KR20230005276A - 인간 클라우딘 및 인간 pd-l1 단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-인간 클라우딘18.2 항체 부분 및 항-PD-L1 항체 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 클라우딘 및 인간 PD-L1 단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체를 개시한다. 상기 이중특이성 항체는 인간 클라우딘18.2 단백질에 결합함과 동시에, PD-1/PD-L1의 결합도 차단할 수 있어, 선천성 면역에서 NK 세포를 활성화하여 종양 세포를 사멸시킬 수 있을 뿐만 아니라, 획득성 면역에서도 종양에 대한 킬러 T 림프구의 사멸 효과를 촉진시킬 수 있다. 상기 이중특이성 항체는 항-클라우딘18.2 항체를 단독으로 사용하는 것보다 더 나은 항종양 효능을 가진다.

Description

인간 클라우딘 및 인간 PD-L1 단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체 및 이의 용도
본 발명은 인간 클라우딘(Claudin) 및 인간 PD-L1 단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체 및 이의 용도에 관한 것이며, 생물의학 분야에 속한다.
이중특이성 항체(BsAbs)는 이중기능성 항체라고도 하며, 두 가지 다른 항원과 에피토프를 동시에 인식하고 결합할 수 있으며, 두 가지 다른 신호 경로를 차단하여 이의 효과를 발휘할 수 있다. BsAb는 일반 항체에 비해 하나의 특이성 항원 결합 부위가 증가되어, 치료에 있어서 하기의 우세를 나타낸다.
종양에 대한 면역 세포의 사멸을 매개한다: 이중특이성 항체의 하나의 중요한 작용 기전은 면역 세포의 사멸을 매개하는 것이며, 이중특이성 항체는 두 개의 항원 결합 암이 있으며, 그 중 하나는 표적 항원과 결합하고, 다른 하나는 효과기 세포의 표지된 항원과 결합하며, 후자는 효과기 세포를 활성화하여, 종양 세포를 표적화 하여 사멸할 수 있다.
이중 표적의 신호 차단은 독특하거나 중복되는 기능을 발휘하여 약물 내성을 효과적으로 방지한다: 동시에 이중 표적과 결합하고, 이중 신호 경로를 차단하는 것은 이중특이성 항체의 또 다른 중요한 작용 기전이다. 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinase, RTK)는 가장 큰 유형의 효소 결합 수용체이며, Her 패밀리와 같이 세포 증식 과정에서 중요한 조절 역할을 한다. RTKs는 종양 세포의 표면에서 비정상적으로 높게 발현되어, 종양 세포의 악성 증식을 유발하므로, 종양 치료의 중요한 표적이기도 하다. RTKs에 대한 단일 표적의 단일 클론 항체는 종양 치료에 널리 사용되고 있지만, 종양 세포는 신호 경로를 전환하거나 HER 패밀리 구성원 자체 또는 다른 구성원 사이의 동종이량체 또는 이종이량체에 의해 세포 내 신호를 활성화하여 면역 탈출을 수행할 수 있다. 따라서 이중특이성 항체 약물을 사용하여 둘 이상의 RKTs 또는 이의 리간드를 동시에 차단하여, 종양 세포의 탈출을 감소시키고, 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
보다 강한 특이성, 표적화성을 가지며 오프 타겟의 독성을 감소시킨다: 이중특이성 항체의 두 개의 항원 결합 암을 사용하여 서로 다른 항원과 특이적으로 결합할 수 있으며, 두 개의 항원 결합 암은 각각 암세포 표면의 두 가지 항원과 결합하여, 암 세포에 대한 항체의 결합 특이성 및 표적화성을 효과적으로 향상시킬 수 있고, 오프 타겟과 같은 부작용을 감소시킬 수 있다.
치료 비용을 효과적으로 절감한다: BiTE를 예로 들면, 기존 항체에 비해 조직 투과율, 종양 세포 사멸 효율, 오프 타겟 비율 및 임상 적응증과 같은 지표에서 비교적 강한 경쟁력을 가지며, 임상적 우세가 유의하다. 특히 사용량에 있어서, 그 치료 효과가 기존 항체의 100 내지 1000배에 달할 수 있어, 최저 사용량이 기존의 1/2000이 될 수 있으므로, 약물 치료 비용을 유의하게 절감할 수 있다. 병용 요법에 비해, 이중특이성 항체의 비용도 두 개의 단일 약물의 병용 요법보다 훨씬 저렴하다.
PD-1(CD279)은 1992년에 처음 보도되었으며, 인간 PD-1 코딩 유전자 PDCD1은 2q37.3에 위치하고, 전체 길이는 2097bp이고, 6개의 엑손으로 구성되며, 번역 산물은 288개의 아미노산으로 구성된 PD-1 전구체 단백질이며, 처음 20개의 아미노산으로 구성된 신호 펩타이드를 절단하여 성숙된 단백질을 수득한다. PD-1은 세포외 면역 글로불린 가변 영역 IgV 구조 도메인, 소수성 막횡단 구조 도메인 및 세포 내 구조 도메인을 포함하며, 세포 내 꼬리 구조 도메인의 N-말단의 ITIM 모티브는 2개의 인산화 부위를 포함하고, C-말단은 하나의 ITSM 모티브이다. PD-1은 CD28 면역 글로불린 슈퍼 패밀리에 속하는 막 단백질이며, 주로 활성화된 T 세포 표면에서 발현되며, 그 외에도 흉선의 CD4-CD8-T 세포, 활성화된 NK 세포 및 단핵구에서도 소량으로 발현된다. PD-1은 B7 단백질 패밀리의 PD-L1(CD274, B7-H1) 및 PD-L2(CD273, B7-DC)의 2개의 리간드를 가지며, PD-L1 및 PD-L2의 아미노산 서열은 40%의 상동성을 가진다. 양자의 차이는 주로 발현 패턴이 다른 것에 있으며, PD-L1은 APCs, 비조혈 세포(예를 들어, 혈관 내피세포, 섬 세포) 및 면역 면제 부위(예를 들어, 태반, 고환 및 눈)에서 구성적으로 낮게 발현되고, I형 및 II형 인터페론, TNF-α 및 VEGF와 같은 염증성 사이토카인은 모두 PD-L1의 발현을 유도할 수 있다. PD-L2는 활성화된 대식세포와 수상세포에서만 발현된다. PD-1과 PD-L1이 활성화된 T 세포에서 결합한 후, PD-1의 ITSM 모티브는 티로신 인산화가 발생하여, 다운스트림 단백질 키나아제 Syk 및 PI3K의 탈인산화를 일으키고, 다운스트림 AKT, ERK와 같은 경로의 활성화를 억제하며, 최종적으로 T 세포 활성화에 필요한 유전자 및 사이토카인의 전사 및 번역을 억제하여, T 세포 활성을 조절하는 데 부정적인 작용을 발휘한다.
종양 세포에서, 종양 세포 및 종양 미세 환경은 PD-L1의 발현을 상향 조절하고 또한 종양 특이적 CD8+T 세포 표면의 PD-1과 결합하여, T 세포 활성을 부정적으로 조절하고, 면역 반응을 억제한다. 종양 세포는 다음과 같은 네 가지 경로를 통해 PD-L1의 발현을 상향 조절할 수 있다: 1. PD-L1을 코딩하는 유전자 증폭(9p24.1); 2. EGFR, MAPK, PI3K-Akt의 신호 경로를 활성화하고, HIF-1 전사 인자 등을 통한 전사 수준에서의 PD-L1의 발현의 상향 조절; 3. EB 바이러스의 유도(EB 바이러스 양성 위암 및 비인두암은 PD-L1의 높은 발현을 나타낸다); 4. 에피제네틱스의 조절. 종양 미세 환경에서의 인터페론-γ와 같은 염증 인자의 자극 역시 PD-L1 및 PD-L2의 발현을 유도할 수 있다. 염증 인자는 종양 미세 환경에서 대식세포, 수지상 세포 및 기질 세포를 포함하는 다른 세포의 PD-L1 및 PD-L2의 발현을 유도할 수 있으며, 종양 항원을 인식할 수 있는 종양 침윤성 T 세포는 인터페론-γ를 분비할 수 있고, 더 나아가 PD-L1의 발현의 상향 조절을 유도할 수 있으며, 상기 과정을 "적응성 면역 저항"이라고 하며, 종양 세포는 상기 메커니즘을 통해 자가 보호를 실현할 수 있다. 종양이 PD-1 의존성 면역 억제를 이용하여 면역을 회피한다는 것을 보여주는 증거가 점점 더 많아지고 있다. PD-L1 및 PD-L2는 다양한 고형 종양 및 혈액계의 악성 종양 종에서 모두 높게 발현되는 것이 발견되고 있다. 또한 식도암, 위암, 신장암, 난소암, 방광암, 췌장암 및 흑생종에서 입증된 바와 같이, PD-Ls의 발현과 종양 세포의 불량한 예후 사이에는 강한 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
지난 수십 년 동안 미국과 많은 선진국에서 위암 발병률과 사망률은 크게 감소하였다. 그러나, 위(GC), 식도 또는 식도 위 접합부 암(GEJ)은, 특히 저소득 및 중간 소득 국가를 포함한 세계적인 주요 건강 문제로 남아 있다. 위암의 세계적 발병률은 광범위한 지리적 차이를 보이고 있으며, 발병률이 높은 지역과 낮은 지역 간의 차이는 15 내지 20배이다. 세계적으로, 2018년에는 103만 건의 위암에 의해 78만 명 이상이 사망한 것으로 추정되며, 위암은 세계에서 다섯 번째로 가장 많이 진단되는 암이고 세 번째의 암 관련 사망 원인이 되었지만 서유럽, 호주 및 북미에서는 위암이 희귀 암 중 하나이다. 2019년 미국에서는 27,510명이 진단되고, 11,140명이 이러한 질환으로 사망한 것으로 추정되며, 미국에서는 15번째로 가장 많이 진단되는 암이고, 15번째로 암 관련 사망 원인이 되고 있다. 위암의 가장 높은 발병률은 동아시아, 남미, 중미, 동유럽에서 발생하며, 그중에서도 동아시아 3개 국(중국, 일본, 한국)에서의 발병률이 특히 높다. 중국에서, 위암은 남성에게 가장 흔한 암이며, 암 관련 사망률의 주요 원인이다. 클라우딘-18A2(클라우딘18.2)는 최근 소화관 종양, 특히 위암의 종양 특이성 항원으로 간주되어 점점 중시되고 있다.
밀착연접(Tight junctions, TJ)은 세포 간 물질 흐름에서 핵심적인 역할을 하며, 막 단백질과 막 지질의 방사상 확산을 차단하여 세포의 극성을 유지하고, 또한 세포의 증식, 분화 및 이동을 조절하는 신호 분자를 모집하는 데 관여한다. 밀착연접은 클라우딘(클라우딘, CLDN)에 의해 형성되며, 클라우딘 패밀리는 20가지 이상의 단백질 분자로 구성되고, 이의 구성원은 모두 하나의 4차 막횡단 구조 도메인과 및 유사한 아미노산 서열을 포함하지만, 조직 분포에는 소정의 특이성을 가진다. CLDN은 세포주위 경로의 선택적 투과 조절에 핵심적인 역할을 하며, CLDN2 및 CLDN15는 양이온 채널 및 양이온 기공의 형성에 관여하고, CLDN4/7/10은 음이온 채널 및 기공의 형성에 관여한다. CLDN 단백질의 차등 발현은 다양한 암과 관련된 것으로 여겨진다. CLDN1 및 CLDN7은 침윤성 유방암, 전립선암 및 식도암에서 하향 조절되는 반면, CLDN3/4는 자궁경부암, 결장암, 식도암, 위암과 같은 다양한 암에서 상이한 정도로 상향 조절되는 것으로 인정되었다. Sahin 등은 정상 조직에서 CLDN18의 isoform 2 서브타입(클라우딘18.2)이 위 점막의 분화 된 후 표피 세포에서만 발현되고, 위 줄기 세포 영역에서는 발현이 나타나지 않았으나, 원발성 위암 및 이의 전이성 병소에서는 모두 비정상적인 높은 발현을 발견하였다. 췌장암, 식도암 및 폐암에서도 클라우딘18.2의 높은 발현이 보고되고 있다. 클라우딘18.2는 세포막 표면에 위치하고 있기 때문에, 이의 생물학적 기능과 특성은 이가 이상적인 치료 표적임을 결정하였으며, 최근 몇 년 동안 상기 표적에 대한 단일 클론 항체도 출시되고 있다.
본 발명은 인간 클라우딘 및 인간 PD-L1 단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 하기의 기술적 해결 수단을 사용한다:
인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1 단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체는:
항-인간 클라우딘18.2 항체 부분 및 항-PD-L1 항체 부분을 포함한다.
또한, 본 발명의 인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1 단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체의 서열은 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65 또는 서열 번호 66으로 표시되는 바와 같다.
또한, 본 발명의 인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1 단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체에 있어서, 상기 항-인간 클라우딘18.2 항체 부분은 인간 클라우딘18.2 단백질의 세포외 영역에 결합되며, 항-인간 클라우딘18.2 항체 부분의 서열은, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33 또는 서열 번호 34로 표시되는 바와 같다.
또한, 본 발명의 인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1 단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체에 있어서, 항-PD-L1 항체의 서열은, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53 또는 서열 번호 54로 표시되는 바와 같다.
암, 감염 또는 면역조절 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의 상기 임의의 이중특이성 항체의 용도이다.
종양 성장을 억제하기 위한 약물의 제조에 있어서의 상기 임의의 이중특이성 항체의 용도이다.
또한, 상기 암 또는 종양은: 결직장, 유방, 난소, 췌장, 위, 식도, 전립선, 신장, 자궁경부, 골수암, 림프암, 백혈병, 갑상선, 자궁내막, 자궁, 방광, 신경내분비, 두경부, 간, 비인두, 고환, 소세포폐암, 비소세포폐암, 흑생종, 기저세포 피부암, 편평세포 피부암, 융기성 피부섬유육종, 메르켈 세포암, 교모세포종, 신경교종, 육종, 중피종 및 골수이형성 증후군으로 이루어진 군 또는 부위에서 선택된다.
