。
发明详述
本发明提供了包含抗G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)单链可变片段(scFv)的结合蛋白及抗GASP-1scFv用于检测表达GASP-1或其片段(例如在所述细胞中的颗粒中或颗粒的表面上)的细胞和用于产生抗体或包含用于靶向表达GASP-1的癌细胞的嵌合抗原受体(CAR-T)的T细胞的用途。本发明基于发明人惊奇地发现了抗GASP-1单链可变片段(scFv)以及高度富含GASP-1的颗粒(GASP-1颗粒)。GASP-1颗粒具有不同的尺寸，范围从粉末状颗粒、细小颗粒到其表面不光滑的粗颗粒。粗颗粒的尺寸可以是粉末状颗粒尺寸的约几百倍。已经发现GASP-1颗粒广泛分布在癌细胞内部或癌细胞的细胞膜上，例如，在细胞膜下方，在细胞质中，聚集在细胞核周围或细胞核内。已经在来自乳腺癌、三阴性癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤或结肠癌的细胞中发现了不同大小的GASP-1颗粒。
本发明的发明人还惊奇地发现，随着癌症进展，GASP-1颗粒的数量和大小都会增加。在癌症的早期阶段，GASP-1颗粒可以主要是粉末状颗粒至细小颗粒。在高入侵性和侵袭性癌症(如三阴性乳腺癌(TNBC)和成胶质细胞瘤)的晚期，GASP-1颗粒可以主要是粗GASP-1颗粒。
在正常细胞中，GASP-1可以仅在细胞质中最低限度地表达或不表达，并且如果存在的话，可以是粉末形式。GASP-1颗粒可以最低限度地存在于正常细胞的细胞质中，但不存在于细胞膜上。GASP-1颗粒可以存在于一些正常细胞的细胞核中。GASP-1颗粒仅存在于癌细胞而不是正常细胞的表面上的令人惊讶的发现提供了肿瘤特异性抗原(TSA)的第一个实例。该发现使GASP-1成为使用例如CAR-T细胞或含有GASP-1scFv序列的人源化单克隆抗体进行癌症免疫治疗的理想靶标，因为靶向用于癌症治疗的GASP-1颗粒对正常细胞具有最小的副作用。
术语“表达G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)的颗粒”和“GASP-1颗粒”在本文中可互换使用并且是指含有GASP-1或其片段的颗粒。根据它们的大小，有三种形式的GASP-1颗粒：粉末状颗粒、细小颗粒和粗颗粒。
如本文中所用的术语“粉末状GASP-1颗粒”是指直径范围为在0.1至0.4μm的GASP-1颗粒。如本文中所用的术语“细小GASP-1颗粒”是指直径范围为0.4-1.0μm的GASP-1颗粒。如本文中所用的术语“粗GASP-1颗粒”是指直径范围为1.0-5.0μm的GASP-1颗粒。GASP-1粗颗粒的直径大于细胞外微囊泡的直径。GASP-1颗粒可以在细胞的细胞质中或在细胞的表面上。GASP-1颗粒可以是内体。
术语“单链Fv”和“scFv”在本文中可互换使用并且是指包含针对抗原的抗体的VH链和VL链的单链肽。例如，抗GASP-1scFv是指包含抗GASP-1抗体的VH链和VL链的单个肽。scFv还可以在VH链和VL链之间包含多肽连接子，使得scFv能够形成用于结合抗原的所期望的结构。当抗体是人源化抗体时，包含抗体的VH链和VL链的单链肽是人单链Fv或hscFv。
如本文中所用的术语“微囊泡”是指由细胞膜形成并从细胞(例如癌细胞)的细胞膜表面释放的细胞外囊泡(EV)。微囊泡的直径为0.1-1μm。微囊泡存在于生物流体(如血液、唾液、尿液和脑脊液)中。微囊泡可以表达GASP-1。
如本文中所用的术语“外泌体”是指源自晚期内吞途径的多囊泡体(MVB)并通过与细胞膜融合而释放的细胞外囊泡(EV)。外泌体的直径为30-100nm。外泌体存在于生物流体(如血液、唾液、尿液和脑脊髓液)中。外泌体可以表达GASP-1。
如本文中所用的术语“癌小体”是指由细胞膜形成并从细胞(例如癌细胞)的细胞膜表面释放的细胞外囊泡(EV)。癌小体的直径为1-10μm。癌小体存在于生物流体(如血液、唾液、尿液和脑脊髓液)中。癌小体可以表达GASP-1。
如本文中所用的术语“有效量”是指实现所述目标(例如，检测具有GASP-1颗粒的细胞，治疗有需要的对象的GASP-1介导的疾病或病症，抑制表达GASP-1的细胞的生长，以及使外泌体、微囊泡或癌小体失活)所需的包含结合蛋白或双特异性结合蛋白的药物组合物的量。药物组合物的有效量可以根据所述目标和组合物的物理特性而变化。
提供了检测具有表达G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)或其片段的颗粒的细胞的方法。该检测方法包括使细胞与有效量的结合蛋白接触，并鉴定具有与所述结合蛋白结合的颗粒的细胞。所述结合蛋白包含特异性结合GASP-1的抗原结合片段。所鉴定的细胞是具有GASP-1颗粒的细胞。
根据该检测方法，GASP-1颗粒可以在细胞的细胞质中或在细胞的表面上。在一个实施方案中，GASP-1颗粒可以在细胞的细胞质中。在另一个实施方案中，GASP-1颗粒在细胞的表面上。在另一个实施方案中，GASP-1颗粒可能不在细胞的细胞核中。
根据该检测方法，细胞中GASP-1颗粒的数目可以变化。每个细胞可以有约10-1,000、20-500或20-200个GASP-1颗粒。细胞中GASP-1颗粒的平均数目范围为20至150个。GASP-1颗粒可以具有不同的尺寸，范围从粉末状颗粒、细小颗粒至粗颗粒。粗GASP-1颗粒可以比同一细胞中的粉末状颗粒大至少10、50、100或500倍。GASP-1颗粒的直径范围可以为约0.1-10、0.1-0.4、0.4-1.0、1.0-5.0、0.1-1.0、0.1-5.0、0.4-5.0、0.2-10、0.2-3.0、0.2-5.0、0.5-1.0或0.5-5.0μm。在一个实施方案中，GASP-1颗粒的直径范围为0.2-3.0μm。我们已经发现，随着癌症的进展，发现了更粗的GASP-1颗粒，这可能是由于粉末状颗粒(和/或细小颗粒)的成熟或这些GASP-1颗粒的聚集。在一个实施方案中，在癌细胞中，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的GASP-1颗粒可以是粗GASP-1颗粒。在来自更具侵袭性的癌症(例如高级DCIS、三阴性乳腺癌和成胶质细胞瘤)的细胞中，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的GASP-1颗粒可以是粗GASP-1颗粒。粗GASP-1颗粒可以聚集在核膜周围和/或细胞膜上。
根据该检测方法，具有GASP-1颗粒的细胞可以在肿瘤中的细胞。肿瘤可以是实体瘤或血液瘤。肿瘤可以是对象的肿瘤。对象可能患有癌症。癌症可以选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、神经胶质瘤、头癌、肝细胞癌、浸润性导管乳腺癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢粘液性囊腺癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小肠恶性间质瘤和胃腺癌。例如，癌症可以是：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。乳腺癌可以是高级别原位导管癌(DCIS)乳腺癌或三阴性乳腺癌。肺癌可以是非小细胞肺癌(NSCLC)。对象可以已经接受了癌症治疗。
根据该检测方法，具有GASP-1颗粒的细胞可以是癌细胞。细胞可以是对象的细胞。对象可能患有癌症。癌症可以选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、神经胶质瘤、头癌、肝细胞癌、浸润性导管乳腺癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢粘液性囊腺癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小肠恶性间质瘤和胃腺癌。例如，癌症可以是：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。乳腺癌可以是高级别原位导管癌(DCIS)乳腺癌或三阴性乳腺癌。肺癌可以是非小细胞肺癌(NSCLC)。对象可以已经接受了癌症治疗。
检测方法还可以包括检测具有GASP-1颗粒或GASP-1或其片段的细胞中的癌症生物标志物。癌症生物标记物可以是用于以下癌症的任何合适的生物标志物：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、神经胶质瘤、头癌、肝细胞癌、浸润性导管乳腺癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢粘液性囊腺癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小肠恶性间质瘤或胃腺癌。例如，癌症可以是：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。乳腺癌可以是高级别原位导管癌(DCIS)乳腺癌或三阴性乳腺癌。肺癌可以是非小细胞肺癌(NSCLC)。示例性的癌症生物标志物包括CA125、CA19-9、CA15-3、CA27.29、AFP、BRCA1/BRCA2、EGFR、HER-2、KIT、VEGF、KRAS、ALK、PSA、HE4、CYFRA 21-1、NSE、PD-L1、TIMP-1、TIMP-2、HGF、OPN、MSLN、MMP2和CEA。
根据该检测方法，结合蛋白可以包含抗GASP-1单链可变片段(抗GASP-1scFv)。结合蛋白可以是抗GASP-1抗体或嵌合抗原受体(CAR)。抗GASP-1抗体是能够与GASP-1或其片段(例如EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO:22)的GAPS-1肽)结合的抗体。抗GASP-1抗体可以是重组抗体或其抗原结合片段。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或人源化抗体。
还提供了包含抗GASP-1单链可变片段(抗GASP-1scFv)的结合蛋白。抗GASP-1scFv包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)。结合蛋白可以是抗体或嵌合抗原受体(CAR)。
抗GASP-1scFv的VH链可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。VH链可以由SEQ IDNO:1的氨基酸序列组成。VH链可以包含第一互补决定区1(VHCDR1)、第二互补决定区2(VHCDR2)和第三互补决定区3(VHCDR3)。VHCDR1可以包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。VHCDR1可以由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。VHCDR2可以包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。VHCDR2可以由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。VHCDR3可以包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。VHCDR3可以由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。VHCDR1可以由包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列编码。VHCDR1可以由SEQ ID NO:6的核苷酸序列编码。VHCDR2可以由包含SEQ IDNo:7的核苷酸序列编码。VHCDR2可以由SEQ ID No:7的核苷酸序列编码。VHCDR3可以由包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码。VHCDR3可以由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码。
