CN112770723A - 新型cldn 18.2特异性单克隆抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了新颖的抗CLDN 18.2抗体和嵌合抗原受体（CAR）、包含其的细胞或组合物、编码抗CLDN 18.2 CAR的载体或质粒、抗CLDN18.2抗体‑药物缀合物（ADC）、含有抗CLDN 18.2抗体的双特异性抗体、及其产生方法、或将其用于检测或治疗卵巢癌或前列腺癌的方法。本文还提供了抗CLDN 18.2抗体、包含其的组合物、编码其的核酸序列、以及用于检测CLDN 18.2的试剂盒。

Description

新型CLDN 18.2特异性单克隆抗体及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2018年7月25日提交的美国临时申请62/703,036号的优先权，其内容在此通过引用合并于本发明。
技术领域
本发明涉及新颖的CLDN 18.2抗体和由其衍生的嵌合抗原受体(CAR)、包含它们的细胞或组合物、以及将其用于治疗包括实体瘤的治疗的方法。
背景技术
紧密连接蛋白(claudin)-18(一种紧密连接分子)的同种型2(CLDN 18.2)已知为选择性谱系标记。已经观察到它在原发性胃癌和转移中有很大比例表达。在胰腺、食道、卵巢和肺部肿瘤中也发现了外源性激活。尽管CLDN 18.2在正常组织中的表达受到高度限制，但在多种癌症中都被异位激活。参见Sahin et al.,Claudin-18 splice variant 2is apan-cancer target suitable for therapeutic antibody development,Clin.CancerRes.2008；14)23(:7624–34。因此，针对这种同种型的抗体可用于治疗胃肠道(GI)肿瘤，例如胃、胰腺、食道、卵巢和肺部肿瘤(例如IMAB362(claudiximab，开发自GanymedPharmaceuticals AG)。
发明概述
本发明提供了针对CLDN 18.2的新型抗体及其组合物和使用方法。更具体地，本发明提供了用于治疗表达CLDN 18.2的肿瘤(例如GI肿瘤，其包括但不限于胃、胰腺、食道、胆道、结直肠、结肠、直肠、卵巢和肺癌)的新型抗CLDN 18.2抗体。靶标CLDN 18.2在这些肿瘤的大多数中高度表达，但脱靶阳性率受到限制，因此具有理想的安全性。因此，一方面，所述组合物特别可用于治疗表达或过表达CLDN 18.2的肿瘤或癌细胞。
在一方面，本发明提供了分离的抗体，所述抗体包含重链(HC)免疫球蛋白可变域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变域序列，其中所述抗体结合CLDN 18.2的表位。一方面，抗体结合CLDN 18.2的表位，但不结合CLDN 18.1的表位。一方面，该抗体是人源化抗体，其包含表3中鉴定的CDR中的一个或更多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个或全部八个，以及表4中公开的抗体。在另一方面，所述抗体以高特异性结合，即它们以与表达CLDN18.2的细胞的结合的大于80％、或者大于85％、或者大于90％、或者大于95％的亲和力与CLDN 18.2结合，而以小于20％、或者小于15％、或者小于10％，或者小于5％的亲和力与CLDN 18.1结合。这样的例子在图1a、1b和9中示出。在那里，抗体对于表达CLDN18.2的肿瘤细胞更具特异性，并且由于它们不与表达CLDN18.1的正常细胞结合而具有较低的毒性。
在一些实施方案中，抗体是对第二靶蛋白具有结合特异性的双特异性抗体。在一些实施方案中，第二靶蛋白选自IL-1、CD3、CD16、CD19、CD28、CD47、CD64、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、CD28、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM、BTLA以及KIR。在一些实施方案中，抗体被包含在抗体和另一种试剂(例如毒素或药物)之间形成的抗体药物缀合物(ADC)中。在一些实施方案中，抗体可以缀合至治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应修饰剂、药剂和/或聚乙二醇(PEG)。
在另一方面，本发明提供了本文所公开的分离的抗CLDN 18.2抗体或其片段以及可检测或纯化的标记，其单独存在或与CLDN 18.2抗原或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR 1、CDR 2、CDR3)一起，其在一方面彼此结合形成抗原/抗体复合物。本文进一步提供了包含该抗原/抗体复合物的离体细胞。
本发明的方面涉及一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR 2、CDR3)；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；以及(d)细胞内结构域。本发明的其他方面涉及一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR 1、CDR 2、CDR3)；(b)铰链结构域；(c)CD28跨膜结构域；(d)选自CD28共刺激信号传导区域、4-1BB共刺激信号传导区域、ICOS共刺激信号传导区域和OX40共刺激区域的一个或多个共刺激区域；以及(e)CD3ζ信号传导结构域及其替代物。
在另一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)抗CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR 1、CDR 2、CDR3)，(b)CD8α铰链结构域；(c)CD8α跨膜结构域；(d)CD28和/或4-1BB共刺激信号传导区域；以及(e)CD3ζ信号传导结构域及其替代物。
在另一方面，本发明提供了一种分离的核酸序列，其编码抗CLDN 18.2抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或抗CLDN 18.2 CAR。
在另一方面，本发明提供了一种载体，其包含编码抗CLDN 18.2抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体或抗CLDN 18.2 CAR的分离的核酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种载体，其包含编码抗CLDN 18.2抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体或抗CLDN 18.2 CAR的分离的核酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含载体和以下中的一种或多种：抗CLDN 18.2抗体；和/或双特异性抗体；和/或嵌合抗体；和/或人源化抗体；和/或抗CLDN18.2 CAR；和/或编码抗CLDN 18.2抗体双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体或抗CLDN18.2 CAR的分离的核酸；和/或包含编码抗CLDN 18.2抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体或抗CLDN 18.2 CAR的分离的核酸序列的载体；和/或包含抗CLDN 18.2 CAR的分离细胞。
在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含载体和以下中的一种或多种，或基本上由其组成，或由其组成：抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR 1、CDR 2、CDR3)，编码抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR 2、CDR3)的核酸，包含编码抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR 2、CDR3)的核酸的载体，包含抗CLDN 18.2 CAR和/或编码抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR2、CDR3)的多核苷酸的分离的细胞；和/或编码CAR的分离的核酸；和/或包含编码CAR的核酸的载体；和/或表达抗CLDN 18.2CAR的分离的细胞；和/或抗CLDN18.2抗体；和/或双特异性抗体；和/或人源化抗体。