구체적으로, 본 발명의 제1 실시 양태에 있어서, 인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체를 제공하며, 상기 이중특이성 항체는:
항-인간 클라우딘18.2 항체 부분 및 항-PD-L1 항체 부분을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 인간 클라우딘18.2에 결합되는 활성을 가지며, 인간 PD-L1 단백질에 결합되는 활성을 더 가진다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 상보성 결정 영역(CDR)은:
서열 번호 93, 75, 79, 83 또는 87로 표시되는 HCDR1,
서열 번호 94, 76, 80, 84 또는 88로 표시되는 HCDR2와
서열 번호 95, 77, 81, 85 또는 89로 표시되는 HCDR3; 및
서열 번호 90 또는 72로 표시되는 LCDR1,
서열 번호 91 또는 73으로 표시되는 LCDR2와
서열 번호 92, 74, 78, 82 또는 86으로 표시되는 LCDR3을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 항-인간 클라우딘18.2 항체의 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR은:
(Z1) 서열 번호 93, 94, 95로 표시되는 HCDR1, HCDR2와 HCDR3; 및 서열 번호 90, 91, 92로 표시되는 LCDR1, LCDR2와 LCDR3;
(Z2) 서열 번호 75, 76, 77로 표시되는 HCDR1, HCDR2와 HCDR3; 및 서열 번호 72, 73, 74로 표시되는 LCDR1, LCDR2와 LCDR3;
(Z3) 서열 번호 79, 80, 81로 표시되는 HCDR1, HCDR2와 HCDR3; 및 서열 번호 72, 73, 78로 표시되는 LCDR1, LCDR2와 LCDR3;
(Z4) 서열 번호 83, 84, 85로 표시되는 HCDR1, HCDR2와 HCDR3; 및 서열 번호 72, 73, 82로 표시되는 LCDR1, LCDR2와 LCDR3;
(Z5) 서열 번호 87, 88, 89로 표시되는 HCDR1, HCDR2와 HCDR3; 및 서열 번호 72, 73, 86으로 표시되는 LCDR1, LCDR2와 LCDR3으로 이루어진 군에서 선택된다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 상보성 결정 영역(CDR)은: 서열 번호 93으로 표시되는 HCDR1, 서열 번호 94로 표시되는 HCDR2와 서열 번호 95로 표시되는 HCDR3, 및 서열 번호 90으로 표시되는 LCDR1, 서열 번호 91로 표시되는 LCDR2와 서열 번호 92로 표시되는 LCDR3을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 단일 도메인 항체이다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 단일 도메인 항체의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)은: 서열 번호 69로 표시되는 HCDR1, 서열 번호 70 또는 96으로 표시되는 HCDR2와 서열 번호 71로 표시되는 HCDR3을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 단일 도메인 항체의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)은: 서열 번호 69로 표시되는 HCDR1, 서열 번호 70으로 표시되는 HCDR2와 서열 번호 71로 표시되는 HCDR3을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 단일 도메인 항체의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)은: 서열 번호 69로 표시되는 HCDR1, 서열 번호 96으로 표시되는 HCDR2와 서열 번호 71로 표시되는 HCDR3을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 2개의 단량체로 구성된 이량체이고, 상기 단량체는 N-말단에서 C-말단까지 식 I로 표시되는 구조를 가지며:
Figure pct00001
상기 식에서,
L1, L2 및 L3은 각각 독립적으로 결합 또는 연결요소이고;
VH는 항-인간 클라우딘18.2 항체의 중쇄 가변 영역을 나타내고;
VL은 항-인간 클라우딘18.2 항체의 경쇄 가변 영역을 나타내고;
CH는 항-인간 클라우딘18.2 항체의 중쇄 불변 영역을 나타내고;
CL은 항-인간 클라우딘18.2 항체의 경쇄 불변 영역을 나타내고;
VHH는 항-PD-L1 단일 도메인 항체를 나타내며;
"-"는 펩타이드 결합을 나타내고;
"~"는 이황화 결합 또는 공유 결합을 나타낸다. 또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 L1 및 L3은 각각 결합(예를 들어 펩타이드 결합)이다. 또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 중쇄 가변 영역(VH)은, 서열 번호 93, 75, 79, 83 또는 87로 표시되는 HCDR1, 서열 번호 94, 76, 80, 84 또는 88로 표시되는 HCDR2와 서열 번호 95, 77, 81, 85 또는 89로 표시되는 HCDR3을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 인간화 FR 영역을 더 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열은, 서열 번호 31, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 32, 서열 번호 33 또는 서열 번호 34로 표시되는 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 경쇄 가변 영역(VL)은, 서열 번호 90 또는 72로 표시되는 LCDR1, 서열 번호 91 또는 73으로 표시되는 LCDR2와 서열 번호 92, 74, 78, 82 또는 86으로 표시되는 LCDR3을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 인간화 FR 영역도 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열은, 서열 번호 29, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 28 또는 서열 번호 30으로 표시되는 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 중쇄 불변 영역(CH)은 인간 유래 또는 마우스 유래이다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 경쇄 불변 영역(CL)은 인간 유래 또는 마우스 유래이다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체(VHH)는 서열 번호 69로 표시되는 HCDR1, 서열 번호 70으로 표시되는 HCDR2와 서열 번호 71로 표시되는 HCDR3을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체(VHH)는 서열 번호 69로 표시되는 HCDR1, 서열 번호 96으로 표시되는 HCDR2와 서열 번호 71로 표시되는 HCDR3을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체(VHH)는 인간화 FR 영역도 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체(VHH)의 아미노산 서열은, 서열 번호 51, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 53 또는 서열 번호 54로 표시되는 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 이중특이성 항체의 VL의 아미노산 서열은 서열 번호 29로 표시되는 바와 같고, VH의 아미노산 서열은 서열 번호 31로 표시되는 바와 같으며, 항-PD-L1 단일 도메인 항체(VHH)의 아미노산 서열은 서열 번호 51로 표시되는 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 이중특이성 항체의 VL의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 표시되는 바와 같고, VH의 아미노산 서열은 서열 번호 5로 표시되는 바와 같으며, 항-PD-L1 단일 도메인 항체(VHH)의 아미노산 서열은 서열 번호 51로 표시되는 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 이중특이성 항체의 VL의 아미노산 서열은 서열 번호 16으로 표시되는 바와 같고, VH의 아미노산 서열은 서열 번호 17로 표시되는 바와 같으며, 항-PD-L1 단일 도메인 항체(VHH)의 아미노산 서열은 서열 번호 51로 표시되는 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 이중특이성 항체의 VL의 아미노산 서열은 서열 번호 8로 표시되는 바와 같고, VH의 아미노산 서열은 서열 번호 13으로 표시되는 바와 같으며, 항-PD-L1 단일 도메인 항체(VHH)의 아미노산 서열은 서열 번호 51로 표시되는 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 이중특이성 항체의 VL의 아미노산 서열은 서열 번호 21로 표시되는 바와 같고, VH의 아미노산 서열은 서열 번호 26으로 표시되는 바와 같고, 및 항-PD-L1 단일 도메인 항체(VHH)의 아미노산 서열은 서열 번호 51로 표시되는 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 이중특이성 항체의 L쇄(VL-L3-CL)의 아미노산 서열은, 서열 번호 63, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 또는 서열 번호 65로 표시되는 바와 같으며; 상기 이중특이성 항체의 H쇄(VH-L1-CH-L2-VHH)의 아미노산 서열은, 서열 번호 64, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 또는 서열 번호 66으로 표시되는 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 이중특이성 항체의 L쇄(VL-L3-CL)의 아미노산 서열은 서열 번호 63으로 표시되는 바와 같으며, H쇄(VH-L1-CH-L2-VHH)의 아미노산 서열은 서열 번호 64로 표시되는 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 이중특이성 항체의 L쇄(VL-L3-CL)의 아미노산 서열은 서열 번호 59로 표시되는 바와 같으며, H쇄(VH-L1-CH-L2-VHH)의 아미노산 서열은 서열 번호 60으로 표시되는 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 이중특이성 항체의 L쇄(VL-L3-CL)의 아미노산 서열은 서열 번호 61로 표시되는 바와 같으며, H쇄(VH-L1-CH-L2-VHH)의 아미노산 서열은 서열 번호 62로 표시되는 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 이중특이성 항체의 L쇄(VL-L3-CL)의 아미노산 서열은 서열 번호 65로 표시되는 바와 같으며, H쇄(VH-L1-CH-L2-VHH)의 아미노산 서열은 서열 번호 66으로 표시되는 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 부분적으로 또는 완전히 인간화된 항체이다.
본 발명의 제2 실시 양태에 있어서, 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 제1 실시 양태의 이중특이성 항체를 코딩한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 cDNA를 포함한다.
본 발명의 제3 실시 양태에 있어서, 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 본 발명의 제2 실시 양태의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터에서 선택된다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 발현 벡터는 세균성 플라스미드, 파지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 아데노 바이러스와 같은 포유동물 세포 바이러스, 아데노 관련 바이러스 AAV, 레트로 바이러스, 또는 다른 벡터를 포함한다.
본 발명의 제4 실시 양태에 있어서, 유전자 조작된 숙주 세포를 제공하며, 상기 숙주 세포는 본 발명의 제3 실시 양태에서 서술한 벡터를 포함하거나, 게놈에 본 발명의 제2 실시 양태에서 서술한 폴리뉴클레오티드가 통합되어 있다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 숙주 세포는 대장균, 효모 세포 및 포유동물 세포로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 제5 실시 양태에 있어서, 본 발명의 제1 실시 양태의 이중특이성 항체의 제조 방법을 제공하며,
(i) 본 발명의 제4 실시 양태에 있어서, 숙주 세포를 적합한 조건 하에 배양하여, 본 발명의 제1 실시 양태의 이중특이성 항체를 함유하는 혼합물을 수득하는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 수득한 혼합물을 정제 및/또는 분리하여, 상기 이중특이성 항체를 수득하는 단계;
를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 정제는 단백질 A 친화성 컬럼으로 정제하고 분리하여 표적 항체를 수득할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 정제하고 분리한 후의 표적 항체의 순도는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이며, 바람직하게는 100%이다.
본 발명의 제6 실시 양태에 있어서, 약학 조성물을 제공하며, 상기 약학 조성물은:
(a) 본 발명의 제1 실시 양태의 이중특이성 항체 또는 제7 실시 양태의 접합체; 및
(b) 약학적으로 허용 가능한 담체;
를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 약학 조성물은 화학요법 약물과 같은 암(또는 종양)을 치료하기 위한 다른 약물을 더 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 약학 조성물은 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 차단하는 동시에, 클라우딘18.2 단백질과 결합하는 데 사용된다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 약학 조성물은 클라우딘18.2 단백질을 발현(즉, 클라우딘18.2를 양성)하는 암(또는 종양)을 치료하는 데 사용된다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 약학 조성물은 주사용 제형이다.
본 발명의 제7 실시 양태에 있어서, 면역접합체를 제공하며, 상기 면역접합체는:
(a) 본 발명의 제1 실시 양태의 이중특이성 항체; 및
(b) 검출 가능한 마커, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 또는 효소로 이루어진 군에서 선택되는 접합 부분:
을 포함한다.
본 발명의 제8 실시 양태에 있어서, 암(또는 종양), 감염 또는 면역조절 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의 본 발명의 제1 실시 양태의 이중특이성 항체의 용도를 제공한다.
본 발명의 제9 실시 양태에 있어서, 종양 성장을 억제하기 위한 약물의 제조에 있어서의 본 발명의 제1 실시 양태의 이중특이성 항체의 용도를 제공한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 상기 암 또는 종양은, 결직장암, 유선암, 난소암, 췌장암, 위암, 식도암, 전립선암, 신장암, 자궁경부암, 골수암, 림프암, 백혈병, 갑상선암, 자궁내막암, 자궁암, 방광암, 신경내분비암, 두경부암, 간암, 비인두암, 고환암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 흑생종, 기저세포 피부암, 편평세포 피부암, 융기성 피부섬유육종, 메르켈 세포암, 교모세포종, 신경교종, 육종, 중피종 및 골수이형성 증후군으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 주요 유익한 효과는 하기와 같다: 본 발명은 클라우딘18.2 및 PD-L1을 동시에 표적으로 하는 이중특이성 항체를 제공하며, 상기 이중특이성 항체 분자는 클라우딘18.2 및 PD-L1을 높은 효율로 표적화 할 수 있다. 본 발명은 클라우딘18.2를 발현하는 종양의 치료 효과를 향상시킬 수 있다. 상기 이중특이성 항체는 인간 클라우딘18.2 단백질과 결합하는 동시에, PD-1/PD-L1의 결합을 차단할 수 있어, 선천성 면역에서 NK 세포를 활성화하여 종양 세포를 사멸시킬 수 있을 뿐만 아니라, 획득성 면역에서 종양에 대한 킬러 T 림프구의 사멸 효과를 촉진할 수 있어 상승적인 종양 사멸 효과를 가진다. 상기 이중특이성 항체는 항-클라우딘18.2 항체를 단독으로 사용하는 것보다 더 나은 항종양 효과를 가진다.
도 1은 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체 분자의 구조 개략도를 나타낸다.
도 2는 ELISA를 사용하여 확인한 제1군 인간화 클라우딘18.2 항체의 활성 결과를 나타낸다.
도 3은 ELISA를 사용하여 확인한 제2군 인간화 클라우딘18.2 항체의 활성 결과를 나타낸다.
도 4는 ELISA를 사용하여 확인한 제3군 인간화 클라우딘18.2 항체의 활성 결과를 나타낸다.
도 5는 ELISA를 사용하여 확인한 제4군 인간화 클라우딘18.2 항체의 활성 결과를 나타낸다.
도 6은 ELISA를 사용하여 확인한 제5군 인간화 클라우딘18.2 항체의 활성 결과를 나타낸다.
도 7은 FACS를 사용하여 확인한 제1군 인간화 클라우딘18.2 항체의 활성 결과를 나타낸다.
도 8은 FACS를 사용하여 확인한 제2군 인간화 클라우딘18.2 항체의 활성 결과를 나타낸다.
도 9는 FACS를 사용하여 확인한 제3군 인간화 클라우딘18.2 항체의 활성 결과를 나타낸다.
도 10은 FACS를 사용하여 확인한 제4군 인간화 클라우딘18.2 항체의 활성 결과를 나타낸다.
도 11은 FACS를 사용하여 확인한 제5군 인간화 클라우딘18.2 항체의 활성 결과를 나타낸다.
도 12는 인간화 클라우딘18.2 항체의 ADCC 결과를 나타낸다.
도 13은 인간화 클라우딘18.2 항체의 CDC 결과를 나타낸다.
도 14는 면역 결핍 마우스 CB.17-SCID 모델에서의 인간화 클라우딘18.2 항체의 생체 내 효능 결과를 나타낸다.
도 15는 인간화 항-PD-L1 단일 도메인 항체의 결합 활성을 확인한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 16은 인간화 항-PD-L1 단일 도메인 항체의 차단 활성을 확인한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 17은 제1 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 발현 및 정제 결과를 나타낸다.
도 18은 제2 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 발현 및 정제 결과를 나타낸다.
도 19는 제3 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 발현 및 정제 결과를 나타낸다.
도 20은 제4 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 발현 및 정제 결과를 나타낸다.
도 21은 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 결합 활성을 확인한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 22는 PD-L1/PD-1에 대한 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 차단 활성의 ELISA 결과를 나타낸다.
도 23은 PD-L1/CD80에 대한 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 차단 활성의 ELISA 결과를 나타낸다.
도 24는 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 CLDN18.2 결합 활성의 ELISA 결과를 나타낸다.
도 25는 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체 PD-L1 기능적 활성의 검정(혼합 림프구 반응 MLR에서의 후보 분자 CHO14에 의한 T 세포 활성화 후 생성되는 사이토카인 IFNγ의 농도 의존적 결과)을 나타낸다.
도 26은 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체 PD-L1 기능적 활성의 검정(혼합 림프구 반응 MLR에서의 후보 분자 CHO14에 의한 T 세포 활성화 후 생성되는 사이토카인 IL-2의 농도 의존적 결과)을 나타낸다.
도 27은 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체 PBMC가 매개하는 세포 사멸 실험의 결과를 나타낸다.
도 28은 면역 표적 인간화 형질전환 마우스 C57BL/6-hPDL1 모델 MC38-hPDL1-m클라우딘18.2에서의 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 생체 내 약력학적 평가 결과를 나타낸다.
도 29는 면역계 인간화 마우스 PBMC 이식-NCG모델 HCC827-h클라우딘18.2에서 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 생체 내 약력학적 평가 결과를 나타낸다.