抗GASP-1scFv的VL链可以包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。VL链可以由SEQ IDNO:9的氨基酸序列组成。VL链可以包含第一互补决定区1(VLCDR1)、第二互补决定区2(VLCDR2)和第三互补决定区3(VLCDR3)。VLCDR1可以包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。VLCDR1可以由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成。VL1CDR2可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。VL1CDR2可以由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。VL1CDR3可以包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。VL1CDR3可以由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成。
抗GASP-1scFv的VL链可以包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。VL链可以由SEQ IDNO:17的氨基酸序列组成。VL链可以包括第一互补决定区1(VLCDR1)、第二互补决定区2(VLCDR2)和第三互补决定区3(VLCDR3)。VLCDR1可以包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。VLCDR1可以由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成。VL1CDR2可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。VL1CDR2可以由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。VL1CDR3可以包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。VL1CDR3可以由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成。
抗GASP-1scFv可以包含由SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码的可变重链(VH)和由SEQ ID NO:13的核苷酸序列编码的可变轻链(VL)。可以用由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的连接子将VH链与VL链连接。抗GASP-1scFv可以是针对由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的GASP-1的免疫显性表位所选择的抗体。
抗GASP-1scFv可以包含由SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码的可变重链(VH)和由SEQ ID NO:19的核苷酸序列编码的可变轻链(VL)。可以用由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的连接子将VH链与VL链连接。抗GASP-1scFv可以是针对由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的GASP-1的免疫显性表位所选择的抗体。
抗GASP-1scFv可以包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的可变重链(VH)和由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的可变轻链(VL)。可以用由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的连接子将VH链与VL链连接。抗GASP-1scFv可以针对由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的GASP-1的免疫显性表位进行选择。
抗GASP-1scFv可以包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的可变重链(VH)和由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的可变轻链(VL)。可以用由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的连接子将VH链与VL链连接。抗GASP-1scFv可以针对由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的GASP-1的免疫显性表位进行选择。
抗GASP-1抗体或scFv的VH链可以包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的CDR1、由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的CDR3。
抗GASP-1抗体或scFv的VH链可以包含由SEQ ID NO:6的核苷酸序列编码的CDR1、由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的VHCDR2和由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的VHCDR3。
抗GASP-1scFv的VL链可以包含由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的CDR1、由SEQID NO:11的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的CDR3。
抗GASP-1scFv的VL链可以包含由SEQ ID NO:14的核苷酸序列编码的CDR1、由SEQID NO:15的核苷酸序列编码的CDR2和由SEQ ID NO:16的核苷酸序列编码的CDR3。
抗GASP-1scFv的VL链可以包含由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的CDR1、由SEQID NO:11的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的CDR3。
抗GASP-1scFv的VL链可以包含由SEQ ID NO:20的核苷酸序列编码的CDR1、由SEQID NO:15的核苷酸序列编码的CDR2和由SEQ ID NO:16的核苷酸序列编码的CDR3。
在结合蛋白中，可以用连接子将VH链与VL链连接。连接子可以包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。连接子可以由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。
抗GASP-1scFv可以特异性结合GASP-1的免疫显性表位。免疫显性表位可以包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。免疫显性表位可以由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成。
结合蛋白可以是选自以下的抗体：重组单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体及其抗原结合片段。在一个实施方案中，结合蛋白可以是人源化抗体。
结合蛋白可以是抗GASP-1抗体，可以是能够结合GASP-1或其片段(例如EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO:22)的GASP-1肽)的抗体。抗GASP-1抗体可以是重组抗体或其抗原结合片段。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或人源化抗体。
结合蛋白可以是包含抗GASP-1scFv的嵌合抗原受体(CAR)。抗GASP-1scFv可以包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。抗GASP-1scFv可以由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成。抗-GASP-1scFv可以包含含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列。抗GASP-1scFv可以由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成。
结合蛋白可以包含选自SEQ ID NO:1-4、9-12和17-18中的至少一个氨基酸序列。结合蛋白可以包含SEQ ID NO:1和9的氨基酸序列。结合蛋白可以包含SEQ ID NO:1和17的氨基酸序列。结合蛋白可以包含SEQ ID NO:2-4的氨基酸序列。结合蛋白可以包含SEQ IDNO:10-12的氨基酸序列。结合蛋白可以包含SEQ ID NO:11、12和18的氨基酸序列。结合蛋白可以包含SEQ ID NO:1和10-12的氨基酸序列。结合蛋白可以包含SEQ ID NO:1、11、12和18的氨基酸序列。结合蛋白可以包含SEQ ID NO:2-4和9的氨基酸序列。结合蛋白可以包含SEQID NO:2-4和17的氨基酸序列。
结合蛋白可以与化学治疗剂缀合。化学治疗剂可以选自：阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、帕博西尼、瑞博西尼、来那替尼、阿贝西利、奥拉帕尼、瑞戈非尼、维甲酸、axicabtagene ciloleucel、达沙替尼、尼洛替尼、博舒替尼、依鲁替尼、艾代拉利司、维奈托克、普纳替尼、米哚妥林、恩西地平、Tisagenlecleucel、艾伏尼布、杜韦利西布、伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、索拉非尼、阿比特龙、克里唑替尼、维莫非尼、放射性同位素如111In和90Y、毒素如auristatins、美登木素生物碱、阿霉素、紫杉醇、顺铂、长春花碱、加利车霉素和假单胞菌外毒素A。
提供了产生包含嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的方法。CAR-T细胞产生方法包括将编码CAR的基因引入T细胞。CAR包含本发明的抗GASP-1单链可变片段(抗GASP-1scFv)。CAR产生方法还包括通过T细胞表达抗GASP-1scFv并分离表达抗GASP-1scFv的T细胞。
根据CAR-T细胞的产生方法，抗GASP-1scFv可以包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。抗GASP-1scFv可以由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成。抗GASP-1scFv可以包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。抗GASP-1scFv可以由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成。
