JP7463000B2 - ヒトclaudin及びヒトPDL1タンパク質を標的とする二重特異性抗体及びその使用 - Google Patents
ヒトclaudin及びヒトPDL1タンパク質を標的とする二重特異性抗体及びその使用 Download PDFInfo
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Description
本発明はヒトclaudin及びヒトPDL1タンパク質を標的とする二重特異性抗体及びその使用に関し、生物医学の分野に属する。
二重特異性抗体(BsAb)は二重機能抗体とも呼ばれ、二つの異なる抗原とエピトープを同時に認識して結合し、二つの異なるシグナル伝達経路をブロックしてその役割を果たす。BsAbは、通常の抗体と比較して特異的な抗原結合部位が一つ多いため、治療面で以下の利点を示す:
腫瘍に対する免疫細胞の殺傷を媒介する:二重特異性抗体の一つの重要な作用機序は免疫細胞の殺傷を媒介することであり、二重特異性抗体には2本の抗原結合アームがあり、その中の1本は標的抗原と結合し、もう1本はエフェクター細胞上の標識抗原と結合し、後者はエフェクター細胞を活性化して、腫瘍細胞を標的にして殺傷させることができる。
本発明の目的は、ヒトclaudin及びヒトPDL1タンパク質を標的とする二重特異性抗体及びその使用を提供することである。
抗ヒトclaudin18.2の抗体部分及び抗PD-L1の抗体部分を含む。
抗ヒトclaudin18.2の抗体部分及び抗PD-L1の抗体部分を含む。
配列番号93、75、79、83又は87で示されるHCDR1、
配列番号94、76、80、84又は88で示されるHCDR2、と
配列番号95、77、81、85又は89で示されるHCDR3、及び
配列番号90又は72で示されるLCDR1、
配列番号91又は73で示されるLCDR2、と
配列番号92、74、78、82又は86で示されるLCDR3を含む。
(Z1)配列番号93、94、95で示されるHCDR1、HCDR2とHCDR3、及び配列番号90、91、92で示されるLCDR1、LCDR2とLCDR3、
(Z2)配列番号75、76、77で示されるHCDR1、HCDR2とHCDR3、及び配列番号72、73、74で示されるLCDR1、LCDR2とLCDR3、
(Z3)配列番号79、80、81で示されるHCDR1、HCDR2とHCDR3、及び配列番号72、73、78で示されるLCDR1、LCDR2とLCDR3、
(Z4)配列番号83、84、85で示されるHCDR1、HCDR2とHCDR3、及び配列番号72、73、82で示されるLCDR1、LCDR2とLCDR3、
(Z5)配列番号87、88、89で示されるHCDR1、HCDR2とHCDR3、及び配列番号72、73、86で示されるLCDR1、LCDR2とLCDR3から選択される。
L1、L2及びL3は、それぞれ独立して結合又はリンカーエレメントであり、
VHは抗ヒトclaudin18.2抗体の重鎖可変領域を表し、
VLは抗ヒトclaudin18.2抗体の軽鎖可変領域を表し、
CHは抗ヒトclaudin18.2抗体の重鎖定常領域を表し、
CLは抗ヒトclaudin18.2抗体の軽鎖定常領域を表し、
VHHは抗PD-L1単一ドメイン抗体を表す。
(i)本発明の第四態様に記載の宿主細胞を適当な条件で培養して、本発明の第一態様に記載の二重特異性抗体を含有する混合物を得るステップ、
(ii)ステップ(i)で得られた混合物を精製及び/又は分離して、前記二重特異性抗体を得るステップを含む。
(a)本発明の第一態様に記載の二重特異性抗体又は第七態様に記載のコンジュゲート、及び
(b)薬学的に許容される担体を含む。
(a)本発明の第一態様に記載の二重特異性抗体、及び
(b)以下の群:検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素から選択される共役部分を含む。
図1は、抗CLDN18.2/抗PD-L1二重特異性抗体分子の構造模式図を示す。
本発明者らは、広範かつ深く研究し、多量のスクリーニングにより、高い特異性と高い親和性を有する抗CLDN18.2抗体及び抗PD-L1単一ドメイン抗体を得、これに基づいてヒト化及び遺伝子組換えを行い、ヒトclaudin18.2及びヒトPD-L1を同時に標的とする二重特異性抗体を得た。体外実験は、本発明の二重特異性抗体がヒトclaudin18.2及びヒトPD-L1分子に特異的に結合し、claudin18.2を組換えて発現し、PD-L1を自然発現するヒト肺がん細胞を殺傷することを証明した。生体内薬効実験は、本発明の二重特異性抗体が相乗的な作用を有し、ヒト化マウスモデルにおいてclaudin18.2モノクローナル抗体及びPD-L1モノクローナル抗体よりも優れた抗腫瘍活性を示すことを証明した。これに基づいて、本発明が完成された。
本開示をより容易に理解するために、まずはいくつかの用語を定義する。本明細書に使用される場合、本明細書で別段の明確的な規定がない限り、以下の用語の各々は以下で示される意味を有する。その他の定義は、出願全体にわたって説明されている。
本発明は、ヒトclaudin18.2及びヒトPD-L1タンパク質を標的とする二重特異性抗体を提供し、それは抗ヒトclaudin18.2抗体部分及び抗PD-L1抗体部分を含む。