도 30은 C57BL/6 모델 MC38-hPDL1-m클라우딘18.2에서의 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 생체 내 시너지 약력학적 평가를 나타낸다.
도 31은 C57BL/6 모델 MC38-hPDL1-m클라우딘18.2에서의 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 생체 내 시너지 약력학적 평가를 나타낸다.
본 발명자들은 광범위하고 심도 깊은 연구하에, 다량의 스크리닝을 통해, 높은 특이성 및 높은 친화성을 가지는 항-CLDN18.2 항체 및 항-PD-L1 단일 도메인 항체를 수득하였고, 이에 기초하여 인간화 및 유전자 재조합을 수행하여 인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1을 동시에 표적으로 하는 이중특이성 항체를 수득하였다. 체외 실험은 본 발명의 이중특이성 항체가 인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 클라우딘18.2를 재조합하여 발현하며, PD-L1을 자연 발현하는 인간 폐암세포를 사멸시킬 수 있음을 증명하였다. 생체 내 약력학적 실험은 본 발명의 이중특이성 항체가 시너지 효과를 가지며, 인간화된 마우스 모델에서 클라우딘18.2 단일 항체 및 PD-L1 단일 항체보다 우수한 항종양 활성을 나타낸다는 것을 증명하였다. 이에 기초하여, 본 발명이 완성되었다.
용어
본 개시를 보다 용이하게 이해하기 위하여, 우선 몇 가지 용어를 정의한다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, 하기의 용어 각각은 다음과 같은 의미를 가진다. 다른 정의는 출원 전체에서 설명된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "본 발명의 이중특이성 항체", "본 발명의 이중 항체", "항-클라우딘18.2/PD-L1 이중특이성 항체”는 동일한 의미를 가지며, 모두 클라우딘18.2 및 PD-L1을 특이적으로 인식하고 결합하는 이중특이성 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 또는 "면역 글로불린"은 동일한 구조적 특징을 가지는 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이며, 이는 두 개의 동일한 경쇄(L) 및 두 개의 동일한 중쇄(H)로 구성된다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합을 통해 중쇄와 연결되며, 서로 다른 면역 글로불린 동형의 중쇄 사이의 이황화 결합의 수는 다르다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적인 간격을 둔 사슬 내 이황화 결합도 가진다. 경쇄에는 λ(l) 및 κ(k)의 두 가지 유형이 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 주요 중쇄에는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 다섯 가지 유형 (또는 동형)이 존재한다. 매개 종류의 사슬은 서로 다른 서열 구조 도메인을 포함한다. 경쇄는 가변 구조 도메인(VL) 및 불변 구조 도메인(CL)의 두 개의 구조 도메인 또는 영역을 포함한다. 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 세 개의 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3, 총칭하여 CH로 불린다)의 네 개의 구조 도메인을 포함한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)의 가변 영역은 모두 항원에 대한 결합 인식 및 특이성을 결정한다. 경쇄의 불변 구조 영역(CL)과 중쇄의 불변 영역(CH)은 항체 사슬의 결합, 분비, 태반의 이동성, 보체 결합 및 Fc 수용체(FcR)의 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. Fv 단편은 면역 글로불린 Fab 단편의 N-말단 부분이며 하나의 경쇄와 하나의 중쇄의 가변 부분으로 구성된다. 항체의 특이성은 항체 결합 부위와 항원 결정 영역 간의 구조적 상보성에 의하여 결정된다. 항체 결합 부위는 주로 고도 가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기로 구성된다. 때때로, 비고도 가변 또는 프레임 워크 영역(FR)의 잔기는 전체 도메인의 구조에 영향을 미치고 더 나아가 결합 부위에 영향을 미친다. 상보성 결정 영역 또는 CDR은 결합 친화성 및 천연 면역 글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 특이성을 공동으로 한정하는 아미노산 서열을 지칭한다. 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 세 개의 CDR을 가지며, 각각 LCDR1(CDR1-L), LCDR2(CDR2-L), LCDR3(CDR3-L) 및 HCDR1(CDR1-H), HCDR2(CDR2-H)로 불린다. 따라서 통상적인 항체-항원 결합 부위는 각각의 중쇄 및 경쇄 v영역으로부터의 CDR 집합을 포함하는 여섯 개의 CDR을 포함한다
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단일 도메인 항체", "VHH", "나노 항체”는 동일한 의미를 가지며, 항체의 중쇄를 클로닝하는 가변 영역을 지칭하고, 하나의 중쇄 가변 영역만으로 구성된 나노 항체(VHH)를 구축하며, 이는 완전한 기능을 가진 가장 작은 항원 결합 단편이다. 통상적으로 먼저 경쇄 및 중쇄 불변 영역 1(CH1)이 자연적으로 결실된 항체를 수득한 후, 항체 중쇄의 가변 영역을 클로닝하여, 하나의 중쇄 가변 영역만으로 구성된 나노 항체(VHH)를 구축한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가변"은 항체에서 가변 영역의 소정 부분이 서열 상에서 상이하다는 것을 나타내며, 이의 특정 항원에 대한 다양한 특정 항체의 결합 및 특이성을 형성한다. 그러나, 가변성은 항체 가변 영역 전체에 불균일하게 분포되어 있다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역으로 불리는 3개의 단편에 집중되어 있다. 가변 영역에서 상대적으로 보수적인 부분을 프레임 워크 영역(FR)이라 부른다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 네 개의 FR 영역을 포함하며, 이들은 대체로 β-폴드 구조 형태를 취하고, 연결 고리를 형성하는 세 개의 CDR에 의해 연결되며, 일부 상황에 따라 부분적으로 β-폴드 구조를 형성할 수 있다. 각 사슬의 CDR은 FR 영역을 통해 함께 밀접하게 붙어 있고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성한다(Kabat et al., NIH Publ. No. 91 내지 3242, 권 I, 제647 내지 669 페이지(1991)를 참조). 불변 영역은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 이들은 예를 들어 항체의 항체 의존적 세포 독성에 관여하는 등 상이한 이펙터 기능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프레임 워크 영역"(FR)은 CDR 사이에 삽입된 아미노산 서열을 지칭하며, 즉 단일 종의 상이한 면역 글로불린 중 상대적으로 보존된 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 부분을 지칭한다. 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 네 개의 FR을 가지며, 각각 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L 및 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H로 불린다. 따라서, 경쇄 가변 구조 도메인은 (FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)로 지칭될 수 있으며 중쇄 가변 구조 도메인은 (FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)로 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 FR은 인간 항체 FR 또는 이의 유도체이며, 상기 인간 항체 FR의 유도체는 자연적으로 존재하는 인간 항체 FR과 실질적으로 동일하며, 즉 서열 동일성이 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%에 도달한다.
CDR의 아미노산 서열을 알면, 당업자는 프레임 워크 영역 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L 및/또는 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H를 용이하게 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 표적 항원에 결합될 수 있는 비인간 항체에서 유도된 항체 분자이며, 상기 표적 항원은 비인간 유래의 하나 또는 여러개의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역 글로불린 분자 유래의 프레임 워크 영역을 가지고 있다. 통상적으로 인간 프레임 워크 영역의 프레임 워크 잔기는 CDR 공여체 유래의 상응하는 잔기에 의해 치환되어, 항원의 결합을 변화시키고, 바람직하게는 개선시킬 수 있다. 이러한 프레임 워크의 치환은 본 분야의 공지된 방법에 의해 확인할 수 있으며, 예를 들어, CDR과 프레임 워크 잔기의 상호작용을 시뮬레이션하여, 항원 결합에 중요한 역할을 하는 프레임 워크 잔기를 확인할 수 있고, 서열 비교를 통해 특정 위치에서의 비정상적인 프레임 워크 잔기를 확인할 수 있다. 항체의 인간화는 본 분야의 공지된 다양한 기술을 사용할 수 있으며, 예를 들어, CDR 이식(EP 239,400, PCT 공개 WO91/09967, 미국 특허 번호 5,225,539, 5,530,101 및 5,585,089), 축성 또는 리모델링(EP 592,106, EP 519,596, Padlan,Molecular Immunology28(4/5): 489 내지 498(1991), Studnicka 등, Protein Engineering 7(6): 805 내지 814(1994), Roguska. 등, Proc.Natl.Sci.USA 91: 969 내지 973(1994)), 및 사슬 치환(U.S.Pat.No.5,565,332)이며, 이의 전체 내용은 인용에 의해 본 명세서에 편입된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 프레임 워크 영역"은 자연적으로 존재하는 인간 항체의 프레임 워크 영역과 실질적으로 동일한(약 85% 또는 이상이고, 구체적으로 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 동일성이다) 프레임 워크 영역이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "링커"는 경쇄 및 중쇄의 구조 도메인이 교환된 이중 가변 영역을 가지는 면역 글로불린으로 접힐 수 있는 충분한 이동성을 제공하기 위해 면역 글로불린 구조 도메인에 삽입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다.
본 발명은 완전한 항체뿐만 아니라, 면역 활성을 가지는 항체의 단편 또는 항체가 다른 서열과 형성한 융합 단백질도 포함한다. 따라서, 본 발명은 상기 항체의 단편, 유도체 및 유사체를 더 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단편", "유도체", "유사체"는 본 발명의 항체와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 유지하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 발명의 폴리펩타이드 단편, 유도체 또는 유사체는, (i) 하나 이상의 보존성 또는 비보존성 아미노산 잔기(바람직하게는 보존성 아미노산 잔기이다)가 치환된 폴리펩타이드일 수 있고, 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩되거나 코딩되지 않을 수 있으며, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에 치환기를 가지는 폴리펩타이드일 수 있고, 또는 (iii) 성숙된 폴리펩타이드와 다른 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리펩타이드의 반감기를 연장시키는 화합물)이 융합하여 형성되는 폴리펩타이드일 수 있고, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열이 상기 폴리펩타이드 서열에 융합되어 형성되는 폴리펩타이드(예를 들어, 리더 서열 또는 분비 서열 또는 해당 폴리펩타이드를 정제하는데 사용되는 서열 또는 단백질원 서열, 또는 6His 태그와 형성되는 융합 단백질)일 수 있다. 본 명세서의 교시에 따르면, 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 당업자의 공지의 범위에 속한다.
본 발명의 항체는 클라우딘18.2 및 PD-L1 단백질과 결합하는 활성을 가지는 이중 항체를 지칭한다. 상기 용어는 또한 본 발명의 항체와 동일한 기능을 가지며, 동일한 CDR 영역을 함유하는 폴리펩타이드의 변이 형태를 포함한다. 이러한 변이 형태는: 하나 또는 복수(일반적으로 1 내지 50개, 보다 바람직하게는 1 내지 30개, 더욱 바람직하게는 1 내지 20개, 가장 바람직하게는 1 내지 10개)의 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환, 및 C-말단 및/또는 N-말단에 하나 또는 복수(통상적으로 20개 이내, 보다 바람직하게는 10개 이내, 더욱 바람직하게는 5개 이내)의 아미노산의 첨가를 포함한다(단, 이에 한정되지 않는다). 예를 들어, 당업계에서 비슷하거나 유사한 성능의 아미노산으로 치환하는 경우, 일반적으로 단백질의 기능은 변경되지 않는다. 또 예를 들어, C-말단 및/또는 N-말단에 하나 또는 복수의 아미노산을 첨가하는 것도 통상적으로 단백질의 기능을 변경시키지 않는다.
상기 폴리펩타이드의 변이 형태는, 상동 서열, 보존성 변이체, 대립 유전자 변이체, 천연 돌연변이체, 유도된 돌연변이체, 높거나 낮은 엄밀한 조건 하에 본 발명의 항체의 코딩 DNA와 혼성화할 수 있는 DNA에 의해 코딩되는 단백질, 및 본 발명의 항체의 항혈청을 이용하여 수득한 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함한다.
여기서, “보존성 변이체"는 본 발명의 항체의 아미노산 서열과 비교하여, 최대 10개, 보다 바람직하게는 최대 8개, 더욱 바람직하게는 최대 5개, 가장 바람직하게는 최대 3개의 아미노산이 유사하거나 비슷한 특성을 가지는 아미노산으로 치환되어 폴리펩타이드를 형성하는 것을 지칭한다(특히, 프레임 워크 영역이 유사하거나 비슷한 특성을 가지는 아미노산으로 치환되어 폴리펩타이드를 형성한다). 이러한 보존성 변이체 폴리펩타이드는 표 A에 따른 아미노산 치환에 의하여 제조되는 것이 바람직하다.
Figure pct00002
본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 단편 또는 이의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 형태 또는 RNA 형태일 수 있다. DNA 형태는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인공적으로 합성된 DNA를 포함한다. DNA는 단쇄 또는 이중 쇄일 수 있다. DNA는 코딩 사슬 또는 비코딩 사슬 일 수 있다.
본 발명의 성숙된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 성숙된 폴리펩타이드만을 코딩하는 코딩 서열, 성숙된 폴리펩타이드의 코딩 서열 및 다양한 추가 코딩 서열, 성숙된 폴리펩타이드의 코딩 서열(및 임의로 선택되는 추가 코딩 서열) 및 비코딩 서열을 포함한다.
용어 "폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 추가 코딩 및/또는 비코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 서열과 혼성화하고, 두 개의 서열 사이에 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건 하에 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드와 혼성화 될 수 있는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, “엄격한 조건”은: (1) 비교적 낮은 이온 강도 및 비교적 높은 온도 하에 혼성화 및 용출, 예를 들어 0.2×SSC, 0.1%의 SDS, 60℃이고; 또는 (2) 혼성화 시 변성제를 가하는 것, 예를 들어 50%(v/v)의 포름 아미드, 0.1%의 소 태아 혈청/0.1%의 Ficoll, 42℃ 등이며; 또는 (3) 혼성화가 두 서열 사이의 상동성이 적어도 90% 이상이고, 바람직하게는 95% 이상인 경우에만 발생하는 것을 지칭한다. 또한, 혼성화 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드는 성숙한 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 기능 및 활성을 가진다.
본 발명의 항체의 뉴클레오티드 전장 서열 또는 이의 단편은 통상적으로 PCR 증폭 방법, 재조합 방법 또는 인공 합성 방법으로 수득할 수 있다. 실행 가능한 방법 중 하나는, 특히 단편의 길이가 짧은 경우 인공적으로 합성하는 방법에 의해 관련 서열을 합성한다. 통상적으로, 먼저 다수 개의 작은 단편을 합성한 후, 다시 연결하여 매우 긴 서열의 단편을 수득할 수 있다. 또한, 중쇄의 코딩 서열 및 발현 태그(예를 들어, 6His)를 함께 융합시켜, 융합 단백질을 형성할 수 있다.
관련 서열이 수득되면, 재조합 방법을 사용하여 관련 서열을 대량으로 수득할 수 있다. 이는 통상적으로 벡터에 이를 클로닝하고, 다시 세포에 옮긴 후, 통상적인 방법으로 증식된 후의 숙주 세포로부터 분리하여 관련 서열을 수득한다. 본 발명에 따른 생체 분자(핵산, 단백질 등)는 분리된 형태로 존재하는 생체 분자를 포함한다.