CAR还可以包含信号肽(SEQ ID NO:35)、CD8铰链(SEQ ID NO:37)、CD28跨膜细胞内结构域(SEQ ID NO:38)、CD3ζ(SEQ ID NO:39)、T2A(SEQ ID NO:36)和EGFRt(SEQ ID NO:41)。如果它们被共表达，则诸如白细胞介素、趋化因子、免疫检查点抑制剂的元件可以增强CAR-T的功效。以白介素-12(IL-12)为例，CAR序列可以是CAR-T2A-EGFRt-T2A-IL-12、CAR-T2A-EGFRt-IRES-IL-12或CAR-T2A-EGFRt-T2A-PGK启动子-IL-12。共刺激结构域可以是4-1BB、OX40等，这些元件也可以改善CAR-T治疗。共刺激结构域(4-1BB、OX40等)可以被添加到CAR的共刺激结构域，包括以下实例：
(a)CD8铰链、CD28跨膜、4-1BB细胞内结构域、CD3ζ；
(b)CD8铰链、CD8跨膜、4-1BB细胞内结构域、CD3ζ；
(c)CD8铰链、CD28跨膜、OX40细胞内结构域、CD3ζ；
(d)CD8铰链、CD8跨膜、OX40细胞内结构域、CD3ζ；和
(e)CD8铰链、CD28跨膜细胞内结构域、4-1BB或OX40、CD3ζ。
鉴于目前可用的CAR-T疗法对实体瘤相当无效，所以GASP-1CAR-T疗法可以与目前被批准的CAR-T治疗组合，以提高此类CAR-T治疗的有效性，所述CAR-T治疗为诸如tisagenlecleucel(Kymriah)或axicabtagene ciloleucel(Yescarta)，其在细胞产生CD19之后进行。也可以使用含有针对CD19或另一种癌症表面抗原的另外的CAR序列的GASP-1CAR-T。还提出了GASP-1CAR-T与被称为检查点抑制剂的另一种免疫疗法的组合。检查点抑制剂可以是易普利姆玛、纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗或西米普利单抗。
提供了产生抗GASP-1抗体的方法。该抗体产生方法包括用GASP-1肽作为免疫原免疫宿主。GASP-1肽可以是衍生自GASP-1的任何肽。GASP-1肽可以包含选自SEQ ID NO:22-26的氨基酸序列。GASP-1肽可以由选自SEQ ID NO:22-26的氨基酸序列组成。GASP-1肽可以包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。GASP-1肽可以由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成。GASP-1肽可以包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。GASP-1肽可以由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成。GASP-1肽可以包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。GASP-1肽可以由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成。GASP-1肽可以包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。GASP-1肽可以由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成。
产生双特异性结合蛋白的方法。双特异性结合蛋白的产生方法包括将本发明的结合蛋白与另外的人源化抗体组合以产生双特异性结合蛋白。双特异性结合蛋白可以具有比另外的人源化抗体更好的免疫治疗特异性和/或功效。结合蛋白可以是本发明的GASP-1抗体或CAR。另外的人源化抗体可以选自：利妥昔单抗、阿仑单抗、阿达木单抗、依法利珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、那他珠单抗、帕尼单抗、雷珠单抗、易普利姆玛、贝利单抗、奥滨尤妥珠单抗、帕妥珠单抗、维多珠单抗、雷莫芦单抗、依洛尤单抗、派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、瑞利珠单抗、耐昔妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、奥法木单抗、德瓦鲁单抗、硼替佐米、埃罗妥珠单抗、阿维鲁单抗、西米普利单抗和奥拉单抗。
对于每种双特异性结合蛋白产生方法，提供了产生的双特异性结合蛋白。双特异性结合蛋白包含本发明的结合蛋白和另外的人源化抗体。双特异性结合蛋白可以具有比另外的人源化抗体更好的免疫治疗特异性和/或功效。结合蛋白可以是本发明的GASP-1抗体或CAR。另外的人源化抗体可以选自：利妥昔单抗、阿仑单抗、阿达木单抗、依法利珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、那他珠单抗、帕尼单抗、雷珠单抗、易普利姆玛、贝利单抗、奥滨尤妥珠单抗、帕妥珠单抗、维多珠单抗、雷莫芦单抗、依洛尤单抗、派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、瑞利珠单抗、耐昔妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、奥法木单抗、德瓦鲁单抗、硼替佐米、埃罗妥珠单抗、阿维鲁单抗、西米普利单抗和奥拉单抗。
对于本发明的每种结合蛋白或双特异性结合蛋白，提供了药物组合物。该药物组合物包含本发明的结合蛋白或双特异性结合蛋白，以及药学上可接受的载体。
提供了用于治疗有需要的对象的GASP-1介导的疾病或病症的方法。治疗方法包括向对象施用有效量的本发明的药物组合物。
根据治疗方法，GASP-1介导的疾病或病症可以是肿瘤。肿瘤可以是实体瘤。肿瘤可以是血液肿瘤。
根据治疗方法，GASP-1介导的疾病或病症可以是癌症。对象可以已经接受了癌症的治疗。GASP-1可以在对象细胞中的颗粒中表达。GASP-1颗粒可以在细胞的细胞质中或在细胞的表面上。在一个实施方案中，GASP-1颗粒可以在细胞的细胞质中。在另一个实施方案中，GASP-1颗粒可以在细胞的表面上。在另一个实施方案中，GASP-1颗粒可能不在细胞的细胞核中。
治疗方法还可以包括在癌症治疗之前，确定对象细胞中GASP-1颗粒的平均数目、和/或平均直径、和/或稳定性。治疗方法还可以包括确定癌症治疗后，对象细胞中GASP-1颗粒的平均数目、平均直径和/或稳定性，以及任选地比较癌症治疗前和癌症治疗后，对象细胞中GASP-1颗粒的平均数目、平均直径和/或稳定性。
根据治疗方法，癌症可以选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、神经胶质瘤、头癌、肝细胞癌、浸润性导管乳腺癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢粘液性囊腺癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小肠恶性间质瘤和胃腺癌。癌症可以选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。乳腺癌可以是高级别原位导管癌(DCIS)乳腺癌或三阴性乳腺癌。肺癌可以是非小细胞肺癌(NSCLC)。
提供了抑制表达GASP-1的细胞生长的方法。抑制方法包括向细胞施用有效量的本发明的药物组合物。细胞可以是癌细胞。细胞可以是患有癌症的患者的细胞。癌症可以选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、神经胶质瘤、头癌、肝细胞癌、浸润性导管乳腺癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢粘液性囊腺癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小肠恶性间质瘤和胃腺癌。癌症可以选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。乳腺癌可以是高级别原位导管癌(DCIS)乳腺癌或三阴性乳腺癌。肺癌可以是非小细胞肺癌(NSCLC)。
提供了使表达GASP-1的外泌体、微囊泡或癌小体失活的方法。失活方法包括向外泌体、微囊泡或癌小体施用有效量的本发明的药物组合物。外泌体、微囊泡或癌小体的失活可以通过表面生物标志物(如外泌体的CD63、CD9或CD81；微囊泡的CD45、CD47；和癌小体的热激蛋白HSPA5和HSPA9)的数量的减少来证明。外泌体、微囊泡或癌小体可以是患有癌症的对象的外泌体、微囊泡或癌小体。外泌体，微囊泡或癌小体可以在对象的血液循环中的外泌体、微囊泡或癌小体。癌症可以选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、神经胶质瘤、头癌、肝细胞癌、浸润性导管乳腺癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢粘液性囊腺癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小肠恶性间质瘤和胃腺癌。癌症可以选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。乳腺癌可以是高级别原位导管癌(DCIS)乳腺癌或三阴性乳腺癌。肺癌可以是非小细胞肺癌(NSCLC)。
实施例1.前列腺癌中GASP-1癌小题或微囊泡的鉴定。
使用针对EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO:22)的多克隆抗体检测前列腺癌细胞中GASP-1的表达。通过从细胞膜出芽释放GASP-1癌小体或微囊泡。如图1中所示的，尽管正常前列腺细胞不释放GASP-1癌小体或微囊泡(左图)，但是可以看到GASP-1癌小体在被释放之前经由形成从癌细胞膜突出的膜泡而从细胞膜中出芽(参见右图中的箭头)。癌小体或微囊泡似乎来源于最初集中在癌细胞膜的某些区域的GASP-1。还可以在释放区域附近观察到完全被释放的癌小体或微囊泡(右图)。
实施例2.癌细胞中各种大小的GASP-1颗粒的存在。
使用针对EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO:22)的多克隆抗体检测各种癌细胞中GASP-1的表达。与上述实施例1中所述的被释放的细胞外GASP-1癌小体不同，表达GASP-1的颗粒存在于癌细胞的细胞质中或癌细胞的表面，所述癌细胞包括：乳腺癌、三阴性乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、胃癌、膀胱癌、黑色素瘤或结肠癌。因为GASP-1过表达是癌症发生和进展所必需的，所以GASP-1颗粒的产生可能是癌症进展所必需的步骤。
图2显示了使用针对EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO:22)的多克隆抗体对高级别DCIS乳腺癌的免疫组织化学(IHC)染色。在正常乳腺细胞中，GASP-1仅在一些细胞核中表达而不在细胞质中表达(图2的左图)。在癌细胞中，GASP-1颗粒与细胞膜缔合，在细胞质中，聚集在核膜周围和在核内(图2的右图和图3)。
GASP-1颗粒可以来源于内体。然而，与成熟时直径为0.5μm的内体不同，在这种癌症中存在不同大小的GASP-1颗粒，范围从粉末状颗粒、细小颗粒至粗颗粒(图3)。直径为1.0-5.0μm的粗GASP-1颗粒可以大于内体。此外，与图1中所述的细胞外GASP-1癌小体不同，粗GASP-1颗粒仍然附着在细胞膜上(参见图3中的箭头)，并且不会从细胞膜上被释放。GASP-1颗粒也不形成从细胞膜突出的膜泡，所述膜泡是癌小体的标志。粗GASP-1颗粒可能是通过较小颗粒的成熟或通过较小颗粒的聚集而形成的。细胞膜上如此多的粗GASP-1颗粒的缔合可能导致膜的不稳定和细胞膜的破碎(或片段化)。片段化的细胞膜片仍含有许多附着在其上的GASP-1颗粒(图3)。破裂细胞膜的一个结果是许多最初存在于细胞内(在细胞质中，聚集在核膜上，或在核中)的GASP-1颗粒释放到肿瘤微环境中并随后释放到血液循环中。我们还发现，随着癌症变得更加严重，GASP-1颗粒的大小变得越来越大和粗糙。