本発明の二重特異性抗体における抗ヒトclaudin18.2抗体部分は、マウス由来の抗claudin18.2抗体をヒト化修飾することによって得られたものである。IMGTヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとMOEソフトウェアを比較することより、それぞれQP190191、QP192193、QP199200、QP201202、QP207208と相同性の高い重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をテンプレートとして選び、マウス由来抗体のCDRをそれぞれ対応するヒト由来テンプレートに移植して、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順で可変領域配列を形成する。さらにいくつかの重要なアミノ酸残基を復帰突然変異の組み合わせのために選択する。
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QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGNGDTTYNGKFKGQATLTADKSSSTVYMQLSSLTSEDSAVYFCARFVKGNAMDYWGQGTSVTVSS
>QD200配列番号42
DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSNSIYYVDTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLKSEDTAMYYCARNAYYGNSFDYWGQGTTLTVSS
>QD202配列番号44
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYFVHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDDTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMDLSSLTSEDSAVYYCLSLRFFAYWGQGTLVTVSA
前記マウス由来の抗claudin18.2抗体の軽鎖可変領域は、それぞれ以下のアミノ酸配列を有し、CDRは配列中の下線部で示される。
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPFTFGSGTKLEIK
>QD190 配列番号37
DIVMTQSPSSQTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIK
>QD192 配列番号39
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQNPGQPPKMLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGIDFSLTISSVQAEDLALYYCQNAYSYPFTFGSGTKLEIK
>QD199 配列番号41
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTVFTLTISSVQAEDLAVYFCQNNYYYPLTFGAGTKLELK
>QD201 配列番号43
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQAPKLLIYWASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISHVQAEDLAVYFCQNDYSYPLTFGAGTNLELK
上記抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のCDR(下線部)領域は表Bに示される通りである。
本発明の二重特異性抗体における抗ヒトPD-L1抗体部分は、抗PD-L1単一ドメイン抗体(抗PD-L1ナノ抗体)をヒト化することによって得られたものである。IMGTヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとMOEソフトウェアを比較することより、それぞれQP1162、QP1166と相同性の高い重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をテンプレートとして選び、単一ドメイン抗体のCDRをそれぞれ対応するヒト由来テンプレート(例えば、IGHV3-23 germline及びJ-region IGHJ4*01)に移植して、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順で可変領域配列を形成する。さらにいくつかの重要なアミノ酸残基を復帰突然変異の組み合わせのために選択する。
QVQLVESGGGSVQSGGSLRLSCAASGFTYGTYAMSWFRQAPGKEREGVACIDIYGRASYTDPVKGRFTISQDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARDFGYCTASWVHEGFSRYWGQGTQVTVSS
>QD1166 配列番号56
QVQLVESGGDSVQPGGSLRLSCAASGFTYGTYAMSWFRQAPGKEREGVACIDIYGRTSYTDPVKGRFTISQDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARDFGYCTASWVHEGFSRYWGQGTQVTVSS
上記単一ドメイン抗体のCDR(下線部)領域をまとめると、以下の表に示される通りである。
本発明はまた、医薬組成物を提供する。好ましくは、前記組成物は医薬組成物であり、上記抗体又はその活性フラグメント又はその融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含有する。通常、これらの物質は、無毒、不活性及び薬学的に許容される水性担体媒体の中で調製することができ、ここで、pHは、通常、約5~8であり、好ましくは約6~8であるが、pHは、調製される物質の性質及び治療される状態によって変化することができる。調製された医薬組成物は腫瘍内、腹膜内、静脈内、又は局所投与を含む(ただし、これらに限定されない)通常の経路によって投与することができ、。