本发明还提供了组合物。在一个实施方案中，组合物包含本发明的抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR 2、CDR3)、融合蛋白、或CAR和/或CAR表达细胞和药学上可接受的载体。本发明还提供了分离的细胞，其包含本发明的编码抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR 2、CDR3)的多核苷酸或融合蛋白或双特异性抗体中的一种或多种。
本发明进一步提供了一种治疗表达CLND 18.2抗原的肿瘤或生长(如在有需要的患者中的癌症)的方法，其包括向该患者施用本发明的抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR 2、CDR3)、融合蛋白、或CAR和/或CAR表达细胞。癌症的非限制性实例包括GI癌、膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胆道癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌和甲状腺癌。
附图说明
图1A-1B显示了抗CLDN18.2杂交瘤抗体的结合特异性。在FACS分析中使用表达人CLDN18.1或人CLDN18.2的CHO稳定细胞系。所有抗CLDN18.2杂交瘤抗体均以10μg/ml的浓度使用。
图2显示了在FACS分析中抗CLDN18.2杂交瘤抗体克隆T29S9与CLDN18.1和CLDN18.2两者结合。分析中使用的T29S9浓度为10μg/ml。
图3显示了通过滴定至CHO-CLDN18.2细胞的抗CLDN18.2杂交瘤抗体的结合。
图4显示了CLDN18.2杂交瘤抗体与包被有CLDN18.2 EC1蛋白的板的结合。将人CLDN18.2EC1-huFc蛋白以1μg/ml包被到ELISA孔中。
图5显示了抗CLDN18.2杂交瘤抗体与KATO III细胞的结合。在FACS分析中，抗CLDN18.2杂交瘤抗体的浓度为20μg/ml。
图6显示了在FACS分析中通过滴定至CHO-CLDN18.2细胞的抗CLDN18.2嵌合抗体的结合。
图7显示了抗CLDN18.2嵌合抗体与KATO III细胞的结合。在FACS分析中，抗CLDN18.2嵌合抗体的浓度为20μg/ml。
图8A-8E显示了CHO-CLDN18.2细胞中抗人CLDN18.2抗体诱导的受体内在化。
图9显示了人源化的抗CLDN18.2抗体HuT252S4以与嵌合T252S4抗体相似或更高的亲和力结合稳定表达CLDN18.2的CHO细胞上的细胞表面人CLDN18.2。
详细说明
应该理解的是，本公开不被限制至所描述的特定方面，因为这些方面当然可能发生改变。还应该理解的是，本文所用的术语仅仅是为了描述特定的方面，并且并非旨在限制，因为本公开的范围将仅仅被附加的权利要求限制。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术的和科学的术语都具有与属于本技术的技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本技术的实践或测试，但现在描述的是优选的方法、装置和材料。本文所引用的所有技术和专利出版物其全文均通过引用方式并入本文。本文的任何内容均不应被解释为承认由于在先公开而本公开不早于这样的公开。
除非另有说明，否则本技术的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这是在本领域的技术范围内。参见例如，Green andSambrook eds.(2012)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th edition；Ausubelet al.eds.(2015)Current Protocols in Molecular Biology系列；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)系列；MacPherson et al.(2015)PCR1:APractical Approach(IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al.(1995)PCR 2:A Practical Approach；McPherson et al.(2006)PCR:The Basics(GarlandScience)；Harlow and Lane eds.(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Greenfielded.(2014)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2010)Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique,6th edition；Gait ed.(1984)OligonucleotideSynthesis；美国专利号4,683,195；Hames and Higgins eds.(1984)Nucleic AcidHybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Herdewijn ed.(2005)Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications；Hames and Higgins eds.(1984)Transcription and Translation；Buzdin and Lukyanov ed.(2007)NucleicAcids Hybridization:Modern Applications；Immobilized Cells and Enzymes(IRLPress(1986))；Grandi ed.(2007)In Vitro Transcription and TranslationProtocols,2nd edition；Guisan ed.(2006)Immobilization of Enzymes and Cells；Perbal(1988)A Practical Guide to Molecular Cloning,2nd edition；Miller andCalos eds,(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring HarborLaboratory)；Makrides ed.(2003)Gene Transfer and Expression in MammalianCells；Mayer and Walker eds.(1987)Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology(Academic Press,London)；Lundblad and Macdonald eds.(2010)Handbook ofBiochemistry and Molecular Biology,4th edition；以及Herzenberg et al.eds(1996)Weir's Handbook of Experimental Immunology,5th edition。以及在提交时均可用的每个版本的最新版本。
所有数字指定(包括范围)，例如pH、温度、时间、浓度、以及分子量，都是近似值，其在适当时以1.0或0.1、或+/-15％、或10％、或5％、或2％的增量((+)或(-))变化。应该理解的是，尽管并非总是明确地说明，但是所有的数字值前面都有术语“约”。还应该理解的是，尽管并非总是明确地说明，但是本文所述的试剂仅是示例性的，并且这些试剂的等效物在本领域是已知的。
在没有明确描述的情况下应该推断并且除非另有说明，否则当本技术涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体时，这样的等效物或生物等效物旨在落入本技术的范围之内。
定义
除非上下文另有明确说明，否则如说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
如本文使用的，术语“动物”表示活的多细胞脊椎动物生物，是包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语“哺乳动物”包括人类哺乳动物和非人类哺乳动物。