在癌细胞表面上存在GASP-1颗粒和在正常细胞表面上不存在GASP-1颗粒提供了特异性靶向癌细胞和备用正常细胞的机会。在癌细胞表面上大量存在粗GASP-1颗粒也可以使GASP-1靶向的癌症治疗更有效。在实体瘤(如DCIS乳腺癌和其它癌症)中，在不同细胞层的表面上也发现了GASP-1颗粒。这也将使靶向GASP-1颗粒的免疫疗法相当有效，因为它们对于癌症治疗剂是可接近的。
三重阴性乳腺癌是乳腺癌的一种非常具侵袭性的形式，它显示出与高级别DCIS几乎相同的GASP-1颗粒模式(图4)。同样，在这种癌症中存在不同大小的GASP-1颗粒，范围从粉末状颗粒、细小颗粒至粗颗粒。箭头指向仍然附着在细胞膜或膜片段上的GASP-1颗粒。
肺癌是男性和女性最致命的癌症之一。它的死亡率超过三种最常见的癌症(结肠癌、乳腺癌和胰腺癌)组合的死亡率。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的约85％，并且大多数新诊断的肺癌患者是晚期的。早期检测是非常重要的，并且随着活组织检查样品的可用性，GASP-1颗粒在细胞质中的存在和丰度可以代表早期检测。图5显示了NSCLC的代表性IHC染色。尽管在正常肺细胞中，GASP-1颗粒仅存在于一些细胞核中，而不存在于细胞质中(左图)，但不同大小的GASP-1颗粒存在于细胞质中，或附着于NSCLC中的细胞膜(右图)。右图中的箭头指出GASP-1颗粒与细胞膜和膜片段的缔合。因此，对来自疑似患有肺癌的个体的肺组织GASP-1颗粒的IHC染色将证实肺癌的存在。
图6显示了成胶质母细胞瘤细胞中的GASP-1颗粒。尽管正常脑细胞中不存在GASP-1颗粒(左图)，但成胶质细胞瘤细胞中存在高度丰富的GASP-1颗粒(右图)。不同大小的GASP-1颗粒存在于成胶质细胞瘤细胞的细胞质中和表面上。
发现类似的大量GASP-1颗粒存在于卵巢癌细胞、结肠癌细胞、黑色素瘤细胞、胃癌细胞和前列腺癌细胞的细胞质中或表面上。
在癌细胞内存在如此多的不同大小的GASP-1颗粒是出乎意料的。在我们研究的所有癌细胞表面上都存在GASP-1颗粒；可以假定它们也将存在于其它癌细胞表面，诸如子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、喉癌、卵巢粘液性囊腺癌、肾细胞癌、小肠恶性间质瘤和胃腺癌。因此，GASP-1是一种通用的癌症生物标志物，并且GASP-1颗粒的产生可以代表癌症进展中所需的步骤。因此可以使用GASP-1颗粒的存在、它们的亚细胞定位、它们的丰度等来评估癌症和癌症的严重程度。
实施例3.GASP-1scFv序列
产生针对GASP-1肽片段EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO:22)的单克隆抗体。分离几个克隆。克隆14B8显示了针对GASP-1肽的最高效价。将来自克隆14B8的细胞裂解物储存在Trizol溶液中。从细胞裂解物中的总RNA逆转录cDNA，然后通过PCR扩增抗体的可变区(重链(VH)和轻链)。图7显示了使用VL特异性引物(泳道1)或VH特异性引物(泳道2)的PCR产物的凝胶分析。然后将所得PCR片段分别克隆到标准克隆载体中并测序。使用PCR，对克隆14B8的重链和轻链进行测序，并发现两个可变轻链序列。
表1显示了克隆14B8的多种氨基酸序列和核苷酸序列，例如可变重链(VH)链，其包括其第一、第二和第三互补决定区(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)；第一可变轻链(VL1)，其包括其第一、第二和第三互补决定区(VL1CDR1、VL1CDR2和VL1CDR3)；和第二可变轻链(VL2)，其包括其第一、第二和第三互补决定区(VL2CDR1、VL2CDR2和VL2CDR3)。两条轻链序列在CDR1中仅有一个氨基酸不同(比较SEQ ID NO:9和17)。从N到Y的变化是由于如SEQ ID:NO:13和19所述的从TAT到AAT的密码子变化。这种差异可能是由于靶子克隆的多菌落性。核苷酸和氨基酸的变化以粗体和下划线突出。
表1.克隆14B8的序列
Figure BDA0002875728480000211
Figure BDA0002875728480000221
实施例4.抗GASP-1scFv-Fc蛋白
基于克隆14B8的序列产生抗GASP-1scFv-Fc蛋白。使用不同的可变轻链(VL)序列，制备两种scFv-Fc表达载体scFv1-Fc和scFv2-Fc。表达载体构建体设计如图8中所示。scFv1-Fc的VL是1468轻链#2(SEQ ID NO:9)，而scFv2-Fc的VL是1468轻链#1(SEQ ID NO:17)。将表达载体瞬时转染到HEK293细胞中，并且用
Figure BDA0002875728480000222
293表达培养基在HEK293细胞中表达scFv-Fc蛋白。
通过蛋白A亲和层析法纯化scFv-Fc蛋白并分析其对靶标PC-3癌细胞的亲和力。在流式细胞仪分析(FACS)中，用scFv1-Fc或scFv2-Fc蛋白染色5×105个PC-3细胞，然后用PE-抗人IgG Fc抗体作为次级抗体。图9显示了49.4％的PC-3细胞被scFv1-Fc蛋白识别，而仅8.39％的PC-3细胞被scFv2-Fc蛋白识别，这表明scFv1对PC-3细胞具有显著更高的亲和力。
实施例5.癌细胞表面上GASP-1的表达
使用针对EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO:22)的抗GASP-1单克隆抗体研究在各种癌细胞中GASP-1的表达。在肺癌细胞和卵巢癌细胞的表面上发现了GASP-1(图10)。肺癌表面上GASP-1的出现证实了免疫组织化学(IHC)分析的结果(图5)，其显示了癌细胞表面上存在GASP-1颗粒。通过流式细胞仪分析还在所检查的其它癌细胞(例如结肠癌细胞、乳腺癌细胞、白血病细胞、黑色素瘤细胞、成胶质细胞瘤细胞和胰腺癌细胞)的表面发现了GASP-1。基于这些结果，GASP-1可能是通用的癌症生物标志物，并且出现在其它癌症的细胞表面上，所述其他癌症包括子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、神经胶质瘤、肝细胞癌、浸润性导管乳腺癌、喉癌、肾细胞癌、小肠恶性间质瘤和胃腺癌。GASP-1颗粒与许多癌症的细胞膜的相当稳定的缔合将使GASP-1颗粒成为用于治疗包括许多实体瘤的癌症的CAR-T和人源化重组抗体的良好靶标。
实施例6.构建CAR载体
由于GASP-1颗粒存在于不同癌细胞层的表面上(参见图3和图4)，不埋在细胞层内，并且也不在正常细胞表面上，因此用scFv1合成了全长的嵌合抗原受体(CAR)，并将其亚克隆到慢病毒载体中(图11)。通过Sanger测序证实了插入片段。
表2显示了用于产生CAR盒的核苷酸序列和氨基酸序列。使用Lenti-EF-1α启动子(SEQ ID NO:27)、信号肽(SEQ ID NO:28)、scFv1(SEQ ID NO:29)、CD28铰链(SEQ ID NO:30)、CD28膜内序列(SEQ ID NO:31)、CD3z(SEQ ID NO:32)、T2A(明脉扁刺蛾(Thoseaasigna)病毒2A自切割肽)(SEQ ID NO:33)和EGFRt(截短的人表皮生长因子受体多肽)(SEQID NO:34)的核苷酸序列制备CAR构建体。GASP-1CAR构建体包含信号序列(SEQ ID NO:35)、scFv1(SEQ ID NO:36)或scFv2(SEQ ID NO:43)、CD28铰链(SEQ ID NO:37)、CD28跨膜序列(SEQ ID NO:38)、CD3z(SEQ ID NO:39)、T2A(SEQ ID NO:40)和EGFRt(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列。scFv1可以用scFv2(SEQ ID NO:42)取代。
表2.CAR构建体的序列
Figure BDA0002875728480000241
Figure BDA0002875728480000251
Figure BDA0002875728480000261
使用GASP-1颗粒作为CAR-T靶标，靶向癌细胞表面GASP-1颗粒的CAR-T疗法代表了一种新的方法，并且可以有效地对抗血液肿瘤和实体瘤。
实施例7.CAR-T细胞
为了评估CAR-T的百分比，用抗EGFR和PE缀合的抗人IgG对CAR-T细胞进行染色。流式细胞仪分析显示34.9％的细胞是CAR阳性的(图12)。
为了测试CAR-T的有效性，将CAR-T细胞与靶细胞系PC-3以不同的E/T比例共培养24小时，收集上清液用于测定细胞因子释放。数据显示CAR-T细胞分泌的IL-2和IFN-γ在与靶肿瘤细胞接触后增加(图13)。
实施例8.含抗GASP-1scFv序列的人源化抗体的构建。
制备含有scFv1序列的人源化抗体。第一抗体可以包含重链(SEQ ID NO:44)和轻链(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列，所述重链包括可变区VH(SEQ ID NO:1)和人恒定区(SEQID NO:45)，所述轻链包括由人恒定区(SEQ ID NO:47)连接的可变区VL1(SEQ ID NO:9)。第二抗体可以包含重链(SEQ ID NO:44)和轻链(SEQ ID NO:48)的氨基酸序列，所述重链包括可变区VH(SEQ ID NO:1)和人恒定区(SEQ ID NO:45)，所述轻链包括由人恒定区(SEQ IDNO:47)连接的可变区VL2(SEQ ID NO:17)。表3显示了用于制备抗GASP-1人源化抗体的各种序列。合成设计的嵌合抗体链并亚克隆到哺乳动物表达载体中，以及瞬时转染到HEK293细胞中。通过蛋白A亲和层析和SEC-HPLC纯化mAb。超滤后，对最终产物进行0.2微米的无菌过滤。蛋白纯度>99％，并且内毒素低于1EU/mg。
表3.人源化抗GASP-1抗体序列
Figure BDA0002875728480000271
Figure BDA0002875728480000281
尽管本文中参考特定实施方案说明和描述了本发明，但是本发明并不旨在限于所示的细节。相反，在不脱离本发明的情况下，可以在权利要求的等同物的范围(scope/range)内对细节进行各种修改。
序列表
<110> 普瑞普莱克斯技术有限责任公司(Proplex Technologies, LLC)
弗兰克·N·常(Chang, Frank N.)
乔治·P·图兹恩斯基(Tuszynski, George P.)
索罗蒙·罗(Luo, Solomon)
杰夫·杨(Yang, Jeff)
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<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 1
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp His Asn Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Arg
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Lys Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Ser Pro Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2
Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 3
Trp His Asn Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 4
Gly Gly Arg Ser Pro Trp Phe Pro Tyr
1 5
<210> 5
<211> 351
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 5
gaggtgaagt tggtggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgaccatc 60
acatgcaccg tctcagggtt ctcattaacc ggctatggtg taaactgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atctggcata atggaagcac agactataat 180
tcagctctca gatccagact gagcatcaac aaggacaagt ccaagaacca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccaggtact actgtgccag agggggaagg 300
tccccctggt ttccttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
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<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
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<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
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1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Asn Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 10
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Asn Leu Asn
1 5 10 15
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 11
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 12
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 13
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 13
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgacga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 14
aagtcaagtc agagcctctt agatagtgat ggaaagacat atttgaat 48
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 15
ctggtgtcta aactggactc t 21
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 16
tggcaaggta cacattttcc gtggacg 27
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 17
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 18
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 19
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 19
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacaaa tttgaattgg 120
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgacga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 20
<211> 48
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 20
aagtcaagtc agagcctctt agatagtgat ggaaagacaa atttgaat 48
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Glu Glu Ala Ser Pro Glu Ala Val Ala Gly Val Gly Phe Glu Ser Lys
1 5 10 15
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Trp Lys Glu Asp Glu Ala Ile Ser Glu Ala Thr Asp Arg
1 5 10
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Cys Ser Lys Ser Ser Pro Lys Ala Glu Glu Glu Glu Val
1 5 10
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Glu Glu Ala Ser Ile Gln Ala Gly Ser Gln Ala Val Glu Glu
1 5 10
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Phe Trp Asp Gly Lys Glu Val Ser Glu Glu Ala Gly Pro Cys
1 5 10
<210> 27
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 27
gagtaattca tacaaaagga ctcgcccctg ccttggggaa tcccagggac cgtcgttaaa 60
ctcccactaa cgtagaaccc agagatcgct gcgttcccgc cccctcaccc gcccgctctc 120
gtcatcactg aggtggagaa gagcatgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc 180
gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga accggtgcct 240
agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc 300
ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca 360
acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct 420
ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac gcccctggct gcagtacgtg 480
attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa 540
ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcttg ggcgctgggg ccgccgcgtg 600
cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa 660
aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc 720
caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg 780
tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg 840
gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc 900
ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg 960
cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg 1020
ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac 1080
tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg 1140
tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg 1200
gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt 1260
gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca 1320
tttcaggtgt cgtga 1335
<210> 28
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 28
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 29
<211> 738
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 29
Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Thr Thr
20 25 30
Gly Thr Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Thr Thr Gly Gly Ala
35 40 45
Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr
50 55 60
Cys Thr Thr Gly Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala
65 70 75 80
Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Thr Ala Gly Ala Thr Ala Gly Thr
85 90 95
Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ala Thr Ala Thr Thr
100 105 110
Thr Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Thr Gly Thr Thr Ala Cys Ala
115 120 125
Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Thr
130 135 140
Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys Gly Cys Cys Thr Ala Ala Thr Cys Thr
145 150 155 160
Ala Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys Thr Ala Ala Ala Cys Thr
165 170 175
Gly Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr
180 185 190
Gly Ala Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys Ala
195 200 205
Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala
210 215 220
Thr Thr Thr Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Cys
225 230 235 240
Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly
245 250 255
Ala Cys Gly Ala Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Ala
260 265 270
Thr Thr Ala Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr
275 280 285
Ala Cys Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala
290 295 300
Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys
305 310 315 320
Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala
325 330 335
Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly
340 345 350
Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Gly
355 360 365
Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Cys Gly Ala Gly
370 375 380
Gly Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Thr
385 390 395 400
Cys Ala Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr
405 410 415
Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Cys Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys
420 425 430
Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Ala Thr Gly Cys Ala
435 440 445
Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly Thr Thr Cys Thr Cys
450 455 460
Ala Thr Thr Ala Ala Cys Cys Gly Gly Cys Thr Ala Thr Gly Gly Thr
465 470 475 480
Gly Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Thr Cys Gly Cys Cys
485 490 495
Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly
500 505 510
Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Gly Gly Ala
515 520 525
Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Thr Ala Ala Thr Gly
530 535 540
Gly Ala Ala Gly Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Ala Thr Ala Ala
545 550 555 560
Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Ala Thr Cys Cys
565 570 575
Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala
580 585 590
Ala Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala
595 600 605
Cys Cys Ala Ala Gly Thr Thr Thr Thr Cys Thr Thr Ala Ala Ala Ala
610 615 620
Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala
625 630 635 640
Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly
645 650 655
Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Gly Cys Cys Ala Gly Ala
660 665 670
Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Cys Cys Cys Cys Thr
675 680 685
Gly Gly Thr Thr Thr Cys Cys Thr Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly
690 695 700
Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Cys
705 710 715 720
Ala Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Thr
725 730 735
Cys Thr
<210> 30
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 30
Cys Cys Ala Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Cys Cys
1 5 10 15
Gly Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys Gly
20 25 30
Gly Cys Gly Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Gly Cys Gly Thr
35 40 45
Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr
50 55 60
Gly Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys
65 70 75 80
Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Cys Gly Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Cys Gly Ala Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys Gly Cys Cys
115 120 125
Thr Gly Thr Gly Ala Thr Ala
130 135
<210> 31
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 31
ttctgggtgc tggtcgttgt gggcggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtgacagtg 60
gccttcatca tcttttgggt gaggagcaag cggagcagac tgctgcacag cgactacatg 120
aacatgaccc cccggaggcc tggccccacc cggaagcact accagcccta cgcccctccc 180
agggatttcg ccgcctaccg gagc 204
<210> 32
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 32
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 33
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 33
gagggcagag gcagcctgct gacatgtggc gacgtggaag agaaccctgg cccc 54
<210> 34
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 34
atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tcgcaaagtg 60
tgtaacggaa taggtattgg tgaatttaaa gactcactct ccataaatgc tacgaatatt 120
aaacacttca aaaactgcac ctccatcagt ggcgatctcc acatcctgcc ggtggcattt 180
aggggtgact ccttcacaca tactcctcct ctggatccac aggaactgga tattctgaaa 240
accgtaaagg aaatcacagg gtttttgctg attcaggctt ggcctgaaaa caggacggac 300
ctccatgcct ttgagaacct agaaatcata cgcggcagga ccaagcaaca tggtcagttt 360
tctcttgcag tcgtcagcct gaacataaca tccttgggat tacgctccct caaggagata 420
agtgatggag atgtgataat ttcaggaaac aaaaatttgt gctatgcaaa tacaataaac 480
tggaaaaaac tgtttgggac ctccggtcag aaaaccaaaa ttataagcaa cagaggtgaa 540
aacagctgca aggccacagg ccaggtctgc catgccttgt gctcccccga gggctgctgg 600
ggcccggagc ccagggactg cgtctcttgc cggaatgtca gccgaggcag ggaatgcgtg 660
gacaagtgca accttctgga gggtgagcca agggagtttg tggagaactc tgagtgcata 720
cagtgccacc cagagtgcct gcctcaggcc atgaacatca cctgcacagg acggggacca 780