本発明は本発明の抗体の使用をさらに提供し、がん(又は腫瘍)、感染症又は免疫調節疾患を治療するための薬物の製造における使用に関する。好ましい使用は、がん(又は腫瘍)の治療に使用される。
IMGTヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとMOEソフトウェアを比較することより、それぞれQP190191、QP192193、QP199200、QP201202、QP207208と相同性の高い重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をテンプレートとして選び、マウス由来抗体のCDRをそれぞれ対応するヒト由来テンプレートに移植し、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順の可変領域配列を形成した。さらにいくつかの重要なアミノ酸残基を復帰突然変異の組み合わせのために選択する。ここで、アミノ酸残基はKabat番号システムにより同定され、注釈付けされた。
プライマーPCRを設計して各ヒト化抗体VH/VK遺伝子フラグメントを構築し、シグナルペプチド及び定常領域遺伝子(CH1-FC/CL)フラグメントを有する発現ベクターpQDと相同組換えを行い、抗体全長発現ベクターVH-CH1-FC-pQD/VK-CL-pQDを構築した。
293E細胞の培養密度を0.2~3×106/mlに維持し、維持段階培地(GIBCO Freestyle 293発現培地)を使用して培養し、トランスフェクション前日にトランスフェクション細胞を遠心分離し、培地を交換し、細胞密度を0.5~0.8×106/mlに調節した。トランスフェクション当日、293E細胞密度は1~1.5×106/mlであった。プラスミドとトランスフェクション試薬PEIを調製し、トランスフェクションするプラスミドの量は100ug/100ml細胞であり、使用したPEIとプラスミドの質量比は2:1であった。プラスミドとPEIをよく混合し、15分間静置し、20分を超えてはいけなお。プラスミドとPEI混合物を293Eの細胞にゆっくりと加え、8%CO2、120rpm、37℃のシェーカーで培養し、トランスフェクションの5日目、水平遠心分離機で4700rpmで20分間遠心分離して細胞上清を収集した。
プロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製
機器から流出する最終溶液のpHと導電率が平衡液と一致するように、カラムに平衡液を通し、少なくとも3CVであり、実際の体積は20mlであり、流速は1ml/minであり;遠心分離後の培養液上澄をカラムに通し、サンプルは40mlであり、流速は0.33ml/minであり;機器から流出する最終溶液のpHと導電率が平衡液と一致するように、カラムに平衡液を通し、少なくとも3CVであり、実際の体積は20mlであり、流速は0.33ml/minであり;溶離液をカラムに通し、UV280が15mAUまで上昇した時点で溶離ピーク(PAC-EP)の収集を開始し、UV280が15mAUまで下降した時点で収集を停止し、流速は1ml/minであった。サンプルの収集が終了した後、PAC-EPをpH調節液で中性に調節した。
検査試薬:脱脂粉乳(BD、232100)、PBS(生工、B548117-0500)、HRP-anti human IgG(H+L)(jackson、109-035-088)、TMB(Luoyang Baiaotong Experimental Materials Center、C060201)、Elisaプレート(costa、9018)1×PBS緩衝液:NaCl 8.00g、KCl 0.20g、Na2HPO4・12H20 2.9g、KH2PO4 0.2g~800mLを秤量してddH2O中に溶解させ、十分に溶解させた後、1Lまで定容し、pHを7.4まで調節し、使用のために高温滅菌しておいた。又は市販の10×、20×のPBS溶液を購入して1×PBS緩衝液に希釈して使用した。ブロッキング液:5gの粉ミルクをPBSに秤量し、ブロッキング液は使用直前に調製する必要がある。終止液(1mol/L H2SO4):109mLの98%濃H2SO4を2000mLのddH2Oにゆっくりと滴下した。100ul/ウェルのTMBで37℃で10分間発色させ、シェーカー(120rpm)に置いた。
それぞれ細胞CHOS、CHOS-CLDN18.2を収集し、2E5/ウェルであり、1000rで5分間遠心分離し、3%BSA/PBS buffer 200ul/ウェルで60分間、4℃でブロッキングした。抗体20ug/mlの初期濃度を、1:4で希釈し、4℃で60分間培養した。PBSで2回洗浄し、PE-anti-human FC(1:200)50ul/ウェルを培養し、4℃で30分間培養し、PBSで3回洗浄し、PBSで重懸濁させ、FACSの結果は:表3、表4、表5、表6、表7及び図7、図8、図9、図10と図11に示される通りである。
蛍光活性化セルソーティングFACSを使用して、本発明のヒト化抗体のclaudin18.2に結合するがclaudin18.1には結合しない特異性を同定