术语“对象”、“宿主”、“个体”和“患者”在此被可交换地使用，是指人类和兽医学对象，例如人类、动物、非人类灵长类动物、狗、猫、绵羊、老鼠、马和牛。在一些实施方案中，对象是人。
如本文使用的，术语“抗体”统一指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如且不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其组合，以及在任何脊椎动物中在免疫反应期间产生的类似分子，所述脊椎动物例如是哺乳动物(例如人类、山羊、兔和鼠)以及非哺乳动物物种(例如鲨鱼免疫球蛋白)。除非另有具体说明，否则术语“抗体”包括特异性地结合至感兴趣的分子(或感兴趣的高度相似的分子的群组)以至于实质性排除结合至其他分子的完整的免疫球蛋白和“抗体片段”或“抗原结合片段”(例如，在生物样品中与对其他分子的结合常数相比，对感兴趣的分子的结合常数大至少103M-1、大至少104M-1或大至少105M-1的抗体和抗体片段)。术语“抗体”还包括遗传工程形式，例如嵌合抗体(例如鼠源或人源化非灵长类抗体)、异源偶联抗体(例如双特异性抗体)。还请参见Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.)；Owen et al.,Kuby Immunology,7th Ed.,W.H.Freeman&Co.,2013；Murphy,Janeway’s Immunobiology,8th Ed.,Garland Science,2014；Male et al.,Immunology(Roitt),8th Ed.,Saunders,2012；Parham,The ImmuneSystem,4th Ed.,Garland Science,2014。
就抗体结构而言，免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重(H)链和轻(L)链。存在两种类型的轻链：λ和κ。存在决定抗体分子的功能活性的五种主要的重链类型(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每个重链和轻链都包括恒定区和可变区(所述区也被称为“结构域”)。重链和轻链可变区一起特异性地结合抗原。重链和轻链可变区包括被三个高度可变区间隔开的“框架”区，所述高度可变区也被称为“互补决定区”或“CDR”。框架区和CDR的范围已经被确定(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,U.S.Department of Health and Human Services,1991，其以引用的方式合并入本文中)。Kabat数据库现在在线维护。不同的轻链或重链的框架区的序列在物种之内是相对保守的。抗体的框架区，即组成的轻链和重链的结合的框架区，主要采用β折叠构象，而CDR形成环，该环连接所述β折叠结构或者在一些情况中形成所述β折叠的一部分。因此，框架区作用来形成支架，其用来通过链间非共价相互作用将CDR定位在正确的朝向中。
CDR主要负责结合至抗原的表位。每个链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始依次进行编号，并且通常也由该特定的CDR所位于的链而确定。因此，VH CDR3位于发现它的抗体的重链的可变域中，而VL CDR1是来自发现它的抗体的轻链的可变域的CDR1。结合CLDN 18.2的抗体将具有特异性VH区和VL区序列，从而具有特异性CDR序列。具有不同的特异性(即对不同抗原具有不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。虽然抗体与抗体之间不同的是CDR，但是在CDR之内只有数量有限的氨基酸位置直接涉及抗原结合。在CDR之内的这些位置被称为特异性决定残基(SDR)。
如本文所用，术语“抗原”是指可以被特定体液或细胞免疫产物(例如抗体分子或T细胞受体)特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单的中间代谢产物、糖(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子，例如复杂的碳水化合物(例如多糖)、磷脂和蛋白质。抗原的常见类别包括但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生虫抗原、肿瘤抗原、涉及自身免疫疾病、变态反应和移植排斥、毒素的抗原和其他杂种抗原。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指可以特异性结合抗原靶标的任何蛋白质或多肽结构域。
如本文使用的，术语“自体同源的”在涉及细胞时是指，被分离并且被输回相同的对象(受体或宿主)的细胞。“同种异体的”是指非自体同源的细胞。
如本文使用的，术语“B细胞”是指在适应性免疫系统的体液免疫中的一类淋巴细胞。B细胞主要作用来制造抗体、用作抗原呈递细胞、释放细胞因子、以及在抗原相互作用引起的刺激之后发展成记忆B细胞。B细胞与其他淋巴细胞(例如T细胞)的不同点在于细胞表面上存在B细胞受体。B细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业上可获得的B细胞系的非限制性实施例包括AHH-1(
Figure BDA0002979842930000081
CRL-8146TM)、BC-1(
Figure BDA0002979842930000082
CRL-2230TM)、BC-2(
Figure BDA0002979842930000083
CRL-2231TM)、BC-3(
Figure BDA0002979842930000084
CRL-2277TM)、CA46(
Figure BDA0002979842930000085
CRL-1648TM)、DG-75[D.G.-75](
Figure BDA0002979842930000086
CRL-2625TM)、DS-1(
Figure BDA0002979842930000087
CRL-11102TM)、EB-3[EB3](
Figure BDA0002979842930000088
CCL-85TM)、Z-138(ATCC#CRL-3001)、DB(ATCC CRL-2289)、Toledo(ATCC CRL-2631)、Pfiffer(ATCC CRL-2632)、SR(ATCC CRL-2262)、JM-1(ATCC CRL-10421)、NFS-5C-1(ATCC CRL-1693)；NFS-70C10(ATCC CRL-1694)、NFS-25C-3(ATCC CRL-1695)和SUP-B15(ATCC CRL-1929)细胞系。进一步的实施例包括但不限于衍生自间变性和大细胞淋巴瘤的细胞系，例如DEL、DL-40、FE-PD、JB6、Karpas 299、Ki-JK、Mac-2A Ply1、SR-786、SU-DHL-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10和-16、DOHH-2、NU-DHL-1、U-937、Granda 519、USC-DHL-1、RL；霍奇金淋巴瘤，例如DEV、HD-70、HDLM-2、HD-MyZ、HKB-1、KM-H2、L 428、L540、L1236、SBH-1、SUP-HD1、SU/RH-HD-l。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括AmericanType Culture Collection或ATCC(atcc.org/)以及German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures(dsmz.de/)。
如本文使用的，“癌症”是一种疾病状态，其特征是在对象中存在表现出异常的不受控制的复制的细胞，并且在一些方面可以与术语“肿瘤”互换地使用。术语“癌症或肿瘤抗原”是指已知与癌细胞或肿瘤细胞或组织在表面上结合并表达的抗原，术语“癌或肿瘤靶向抗体”是指靶向这种抗原的抗体。