현재, 본 발명의 단백질(또는 이의 단편, 또는 이의 유도체)을 코딩하는 DNA 서열은 완전히 화학적 합성에 의해 수득할 수 있다. 그 다음 상기 DNA 서열을 당업계에 공지된 다양한 기존의 DNA 분자(또는 예를 들어 벡터) 및 세포에 도입할 수 있다. 또한, 돌연변이는 화학적 합성을 통해 본 발명의 단백질 서열에 도입할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 적절한 DNA 서열 및 적절한 프로모터 또는 제어 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 단백질을 발현할 수 있도록 적절한 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용될 수 있다.
숙주 세포는 세균 세포와 같은 원핵 세포; 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포 또는 포유동물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 대표적인 예로는 대장균, 스트렙토미세스(Streptomyces); 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 세균 세포; 효모와 같은 진균 세포; 초파리 S2 또는 Sf9의 곤충 세포; CHO, COS7, 293 세포의 동물 세포 등이 있다.
재조합 DNA에 의한 숙주 세포의 형질전환은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 숙주가 대장균과 같은 원핵생물인 경우, DNA를 흡수할 수 있는 수용성 세포는 지수 성장기 후에 수득할 수 있고, CaCl2 방법으로 처리하며, 사용되는 단계는 당업계에 잘 알려져 있는 것이다. 또 다른 방법은 MgCl2를 사용하는 것이다. 필요에 따라, 전기 천공법에 의해 형질전환을 수행할 수도 있다. 숙주가 진핵생물인 경우, DNA 형질감염 방법은, 인산칼슘 공침법, 및 마이크로 주사, 전기 천공법, 리포솜 포장 등과 같은 통상적인 기계적 방법을 선택할 수 있다.
수득된 형질전환체는 통상적인 방법으로 배양하여, 본 발명의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 배양에 사용되는 배지는 다양한 통상적인 배지에서 선택할 수 있다. 숙주 세포의 성장에 적합한 조건 하에 배양한다. 숙주 세포가 적절한 세포 밀도로 성장한 후, 적합한 방법(예를 들어 온도 전환 또는 화학적 유도)으로 선택된 프로모터를 유도하고, 세포를 일정 기간 동안 더 배양하였다.
상기 방법 중의 재조합 폴리펩타이드는 세포 내, 또는 세포막 상에서 발현되거나, 또는 세포 외로 분비될 수 있다. 수요에 따라, 재조합 단백질은 이의 물리적, 화학적 및 기타 특성을 이용한 다양한 분리 방법을 통해 분리하고 정제할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법의 예로는, 통상적인 복원 처리, 단백질 침전제 처리(염석법), 원심분리, 삼투를 통한 균 파괴, 초처리, 초원심분리, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 기타 다양한 액체 크로마토그래피 기술 및 이러한 방법의 결합이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 단독으로 사용될 수 있고, 또한 검출 가능한 마커(진단 목적), 치료제, PK(단백질 키나아제) 변형된 부분 또는 상기 임의의 물질의 조합에 결합 또는 커플링될 수 있다.
진단을 목적으로 하는 검출 가능한 마커는, 형광 또는 발광 마커, 방사성 마커, MRI(핵자기 공명 영상) 또는 CT(컴퓨터 X선 단층 촬영 기술) 조영제 또는 검출 가능한 생성물을 생산할 수 있는 효소를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체에 결합되거나 커플링될 수 있는 치료제에는, 1. 방사성 핵종; 2. 생물학적 바이러스; 3. Il-2와 같은 사이토카인; 4. 금 나노 입자/나노 로드; 5. 바이러스 입자; 6. 리포솜; 7. 나노 자성 입자; 8. 전구 약물 활성화 효소(예를 들어, DT-디아포라제(DTD) 또는 비페닐 가수분해 효소-유사 단백질(BPHL)); 9. 화학 요법제(예를 들어, 시스플라틴) 또는 임의의 형태의 나노 입자 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 면역접합체 및 융합 발현 생성물은 약물, 독소, 사이토카인(cytokine), 방사성 핵종, 효소 및 기타 진단 또는 치료 분자를 본 발명의 항체 또는 이의 단편과 결합시켜 형성된 접합체를 포함한다.
본 발명의 이중특이성 항체
본 발명은 인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1 단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체를 제공하며, 이는 항-인간 클라우딘18.2 항체 부분 및 항-PD-L1 항체 부분을 포함한다.
(1) 항-인간 클라우딘18.2 항체 부분
본 발명의 이중특이성 항체의 항-인간 클라우딘18.2 항체 부분은 마우스 유래의 항-클라우딘18.2 항체를 인간화 변형시켜 수득한 것이다. IMGT 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식계 유전자 데이터베이스와 MOE 소프트웨어를 비교하여, 각각 QP190191, QP192193, QP199200, QP201202, QP207208과 상동성이 높은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식계 유전자를 주형으로 선택하고, 마우스 유래 항체의 CDR을 대응하는 인간화 주형에 각각 이식하여, 순서가 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4인 가변 영역 서열을 형성하였다. 일부 중요한 아미노산 잔기를 더 선택하여 역 돌연변이 조합을 수행하였다.
상기 마우스 유래의 항-클라우딘18.2 항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 각각 하기의 아미노산 서열을 가지며, CDR은 서열 중 밑줄 그은 부분에 표시되는 바와 같다.
>QD208 서열 번호 46
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYIMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTVYMELSSLTSEDSAVYCCARLGFTTRNAMDYWGQGTSVTVSS
>QP191 서열 번호 38
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVASIISGGRTYYLDSEKGRFTISRDNARNNLYLQMSSLRSEDTAMYYCTRIYYGNSFDYWGQGTTLTVSS
>QD193 서열 번호 40
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGNGDTTYNGKFKGQATLTADKSSSTVYMQLSSLTSEDSAVYFCARFVKGNAMDYWGQGTSVTVSS
>QD200 서열 번호 42
DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSNSIYYVDTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLKSEDTAMYYCARNAYYGNSFDYWGQGTTLTVSS
>QD202 서열 번호 44
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYFVHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDDTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMDLSSLTSEDSAVYYCLSLRFFAYWGQGTLVTVSA
상기 마우스 유래의 항-클라우딘18.2 항체의 경쇄 가변 영역은 각각 하기의 아미노산 서열을 가지며, CDR은 서열 중 밑줄 그은 부분에 표시되는 바와 같다.
>QD207 서열 번호 45
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPFTFGSGTKLEIK
>QD190 서열 번호 37
DIVMTQSPSSQTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIK
>QD192 서열 번호 39
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQNPGQPPKMLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGIDFSLTISSVQAEDLALYYCQNAYSYPFTFGSGTKLEIK
>QD199 서열 번호 41
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTVFTLTISSVQAEDLAVYFCQNNYYYPLTFGAGTKLELK
>QD201 서열 번호 43
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQAPKLLIYWASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISHVQAEDLAVYFCQNDYSYPLTFGAGTNLELK
상기 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR(밑줄 그은 부분) 영역은 표 B에 나타내는 바와 같다.
Figure pct00003
(2) 항-PD-L1 항체 부분
본 발명의 이중특이성 항체의 항-인간 PD-L1의 항체 부분은 항-PD-L1 단일 도메인 항체(항-PD-L1 나노 항체)를 인간화 변형시켜 수득한 것이다. IMGT 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식계 유전자 데이터베이스와 MOE 소프트웨어를 비교하여, 각각 QP1162, QP1166과 상동성이 높은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식계 유전자를 주형으로 선택하고, 단일 도메인 항체의 CDR을 대응하는 인간화 주형(예를 들어, IGHV3-23 germline 및 J-region IGHJ4×01)에 각각 이식하여, 순서가 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4인 가변 영역 서열을 형성하였다. 일부 중요한 아미노산 잔기를 더 선택하여 역 돌연변이 조합을 수행하였다.
상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체의 아미노산 서열은 하기에 나타내는 바와 같고, CDR은 서열 중 밑줄 그은 부분에 표시되는 바와 같다.
>QD1162 서열 번호 55
QVQLVESGGGSVQSGGSLRLSCAASGFTYGTYAMSWFRQAPGKEREGVACIDIYGRASYTDPVKGRFTISQDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARDFGYCTASWVHEGFSRYWGQGTQVTVSS
>QD1166 서열 번호 56
QVQLVESGGDSVQPGGSLRLSCAASGFTYGTYAMSWFRQAPGKEREGVACIDIYGRTSYTDPVKGRFTISQDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARDFGYCTASWVHEGFSRYWGQGTQVTVSS
상기 단일 도메인 항체의 CDR(밑줄 그은 부분)영역을 요약하면 하기 표에 나타내는 바와 같다.
Figure pct00004
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항-PD-L1 단일 도메인 항체" 및 "항-PD-L1 나노 항체"는 상호 교환하여 사용할 수 있고, 모두 경쇄가 자연적으로 결실되어, 하나의 중쇄 가변 영역(VHH) 및 두 개의 통상적인 CH2 및 CH3 영역만을 포함하는, PD-L1 분자를 표적으로 하는 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친화성"은 이론적으로 완전한 항체와 항원 사이의 평형 결합에 의해 정의된다. 본 발명의 이중특이성 항체의 친화성은 KD값(해리 상수)(또는 다른 측정 방법)에 의해 평가되거나 측정될 수 있으며, 예를 들어 생물층 간섭계(Bio-layer interferometry, BLI)는 FortebioRed96 기기를 사용하여 측정하여 확인하였다.
약학 조성물
본 발명은 또한 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학 조성물이며, 이는 상기 항체 또는 이의 활성 단편 또는 이의 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 통상적으로, 이러한 물질은 무독성, 불활성 및 약학적으로 허용 가능한 수성 담체 매질에서 제조할 수 있으며, 여기서 pH는 통상적으로 약 5 내지 8이고, 바람직하게는 pH가 약 6 내지 8이지만, pH 값은 제조되는 물질의 특성 및 치료 질환에 따라 변경될 수 있다. 제조된 약학 조성물은 종양내, 복강내, 정맥내, 또는 국소 투여를 포함(단 이에 한정되지 않는다)하는 통상적인 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 클라우딘18.2 및/또는 PD-L1 단백질 분자를 결합하는 데 직접적으로 사용할 수 있으므로, 종양 치료에 사용할 수 있다. 또한, 다른 치료제와 병용하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 안전 유효량(예를 들어, 0.001 내지 99wt%, 바람직하게는 0.01 내지 90wt%, 더 바람직하게는 0.1 내지 80wt%)의 본 발명의 이중특이성 항체(또는 이의 접합체) 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세린, 에탄올 및 이의 조합을 포함한다(단 이에 한정되지 않는다). 약물 제제는 투여 방법과 일치해야 한다. 본 발명의 약학 조성물은 주사용 제형으로 제조될 수 있으며, 예를 들어 생리 식염수 또는 포도당 및 다른 보조제를 포함하는 수용액을 사용하여 통상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 주사제, 용액과 같은 약학 조성물은 무균 조건 하에 제조하여야 한다. 활성 성분의 투여량은 치료 유효량이며, 예를 들어 하루에 약 10μg/kg 체중 내지 약 50mg/kg 체중이다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 다른 치료제와 함께 사용할 수도 있다.
약학 조성물을 사용하는 경우, 안전 유효량의 면역접합체를 포유동물에게 투여하며, 여기서 상기 안전 유효량은 통상적으로 적어도 약 10μg/kg 체중이고, 대부분의 경우 약 50mg/kg 체중을 초과하지 않으며, 바람직하게는 상기 투여량은 약 10μg/kg 체중 내지 약 10mg/kg 체중이다. 물론, 구체적인 투여량은 또한 투여 경로, 환자의 건강 상태 등 요소를 고려해야 하며, 이는 모두 숙련된 의사의 기술 범위 내에 있다.
용도
본 발명은 또한 암(또는 종양), 감염 또는 면역조절 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의 본 발명의 항체의 용도를 제공한다. 하나의 바람직한 용도는 암(또는 종양)의 치료에 사용되는 것이다.
본 발명의 주요한 우세는 하기를 포함한다.
(1) 본 발명은 인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1을 동시에 표적으로 하는 이중특이성 항체를 제공하며, 상기 이중특이성 항체 분자는 고효율적으로 인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1을 표적화 할 수 있다.
(2) 본 발명의 이중특이성 항체는 클라우딘18.2를 발현하는 종양의 치료 효과를 향상시킬 수 있다. 상기 이중특이성 항체는 인간 클라우딘18.2 단백질과 결합하는 동시에, PD-1/PD-L1의 결합을 차단할 수 있어, 이는 선천성 면역에서 NK 세포를 활성화하여 종양 세포를 사멸시킬 수 있을 뿐만 아니라, 획득성 면역에서도 종양에 대한 킬러 T 림프구의 사멸 효과를 촉진할 수 있으므로, 상기 이중특이성 항체는 항-클라우딘18.2 항체를 단독으로 사용하는 것보다 더 나은 항종양 효능을 가진다.
(3) 본 발명의 이중특이성 항체는 시너지 효과를 가진다.
하기에서 구체적인 실시 형태와 결부하여 본 발명의 기술적 수단을 상세하게 설명한다.
하기 실시 형태에서 구체적인 조건이 표시되지 않은 실험방법은, 통상적인 조건, 또는 원료 또는 상품 제조사에서 제시하는 조건에 따른다. 또는 분자 클로닝, 연구실 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 연구소, 현대 분자생물학적 방법, 세포생물학 등 생명공학 교과서에 기재된 실험방법으로 수행한다. 구체적인 출처가 표시되지 않은 시약은 상업적 경로를 통해 구입한 통상적인 시약이다.
실시예 1: 하이브리도마 단일 클론 항-클라우딘18.2 항체의 인간화
IMGT 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식계 유전자 데이터베이스와 MOE 소프트웨어를 비교하여, 각각 QP190191, QP192193, QP199200, QP201202, QP207208과 상동성이 높은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식계 유전자를 주형으로 선택하고, 마우스 유래 항체의 CDR을 대응하는 인간화 주형에 각각 이식하여, 순서가 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4인 가변 영역 서열을 형성하였다. 또한 일부 중요한 아미노산 잔기를 선택하여 역 돌연변이 조합을 수행하였다. 여기서 아미노산 잔기는 Kabat 넘버링 시스템에 의해 결정되고 주석이 달린다.
1. 인간화 항-클라우딘18.2 항체의 구축
프라이머 PCR을 설계하여 각 인간화 항체의 VH/VK 유전자 단편을 구축하고, 신호 펩타이드 및 불변 영역 유전자(CH1-FC/CL) 단편을 가진 발현 벡터 pQD와 상동 재조합을 수행하여, 항체 전장 발현 벡터 VH-CH1-FC-pQD/VK-CL-pQD를 구축하였다.