それぞれ細胞CHOS、CHOS-CLDN18.2、CHOS-CLDN18.1を収集し、2E5/ウェルであり、1000rで5分間遠心分離し、3%BSA/PBSbuffer 200ul/ウェルで60分間、4℃でブロッキングさせた。抗体20ug/mlの初期濃度を、1:4に希釈させ、4℃で60分間培養した。PBSで2回洗浄し、PE-anti-human FC(1:200)に50ul/ウェルで培養し、4℃で30分間培養し、PBSで3回洗浄し、PBSで再懸濁させ、FACS読み取り値の平均蛍光値は表8に示される通りであり、FACS結果は、本発明のヒト化抗claudin18.2抗体がすべてCHOS-claudin18.2細胞に結合し、CHOS-claudin18.1及びCHOS細胞に結合しないことを示し、ヒト化抗claudin18.2抗体が特異的にclaudin18.2に結合するがclaudin18.1に結合しないことを証明した。
target cell(HEK293-CLDN18.2)の製造:HEK293-CLDN18.2をトリプシンで1000rpmで5分間消化した。新鮮な培地に交換し、96ウェルプレートに20,000cell/ウェルで播種し、37℃、5%CO2で一晩培養した。抗体の製造:抗体(80ug/ml~0.000512ug/ml、0ug/ml)を培地で1:5の勾配で10個の濃度に希釈した。96ウェルプレートの培地を吸引し、上記の各濃度に希釈させた抗体を70ul/ウェルで加え、濃度ごとに2つの複製ウェルを設定した。PBMCの製造:1日目に蘇生したPBMCを遠心分離し、培地で再懸濁させ、カウントした。PBMC:標的細胞=50:1で上記ウェルプレートに70ul/ウェルを加え、37℃で4時間培養した。15ul lysis緩衝液(1%Triton-X100)をMax lysis wellに加え、37℃で10分間培養した。
試薬:細胞:HEK293-hCLDN18.2-H11、補体:normal human serum complement(quidel、A113)、抗体:QP024025(IMAB362)、QP14631461は、本実施例から合成された。
細胞/培地のプレーティング:背景対照群culture media backgroundを設定し、即ち、培地40ul/ウェルのみを添加し、最大放出群maximum LDH releaseを設定し、即ち、40ul標的細胞を添加した後、検出前45分に12ulのlysis solutionを添加した。体積補正群volume correctionを設定し、即ち、培地40ul/ウェルを添加し;LDL陽性対照群を設定し、即ち、1ul陽性対照をボルテックスした後、PBS+1%BSAの希釈液で5000倍(5mL)に希釈させた。10倍の勾配で希釈することができる。実験群experimentalを設定し、即ち、40ul/ウェル target cellを加えた。補体+抗体mixの添加:対照群と実験群の両方に20%の補体(細胞培地で希釈)を40μl/ウェルで加えた。細胞を37℃、5%CO2で培養し、1時間15分後に12ul/ウェルのlysis solutionを最大放出群と体積補正群に加えた。37℃で45分間培養を続けた後、LDH検出キットで検出し、490nmでの吸光度値を読み取り、読み取りは停止液stop solutionを加えてから1時間以内に完了させる必要がある。計算:実験群は背景対照群を除去し、最大放出群は体積矯正群を除去し、式は以下の通りである:Percent cytotoxicity=100*OD490(experimental LDH release)/OD490(maximum LDH release)。
実験方法:対数増殖期のヒトclaudin18.2(hClaudin18.2)を安定的に発現する安定トランス細胞株HEK293-hClaudin18.2細胞を収集し、PBS緩衝液で細胞濃度を5×107/mLに調節し、CB-17SCIDマウスの右側腹部に0.1mL(1:1Matrigel)の細胞懸濁液を皮下接種した。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニターし、接種当日にマウスの体重に応じて群を分け、投与した後観察した。
IMGTヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとMOEソフトウェアを比較することより、それぞれQP1162、QP1166と相同性の高い重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をテンプレートとして選び、単一ドメイン抗体のCDRをそれぞれ対応するヒト由来テンプレートIGHV3-23 germline及びJ-region IGHJ4*01に移植し、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順の可変領域配列を形成した。さらにいくつかの重要なアミノ酸残基を復帰突然変異の組み合わせのために選択した。ここで、アミノ酸残基はKabat番号システムにより同定され、注釈付けされた。
プライマーPCRを設計して、各ヒト化抗体VH遺伝子フラグメントを構築し、シグナルペプチド及び定常領域遺伝子(FC)フラグメントを有する発現ベクターpQDと相同組換えを行い、抗体全長発現ベクターVH-FC-pQDを構築した。
293E細胞の培養密度を0.2~3×106/mlに維持し、維持段階培地(GIBCO Freestyle 293 expression medium)を用いて培養し、トランスフェクション前日にトランスフェクション細胞を遠心墳りし、細胞密度を0.5~0.8×106/mlに調節した。トランスフェクション当日、293E細胞密度は1~1.5×106/mlであった。プラスミドとトランスフェクション試薬PEIを用意し、PEIとプラスミドの質量比が2:1になるように100ug/100mlの細胞の量でプラスミドをトランスフェクションした。プラスミドとPEIをよく混合し、15分間静置し、20分を超えてはいけない。プラスミドとPEIの混合物を293Eの細胞にゆっくりと加え、8%CO2、120rpm、37℃のシェーカーで培養し、トランスフェクション5日目、水平遠心分離機4700rpmで20分間遠心分離して細胞上清を収集した。
プロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製
カラムに平衡液を通し、少なくとも3CVであり、実際の体積は20mlであり、機器から流出する最終溶液のpHと導電率が平衡液と一致することを確保し、流速は1ml/minであり;遠心分離後の培養液の上澄をカラムに通し、サンプルは40mlであり、流速は0.33ml/minであり;カラムに平衡液を通し、少なくとも3CVであり、実際の体積は20mlであり、機器から流出する最終溶液のpHと導電率が平衡液と一致することを確保し、流速は0.33ml/minであり;溶離液をカラムに通し、UV280が15mAUまで上昇した時点で溶離ピーク(PAC-EP)の収集を開始し、UV280が15mAUまで下降した時点で収集を停止し、流速は1ml/minであった。サンプルの収集が終了した後、PAC-EPをpH調節液で中性に調節した。
抗体QP1162/QP320/QP321/QP322/QP1166/QP323/QP324/QP325 0.75ug/ml、QP11801181 1.5ug/mlを50ul/ウェルでコーティングし、4℃で一晩放置した。PBSを3回実行した。ブロッキング:3%BSA 250ul/ウェル、RT 1h。2ug/mlのBiotin QP004.3(biotin-PDL1-FC)をそれぞれ異なる濃度で1:4に希釈し、RTで1時間培養した。PBSTを3回実行し、PBSを3回実行した。二次抗体の培養:HRP-strepavidin(1:5000)50ul/ウェル、PBSTを6回実行し、PBSを3回実行した。発色:TMB 100ul/wellで10分間発色させた。2MのH2SO4 50ul/wellを加えて終了させた。
50ul/ウェルのタンパク質QP1138(PD1-FC)2ug/mlをコーティングし、4℃で一晩放置した。PBSを3回実行した。ブロッキング:3%BSA 250ul/ウェル、RT 1h。それぞれ2ug/mlのBiotin QP004.3(biotin-PDL1-FC)と異なる濃度のQP1120 15ug/ml、QP11801181 30 ug/mlを調製し、1:3に希釈し、等体積で混合し、RTで1時間放置した。PBSTを3回実行し、PBSを3回実行した。二次抗体の培養:HRP-strepavidin(1:5000)50ul/ウェルでPBSTを6回実行し、PBSを3回実行した。発色:TMB 100ul/wellで10分間発色させた。2MのH2SO4 50ul/wellを加えて終了させた。
表面プラズモン共鳴(SPR)による親和性の検出
Biacore T200(GE)により、被検分子とタンパク質ヒトPD-L1及びcynoPD-L1との親和性を測定した。
本実施例では、ヒト化後のナノ抗体QP322をそれぞれ抗CLDN18.2の重鎖と、結合ペプチド(G4S)4を介して融合タンパク質を形成して、抗CLDN18.2/抗PD-L1二重特異性抗体の構築に用いられた。
プライマーPCRを設計して各ヒト化抗体VH遺伝子フラグメントを構築し、発現ベクターpQD(シグナルペプチド及び定常領域遺伝子フラグメントを有する)と相同組換えを行い、抗体全長発現ベクターpQDを構築した。
293E細胞の培養密度を0.2~3×106/mlに維持し、維持段階培地(GIBCO Freestyle 293 expression medium)を用いて培養し、トランスフェクション前日にトランスフェクション細胞を遠心墳りし、細胞密度を0.5~0.8×106/mlに調節した。トランスフェクション当日、293E細胞密度は1~1.5×106/mlであった。プラスミドとトランスフェクション試薬PEIを用意し、トランスフェクションするプラスミドの量は100ug/100mlの細胞であり、使用されるPEIとプラスミドの質量比は2:1であった。プラスミドとPEIをよく混合し、15分間静置し、20分を超えてはいけない。プラスミドとPEIの混合物を293Eの細胞にゆっくりと加え、8%CO2、120rpm、37℃のシェーカーで培養し、トランスフェクション5日目、水平遠心分離機4700rpmで20分間遠心分離して細胞上清を収集した。
プロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製
カラムに平衡液を通し、少なくとも3CVであり、実際の体積は20mlであり、機器から流出する最終溶液のpHと導電率が平衡液と一致することを確保し、流速は1ml/minであり;遠心分離後の培養液上澄をカラムに通し、サンプルは40mlであり、流速は0.33ml/minであり;カラムに平衡液を通し、少なくとも3CVであり、実際の体積は20mlであり、機器から流出する最終溶液のpHと導電率が平衡液と一致することを確保し、流速は0.33ml/minであり;溶離液をカラムに通し、UV280が15mAUまで上昇した時点で溶離ピーク(PAC-EP)の収集を開始し、UV280が15mAUまで下降した時点で収集を停止し、流速は1ml/minであった。サンプルの収集が終了した後、PAC-EPを調整液で中性に調節した。
4.抗CLDN18.2/抗PD-L1二重特異性抗体の結合活性(PD-L1binding)
PD-L1 Binding ELISA:
抗体QP322 0.75ug/ml、QP11801181 1.5ug/ml、QP3691433、QP3701440、QP3711461、QP3721116 50ul/ウェルをコーティングし、4℃で一晩放置した。PBSを3回実行した。ブロッキング:3%BSA 250ul/ウェル、RTで1時間放置した。1ug/mlのBiotinQP004.3(biotin-PDL1-FC)をそれぞれ異なる濃度で1:5に希釈し、RTで1時間培養した。PBSTを6回実行し、PBSを3回実行した。二次抗体の培養:HRP-strepavidin(1:5000)50ul/ウェルであり、PBSTを6回実行し、PBSを3回実行した。発色:TMB 100ul/wellで、10分間発色させた。2MのH2SO4 50ul/wellを加えて終了させた。