如本文使用的，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指这样的融合蛋白，其包括能够结合至抗原的细胞外结构域、衍生自与该细胞外结构域衍生自的多肽不同的多肽的跨膜结构域、以及至少一个细胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时被称为“嵌合受体”、“T-体(T-body)”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合至抗原的细胞外结构域”意为能够结合至某个抗原的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”或“细胞内信号传导结构域”意为已知用作发送信号来引起细胞内的生物过程的激活或抑制的结构域的任何寡肽或多肽。在某些实施方案中，除了主要的信号传导结构域外，细胞内结构域可以包含一个或多个共刺激信号传导结构域，或基本上由其组成，或进一步由其组成。“跨膜结构域”意为已知跨越细胞膜并且能够作用来连接细胞外结构域和信号传导结构域的任何寡肽或多肽。嵌合抗原受体可以任选地包括“铰链(hinge)结构域”，其用作细胞外结构域和跨膜结构域之间的连接子。本文提供了编码此类结构域的多核苷酸的非限制性实例，例如：
铰链结构域：IgG1重链铰链序列：
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG
跨膜结构域：CD28跨膜区域：
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
细胞内结构域：4-1BB共刺激信号传导区域：
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
细胞内结构域：CD28共刺激信号传导区域：
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
细胞内结构域：CD3ζ信号传导区域：
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA，
或其每一个的等效物。
每个示例性结构域组分的其他实施方案包括与由以上公开的核酸序列编码的蛋白质具有至少70％、或至少80％的氨基酸序列同一性、优选90％的序列同一性、或者至少95％的序列同一性的具有相似生物学功能的其他蛋白质。此外，本文提供了此类结构域的非限制性实例。
如本文使用的，术语“CD8α铰链结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD8α铰链结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在Pinto,R.D.et al.(2006)Vet.Immunol.Immunopathol.110:169-177中提供了人类、小鼠和其他物种的CD8α铰链结构域的示例性序列。在Pinto,R.D.et al.(2006)Vet.Immunol.Immunopathol.110:169-177中提供了与CD8α铰链域相关的序列。
这种的非限制性的实施例包括：
人CD8α铰链结构域：
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
小鼠CD8α铰链结构域：
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY
猫CD8α铰链结构域：
PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY，
及其每一个的等效物。
如本文使用的，术语“CD8α跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD8α跨膜结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与人类T细胞表面糖蛋白CD8α链的183至203位氨基酸(GenBank登录号：NP_001759.3)、或者小鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链的197至217位氨基酸(GenBank登录号：NP_001074579.1)、以及大鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链的190至210位氨基酸(GenBank登录号：NP_113726.1)相关的片段序列，提供了CD8α跨膜结构域的其他的示例性序列。与每个列出的登录号相关的序列提供如下：
人CD8α跨膜结构域：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
小鼠CD8α跨膜结构域：IWAPLAGICVALLLSLIITLI
大鼠CD8α跨膜结构域：IWAPLAGICAVLLLSLVITLI，及其每一个的等效物。
如本文使用的，术语“CD28跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD28跨膜结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与GenBank登录号XM_006712862.2和XM_009444056.1相关的片段序列，提供了CD28跨膜结构域的其他的非限制性的示例性序列。本文提供了与列出的每个登录号相关的序列。
如本文使用的，术语“4-1BB共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的4-1BB共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号20130266551A1(提交为美国专利申请号13/826,258)中提供了4-1BB共刺激信号传导区域的非限制性示例性序列，例如以下提供的示例性序列：
4-1BB共刺激信号传导区域：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL，及其等效物。
如本文使用的，术语“CD28共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD28共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国专利号5,686,281；Geiger,T.L.et al.,Blood 98:2364-2371(2001)；Hombach,A.et al.,J Immunol 167:6123-6131(2001)；Maher,J.et al.NatBiotechnol 20:70-75(2002)；Haynes,N.M.et al.,J Immunol 169:5780-5786(2002)；Haynes,N.M.et al.,Blood 100:3155-3163(2002)中提供了CD28共刺激信号传导结构域的示例序列。非限制性的实施例包括以下CD28序列的114-220残基：
MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS，及其等效物。
如本文使用的，术语“ICOS共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的ICOS共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2015/0017141A1中提供了ICOS共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列。编码该序列的示例性的多核苷酸提供如下：
由以下多核苷酸编码的ICOS共刺激信号传导区域：
ACAAAAAAGA AGTATTCATC CAGTGTGCAC GACCCTAACG GTGAATACAT GTTCATGAGAGCAGTGAACA CAGCCAAAAA ATCCAGACTC ACAGATGTGA CCCTA，及其等效物。
如本文使用的，术语“OX40共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的OX40共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2012/20148552A1中公开了OX40共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列，以下提供了编码其的示例性序列。
由以下多核苷酸编码的OX40共刺激信号传导区域：
AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGACCCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC，及其等效物。