gacaactgta tccagtgtgc ccactacatt gacggccccc actgcgtcaa gacctgcccg 840
gcaggagtca tgggagaaaa caacaccctg gtctggaagt acgcagacgc cggccatgtg 900
tgccacctgt gccatccaaa ctgcacctac ggatgcactg ggccaggtct tgaaggctgt 960
ccaacgaatg ggcctaagat cccgtccatc gccactggga tggtgggggc cctcctcttg 1020
ctgctggtgg tggccctggg gatcggcctc ttcatg 1056
<210> 35
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 35
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 36
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Asn Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
130 135 140
Leu Thr Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly
145 150 155 160
Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
165 170 175
Met Ile Trp His Asn Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Arg Ser
180 185 190
Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Lys Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Lys
195 200 205
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Gly Gly Arg Ser Pro Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ala
<210> 37
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 37
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
35 40
<210> 38
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 39
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 39
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 41
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser
20 25 30
Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser
35 40 45
Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser
50 55 60
Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys
65 70 75 80
Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu
85 90 95
Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly
100 105 110
Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn
115 120 125
Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp
130 135 140
Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn
145 150 155 160
Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser
165 170 175
Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala
180 185 190
Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val
195 200 205
Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn
210 215 220
Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile
225 230 235 240
Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr
245 250 255
Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly
260 265 270
Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn
275 280 285
Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys
290 295 300
His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys
305 310 315 320
Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly
325 330 335
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
340 345 350
<210> 42
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 42
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacaaa tttgaattgg 120
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgacga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaaggtg gaggtggcag cggaggaggt 360
gggtccggcg gtggaggaag cgaggtgaag ttggtggagt caggacctgg cctggtggcg 420
ccctcacaga gcctgaccat cacatgcacc gtctcagggt tctcattaac cggctatggt 480
gtaaactggg ttcgccagcc tccaggaaag ggtctggagt ggctgggaat gatctggcat 540
aatggaagca cagactataa ttcagctctc agatccagac tgagcatcaa caaggacaag 600
tccaagaacc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccaggtac 660
tactgtgcca gagggggaag gtccccctgg tttccttact ggggccaagg gactctggtc 720
actgtctctg caagatct 738
<210> 43
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
130 135 140
Leu Thr Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly
145 150 155 160
Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
165 170 175
Met Ile Trp His Asn Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Arg Ser
180 185 190
Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Lys Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Lys
195 200 205
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Gly Gly Arg Ser Pro Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ala
<210> 44
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp His Asn Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Arg
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Lys Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Ser Pro Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 45
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 46
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Asn Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 48
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 48
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
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Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (59)

1.用于检测具有表达G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)或其片段的颗粒的细胞的方法，其包括：
(a)使所述细胞与有效量的结合蛋白接触，其中所述结合蛋白包含特异性结合GASP-1的抗原结合片段；和