PD-L1/PD-1 blocking ELISA
コーティング:抗体QP1138 2ug/mlを50ul/ウェルで、4℃で一晩放置した。PBSを3回実行した。ブロッキング:3%BSA 250ul/ウェルであり、RTで1時間放置した。それぞれ2ug/mlのBiotin QP004.3(biotin-PDL1-FC)と異なる濃度のQP322 15ug/ml、QP11801181 30ug/ml、QP3691433、QP3701440、QP3711461、QP3721116 36ug/mlを調製し、1:3で希釈し、等体積で混合し、RTで1時間放置した。PBSTを3回実行し、PBSを3回実行した。二次抗体の培養:HRP-strepavidin(1:5000)50ul/ウェルであり、PBSTを3回実行し、PBSを3回実行した。発色:TMB 100ul/wellであり、10分間発色させた。2MのH2SO4 50ul/wellを加えて終了させた。
PD-L1/CD80 blocking ELISA
CD80-FC 4ug/mlをコーティングし、4℃で一晩放置した。PBSで3回洗浄し、5%脱脂粉乳でブロッキングし、RTで1時間放置した。最終濃度0.5ug/mlのBiotin-QP004+CHO14(10ug/ml、1:5で希釈)で培養し、RTで1時間放置した。PBSTで5回洗浄した。HRP-Strepavidin(1:5000)、PBSTで6回洗浄し、PBSで3回洗浄した。TMBで発色させた。注:CHO14タンパク質は、QP3711461であり、CHO細胞で発現することによって得られたタンパク質である。
検査試薬:脱脂粉乳(BD、232100)、PBS(生工、B548117-0500)、HRP-anti human IgG(H+L)(jackson、109-035-088)、TMB(Luoyang Baiaotong Experimental Materials Center、C060201)、Elisaプレート(costa、9018)1×PBS緩衝液:NaCl 8.00g、KCl 0.20g、Na2HPO4・12H20 2.9g、KH2PO4 0.2g~800mLを秤量してddH2O中に溶解させ、十分に溶解させた後、1Lまで定容し、pHを7.4まで調節し、高温滅菌しておいた。又は市販の10×、20×のPBS溶液を購入して1×PBS緩衝液に希釈して使用した。ブロッキング液:5gの脱脂粉乳をPBSに秤量し、ブロッキング液は使用直前に調製する必要がある。停止液(1mol/LのH2SO4):109mLの98%濃H2SO4を2000mLのddH2Oにゆっくりと滴下した。TMBを37℃で10分間発色させ、シェーカー(120rpm)に置き、100ul/ウェルであった。
DC(donor1)細胞の製造:PBMCを蘇生し、EasySepTMHuman Monocyte Isolation Kit(Stemcell 19359)でmonocytesを分離し、rhGM-CSF(1000U/ml)とrhIL4(500U/ml)を加え、細胞を37℃で6日間培養してiDCに誘導し;2~3日ごとに液体の半分を交換し、同時にrhGM-CSF(1000U/ml)とrhIL4(500U/ml)を補充し;細胞を回収して300xgで5分間遠心分離し、rhGM-CSF(1000U/ml)とrhIL4(500U/ml)を加えた培地で再懸濁させ、同時にLPS(1μg/ml)を加え、続いて37℃で1日間培養して成熟DCに誘導し;細胞を収集し、カウントして予備した。T(donor2)細胞の製造:PBMCを蘇生し、EasySepTMHuman CD4+T Cell Isolation Kit(Stemcell 17952)でCD4+Tcellを分離した。抗体の製造:抗体(初期濃度10ug/ml)を培地で1:5の勾配で6個の濃度に希釈した。DC細胞:T細胞を1:10の比で混合し、異なる濃度の抗体を添加して混合培養し、2日目に培養上清中のIL2の発現を検出し、5日目に培養上清中のIFNgの発現を検出した。
target cell(HCC827-CLDN18.2)の製造:HCC827-CLDN18.2をトリプシンで1000rpmで5分間消化した。新鮮な培地に交換し、96ウェルプレートに20,000cell/ウェルで播種し、37℃、5%CO2で一晩培養した。抗体の製造:抗体を培地で1:5の勾配で(200nM~0.000512nM、0)10濃度に希釈した。96ウェルプレートtarget cellの培地を吸引し、上記で希釈した各濃度の抗体を70ul/ウェルずつ加え、濃度ごとに複製ウェルを設定した。PBMCの製造:1日目に蘇生したPBMCを遠心分離し、培地で再懸濁させ、カウントした。PBMC:Target cell=50:1で上記ウェルプレートに70ul/ウェルを加え、37℃で4時間培養した。15ulのlysis緩衝液(1%Triton-X100)をMax lysis wellに加え、37℃で10分間培養した。
実験方法:対数増殖期マウス大腸がん細胞MC38-hPDL1(Tg)-mClaudin18.2(Tg)細胞(ヒトPDL1及びマウスclaudin18.2を過剰発現し、同時にマウスPDL1をノックアウトする)を採取し、培地を除去し、PBSで2回洗浄した後、C57BL/6-hPDL1マウスの右側腹部に皮下に接種し、接種量は5×105/100μL/匹であった。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニタリングし、接種後8日目に平均腫瘍体積が82.85mm3に達した時点で、腫瘍体積に応じて無作為に4群に分け、群当たり9匹であった。群分け当日をD0日と定義し、D0日から投与を開始した。