如本文使用的，术语“CD28共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD28共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国专利号5,686,281；Geiger,T.L.et al.(2001)Blood 98:2364-2371；Hombach,A.et al.(2001)J Immunol 167:6123-6131；Maher,J.et al.(2002)Nat Biotechnol 20:70-75；Haynes,N.M.et al.(2002)J Immunol169:5780-5786(2002)；Haynes,N.M.et al.(2002)Blood 100:3155-3163中提供了CD28共刺激信号传导结构域的示例序列。非限制性的实施例包括以下序列的114-220残基：
CD28序列：MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS，及其等效物。
如本文使用的，术语“CD3ζ信号传导结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD3ζ信号传导结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国专利申请号13/826,258中提供了CD3ζ信号传导结构域的非限制性示例性序列，例如：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR，及其等效物。
“组合物”通常是指活性剂(例如化合物或组合物)和天然存在或非天然存在的载体的组合，所述载体是惰性的(例如可检测试剂或标签)或活性的，例如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等，并且包括药学上可接受的载体。载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二寡糖、三寡糖、四寡糖和寡糖；衍生的糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独地或组合地存在，以重量或体积计单独地或组合地占1-99.99％。示例性的蛋白赋形剂包括血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA))、明胶、酪蛋白等。还具有缓冲能力的代表性的氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也意在本技术的范围之内，其实施例包括但不限于：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(葡萄糖醇)和肌醇。
如本文使用的，术语“包含”旨在意为组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素。“基本上由……组成”当被用来定义组合物和方法时，应该意为排除对于预期目的的组合来说具有任何实质性作用的其他元素。例如，如本文定义的基本上由该元素组成的组合物，将不会从分离和纯化方法中排除微量污染物和药学上可接受的载体(例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等)。“由……组成”应当意为排除多于微量元素的其他成分和用于施用本文公开的组合物的实质性方法步骤。通过这些过渡性术语的每一个进行定义的方面都在本公开的范围之内。
如本文使用的，术语“共有序列(consensus sequence)”是指这样的氨基酸或核苷酸序列，其通过对齐一系列的多个序列而确定，并且定义了代表在所述多个序列的每个对应位置处的氨基酸或碱基的主要选择的理想化序列。根据该系列的多个序列的序列，该系列的共有序列可以与这些序列的每一个有零个、一个、几个、或更多个取代基的不同。并且，根据该系列的多个序列的序列，可以对该系列确定一个以上的共有序列。已经对共有序列的生成进行过深入的数学分析。可以使用各种软件程序来确定共有序列。
如本文使用的，术语“CRISPR”是指依赖于规律成簇的间隔短回文重复序列通路的序列特异性基因操作的技术。CRISPR可用于执行基因编辑和/或基因调控，以及用于简单地将蛋白质靶向至特定的基因组位置。基因编辑是指一种基因工程的类型，其中通过向多核苷酸序列引入缺失、插入、单链或双链断裂或碱基取代来改变该靶多核苷酸的核苷酸序列。在一些方面，CRISPR介导的基因编辑利用非同源末端连接(NHEJ)或同源重组的途径来执行该编辑。基因调控是指增加或减少特定基因产物(例如蛋白质或RNA)的产生。
如本文使用的，术语“gRNA”或“指导RNA”是指用于靶向特定基因以利用CRISPR技术进行校正的指导RNA序列。设计用于靶标特异性的gRNA和供体治疗性多核苷酸的技术是本领域众所周知的。例如Doench,J.,et al.Nature biotechnology2014；32(12):1262-7、Mohr,S.et al.(2016)FEBS Journal 283:3232-38、以及Graham,D.,et al.GenomeBiol.2015；16:260。gRNA包含融合多核苷酸或多核苷酸，或基本上由其组成，或进一步由其组成，所述融合多核苷酸包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRIPSPR RNA(tracrRNA)；所述多核苷酸包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRIPSPR RNA(tracrRNA)。在一些方面，gRNA是合成的(Kelley,M.et al.(2016)J of Biotechnology 233(2016)74-83)。如本文所用，gRNA的生物学等效物包括但不限于可以将Cas9或其等效物引导至特定核苷酸序列(例如细胞基因组的特定区域)的多核苷酸或靶向分子。
如本文所用，“细胞还原疗法”包括但不限于化学疗法、冷冻疗法和放射疗法。起到减少细胞增殖作用的药剂是本领域已知的并且被广泛使用。仅在分裂时杀死癌细胞的化学疗法药物被称为细胞周期特异性。这些药物包括在S期起作用的药物，包括拓扑异构酶抑制剂和抗代谢物。
拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(拓扑异构酶I和II)的作用的药物。在化学治疗过程中，拓扑异构酶控制复制所需的DNA结构的操纵，因此具有细胞周期特异性。拓扑异构酶I抑制剂的实例包括上面列出的喜树碱类似物、伊立替康和托泊替康。拓扑异构酶II抑制剂的例子包括氨苄青霉素(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、依托泊苷磷酸酯和替尼泊苷(teniposide)。
抗代谢物通常是正常代谢底物的类似物，经常干扰涉及染色体复制的过程。它们在周期的特定阶段攻击细胞。抗代谢药物包括：叶酸拮抗剂，例如甲氨蝶呤；嘧啶拮抗剂，例如5-氟尿嘧啶、呋喃核苷、阿糖胞苷、卡培他滨和吉西他滨；嘌呤拮抗剂，例如6-巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤；腺苷脱氨酶抑制剂，例如克拉屈滨、氟达拉滨、奈拉拉滨和喷司他丁；等等。
植物生物碱衍生自某些类型的植物。长春花生物碱由长春花植物(Catharanthusrosea)制成。紫杉烷是从太平洋紫杉树(红豆杉)的树皮制成的。长春花生物碱和紫杉烷类也被称为抗微管剂。鬼臼毒素来自五月苹果植物。喜树碱类似物源自亚洲的“快乐树”(Camptotheca acuminata)。鬼臼毒素和喜树碱类似物也归类为拓扑异构酶抑制剂。植物生物碱通常是细胞周期特异性的。
这些试剂的实例包括长春花生物碱，例如长春新碱、长春碱和长春瑞滨；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西紫杉醇；鬼臼毒素，例如依托泊苷和替尼索德；以及喜树碱类似物，例如伊立替康和托泊替康。
冷冻疗法包括但不限于涉及降低温度的疗法，例如低温疗法。
放射疗法包括但不限于暴露于放射线，例如本领域已知的电离辐射、UV辐射。示例性剂量包括但不限于至少约2Gy至不超过约10Gy的电离辐射剂量和/或至少约5J/m2至不大于约50J/m2(通常为约10J/m2)的紫外辐射剂量。
如本文使用的，术语“可检测的标记物”是指能够直接或间接产生可检测的信号的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括酶，其例如通过比色、荧光、发光产生可检测的信号，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、发色团(例如荧光剂、发光染料)、带有通过电子显微镜或通过其电性质(例如电导率、电流分析、伏安法、阻抗)检测的电子密度的基团、可检测的基团，例如其分子具有足够的大小来诱导其物理和/或化学性质上的可检测的修饰，这样的检测可以通过任选的方法完成，例如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化或物理方法(例如原子力谱、隧道效应)、或放射性分子(例如32P、35S或125I)。