(b)鉴定具有与所述结合蛋白结合的颗粒的细胞，其中所鉴定的细胞是具有GASP-1颗粒的细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞中的GASP-1颗粒的直径范围为0.1至5.0μm。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞中的GASP-1颗粒的平均数目范围为每个细胞20至150个。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述GASP-1颗粒在所述细胞的细胞质中或在所述细胞的表面上。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是在肿瘤中的细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述肿瘤是实体瘤或血液瘤。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是患有癌症的对象的细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述癌症选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、神经胶质瘤、头癌、肝细胞癌、浸润性导管乳腺癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢粘液性囊腺癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小肠恶性间质瘤和胃腺癌。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述癌症选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述乳腺癌是高级别原位导管癌(DCIS)乳腺癌或三阴性乳腺癌。
12.如权利要求9或10所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
13.如权利要求8所述的方法，其中所述对象已经接受了癌症治疗。
14.如权利要求1所述的方法，其还包括检测所述细胞中的癌症生物标志物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述癌症生物标志物选自：CA125、CA19-9、CA15-3、CA27.29、AFP、BRCA1/BRCA2、EGFR、HER-2、KIT、VEGF、KRAS、ALK、PSA、HE4、CYFRA 21-1、NSE、PD-L1、TIMP-1、TIMP-2、HGF、OPN、MSLN、MMP2和CEA。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述结合蛋白是人源化抗体或嵌合抗原受体(CAR)。
17.包含抗GASP-1单链可变片段(抗GASP-1scFv)的结合蛋白。
18.如权利要求17所述的结合蛋白，其中所述抗GASP-1scFv包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)。
19.如权利要求18所述的结合蛋白，其中所述VH链包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
20.如权利要求17所述的结合蛋白，其中所述VH链包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的第一互补决定区1(VHCDR1)、由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的第二互补决定区2(VHCDR2)、由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的第三互补决定区3(VCCDR3)、或它们的组合。
21.如权利要求17所述的结合蛋白，其中所述VL链包含SEQ ID NO:9或17。
22.如权利要求17所述的结合蛋白，其中所述VL链包含由SEQ ID NO:10或18的氨基酸序列组成的第一互补决定区(VL1CDR1)、由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的第二互补决定区(VL1CDR2)和由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的第三互补决定区(VL1CDR3)。
23.如权利要求17所述的结合蛋白，其中所述VH链通过连接子与所述VL链连接。
24.如权利要求17所述的结合蛋白，其中所述连接子包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
25.如权利要求17所述的结合蛋白，其中所述抗GASP-1scFv特异性结合GASP-1的免疫显性表位，并且所述免疫显性表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
26.如权利要求17所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白是选自以下的抗体：重组单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体及其抗原结合片段。
27.如权利要求26所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白是人源化抗体。
28.如权利要求17所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白是包含所述抗GASP-1scFv的嵌合抗原受体(CAR)。
29.如权利要求28所述的结合蛋白，其中所述抗GASP-1scFv包含选自SEQ ID NO:36和43的氨基酸序列。
30.如权利要求17所述的结合蛋白，其包含选自以下中的至少一个氨基酸序列：SEQ IDNO:1-4、9-12和17-18。
31.如权利要求17所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白与化学治疗剂缀合。
32.如权利要求31所述的结合蛋白，其中所述化学治疗剂选自：阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、帕博西尼、瑞博西尼、来那替尼、阿贝西利、奥拉帕尼、瑞戈非尼、维甲酸、axicabtagene ciloleucel、达沙替尼、尼洛替尼、博舒替尼、依鲁替尼、艾代拉利司、维奈托克、普纳替尼、米哚妥林、恩西地平、Tisagenlecleucel、艾伏尼布、杜韦利西布、伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、索拉非尼、阿比特龙、克里唑替尼、维莫非尼、放射性同位素如111In和90Y、毒素如auristatins、美登木素生物碱、阿霉素、紫杉醇、顺铂、长春花碱、加利车霉素和假单胞菌外毒素A。
33.用于产生包含嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的方法，其包括：
(a)将编码包含抗GASP-1单链可变片段(抗GASP-1scFv)的CAR的基因导入T细胞，
(b)通过所述T细胞表达所述抗GASP-1scFv，和
(c)分离表达所述抗GASP-1scFv的T细胞。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述抗GASP-1scFv包含选自SEQ ID NO:36和43的氨基酸序列。
35.产生抗GASP-1抗体的方法，其包括用GASP-1肽作为免疫原免疫宿主。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述GASP-1肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
37.产生双特异性结合蛋白的方法，其包括将权利要求16所述的结合蛋白与另外的人源化抗体组合，由此产生具有比所述人源化抗体更好的免疫治疗特异性和/或功效的双特异性结合蛋白。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述结合蛋白是人源化GASP-1抗体或嵌合抗原受体(CAR)。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述另外的人源化抗体选自：利妥昔单抗、阿仑单抗、阿达木单抗、依法利珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、那他珠单抗、帕尼单抗、雷珠单抗、易普利姆玛、贝利单抗、奥滨尤妥珠单抗、帕妥珠单抗、维多珠单抗、雷莫芦单抗、依洛尤单抗、派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、瑞利珠单抗、耐昔妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、奥法木单抗、德瓦鲁单抗、硼替佐米、埃罗妥珠单抗、阿维鲁单抗、西米普利单抗和奥拉单抗。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的方法制备的双特异性结合蛋白。
41.药物组合物，其包含权利要求17-32中任一项所述的结合蛋白或权利要求40所述的双特异性结合蛋白，以及药学上可接受的载体。
42.用于治疗有需要的对象的GASP-1介导的疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求41所述的药物组合物。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述GASP-1介导的疾病或病症是肿瘤。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述肿瘤是血液肿瘤。
46.如权利要求42所述的方法，其中所述GASP-1介导的疾病或病症是癌症。
47.如权利要求42所述的方法，其中所述对象已经接受了癌症的治疗。
48.如权利要求42-47中任一项所述的方法，其中所述GASP-1在所述对象的细胞中的颗粒中表达。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述颗粒在所述细胞的细胞质中或在所述细胞的表面上。
50.抑制表达GASP-1的细胞生长的方法，其包括向所述细胞施用有效量的权利要求41所述的药物组合物。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述细胞是患有癌症的患者的细胞。
53.使表达GASP-1的外泌体、微囊泡或癌小体失活的方法，其包括向所述外泌体、微囊泡或癌小体施用有效量的权利要求41所述的药物组合物。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述外泌体、微囊泡或癌小体是患有癌症的对象的外泌体、微囊泡或癌小体。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述外泌体、微囊泡或癌小体是在所述对象的血液循环中的外泌体、微囊泡或癌小体。
56.如权利要求46、52或54所述的方法，其中所述癌症选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、神经胶质瘤、头癌、肝细胞癌、浸润性导管乳腺癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢粘液性囊腺癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小肠恶性间质瘤和胃腺癌。
57.如权利要求46、52或54所述的方法，其中所述癌症选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。
58.如权利要求56或57所述的方法，其中所述乳腺癌是高级别原位导管癌(DCIS)乳腺癌或三阴性乳腺癌。
59.如权利要求56或57所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
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