実験方法:対数増殖期のヒト肺腺がんを安定的にトランスフェクションする細胞株HCC827-hClaudin18.2細胞(当該細胞はヒトPDL1を自然に高発現し、ヒトclaudin18.2を過発現する)を採取し、培養液を除去し、PBSで2回洗浄した後、NCGマウス右側腹部に皮下に接種し、接種量は5×106/100μL/匹であった。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニタリングし、接種後7日目に平均腫瘍体積が150mm3に達した時点で、ヒトPBMC(5×106/100μL/匹)を接種した。腫瘍体積に応じて無作為に4群に分け、群当たり9匹であった。群分けした日をD0日と定義し、D0日から投与を開始した。
実験方法:対数増殖期マウス大腸がん細胞MC38-hPDL1(Tg)-mClaudin18.2(Tg)細胞(当該細胞はヒトPDL1及びマウスclaudin18.2を過剰発現し、マウスPDL1をノックアウトする)を採取し、培養液を除去し、PBSで2回洗浄した後、C57BL/6マウスの右側腹部に皮下に接種し、接種量は5×105/100μL/匹であった。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニタリングし、接種後7日目に平均腫瘍体積が約90mm3に達した時点で、腫瘍体積に応じて無作為に4群に分け、群当たり10匹であった。群分けした日をD0日と定義し、D0日から投与を開始した。
実験方法:対数増殖期のマウス大腸がん細胞MC38-hPDL1(Tg)-mClaudin18.2(Tg)細胞(当該細胞はヒトPDL1及びマウスclaudin18.2を過剰発現し、マウスPDL1をノックアウトする)を採取し、培養液を除去し、PBSで2回洗浄した後、C57BL/6マウスの右側脇腹に皮下接種し、接種量は5×105/100μL/匹であった。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニタリングし、接種後6日目に腫瘍体積に応じて無作為に3群に分け、群当たり15匹であった。群分けした日をD0日と定義し、D0日から投与を開始した。
Claims (13)
- ヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体及び抗PD-L1抗体を含み、
前記ヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体の三つの重鎖CDR及び三つの軽鎖CDRが、
(Z1)配列番号93、94、95で示されるHCDR1、HCDR2とHCDR3、及び配列番号90、91、92で示されるLCDR1、LCDR2とLCDR3、
(Z2)配列番号75、76、77で示されるHCDR1、HCDR2とHCDR3、及び配列番号72、73、74で示されるLCDR1、LCDR2とLCDR3、
(Z3)配列番号79、80、81で示されるHCDR1、HCDR2とHCDR3、及び配列番号72、73、78で示されるLCDR1、LCDR2とLCDR3、
(Z4)配列番号83、84、85で示されるHCDR1、HCDR2とHCDR3、及び配列番号72、73、82で示されるLCDR1、LCDR2とLCDR3、
(Z5)配列番号87、88、89で示されるHCDR1、HCDR2とHCDR3、及び配列番号72、73、86で示されるLCDR1、LCDR2とLCDR3からなる群より選択され、
前記抗PD-L1抗体は、単一ドメイン抗体であり、前記単一ドメイン抗体の三つの相補的決定領域CDRは、配列番号69で示されるHCDR1、配列番号70又は96で示されるHCDR2と配列番号71で示されるHCDR3を含むことを特徴とする、ヒトclaudin18.2及びヒトPD-L1タンパク質を標的とする二重特異性抗体。 - 前記二重特異性抗体は、二つの単量体からなる二量体であり、前記単量体は、N末端からC末端まで式Iで表される構造を有することを特徴とする、請求項1に記載の二重特異性抗体。
(ここで、
L1、L2及びL3は、それぞれ独立して結合又はリンカーエレメントであり、
VHはヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体の重鎖可変領域を表し、
VLはヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体の軽鎖可変領域を表し、
CHはヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体の重鎖定常領域を表し、
CLはヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体の軽鎖定常領域を表し、
VHHは抗PD-L1単一ドメイン抗体を表し、
「-」はペプチド結合を表し、
「~」はジスルフィド結合又は共有結合を表す。) - 前記ヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列は、配列番号31、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号32、配列番号33、又は配列番号34で示される通りであり、
前記ヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体の軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列は、配列番号29、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号28、又は配列番号30で示される通りであり、