“有效量”是指该量的试剂或合并的量的两种或多种试剂在被施用来治疗哺乳动物或其他个体时，足以影响对疾病的这种治疗。“有效量”将会根据试剂、疾病及其严重程度和要被治疗的对象的年龄、体重等而发生变化。
术语“编码”在被应用至核酸序列时是指，被陈述来“编码”多肽的多核苷酸，以其天然状态或者在通过本领域技术人员熟知的方法操纵时，可以被转录和/或翻译来产生用于该多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这样的核酸的互补序列，并且编码序列可以由此导出。
如本文使用的，术语“增强子”是指不管其相对于要被表达的氨基酸序列的位置和朝向，都增强、改善或改良氨基酸序列的转录的序列元件。增强子可以增强来自单个启动子的转录，或者同时增强来自一个以上的启动子的转录。只要保留或基本上保留该改善转录的功能(例如至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的野生型活性，即全长序列的活性)，则野生型增强子序列的任何截断的、突变的或修饰的变体都同样在上述定义之内。
在一方面，术语抗体的“等效物”或“生物等效物”意为抗体如通过ELISA或其他合适的方法测定地选择性地结合其表位蛋白或其片段的能力。生物等效抗体包括但不限于与参照抗体结合至相同的表位的抗体、肽、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物和抗体模拟物。
在没有明确描述的情况下应该推断、并且除非另有说明，否则当本公开涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体时，这样的等效物或生物等效物旨在落入本公开的范围内。如本文使用的，在提及参照蛋白、抗体、多肽或核苷酸时，术语“其生物等效物”旨在与“其等效物”是同义的，是指具有最小的同源性，同时仍然保持期望的结构或功能。除非本文具体说明，否则可以预期的是，本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白还包括其等效物。例如，等效物是指与参照蛋白、多肽或核苷酸具有至少约70％同源性或同一性、或至少80％同源性或同一性和替代地、或至少约85％、或替代地至少约90％、或替代地至少约95％、或替代地98％百分比同源性或同一性并且表现出基本上等效的生物活性。替代地，当提及多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参照多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一个序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”是指，当被对齐时，该百分比的碱基(或氨基酸)在两个序列的比较中是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定对齐和同源性或序列同一性百分比，例如在Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.1987)Supplement 30,section 7.7.18,Table 7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的对齐程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；筛选＝无；链＝两个；截点＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝HIGH SCORE；数据库＝不重复的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
如本文使用的，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或被转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括mRNA在真核细胞中的剪接。可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白的量确定基因的表达水平。在一方面，来自一个样品的基因的表达水平可以直接与来自对照或参照样品的基因的表达水平进行比较。在另一方面，来自一个样品的基因的表达水平可以在施用化合物之后直接与来自相同样品的该基因的表达水平进行比较。
短语“一线”或“二线”或“三线”是指患者接受的治疗的顺序。一线治疗方案是首先给出的治疗，而二线或三线疗法是分别在一线疗法之后或在二线疗法之后给出的。美国国家癌症研究所将一线疗法定义为“用于疾病或病症的第一治疗”。在患有癌症的患者中，主要的治疗可以是手术、化疗、放射治疗或这些疗法的组合。一线疗法还被本领域技术人员称为“主要疗法和主要治疗”。参见美国国家癌症研究所网站cancer.gov，最后一次访问是在2008年5月1日。通常，患者被给予后续的化疗方案，因为患者对一线疗法没有显示出阳性的临床或亚临床反应，或者一线疗法已经停止。
如本文使用的，当被用在两个或更多个核酸或多肽序列的内容中时，“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比是指，两个或更多个序列或子序列是相同的，或者在特定的区域(例如编码本文所述的抗体的核苷酸序列或本文所述的抗体的氨基酸序列)上特定百分比的核苷酸或氨基酸残基是相同的，例如至少60％同一性、优选地至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。可以通过比较为了进行比较而被比对的每个序列中的位置，确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源性的程度是这些序列享有的匹配的或同源的位置的数目的函数。可以使用本领域已知的软件程序来确定比对和同源性或序列同一性百分比，例如在Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel et al.,eds.1987)Supplement 30,section 7.7.18,Table7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；筛选＝无；链＝两个；截点＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝HIGHSCORE；数据库＝不重复的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。术语“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比还表示、或者可以被应用至测试序列的互补序列。所述术语还包括具有缺失和/或添加、以及具有取代的序列。如本文描述的，优选的算法可以解释间隙等。优选地，在长度至少为约25个氨基酸或核苷酸的区域上、或者更优选地在长度至少为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在同一性。“不相关的”或“非同源的”序列与本文公开的序列中的一个享有少于40％的同一性、或者替代地少于25％的同一性。
“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应来形成复合物，并且该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而被稳定的反应。可以通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或通过任何其他序列特异性的方式来发生氢键结合。所述复合物可以包括形成双螺旋结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单一的自我杂交的链、或这些的任何组合。杂交反应可以由在更广泛的过程中的步骤组成，例如PCR过程的起始步骤、或者通过核酶进行的多核苷酸的酶裂解步骤。