온라인 소프트웨어 DNAWorks(v3.2.2)(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)를 사용하여 여러 개의 프라이머를 설계하고 재조합에 필요한 유전자 단편: 5'-30bp 신호 펩타이드 +VH/VK+30bp CH1/CL-3'을 포함하는 VH/VK를 합성하였다. TaKaRa사의 Primer STAR GXL DNA 중합효소의 사용 설명서에 따라, 상기에서 설계한 여러 개의 프라이머를 사용하여, 두 단계로 나누어 PCR 증폭하여 재조합에 필요한 유전자 단편을 포함하는 VH/VK를 수득하였다. 발현 벡터 pQD(신호 펩타이드 및 불변 영역 유전자(CH1-FC/CL) 단편을 포함)의 구축 및 효소 절단은 제한성 엔도뉴클레아제 BsmBI, 인식 서열과 효소 절단 부위의 다른 특징을 이용하여 발현 벡터 pQD(신호 펩타이드 및 불변 영역 유전자(CH1-FC/CL) 단편을 포함)를 설계하고 구축하였다. BsmBI 효소를 사용하여 벡터를 절단하고 겔을 나중에 사용하기 위하여 절단하고 회수하였다. 발현 벡터 VH-CH1-FC-pQD/VK-CL-pQD를 재조합하고 구축하였다. 재조합에 필요한 유전자 단편을 포함하는 VH/VK와 BsmBI 효소에 의해 절단하고 회수한 발현 벡터 pQD를 3:1의 비율로 DH5H 수용성 세포에 각각 가하고, 0℃에서 30분 동안 빙욕하고, 42℃에서 90초 동안 열 충격을 가하고, 5배 체적의 LB 매질을 가하고, 37℃에서 45분 동안 배양하고, LB-Amp 플레이트를 코팅하고, 37℃에서 밤새 배양하고, 단일 클론을 선택하고, 시퀀싱하여 각 목적의 클론을 수득하였다.
각 클론의 인간화 설계의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열 및 단백질 발현 번호는 하기에 나타내는 바와 같고, 하기 표에서 모든 항체 경쇄는 kappa 경쇄 불변 영역 CL(서열 번호 67)을 사용하고, 항체 중쇄는 인간-IgG1 불변 영역(서열 번호 68)을 사용하였다.
Figure pct00005
동시에 인간화 전 키메라 항체 및 대조군 항체를 발현하는 클론의 설계는 하기 표에 나타내는 바와 같고, 하기 표에서 모든 항체의 경쇄는 kappa 경쇄 불변 영역 CL을 사용하고, 항체의 중쇄는 인간-IgG1 불변 영역을 사용하였다.
Figure pct00006
2. 인간화 항-클라우딘18.2 항체의 발현
293E 세포의 배양 밀도를 0.2 내지 3×106/ml 사이로 유지하고, 유지 단계에서 배지(GIBCO Freestyle 293 expression medium)를 사용하여 배양하고, 형질감염 전날에 형질감염할 세포를 원심분리하고 용액을 교체하고, 세포 밀도를 0.5 내지 0.8×106/ml로 조절하였다. 형질감염 당일, 293E 세포의 밀도는 1 내지 1.5×106/ml이었다. 플라스미드 및 형질감염 시약 PEI를 준비하고, 형질감염하는 플라스미드의 양은 10μg/100ml 세포이고, 사용한 PEI와 플라스미드의 질량비는 2:1이었다. 플라스미드와 PEI를 균일하게 혼합하고, 15분 동안 방치하며, 20분을 초과하지 않는 것이 바람직하다. 플라스미드와 PEI 혼합물을 293E의 세포에 천천히 가하고, 8%의 CO2를 넣고, 120rpm, 37℃의 진탕기에서 배양하였으며, 형질감염 5일째에, 수평 원심분리기로 4700rpm에서 20분 동안 원심분리하여 세포 상층액을 수집하였다.
3. 인간화 항-클라우딘18.2 항체의 정제
Protein A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
평형 용액으로 컬럼을 통과시키고, 적어도 3CV이며, 실제 체적은 20ml이고, 기기에서 유출되는 최종 용액의 pH와 전도도가 평형 용액과 일치하도록 확보하고, 유속은 1ml/min이며; 원심분리 후 배양 용액의 상층액을 컬럼에 통과시키고, 시료는 40ml이고, 유속은 0.33ml/min이며; 평형 용액으로 컬럼을 통과시키고, 적어도 3CV이고, 실제 체적은 20ml이고, 기기에서 유출되는 최종 용액의 pH와 전도도가 평형 용액과 일치하도록 확보하고, 유속은 0.33ml/min이며; 용리 용액으로 컬럼을 통과시키고, UV280이 15mAU로 상승한 시점에서 용리 피크(PAC-EP)의 수집을 시작하고, UV280이 15mAU로 하강한 시점에서 수집을 중단하고, 유속은 1ml/min이었다. 시료 수집이 완료된 후, pH조절 용액으로 PAC-EP를 중성으로 조절하였다.
4. 인간화 클라우딘18.2 항체의 결합 활성(CHOS-CLDN18.2 세포-ELISA)
검출 시약: 탈지 분유(bd, 232100), PBS(Sangon Biotech, B548117-0500); HRP-anti human IgG(H+L)(jackson, 109-035-088); TMB(Luoyang BaiAoTong Experimental Materials Center, C060201); Elisa 플레이트(costa, 9018) 1ХPBS 완충액: 8.00g의 NaCl, 0.20g의 KCl, 2.9g의 Na2HPO4·12H20, 0.2g의 KH2PO4를 칭량하여 800mL의 ddH2O에 용해시키고, 충분히 용해된 후 1L로 정용하고, pH를 7.4로 조절하고, 고온에서 멸균하여 준비하였다. 또는 시판되는 10×, 20×의 PBS 용액을 구매하여 1×PBS 완충액으로 희석하여 사용하였다. 차단 용액: 5g의 분유를 PBS에 칭량하고, 차단 용액은 사용 직전에 제조하였다. 정지 용액(1mol/L의 H2SO4): 109mL의 98%의 농H2SO4를 취하여 2000mL의 ddH2O에 천천히 적가하였다. TMB로 37℃에서 10분 동안 발색시키고, 진탕기(120rpm)에 방치하였으며, 100ul/웰이었다;
실험 단계: 2E5/웰의 CHOS-CLD18.2-16-2 세포를 U형 플레이트에 접종하고, 차가운 PBS로 1회 세척하고, 1200rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. VCD: 1.21E6이고, 실제로 165ul/웰로 플레이팅하였으며; 세척이 끝난 후, 200μL/웰로 차단 용액을 가하고, 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 차단이 끝난 후, 1200rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상층액을 흔들어 제거하고, CLD18.2 대조군 항체 14-1과 시료를 배양하고, 100ug/mL 1:2의 희석 비율로, 총 12개 구배로 희석하고 마지막으로 하나의 블랭크 대조군을 설치하고, 100ug/mL, 33.33333333ug/mL, 11.11111111ug/mL, 3.703703704ug/mL, 1.234567901ug/mL, 0.411522634ug/mL, 0.137174211ug/mL, 0.045724737ug/mL, 0.015241579ug/mL, 0.005080526ug/mL, 0.001694ug/mL, 0ug/mL로 100ul/웰을 가하여 충분히 흔들어 혼합한 후, 얼음 위에서 2시간 동안 배양하고, 차가운 PBS로 3 회 세척하고; 효소 표지 항체를 가하고; HRP-anti human IgG(H+L) 항체를 배양하고, 1:10000의 비율로 희석하고, 100ul/웰이며, 충분히 혼합한 후, 얼음 위에 1시간 동안 방치하고, 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 기질 발색 용액의 첨가: 기질 발색 용액 TMB를 100μL/웰의 사용량으로 가하고, 진탕기에 넣고, 200rpm, 35℃에서 10분 동안 빛을 차단하고 발색시켰다. 종료: 발색이 완료된 후, 정지 용액을 100μL/웰의 사용량으로 빠르게 가하여 반응을 정지시켰다. 검출: 3500rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액 120ul를 취하여 Elisa 플레이트로 옮기고, 마이크로 플레이트 리더에서, 이의 A450nm의 OD 값을 측정하고, graphpad prism 소프트웨어를 사용하여 분석한 결과는: 도 2, 도 3, 도 4, 도 5 및 도 6에 도시되는 바와 같다.
실험 결과는 도 2, 도 3, 도 4, 도 5 및 도 6에 도시되는 바와 같이, 본 발명의 인간화 클라우딘18.2 항체는 모두 CHOS-클라우딘18.2에 결합됨을 증명하였다.
5. 인간화 클라우딘18.2 항체의 결합 활성(CHOS-CLDN18.2 FACS)
세포 CHOS, CHOS-CLDN18.2를 각각 2E5/웰로 수집하고, 1000r에서 5분 동안 원심분리하고, 3%의 BSA/PBS buffer 200ul/웰로 4℃에서 60분 동안 차단하였다. 항체의 초기 농도는 20ug/ml이고, 1:4로 희석하여, 4℃에서 60분 동안 배양하였다. PBS로 2회 세척하고, PE-anti-human FC(1:200)를 50ul/웰에서 배양하고, 4℃에서 30분 동안 배양하고, PBS로 3회 세척하고, PBS로 재현탁시켰으며, FACS 결과는 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 및 도 7, 도 8, 도 9, 도 10 및 도 11에 도시되는 바와 같다.
여기서 표 3 및 도 7의 EC50 및 Max 값은 마우스 유래 키메라 항체 QP190191의 인간화 항체 QP14361435, QP14371433, QP14371435의 CHOS-CLDN18.2 세포에 대한 결합이 마우스 유래 키메라 항체 QP190191보다 우수하거나 이와 상당함을 증명하였고; 표 7 및 도 11의 EC50 및 Max 값은 마우스 유래 키메라 항체 QP201202의 인간화 항체 QP14561454, QP14581453, QP14581454의 CHOS-CLDN18.2 세포에 대한 결합이 마우스 유래 키메라 항체 QP201202와 상당함을 증명하였고; 표 6 및 도 10의 EC50 및 Max 값은 마우스 유래 키메라 항체 QP192193의 인간화 항체 QP14451440, QP14441441, QP14451442의 CHOS-CLDN18.2 세포에 대한 결합이 마우스 유래 키메라 항체 QP192193과 상당함을 증명하였고; 표 5 및 도 9의 EC50 및 Max 값은 마우스 유래 키메라 항체 QP199200의 인간화 항체 QP14491448, QP14501446, QP14501448의 CHOS-CLDN18.2 세포에 대한 결합이 마우스 유래 키메라 항체 QP199200과 상당함을 증명하였고; 표 4 및 도 8의 EC50 및 Max 값은 마우스 유래 키메라 항체 QP207208의 인간화 항체 QP14631461, QP14641460, QP14641461, QP14641462, QP14651460의 CHOS-CLDN18.2 세포에 대한 결합이 마우스 유래 키메라 항체 QP207208보다 우수하거나 이와 상당함을 증명하였다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
6. 인간화 클라우딘18.2 항체의 특이성 검정
형광 활성화 세포 분류 FACS(Fluorescence activated Cell Sorting)로 본 발명의 인간화 항체의 클라우딘18.2에 결합되고 클라우딘18.1에 결합되지 않는 특이성을 확인하였다.
세포 CHOS, CHOS-CLDN18.2, CHOS-CLDN18.1을 각각 2E5/웰로 수집하고, 1000r에서 5분 동안 원심분리하고, 3%의 BSA/PBS buffer 200ul/웰로 4℃에서 60분 동안 차단하였다. 항체의 초기 농도는 20ug/ml이었고, 1:4로 희석하여, 4℃에서 60분 동안 배양하였다. PBS로 2회 세척하고, PE-anti-human FC(1:200)을 50ul/웰로 배양하고, 4℃에서 30분 동안 배양하고, PBS로 3회 세척하고, PBS로 재현탁시켜, FACS로 판독한 평균 형광 값은 표 8에 나타내는 바와 같고, FACS의 결과는 본 발명의 인간화 항-클라우딘18.2 항체가 모두 CHOS-클라우딘18.2 세포에 결합되고, 또한 CHOS-클라우딘 18.1 및 CHOS세포에 결합되지 않음을 나타내고, 인간화 항-클라우딘18.2 항체가 특이적으로 클라우딘18.2에 결합되지만 클라우딘 18.1에 결합되지 않는다는 것을 증명하였다.
Figure pct00012
7. 인간화 항-클라우딘18.2 항체의 ADCC(항체 의존적 세포가 매개하는 세포 독성 효과)
target cell(HEK293-CLDN18.2)의 제조: HEK293-CLDN18.2를 트립신으로, 1000rpm에서 5분 동안 소화시켰다. 신선한 배지로 교체하고 96-웰 플레이트에, 20,000cell/웰로 플레이팅하고, 37℃의 5%CO2에서 밤새 배양 하였다. 항체의 제조: 항체(80ug/ml 내지 0.000512ug/ml, 0ug/ml)를 배지로 1:5의 구배로 10개 농도로 희석하였다. 96-웰 플레이트의 배지를 흡인하고, 상기에서 희석한 각 농도의 항체를 70ul/웰로 가하였으며, 각 농도에 복제 웰을 설정하였다. PBMC의 제조: 1일째에 소생된 PBMC를 원심분리하고, 배지로 재현탁하여, 계수하였다. PBMC:Target cell=50:1로 상기 웰 플레이트에 70ul/웰을 가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. Max lysis well에 15ul의 lysis 완충액(1%의 Triton-X100)을 가하고, 37℃에서 10분 동안 배양하였다.
LDH 시약의 제조: 200g의 96-웰 플레이트를 5분 동안 원심분리하고, 100ul/웰의 상층액을 하나의 새로운 투명한 96-웰 플레이트로 옮겼다. LDH 세포 독성 검출 키트(cayman, 10008882-480well)를 꺼내, 반응 용액을 제조하고, 100ul/웰을 가하고, 37℃에서 30분 동안 부드럽게 흔들었다. 490nm에서의 흡광도를 판독하고, 공식 Con(ug/ml)%Maximal signal=(Test-Control)/(Max-Control)-Con(0ug/ml)%Maximal signal로 데이터를 분석하였다.
실험 결과는 도 12, 표 9 및 표 10에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 인간화 항-클라우딘18.2 항체 QP14331437, QP14401445, QP14611463, 전체 인간 항체 QP11151116 및 대조군 항체 IMAB362(QP024025)는 모두 농도 의존적으로 PBMC 매개에 의해 클라우딘18.2를 높게 발현하는 HEK293-클라우딘18.2 세포를 사멸시킬 수 있음을 나타냈다.
Figure pct00013
Figure pct00014
8. 인간화 항-클라우딘18.2 항체의 CDC(보체 의존성 세포 독성)
시약: 세포 HEK293-hCLDN18.2-H11, 보체: 정상적인 인간의 혈청 보체(quidel, A113), 항체: QP024025(IMAB362), QP14631461은 본 실시예에 의해 합성된 것이다.
실험 단계:
세포/배지의 플레이팅: 배경 대조군 culture media background를 설정하고, 즉40ul/웰의 배지만을 가하며, 최대 방출군 maximum LDH release를 설정하고, 즉 40ul의 표적 세포를 가한 후, 검출 45분 전에 12ul의 lysis solution을 가하였다. 체적 보정군 volume correction을 설정하고, 즉 40ul/웰의 배지를 가하며; LDH 양성 대조군을 설정하고, 즉 1ul의 양성 대조군을 볼텍싱한 후, PBS+1% BSA 희석액으로 5000배(5mL)로 희석하였다. 10배로 구배 희석할 수 있다. 실험군 experimental를 설정하고, 즉 40ul/웰의 target cell을 가하였다. 보체+항체 믹스의 첨가: 대조군과 실험군 모두에 40ul/웰의 20%의 보체(세포 배지로 희석)를 가하였다. 세포를 37℃, 5%의 CO2에서 배양하고, 1시간 15분 후, 12ul/웰의 lysis solution을 최대 방출군 및 체적 보정군에 가하였다. 37℃에서 45분 동안 계속하여 배양한 후, LDH 검출 키트로 검출하고, 490nm에서의 흡광도 값을 판독하였으며, 판독은 정지 용액 stop solution을 가한 후 1시간 이내에 완료해야 한다. 계산: 실험군에서 배경 대조군을 제거하고, 최대 방출군에서 체적 보정군을 제거하였으며, 공식은: Percent cytotoxicity=100×OD490(experimental LDH release)/OD490(maximum LDH release)이다.