前記抗PD-L1単一ドメイン抗体(VHH)のアミノ酸配列は、配列番号51、配列番号49、配列番号50、配列番号52、配列番号53又は配列番号54で示される通りであることを特徴とする、請求項1または2に記載の二重特異性抗体。 - 前記ヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列は、配列番号31で示される通りであり、及び、前記ヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体の軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列は、配列番号29で示される通りであり、及び、前記抗PD-L1単一ドメイン抗体(VHH)のアミノ酸配列は、配列番号51で示される通りである;または、
前記ヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列は、配列番号5で示される通りであり、及び、前記ヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体の軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列は、配列番号1で示される通りであり、及び、前記抗PD-L1単一ドメイン抗体(VHH)のアミノ酸配列は、配列番号51で示される通りである;または、
前記ヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列は、配列番号17で示される通りであり、及び、前記ヒト化抗ヒトclaudin18.2抗体の軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列は、配列番号16で示される通りであり、及び、前記抗PD-L1単一ドメイン抗体(VHH)のアミノ酸配列は、配列番号51で示される通りであることを特徴とする、請求項3に記載の二重特異性抗体。 - 前記二重特異性抗体のL鎖(VL-L3-CL)のアミノ酸配列は、配列番号63で示され、及び、前記二重特異性抗体のH鎖(VH-L1-CH-L2-VHH)のアミノ酸配列は、配列番号64で示される通りである;または、
前記二重特異性抗体のL鎖(VL-L3-CL)のアミノ酸配列は、配列番号59で示され、及び、前記二重特異性抗体のH鎖(VH-L1-CH-L2-VHH)のアミノ酸配列は、配列番号60で示される通りである;または、
前記二重特異性抗体のL鎖(VL-L3-CL)のアミノ酸配列は、配列番号61で示され、及び、前記二重特異性抗体のH鎖(VH-L1-CH-L2-VHH)のアミノ酸配列は、配列番号62で示される通りであることを特徴とする、請求項4に記載の二重特異性抗体。 - 請求項1~5のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項6に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、ベクター。
- 請求項7に記載のベクターを含有し、又は請求項6に記載のポリヌクレオチドをゲノムに組み込まれていることを特徴とする、遺伝子操作された宿主細胞。
- (i)請求項8に記載の宿主細胞を適当な条件で培養して、前記二重特異性抗体を含有する混合物を得るステップ、
(ii)ステップ(i)で得られた混合物を精製及び/又は分離して、前記二重特異性抗体を得るステップ、を含むことを特徴とする、請求項1~5のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の製造方法。 - (a)請求項1~5のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、及び
(b)薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、医薬組成物。 - (a)請求項1~5のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、及び
(b)検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素からなる群より選択される共役部分を含むことを特徴とする、免疫複合体。 - 腫瘍の増殖の阻害における使用のため、または、がん(又は腫瘍)、感染症又は免疫調節疾患の治療における使用のための、請求項1~5のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記がん又は腫瘍は、結直腸がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、食道がん、前立腺がん、腎臓がん、子宮頸部がん、骨髄がん、リンパがん、白血病、甲状腺がん、子宮内膜がん、子宮がん、膀胱がん、神経内分泌がん、頭頸部がん、肝臓がん、鼻咽頭がん、精巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、基底細胞がん、扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、神経膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、と骨髄異形成症候群からなる群より選択されることを特徴とする、請求項12に記載の使用のための二重特異性抗体。
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