严格杂交条件的实施例包括：约25℃至约37℃的孵育温度；约6x SSC至约10x SSC的杂交缓冲液浓度；约0％至约25％的甲酰胺浓度；以及约4x SSC至约8x SSC的洗涤溶液。中度杂交条件的实施例包括：约40℃至约50℃的孵育温度；约9x SSC至约2x SSC的缓冲液浓度；约30％至约50％的甲酰胺浓度；以及约5x SSC至约2x SSC的洗涤溶液。高严格杂交条件的实施例包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1x SSC至约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1x SSC至约0.1x SSC的洗涤溶液、或去离子水。一般来说，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具有1、2、或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1、2或15分钟。SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸缓冲液。应该理解的是，可以采用使用其他缓冲系统的SSC的等效物。
如本文使用的，术语“分离的”是指，分子或生物体或细胞材料基本上不含其他材料。在一方面，术语“分离的”是指，核酸(例如DNA或RNA)或蛋白或多肽(例如抗体或其衍生物)或细胞或细胞器、或组织或器官与存在于自然来源中的其他DNA或RNA、或蛋白或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离。术语“分离的”还指，核酸或肽基本上不含细胞材料、病毒材料、或培养基(当通过重组DNA技术产生时)、或化学前体或其他化学品(当化学合成时)。再者，“分离的核酸”旨在包括天然地不形成为片段并且不会在天然状态下发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且旨在包括纯化的和重组的多肽。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞分离的细胞或组织，并且旨在包括培养的和工程化的细胞或组织。
如本文使用的，术语“分离的细胞”通常是指细胞基本上和组织的其他细胞分离。
“免疫细胞”包括例如衍生自在骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)、淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)以及骨髓来源的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。
如本文使用的，术语“连接子/接头序列”是指任何这样的氨基酸序列，其包含1至10个、或替代性地8个氨基酸、或替代性地6个氨基酸、或替代性地5个氨基酸，并且可以被重复1至10次、或替代性地约8次、或替代性地约6次、或替代性地约5次、或4次、或替代性地3次、或替代性地2次。例如，接头可以包含由重复三次的五肽组成的多达15个氨基酸残基。在一方面，接头序列是包含三次重复的gly-gly-gly-gly-ser的(甘氨酸4丝氨酸)3柔性多肽接头。
“对应于癌组织类型的正常细胞”是指来自与癌组织相同组织类型的正常细胞。非限制性实例是来自患有肺肿瘤的患者的正常肺细胞、或来自患有结肠肿瘤的患者的正常结肠细胞。
如本文使用的，术语“T细胞”是指在胸腺中成熟的一类淋巴细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并且与与其他淋巴细胞(例如B细胞)的不同点在于细胞表面上存在T细胞受体。T细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、自然杀伤T细胞、T调节细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。商业上可获得的T细胞系的非限制性实施例包括BCL2(AAA)Jurkat(
Figure BDA0002979842930000201
CRL-2902TM)、BCL2(S70A)Jurkat(
Figure BDA0002979842930000202
CRL-2900TM)、BCL2(S87A)Jurkat(
Figure BDA0002979842930000203
CRL-2901TM)、BCL2Jurkat(
Figure BDA0002979842930000204
CRL-2899TM)、Neo Jurkat(
Figure BDA0002979842930000205
CRL-2898TM)、TALL-104细胞毒性人类T细胞系(ATCC#CRL-11386)细胞系。进一步的实施例包括但不限于成熟的T细胞系，例如Deglis、EBT-8、HPB-MLp-W、HUT 78、HUT 102、Karpas 384、Ki 225、My-La、Se-Ax、SKW-3、SMZ-1和T34；以及未成熟的T细胞系，例如ALL-SIL、Be13、CCRF-CEM、CML-T1、DND-41、DU.528、EU-9、HD-Mar、HPB-ALL、H-SB2、HT-1、JK-T1、Jurkat、Karpas 45、KE-37、KOPT-K1、K-T1、L-KAW、Loucy、MAT、MOLT-1、MOLT 3、MOLT-4、MOLT 13、MOLT-16、MT-1、MT-ALL、P12/Ichikawa、Peer、PER0117、PER-255、PF-382、PFI-285、RPMI-8402、ST-4、SUP-T1至T14、TALL-1、TALL-101、TALL-103/2、TALL-104、TALL-105、TALL-106、TALL-107、TALL-197、TK-6、TLBR-1、-2、-3和-4、CCRF-HSB-2(CCL-120.1)、J.RT3-T3.5(ATCC TIB-153)、J45.01(ATCC CRL-1990)、J.CaM1.6(ATCC CRL-2063)、RS4；11(ATCCCRL-1873)、CCRF-CEM(ATCC CRM-CCL-119)；以及皮肤T细胞淋巴瘤细胞系，例如HuT78(ATCCCRM-TIB-161)、MJ[G11](ATCC CRL-8294)、HuT102(ATCC TIB-162)。无白血病(Nullleukemia)细胞系，包括但不限于REH、NALL-1、KM-3、L92-221，是免疫细胞的另一种商业上可获得的来源，同样的是衍生自其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例如K562红白血病、THP-1单核细胞白血病、U937淋巴瘤、HEL红白血病、HL60白血病、HMC-1白血病、KG-1白血病、U266骨髓瘤。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括American TypeCulture Collection或ATCC(atcc.org/)以及German Collection of Microorganismsand Cell Cultures(dsmz.de/)。
如本文使用的，术语“NK细胞”(也被称为自然杀伤细胞)是指起源于骨髓并且在先天免疫系统中起重要作用的一类淋巴细胞。NK细胞提供针对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其他应激细胞的快速免疫反应，即使是细胞表面上不存在抗体和主要组织相容性复合体。NK细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业性的NK细胞系的非限制性实施例包括NK-92(
Figure BDA0002979842930000206
CRL-2407TM)、NK-92MI(
Figure BDA0002979842930000207
CRL-2408TM)细胞系。进一步的实施例包括但不限于HANK1、KHYG-1、NKL、NK-YS、NOI-90和YT NK细胞系。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括American Type Culture Collection或ATCC(atcc.org/)以及German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(dsmz.de/)。
如本文涉及调节性多核苷酸时使用的，术语“可操作地连接”是指调节性多核苷酸和与其连接的多核苷酸序列之间的结合，当特定蛋白质结合至调节性多核苷酸时，转录所连接的多核苷酸。