CDC 결과는 도 13에 도시되는 바와 같이, 본 발명의 인간화 항-클라우딘18.2 항체 QP14611463 및 대조군 항체 IMAB362(QP024025)는 모두 농도 의존적으로 보체 매개에 의해 클라우딘18.2를 높게 발현하는 HEK293-클라우딘18.2 세포를 사멸시킬 수 있음을 나타냈다.
9. 면역결핍 마우스 CB.17-SCID 모델 HEK293-h클라우딘18.2에서의 인간화 클라우딘18.2 항체의 생체 내 효능.
실험 방법: 대수 성장기의 인간 클라우딘18.2(h클라우딘18.2)를 안정적으로 발현하는 안정 발현 세포주 HEK293-h클라우딘18.2 세포를 수집하고, PBS 완충액으로 세포 농도를 5×107/mL로 조절하고, 0.1mL(1:1 Matrigel)의 세포 현탁액을 CB-17 SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 접종 후 마우스를 관찰하고 종양의 성장을 모니터링하고, 접종 당일 마우스의 체중에 따라 군을 나누어 투여하고 관찰하였다.
실험 결과: 도 14 및 표 11에 나타내는 바와 같다.
Figure pct00015
측정할 분자는 인간화 클라우딘18.2 항체 QP14331437 및 QP14611463이고, 양성 대조군 항체는 IMAB362(QP024025)였다. 투여 방안은 10mpk×10, q2d, i.v.으로 투여하였다. 투여 후 37일째에 PBS 군(음성 대조군)의 평균 종양 체적은 1091.34mm3에 도달하였고, QP14331437 군의 평균 종양 체적은 260.65mm3에 도달하여, TGI=76.12%였으며, QP14611463 군의 평균 종양 체적은 225.01mm3에 도달하여, TGI=79.38%였으며, IMAB362 군의 평균 종양 체적은 324.19mm3에 도달하여, TGI=70.29%였으며; 상기 세 군과 PBS 군의 종양 체적은 모두 통계학적으로 매우 유의한 차이가 있었다(t검정, p<0.01).
본 실험은 HEK293-CLDN18.2 모델에서 인간화 항-클라우딘18.2 항체가 모두 대조군 항체 IMAB362보다 우수한 항종양 능력 경향을 나타냄을 설명하였다.
실시예 2: 항-PD-L1 단일 도메인 항체의 인간화
IMGT 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식계 유전자 데이터베이스와 MOE 소프트웨어를 비교하여, 각각 QP1162, QP1166과 상동성이 높은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식계 유전자를 주형으로 선택하고, 단일 도메인 항체의 CDR을 대응하는 인간화 주형 IGHV3-23 germline 및 J-region IGHJ4×01에 각각 이식하여, 순서가 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4인 가변 영역 서열을 형성하였다. 또한 일부 중요한 아미노산 잔기를 선택하여 역 돌연변이 조합을 수행하였다. 여기서 아미노산 잔기는 Kabat 넘버링 시스템에 의해 결정되고 주석이 달린다.
1. 인간화 항-PD-L1 단일 도메인 항체의 분자 클로닝
프라이머 PCR을 설계하여 각 인간화 항체의 VH 유전자 단편을 구축하고, 신호 펩타이드 및 불변 영역 유전자(FC) 단편을 가진 발현 벡터 pQD와 상동 재조합을 수행하여, 항체 전장 발현 벡터 VH-CL-pQD를 구축하였다.
온라인 소프트웨어 DNAWorks(v3.2.2)(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)를 사용하여 여러 개의 프라이머를 설계하고 재조합에 필요한 유전자 단편: 5'-30bp 신호 펩타이드+VH+30bp FC-3'을 포함하는 VH/VK를 합성하였다. TaKaRa사의 Primer STAR GXL DNA 중합효소의 사용 설명서에 따라, 상기에서 설계한 여러 개의 프라이머를 사용하여, 두 단계로 나누어 PCR 증폭하여 재조합에 필요한 유전자 단편을 포함하는 VH/VK를 수득하였다. 신호 펩타이드 및 불변 영역 유전자(FC) 단편을 포함하는 발현 벡터 pQD의 구축 및 효소 절단은 제한성 엔도뉴클레아제 BsmBI, 인식 서열과 효소 절단 부위의 다른 특징을 이용하여 신호 펩타이드 및 불변 영역 유전자(FC) 단편을 포함하는 발현 벡터 pQD를 설계하고 구축하였다. BsmBI 효소를 사용하여 벡터를 절단하고 겔을 나중에 사용하기 위하여 절단하고 회수하였다. 발현 벡터 VH-FC-pQD를 재조합하고 구축하였다. 재조합에 필요한 유전자 단편을 포함하는 VH와 BsmBI 효소에 의해 절단하고 회수한 발현 벡터 pQD(신호 펩타이드 및 불변 영역 유전자(FC) 단편을 포함)를 3:1의 비율로 DH5H 수용성 세포에 각각 가하고, 0℃에서 30분 동안 빙욕하고, 42℃에서 90초 동안 열 충격을 가하고, 5배 체적의 LB 매질을 가하고, 37℃에서 45분 동안 배양하고, LB-Amp 플레이트를 코팅하고, 37℃에서 밤새 배양하고, 단일 클론을 선택하고 시퀀싱하여 각 목적의 클론을 수득하였다.
각 클론의 인간화 설계의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열 및 단백질 발현 번호는 하기에 나타내는 바와 같고, 하기 표에서 항체는 이의 C-말단에서 인간 IgG1-FC 불변 영역에 융합된다.
Figure pct00016
* 인간화된 VHH는 원 낙타의 단일 도메인 항체의 길이와 일치하며, 모두 126개의 aa이다.
동시에 인간화 전 키메라 항체 및 대조군 항체를 발현하는 클론의 설계하였으며 하기 표에 나타내는 바와 같다.
Figure pct00017
2. 인간화 항-PD-L1 단일 도메인 항체의 단백질의 발현
293E 세포의 배양 밀도를 0.2 내지 3×106/ml 사이로 유지하고, 유지 단계에서 배지(GIBCO Freestyle 293 expression medium)를 사용하여 배양하고, 형질감염 전날에 형질감염할 세포를 원심분리하고 용액을 교체하고, 세포 밀도를 0.5 내지 0.8×106/ml로 조절하였다. 형질감염 당일, 293E 세포의 밀도는 1 내지 1.5×106/ml였다. 플라스미드 및 형질감염 시약 PEI를 준비하고, 형질감염하는 플라스미드의 양은 100μg/100ml 세포이고, 사용한 PEI와 플라스미드의 질량비는 2:1이었다. 플라스미드와 PEI를 균일하게 혼합하고, 15분 동안 방치하며, 바람직하게는 20분을 초과하지 않는다. 플라스미드와 PEI 혼합물을 293E의 세포에 천천히 가하고, 8%의 CO2를 넣고, 120rpm, 37℃의 진탕기에서 배양하였으며, 형질감염 5일째에, 수평 원심분리기로 4700rpm에서 20분 동안 원심분리하여 세포 상층액을 수집하였다.
3. 인간화 항-PD-L1 단일 도메인 항체의 단백질의 정제
Protein A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
평형 용액으로 컬럼을 통과시키고, 적어도 3CV이며, 실제 체적은 20ml이고, 기기에서 유출되는 최종 용액의 pH와 전도도가 평형 용액과 일치하도록 확보하고, 유속은 1ml/min이며; 원심분리 후 배양 용액 상층액을 컬럼에 통과시키고, 시료는 40ml이고, 유속은 0.33ml/min이며; 평형 용액으로 컬럼을 통과시키고, 적어도 3CV이고, 실제 체적은 20ml이고, 기기로부터 유출되는 최종 용액의 pH와 전도도가 평형 용액과 일치하도록 확보하고, 유속은 0.33ml/min이고; 용리 용액으로 컬럼을 통과시키고, UV280이 15mAU로 상승한 시점에서 용리 피크(PAC-EP)의 수집을 시작하고, UV280이 15mAU로 하강한 시점에서 수집을 중단하였으며, 유속은 1ml/min이었다. 시료 수집이 완료된 후, pH조절 용액으로 PAC-EP를 중성으로 조절하였다.
4. 인간화 항-PD-L1 단일 도메인 항체의 결합 활성(Binding-ELISA)
0.75ug/ml의 코팅 항체 QP1162/QP320/QP321/QP322/QP1166/QP323/QP324/QP325, 1.5ug/ml의 QP11801181을 50ul/웰로 4℃에서 밤새 방치하였다. PBS를 3회 수행하였다. 차단: 3%의 BSA 250ul/웰, 실온에서 한시간 동안 방치하였다. 각각 2ug/ml의 Biotin QP004.3(biotin-PDL1-FC)을 배양하여 1:4로 상이한 농도로 희석하고, 실온에서 1시간 동안 방치하였다. PBST를 3회 수행하고, PBS를 3회 수행하였다. 2차 항체의 배양: 50ul/웰의 HRP-strepavidin(1:5000)， PBST를 6회 수행하고 PBS를 3회 수행하였다. 발색: 100ul/웰의 TMB로 10분 동안 발색시켰다. 50ul/웰의 2M H2SO4를 가하여 정지시켰다.
결과는 도 15 및 표 14에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 나노 항체 QP1162의 인간화 항체 QP322, 나노 항체 QP1166의 인간화 항체 QP325는 모두 PD-L1 단백질과 결합할 수 있고, 인간화 전의 나노 항체와 상당하였다.
Figure pct00018
5. 인간화 항-PD-L1 단일 도메인 항체의 활성 검정(Blocking-ELISA)
6. 2ug/ml의 코팅 단백질 QP1138(PD1-FC)을 50ul/웰로 4℃에서 밤새 방치하였다. PBS를 3회 수행하였다. 차단: 3%의 BSA 250ul/웰, 실온에서 한시간 동안 방치하였다. 각각 2ug/ml의 Biotin QP004.3(biotin-PDL1-FC) 및 상이한 농도의 15ug/ml의 QP1120, 30ug/ml의 QP11801181을 제조하고, 1:3으로 희석하고, 동일한 체적으로 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 방치하였다. PBST를 3회 수행하고, PBS를 3회 수행하였다. 2차 항체의 배양: 50ul/웰의 HRP-strepavidin(1:5000)， PBST를 6회 수행하고 PBS를 3회 수행하였다. 발색: 100ul/웰의 TMB로 10분 동안 발색시켰다. 50ul/웰의 2M H2SO4을 가하여 정지시켰다.
결과는 도 16 및 표 15에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 나노 항체 QP1162의 인간화 항체 QP322, 나노 항체 QP1166의 인간화 항체 QP325는 PD-L1과 PD-1 단백질의 결합을 차단할 수 있고, 인간화 전의 나노 항체와 상당하였다.
Figure pct00019
7. SPR에 의한 인간화 항-PD-L1 단일 도메인 항체의 친화성 검정
표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 친화도를 검출하였다.
Biacore T200(GE)을 통해 측정할 분자와 단백질 인간 PD-L1 및 cynoPD-L1의 친화도를 측정하였다.
항원 정보는 하기와 같다:
Figure pct00020
Figure pct00021
실험 결과는, SPR 친화도 결과가 인간화 항-PD-L1 항체 QP322, QP325는 모두 인간 PD-L1 단백질 및 원숭이 PD-L1 단백질에 결합된다는 것을 보여줌을 나타냈다. 여기서 인간화 나노 항체 QP322와 낙타 나노 항체 QP1162는 인간 및 원숭이의 PD-L1 단백질에 대한 결합 친화성이 상당하며, 인간화에 성공하였다.
실시예 3: 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체
본 실시 예에서, 인간화 후의 나노 항체 QP322는 각각 항-CLDN18.2의 중쇄와 연결 펩타이드(G4S)4를 통해 융합 단백질을 형성하여, 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체를 구축하는 데 사용하였다.
설계된 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체 분자의 형태는 도 1에 도시되는 바와 같다.
1. 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 클로닝
프라이머 PCR를 설계하여 각 인간화 항체의 VH 유전자 단편을 구축하고, 발현 벡터 pQD(신호 펩타이드 및 불변 영역 유전자 단편을 포함)와 상동 재조합을 수행하여, 항체 전장 발현 벡터 pQD를 구축하였다.
항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 서열 및 단백질 발현 번호는 하기에 나타내는 바와 같다:
Figure pct00022
2. 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 발현
293E 세포의 배양 밀도를 0.2 내지 3×106/ml 사이로 유지하고, 유지 단계에서 배지(GIBCO Freestyle 293 expression medium)로 배양하고, 형질감염 전날에 형질감염할 세포를 원심분리하고 용액을 교체하고, 세포 밀도를 0.5 내지 0.8×106/ml로 조절하였다. 형질감염 당일, 293E 세포의 밀도는 1 내지 1.5×106/ml였다. 플라스미드 및 형질감염 시약 PEI를 준비하고, 형질감염하는 플라스미드의 양은 100μg/100ml 세포이고, 사용한 PEI와 플라스미드의 질량비는 2:1이었다. 플라스미드와 PEI를 혼합하고, 15분 동안 방치하며, 바람직하게는 20분을 초과하지 않는다. 플라스미드와 PEI 혼합물을 293E의 세포에 천천히 가하고, 8%의 CO2를 넣고, 120rpm, 37℃의 진탕기에서 배양하였으며, 형질감염 5일째에, 수평 원심분리기로 4700rpm에서 20분 동안 원심분리하여 세포 상층액을 수집하였다.
3. 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 발현 및 정제
Protein A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
평형 용액으로 컬럼을 통과시키고, 적어도 3CV이며, 실제 체적은 20ml이고, 기기에서 유출되는 최종 용액의 pH와 전도도가 평형 용액과 일치하도록 확보하고, 유속은 1ml/min이며; 원심분리 후 배양 용액의 상층액을 컬럼에 통과시키고, 시료는 40ml이고, 유속은 0.33ml/min이며; 평형 용액으로 컬럼을 통과시키고, 적어도 3CV이고, 실제 체적은 20ml이고, 기기로부터 유출되는 최종 용액의 pH와 전도도가 평형 용액과 일치하도록 확보하고, 유속은 0.33ml/min이고; 용리 용액으로 컬럼을 통과시키고, UV280이 15mAU로 상승한 시점에서 용리 피크(PAC-EP)의 수집을 시작하고, UV280이 15mAU로 하강한 시점에서 수집을 중단하고, 유속은 1ml/min이었다. 시료 수집이 완료된 후, pH조절 용액으로 PAC-EP를 중성으로 조절하였다.
4개의 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체를 Protein A로 정제하고, SEC로 정제하고, 농축하고, SEC를 실행하여 이의 순도를 측정하고 일련의 평가를 거쳤으며, 요약표는 하기 표에 나타내는 바와 같다.
Figure pct00023
SEC 순도 확인은 HPLC로 완성하였으며, 표에서 4개의 분자 스펙트럼은 도 17, 도 18, 도 19 및 도 20에 도시되는 바와 같다. QP3691433은 도 17에 도시되는 바와 같고, QP3701440의 정제는 도 18에 도시되는 바와 같고, QP3711461의 정제는 도 19에 도시되는 바와 같고, QP3721116의 정제는 도 20에 도시되는 바와 같다. 결과는 항-클라우딘18.2/PD-L1 이중특이성 항체의 과도 발현 수율이 양호하고, SEC 순도가 양호함을 나타냈다. 단백질은 농축된 후, 물리화학적 성질이 안정적이였다.
4. 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 결합 활성(PD-L1 binding)
PD-L1 Binding ELISA:
0.75ug/ml의 코팅 항체 QP322, 1.5ug/ml의 QP11801181, QP3691433, QP3701440, QP3711461, QP3721116을 50ul/웰로 4℃에서 밤새 방치하였다. PBS를 3회 수행하였다. 차단: 3%의 BSA 250ul/웰, 실온에서 한시간 동안 방치하였다. 각각 1ug/ml의 Biotin QP004.3(biotin-PDL1-FC)를 배양하여 1:5로 상이한 농도로 희석하고, 실온에서 1시간 동안 방치하였다. PBST를 6회 수행하고, PBS를 3회 수행하였다. 2차 항체의 배양: 50ul/웰의 HRP-strepavidin(1:5000)， PBST를 6회 수행하고 PBS를 3회 수행하였다. 발색: 100ul/웰의 TMB로 10분 동안 발색시켰다. 50ul/웰의 2M H2SO4를 가하여 정지시켰다.
결과는 도 21 및 표 20에 나타내는 바와 같다. ELISA 결과는 항-클라우딘18.2/PD-L1 이중특이성 항체 QP3691433, QP3701440, QP3711461, QP3721116에서의 PD-L1 나노 항체가 FC 단편의 C-말단에 융합되고 동형 대조군(QP322)에서의 PD-L1 나노 항체가 FC 단편의 N-말단에 융합되며, 모두 인간 PD-L1 단백질에 결합되며, 결합 EC50이 유사함을 나타냈다.
Figure pct00024
5. 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 차단 활성(PD-L1/PD-1 blocking)
PD-L1/PD-1 blocking ELISA
코팅: 2ug/ml의 50ul/웰의 항체 QP1138을 4℃에서 밤새 방치하였다. PBS를 3회 수행하였다. 차단: 3%의 BSA 250ul/웰, 실온에서 한시간 동안 방치하였다. 각각 2ug/ml의 Biotin QP004.3(biotin-PDL1-FC) 및 15ug/ml의 상이한 농도의 QP322， 30 ug/ml의 QP11801181， 36ug/ml의 QP3691433， QP3701440， QP3711461， QP3721116을 제조하고, 1:3으로 희석하고, 동일한 체적으로 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 방치하였다. PBST를 3회 수행하고, PBS를 3회 수행하였다. 2차 항체의 배양: 50ul/웰의 HRP-strepavidin(1:5000)， PBST를 3회 수행하고 PBS를 3회 수행하였다. 발색: 100ul/웰의 TMB로 10분 동안 발색시켰다. 50ul/웰의 2M H2SO4를 가하여 정지시켰다.
결과는 도 22 및 표 21에 나타내는 바와 같다. ELISA 결과는 항-클라우딘18.2/PD-L1 이중특이성 항체 QP3691433, QP3701440, QP3711461, QP3721116에서의 PD-L1 나노 항체가 FC의 C-말단에 융합되고 동형 대조군(QP322)에서의 PD-L1 나노 항체가 FC의 N-말단에 융합되며, 모두 인간 PD-L1 및 PD-1 단백질에 결합되는 것을 차단할 수 있으며, 억제 IC50이 유사함을 나타냈다.
Figure pct00025
6. 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 차단 활성(PD-L1/CD80 blocking)
PD-L1/CD80 blocking ELISA
4ug/웰의 코팅 CD80-FC를 4℃에서 밤새 방치하였다. PBS로 3회 세척하고, 5%의 탈지 분유로 차단하고 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 최종 농도가 0.5ug/ml의 Biotin-QP004+CHO14(10ug/ml, 1:5로 희석)로 배양하고, 실온에서 1시간 동안 방치하였다. PBST로 5회 세척하였다. HRP-Strepavidin(1:5000), PBST로 6회 세척하고, PBS로 3회 세척하였다. TMB로 발색시켰다. 참고: CHO14 단백질은 CHO 세포로 발현되어 수득한 QP3711461 단백질이다.
결과는 도 23 및 표 22에 나타내는 바와 같다. ELISA 결과는 본 발명의 항-클라우딘18.2/PD-L1 이중특이성 항체 CHO14(QP3711461)가 PD-L1 및 CD80의 결합을 차단할 수 있음을 나타냈다.
Figure pct00026
7. 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 결합 활성(ELISA로 CLDN18.2 활성을 검출)
검출 시약: 탈지 분유(BD, 232100), PBS(Sangon Biotech, B548117-0500); HRP-anti human IgG(H+L)(jackson, 109-035-088); TMB(Luoyang BaiAoTong Experimental Materials Center, C060201); Elisa 플레이트(costa, 9018) 1×PBS 완충액: 8.00g의 NaCl, 0.20g의 KCl, 2.9g의 Na2HPO4·12H20, 0.2g의 KH2PO4를 칭량하여 800mL의 ddH2O에 용해시키고, 충분히 용해된 후 1L가 되게끔 하고, pH를 7.4로 조절하고, 고온에서 멸균하여 준비하였다. 또는 시판되는 10×, 20×의 PBS 용액을 1×PBS 완충액으로 희석하여 사용하였다. 차단 용액: 5g의 탈지 분유를 PBS에 칭량하고, 차단 용액은 사용 직전에 제조할 필요가 있었다. 정지 용액(1mol/L의 H2SO4): 109mL의 98%의 농 H2SO4를 2000mL의 ddH2O에 천천히 적가하였다. TMB로 37℃에서 10분 동안 발색시키고, 진탕기(120rpm)에 방치하였으며, 100ul/웰이었다;
실험 단계: 2E5/웰 세포 CHOS-CLD18.2-16-2를 U형 플레이트에 접종하고, 차가운 PBS로 1회 세척하고, 1200rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. VCD: 1.21E6이고, 실제로 165ul/웰로 플레이팅하고; 세척이 끝난 후, 200μL/웰의 차단 용액을 가하고, 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 차단이 끝난 후, 1200rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상층액을 흔들어 제거하고, CHO14 시료를 배양하고, 100ug/mL의 1:2의 희석 비율로, 총 12개를 구배로 희석하고 마지막으로 하나의 블랭크 대조군을 설치하고, 100ug/mL, 33.33333333ug/mL, 11.11111111ug/mL, 3.703703704ug/mL, 1.234567901ug/mL, 0.411522634ug/mL, 0.137174211ug/mL, 0.045724737ug/mL, 0.015241579ug/mL, 0.005080526ug/mL, 0.001694ug/mL, 0ug/mL을 100ul/웰로 가하고 충분히 흔들어 혼합한 후, 얼음 위에서 2시간 동안 배양하고, 차가운 PBS로 3 회 세척하고; 효소 표지 항체를 가하고; HRP-anti human IgG(H+L) 항체를 배양하고, 1:10000의 비율로 희석하여, 100ul/웰이었으며, 충분히 혼합한 후, 1시간 동안 얼음 위에 방치하고, 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 기질 발색 용액의 첨가: 기질 발색 용액 TMB를 100μL/웰의 사용량으로 가하고, 진탕기에 넣고, 200rpm, 35℃에서 10분 동안 빛을 차단하여 발색시켰다. 종료: 발색이 완료된 후, 정지 용액을 100μL/웰의 사용량으로 빠르게 가하여 반응을 정지시켰다. 검출: 3500rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 120ul의 상층액을 취하여 Elisa 플레이트로 옮기고, 마이크로 플레이트 리더에서 이의 A450nm의 OD 값을 측정하고, graphpad prism 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하였다.
CHO14와 CHOS-CLDN 18.2 높은 발현 세포주의 결합 EC50은 0.2653nM이었다. 후보 분자 CHO14가 클라우딘18.2에 결합된다는 것이 증명되었으며, 결과는 도 24에 도시되는 바와 같다.
8. 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 PD-L1 기능적 활성의 검정(혼합 림프구 반응 MLR)
DC(donor1) 세포의 준비: PBMC를 소생시키고, EasySep™ 인간 단핵구 분리 키트(Stemcell 19359)로 단핵구를 분리하고, rhGM-CSF(1000U/ml) 및 rhIL4(500U/ml)를 가하고, 37℃에서 6일 동안 세포를 배양하여 iDC로 유도하고; 2일 내지 3일에 한번씩 용액의 반을 교체하고, rhGM-CSF(1000U/ml) 및 rhIL4(500U/ml)를 동시에 보충하고; 세포 300×g을 수집하여 5분 동안 원심분리하고, rhGM-CSF(1000U/ml) 및 rhIL4(500U/ml)를 가한 배지로 재현탁시키고, 동시에 LPS(1μg/ml)를 가하고, 세포를 37℃에서 1일 동안 계속하여 배양하여 성숙한 DC로 유도하고; 세포를 수집하고, 계수하여 준비하였다. T(donor2) 세포의 제조: PBMC를 소생시키고, EasySep™ 인간 CD4+T 세포 분리 키트(Stemcell 17952)로 CD4+Tcell를 분리하였다. 항체의 제조: 배지로 항체(초기 농도 10ug/ml)를 6개 농도로 1:5 구배 희석하였다. DC 세포: T 세포를 1:10의 비율로 혼합하고, 상이한 농도의 항체를 가하여, 혼합하여 배양하였고, 2일째에 배양 상층액에서 IL2의 발현을 검출하였고, 5일째에 배양 상층액에서 IFNg의 발현을 검출하였다.
혼합 림프구 반응 실험에서, 후보 분자 CHO14는 T 세포 활성화 후에 생성된 사이토카인 IFNγ 및 IL-2의 농도에 대해 유의한 항체 농도 의존성을 가졌다. 후보 분자 CHO14에서 PD-L1 항체의 생물학적 기능이 증명되었고, CHO14는 T 세포 증식을 유의하게 촉진할 수 있었다. 도 25 및 도 26에 도시되는 바와 같다.
9. 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 PBMC-매개 세포 사멸
target cell(HCC827-CLDN18.2)의 제조: HCC827-CLDN18.2를 트립신으로, 1000rpm에서 5분 동안 소화시켰다. 신선한 배지로 교체하고 96-웰 플레이트에, 20,000cell/웰로 플레이팅하고, 37℃ 5%CO2에서 밤새 배양 하였다. 항체의 제조: 배지로 항체(200nM 내지 0.000512nM, 0)를 10개 농도로 1:5 구배 희석하였다. 96-웰 플레이트의 배지를 흡인하고, 상기에서 희석한 각 농도의 항체를 70ul/웰로 가하고, 각 농도에 복제 웰을 설정하였다. PBMC의 제조: 1일째에 소생된 PBMC를 원심분리하고, 배지로 재현탁하고, 계수하였다. PBMC:Target cell=50:1로 상기 웰 플레이트에 70ul/웰로 가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. Max lysis well에 15ul의 lysis buffer(1%Triton-X100)를 가하고, 37℃에서 10분 동안 배양하였다.
LDH reagents의 제조: 200g의 96-웰 플레이트를 5분 동안 원심분리하고, 100ul/웰의 상층액을 하나의 새로운 투명한 96-웰 플레이트로 옮겼다. LDH 세포독성 분석 키트(cayman, 10008882-480well)를 꺼내, 반응 용액을 제조하고, 100ul/웰을 가하고, 37℃에서 30분 동안 부드럽게 흔들었다. 490nm에서의 흡광도를 판독하고, 공식 Con(ug/ml)%Maximal signal=(Test-Control)/(Max-Control)-Con(0ug/ml)%Maximal signal으로 데이터를 분석하였다.
결과는 도 27, 표 23 및 표 24에 나타내는 바와 같다. ADCC 실험에서, 항-클라우딘18.2 단일 항체 QP14611463 및 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체 QP3711461은 모두 농도 의존적으로 PBMC 매개에 의해 재조합하여 발현하는 클라우딘18.2 및 PD-L1을 자연적으로 발현하는 인간 폐암 세포 HCC827-CLDN18.2를 사멸시킬 수 있음을 나타냈다. 이중특이성 항체 QP3711461의 EC50 사멸은 항-클라우딘18.2 단일 항체 QP14611463보다 우수하였다.
Figure pct00027
Figure pct00028
10. 면역 표적 인간화 형질전환 마우스 C57BL/6-hPDL1 모델 MC38-hPDL1-m클라우딘18.2에서의 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 생체 내 효능 연구
실험 방법: 대수 성장기의 마우스 대장암 세포 MC38-hPDL1(Tg)-m클라우딘18.2(Tg) 세포(인간 PD-L1 및 마우스의 클라우딘18.2를 높게 발현하고, 동시에 마우스의 PDL1을 녹아웃한다)를 취하여, 배양 용액을 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 C57BL/6-hPDL1 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였으며, 접종량은 5×105/100μL/마리 였다. 접종 후의 마우스를 관찰하고 종양의 성장을 모니터링하고, 접종 후 8일째에, 평균 종양 체적이 82.85mm3로 도달하였을 때, 종양 체적에 따라 무작위로 4개 군으로 나누고, 각 군은 9마리였다. 군을 나눈 당일을 D0일로 정의하고, D0일부터 투여를 시작하였다.
실험 결과는 도 28 및 표 25에 나타내는 바와 같다.
Figure pct00029
측정할 분자는 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체 QP3711461이며, 투여량은 각각 1.5mpk, 4mpk, 10mpk이고, BIW×3, i.v.로 투여하였다. 투여 후 28일째에 PBS 군(음성 대조군)의 평균 종양 체적은 1033.97 mm3에 도달하였고, QP3711461(1.5mpk) 군의 평균 종양 체적은 932.52mm3에 도달하여, TGI=12.19%였으며, QP3711461(4mpk) 군의 평균 종양 체적은 360.92mm3에 도달하여, TGI=61.81%였으며, QP3711461(10mpk) 군의 평균 종양 체적은 294.50mm3에 도달하여, TGI=69.53%였으며; 4mpk 군, 10mpk 군과 PBS 군의 종양 체적은 모두 통계학적으로 매우 유의한 차이가 있었다(t검정, p<0.01).
본 실험은 면역 표적 인간화 형질전환 마우스의 MC38-hPDL1-m클라우딘18.2 모델에서 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체가 우수한 항종양 능력을 나타낸다는 것을 설명하였다.
11. 면역계 인간화 마우스 PBMC engrafted-NCG모델 HCC827-h클라우딘18.2에서의 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 생체 내 효능 연구
실험 방법: 대수 성장기의 인간 폐 선암종 형질전환된 세포주 HCC827-h클라우딘18.2 세포(인간 PD-L1을 자연적으로 높게 발현하고, 인간 클라우딘18.2를 높게 발현한다)를 취하여, 배양 용액을 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 NCG 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였으며, 접종량은 5×106/100μL/마리 였다. 접종 후 마우스를 관찰하고 종양의 성장을 모니터링하였으며, 접종 후 7일째에, 평균 종양 체적이 약 150mm3로 도달하였을 때, 인간 PBMC(5×106/100μL/마리)를 접종하였다. 종양 체적에 따라 무작위로 4개 군으로 나누었으며, 각 군은 9마리였다. 군을 나눈 당일을 D0일로 정의하고, D0일부터 투여를 시작하였다.
실험 결과: 도 29 및 표 26에 나타내는 바와 같다.
Figure pct00030
측정할 분자는 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체 QP3711461이며, 투여량은 각각 4mpk, 10mpk이고, BIW×3, i.v.로 투여하였고; 대조군 항체 분자는 Tecentriq이며, 투여량은 5mpk이고, BIW×3, i.v.로 투여하였다. 투여 후 24일째에 PBS 군(음성 대조군)의 평균 종양 체적은 1306.8mm3에 도달하였고, QP1461371(4mpk) 군의 평균 종양 체적은 258.51mm3에 도달하여, TGI=80.22%였으며, QP1461371(10mpk) 군의 평균 종양 체적은 104.81mm3에 도달하여, TGI=91.98%였으며, Tecentriq(5mpk) 군의 평균 종양 체적은 90.90mm3에 도달하여, TGI=93.04%였으며; QP3711461(4mpk) 군, QP3711461(10mpk) 군, Tecentriq(5mpk) 군과 PBS 군의 종양 체적은 모두 통계학적으로 매우 유의한 차이가 있었다(t검정, p<0.01).
본 실험은 면역계 인간화 마우스의 HCC827-h클라우딘18.2 모델에서도 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체가 우수한 항종양 능력을 나타낸다는 것을 설명하였다.
12. C57BL/6 모델 MC38-hPDL1-m클라우딘18.2에서의 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 생체 내 시너지 효능 연구
실험 방법: 대수 성장기의 마우스 대장암 세포 MC38-hPDL1(Tg)-m클라우딘18.2(Tg) 세포(인간 PD-L1 및 마우스의 클라우딘18.2를 높게 발현하고, 동시에 마우스의 PD-L1을 녹아웃한다)를 취하여, 배양 용액을 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였으며, 접종량은 5×105/100μL/마리 였다. 접종 후 마우스를 관찰하고 종양의 성장을 모니터링하고, 접종 후 7일째에, 평균 종양 체적이 약 90mm3로 도달하였을 때, 종양 체적에 따라 무작위로 4개 군으로 나누었으며, 각 군은 10마리였다. 군을 나눈 당일을 D0일로 정의하고, D0일부터 투여를 시작하였다.
실험 결과: 도 30 및 표 27에 나타내는 바와 같다.
Figure pct00031
측정할 분자는 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체 QP3711461, 돌연변이 PD-L1 결합능력을 가진 분자 QP30771461(QP3711461-ΔPDL1 null) 및 돌연변이 클라우딘18.2 결합능력을 가진 분자 QP30891902(QP3711461-Δ클라우딘18.2 null)이며, 투여량은 5mg/kg이고, Q2D×6，ip.로 투여하였다. 투여 후 13일째에 PBS 군(음성 대조군)의 평균 종양 체적은 1262.27 mm3에 도달하였고, QP3711461 군의 평균 종양 체적은 532.87mm3에 도달하여, TGI=62.24%였으며, QP30771461 군의 평균 종양 체적은 1173.62mm3에 도달하여, TGI=7.59%였으며, QP30891902 군의 평균 종양 체적은 794.75mm3에 도달하여, TGI=39.63%였으며; QP30771461 군과 PBS 군의 종양 체적은 모두 통계학적으로 매우 유의한 차이가 있으며(t검정, p<0.01), 돌연변이 분자 QP30891902 군과 PBS 군의 종양 체적은 모두 통계학적으로 매우 유의한 차이가 있었다(t검정, p<0.05).
본 실험은 C57BL/6 마우스의 MC38-hPDL1-m클라우딘18.2 모델에서 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체가 시너지 효과를 가지며, 클라우딘18.2 단일 항체 및 PD-L1 단일 항체보다 더 우수한 항종양 활성을 나타낸다는 것을 설명하였다.
13. C57BL/6 모델 MC38-hPDL1-m클라우딘18.2에서의 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체의 생체 내 시너지 효능 연구
실험 방법: 대수 성장기의 마우스 대장암 세포 MC38-hPDL1(Tg)-m클라우딘18.2(Tg) 세포(인간 PD-L1 및 마우스의 클라우딘18.2를 높게 발현하고, 동시에 마우스의 PD-L1을 녹아웃한다)를 취하여, 배양 용액을 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였으며, 접종량은 5×105/100μL/마리 였다. 접종 후 마우스를 관찰하고 종양의 성장을 모니터링하고, 접종 후 6일째에 종양 체적에 따라 무작위로 3개 군으로 나누고, 각 군은 15마리였다. 군을 나눈 당일을 D0일로 정의하고, D0일부터 투여를 시작하였다.
실험 결과: 도 31 및 표 28에 나타내는 바와 같다.
Figure pct00032
측정할 분자는 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체 QP3711461, 돌연변이 PD-L1 결합능력을 가진 분자 QP30771461(QP3711461-ΔPDL1 null) 및 돌연변이 클라우딘18.2 결합능력을 가진 분자 QP30891902(QP3711461-Δ클라우딘18.2 null)이며, 투여량은 각각 5mg/kg(QP3711461 군), 5mg/kg+5mg/kg(QP30771461+QP30891902 병용 투여군)이고, Q3D×6，iv.로 투여하였다. 투여 후 19일째에 PBS 군(음성 대조군)의 평균 종양 체적은 838.76mm3에 도달하였고, QP3711461 군의 평균 종양 체적은 313.63mm3에 도달하여, TGI=67.15%였으며, QP30771461+QP30891902 병용 투여군의 평균 종양 체적은 478.61mm3에 도달하여, TGI=45.98%였으며, QP3711461 군과 PBS 군의 종양 체적은 통계학적으로 매우 유의한 차이가 있으며(t검정, p<0.01), 돌연변이 분자 병용 투여 QP30771461+QP30891902 군과 PBS 군의 종양 체적은 통계학적으로 매우 유의한 차이가 있었다(t검정, p<0.05).
본 실험은 C57BL/6 마우스의 MC38-hPDL1-m클라우딘18.2 모델에서 항-CLDN18.2/항-PD-L1 이중특이성 항체가 시너지 효과를 가지며, 클라우딘18.2 단일 항체 및 PD-L1 단일 항체보다 더 우수한 항종양 활성(p=0.052)을 나타낸다는 것을 설명하였다.
본 발명에서 언급된 모든 문헌은 각 문헌이 단독으로 참조로서 인용되고 있듯이 본 출원에 참조로 인용된다. 또한, 본 발명의 상기 교시를 읽은 후, 당업자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 수정을 가할 수 있으며, 이러한 등가 형태도 본 출원에 첨부된 청구항에 의해 한정된 범위에 포함된다는 것을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> QURE BIOTECHNOLOGY (SHANGHAI) CO., LTD. <120> BISPECIFIC ANTIBODY TARGETING HUMAN CLAUDIN AND HUMAN PDL1 PROTEINS, AND APPLICATION THEREOF <130> P22417019KR <140> PCT/CN2021/089729 <141> 2021-04-25 <150> CN 202010344676.8 <151> 2020-04-27 <160> 96 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant 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25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 64 <211> 595 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 64 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Phe Thr Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 465 470 475 480 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 485 490 495 Thr Tyr Gly Thr Tyr Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys 500 505 510 Gly Arg Glu Gly Val Ala Cys Ile Asp Ile Tyr Gly Arg Ala Ser Tyr 515 520 525 Thr Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys 530 535 540 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala 545 550 555 560 Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Phe Gly Tyr Cys Thr Ala Ser Trp 565 570 575 Val His Glu Gly Phe Ser Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 580 585 590 Val Ser Ser 595 <210> 65 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 65 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 66 <211> 595 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 66 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 465 470 475 480 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 485 490 495 Thr Tyr Gly Thr Tyr Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys 500 505 510 Gly Arg Glu Gly Val Ala Cys Ile Asp Ile Tyr Gly Arg Ala Ser Tyr 515 520 525 Thr Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys 530 535 540 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala 545 550 555 560 Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Phe Gly Tyr Cys Thr Ala Ser Trp 565 570 575 Val His Glu Gly Phe Ser Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 580 585 590 Val Ser Ser 595 <210> 67 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 68 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Camelus <400> 69 Thr Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Camelus <400> 70 Cys Ile Asp Ile Tyr Gly Arg Ala Ser Tyr Thr Asp Pro Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 71 <211> 19 <212> PRT <213> Camelus <400> 71 Ala Arg Asp Phe Gly Tyr Cys Thr Ala Ser Trp Val His Glu Gly Phe 1 5 10 15 Ser Arg Tyr <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 72 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 73 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 74 Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 75 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 76 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 76 Ser Ile Ile Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Glu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 77 Ile Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 78 Gln Asn Ala Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 80 Gln Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81 Phe Val Lys Gly Asn Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 82 Gln Asn Asn Tyr Tyr Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 83 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 83 Ser Phe Gly Met His 1 5 <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 84 Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Ser Ile Tyr Tyr Val Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 85 Asn Ala Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 86 Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 87 Asn Tyr Phe Val His 1 5 <210> 88 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 88 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 89 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 89 Leu Ser Leu Arg Phe Phe Ala Tyr 1 5 <210> 90 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 90 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 91 Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 92 Gln Asn Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 93 Ser Tyr Ile Met His 1 5 <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 94 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 95 Leu Gly Phe Thr Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 96 <211> 16 <212> PRT <213> Camelus <400> 96 Cys Ile Asp Ile Tyr Gly Arg Thr Ser Tyr Thr Asp Pro Val Lys Gly 1 5 10 15

Claims (23)

  1. 항-인간 클라우딘(Claudin)18.2 항체 부분 및 항-PD-L1 항체 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1 단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 상보성 결정 영역(CDR)이
    서열 번호 93, 75, 79, 83 또는 87로 표시되는 HCDR1,
    서열 번호 94, 76, 80, 84 또는 88로 표시되는 HCDR2와
    서열 번호 95, 77, 81, 85 또는 89로 표시되는 HCDR3; 및
    서열 번호 90 또는 72로 표시되는 LCDR1,
    서열 번호 91 또는 73으로 표시되는 LCDR2와
    서열 번호 92, 74, 78, 82 또는 86으로 표시되는 LCDR3
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR이
    (Z1) 서열 번호 93, 94와 95로 표시되는 HCDR1, HCDR2와 HCDR3; 및 서열 번호 90, 91과 92로 표시되는 LCDR1, LCDR2와 LCDR3;
    (Z2) 서열 번호 75, 76과 77로 표시되는 HCDR1, HCDR2와 HCDR3; 및 서열 번호 72, 73과 74로 표시되는 LCDR1, LCDR2와 LCDR3;
    (Z3) 서열 번호 79, 80과 81로 표시되는 HCDR1, HCDR2와 HCDR3; 및 서열 번호 72, 73과 78로 표시되는 LCDR1, LCDR2와 LCDR3;
    (Z4) 서열 번호 83, 84와 85로 표시되는 HCDR1, HCDR2와 HCDR3; 및 서열 번호 72, 73과 82로 표시되는 LCDR1, LCDR2와 LCDR3; 및
    (Z5) 서열 번호 87, 88과 89로 표시되는 HCDR1, HCDR2와 HCDR3; 및 서열 번호 72, 73과 86으로 표시되는 LCDR1, LCDR2와 LCDR3
    으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항-PD-L1 항체가 단일 도메인 항체인 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 단일 도메인 항체의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)이 서열 번호 69로 표시되는 HCDR1, 서열 번호 70 또는 96으로 표시되는 HCDR2와 서열 번호 71로 표시되는 HCDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이중특이성 항체가 2개의 단량체로 구성된 이량체이고, 상기 단량체가 N-말단에서 C-말단까지 식 I로 표시되는 구조를 가지는 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체:
    Figure pct00033

    상기 식에서,
    L1, L2 및 L3은 각각 독립적으로 결합 또는 연결요소이고;
    VH는 항-인간 클라우딘18.2 항체의 중쇄 가변 영역을 나타내고;
    VL은 항-인간 클라우딘18.2 항체의 경쇄 가변 영역을 나타내고;
    CH는 항-인간 클라우딘18.2 항체의 중쇄 불변 영역을 나타내고;
    CL은 항-인간 클라우딘18.2 항체의 경쇄 불변 영역을 나타내고;
    VHH는 항-PD-L1 단일 도메인 항체를 나타내고;
    "-"는 펩타이드 결합을 나타내고;
    "~"는 이황화 결합 또는 공유 결합을 나타낸다.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열이 서열 번호 31, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 32, 서열 번호 33 또는 서열 번호 34로 표시되는 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-인간 클라우딘18.2 항체의 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열이 서열 번호 29, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 28 또는 서열 번호 30으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
  9. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체(VHH)의 아미노산 서열이 서열 번호 51, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 53 또는 서열 번호 54로 표시되는 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 이중특이성 항체의 L쇄(VL-L3-CL)의 아미노산 서열이 서열 번호 63, 서열 번호 59, 서열 번호 61 또는 서열 번호 65로 표시되고; 상기 이중특이성 항체의 H쇄(VH-L1-CH-L2-VHH)의 아미노산 서열이 서열 번호 64, 서열 번호 60, 서열 번호 62 또는 서열 번호 66으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이중특이성 항체가 부분적으로 또는 완전히 인간화된 항체인 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
  12. 제1항에 있어서,
    서열이 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65 또는 서열 번호 66으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1 단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 항-인간 클라우딘18.2 항체 부분이 인간 클라우딘18.2 단백질의 세포외 영역에 결합되고, 상기 항-인간 클라우딘18.2 항체 부분의 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33 또는 서열 번호 34로 표시되는 것을 특징으로 하는, 인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1 단백질을 표적으로 하는 이중특이성 항체.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 항-PD-L1 항체의 서열이 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53 또는 서열 번호 54로 표시되는 것을 특징으로 하는, 인간 클라우딘18.2 및 인간 PD-L1 단백질을 표적으로 하는, 이중특이성 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  16. 제15항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  17. 제16항에 따른 벡터를 함유하거나, 게놈에 제15항에 따른 폴리뉴클레오티드가 통합된 것을 특징으로 하는, 유전적으로 조작된 숙주 세포.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체의 제조 방법으로서,
    (i) 상기 이중특이성 항체를 함유하는 혼합물을 수득하기에 적합한 조건 하에 제17항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (ii) 단계 (i)에서 수득한 혼합물을 정제 및/또는 분리하여, 상기 이중특이성 항체를 수득하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  19. (a) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체; 및
    (b) 약학적으로 허용 가능한 담체
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  20. (a) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체; 및
    (b) 검출 가능한 마커, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종 및 효소로 이루어진 군에서 선택되는 접합 부분
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역접합체.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체의 암(또는 종양), 감염 또는 면역조절 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에서의 용도.
  22. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체의 종양 성장을 억제하기 위한 약물의 제조에서의 용도.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    상기 암 또는 종양이 결직장암, 유방암, 난소암, 췌장암, 위암, 식도암, 전립선암, 신장암, 자궁경부암, 골수암, 림프암, 백혈병, 갑상선암, 자궁내막암, 자궁암, 방광암, 신경내분비암, 두경부암, 간암, 비인두암, 고환암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 흑색종, 기저세포 피부암, 편평세포 피부암, 융기성 피부섬유육종, 메르켈 세포암, 교모세포종, 신경교종, 육종, 중피종 및 골수이형성 증후군으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 용도.
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