如本文使用的，术语“过度表达”是指细胞、组织、或器官表达蛋白的量大于在对照细胞、对照组织、或器官中产生的量。过度表达的蛋白可以对于宿主细胞来说是内源性的或者对于宿主细胞来说是外源性的。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”被互换地使用，并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任意的三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、RNAi、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在修饰，则可在多核苷酸的组装之前或之后对核苷酸结构施加修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合之后被进一步修饰，例如与标签组分结合。该术语还指双链分子和单链分子。除非另有说明或者需要，否则本技术的涉及多核苷酸任何方面都包括双链形式以及已知或预测形成双链形式的两个互补的单链形式中的每一个。
如本文使用的，术语“核酸序列”和“多核苷酸”被可互换地使用来指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学的或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
如本文使用的，术语“启动子”是指调节编码序列(例如基因)的表达的任何序列。启动子可以例如是组成型的、可诱导的、可抑制的或组织特异性的。“启动子”是多核苷酸序列的一个区域并在此控制转录的起始和速率的控制序列。它可以包含遗传性元件，在此调节蛋白和分子可以结合例如RNA聚合酶和其他转录因子。
术语“蛋白”、“肽”和“多肽”被可互换地使用，并且在其最广泛的意义上是指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物子单元的化合物。所述子单元可以通过肽键而被连接。在另一方面，所述子单元可以通过其他键(例如酯键、醚键等)而被连接。蛋白或肽必须包括至少两个氨基酸，并且对于可以组成蛋白或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。如本文使用的，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。
如本文使用的，术语“纯化的”不要求绝对的纯度；相反，它旨在作为相对性的术语。因此，例如，纯化的核酸、肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物是整体地或部分地与蛋白或其他污染物分离的。通常，用于在本公开中使用的基本上纯化的肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物，在该肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物与药物载体、赋形剂、缓冲剂、吸收促进剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其它辅助成分在用于治疗性给药的完整的药物制剂中混合或制备之前，包括多于80％的存在于制剂中的所有大分子种类。更一般地，在与其他制剂成分混合之前，所述肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物被纯化，以代表大于90％、通常大于95％的存在于纯化制剂中的所有大分子种类。在其他情况中，纯化制剂可以是基本上均质的，其中其他大分子种类不能通过常规技术而被检测到。
如本文使用的，术语“纯化标记物”是指可用于纯化或鉴定的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括His、lacZ、GST、麦芽糖结合蛋白、NusA、BCCP、c-myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、樱桃、硫氧还蛋白、聚(NANP)、V5，Snap、HA、几丁质结合蛋白、Softag 1、Softag 3、Strep或S蛋白。合适的直接或间接荧光标记物包括FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、樱桃红、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、DNP、AMCA、生物素、地高辛、Tamra、得克萨斯红、罗丹明、Alexa荧光、FITC、TRITC或任何其他荧光染料或半抗原。
如本文使用的，术语“重组蛋白”是指通过重组DNA技术产生的多肽，其中通常编码该多肽的DNA被插入进合适的表达载体，该表达载体被用来转化宿主细胞以产生异源蛋白。
如本文使用的，术语“特异性结合”是指抗体与抗原之间的接触具有至少10-6M的结合亲和力。在某些方面，抗体以至少约10-7M的亲和力结合，并且优选约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或约10-12M。
如本文所用，术语“融合蛋白”或“融合多肽”意指与本文所公开的抗体或其片段融合或连接的任何药物(小分子、多肽或蛋白质)。这样的非限制性实例包括例如双特异性和抗体-药物缀合物。
“实体肿瘤”是通常不包含囊肿或液体区域的异常的组织块。实体肿瘤可以是良性的或恶性的、转移性或非转移性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞的类型命名。实体肿瘤的实施例包括肉瘤、癌和淋巴瘤。
如本文使用的，术语“自杀基因”是能够诱导细胞凋亡的基因；非限制性实施例包括HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧酸酯酶、细胞色素P450或PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)、截短的EGFR或诱导型胱天蛋白酶(“iCasp”)。自杀基因可以根据多种途径起作用，并且在一些情况下，可以由例如小分子的诱导剂诱导。例如，iCasp自杀基因包含可操作地连接至被优化为与诱导剂结合的蛋白的半胱天冬酶蛋白酶蛋白的一部分；将诱导剂引入包含自杀基因的细胞中导致半胱天冬酶蛋白酶的活化和所述细胞的随后凋亡。
术语“转导”或“转染”在其被应用至嵌合抗原受体细胞的产生时是指外来核酸序列被引入细胞中的过程。在一些实施方案中，该转导是通过载体完成的。
如本文使用的，“治疗”或“处理”在对象中的疾病是指(1)防止症状或疾病在预先有倾向的或尚未显示疾病症状的对象中发生；(2)抑制疾病或阻止其发展或复发；或者(3)改善或消退疾病或疾病的症状。如本领域中理解的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。对于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于以下中的一种或多种：一个或多个症状的缓解或改善，病症(包括疾病)的程度的降低，病症(包括疾病)的稳定化(即不恶化)状态，病症(包括疾病)的延迟或减缓，病症(包括疾病)、状态和缓解(无论是部分还是全部)的进展、改善或缓解，无论是可检测的还是不可检测的。包含所公开的组合物和方法的治疗可以是一线、二线、三线、四线、五线疗法，并且意在用作单独疗法或与其他合适的疗法组合。在一方面，“治疗”不包括预防。
如本文使用的，术语“载体”是指被设计来用于在不同的宿主之间传送的核酸构建体，其包括但不限于质粒、病毒、粘粒、噬菌体、BAC、YAC等。在一些实施方案中，可以从商业上可获得的载体制备质粒载体。在其他实施方案中，可以根据本领域已知的技术从杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV等产生病毒载体。在一个实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。
如本文所用，术语“CLDN 18.2”是指紧密连接蛋白(claudin)-18的同种型2。参见Sahin U,Koslowski M,Dhaene K,Usener D,Brandenburg G,Seitz G,Huber C,Tureci O。紧密连接蛋白(claudin)-18剪接变体2是适用于治疗性抗体开发的泛癌靶标，Clin.CancerRes.2008；14(23):7624–34。可在基因卡ID:GC03P137998、HGNC:2039、Entrez Gene:51208、Ensembl:ENSG00000066405、OMIM:609210和UniProtKB:P56856(其通过引用并入本文)下找到紧密连接蛋白(claudin)18或基础基因的非限制性示例序列。
与上面列出的GenBank登录号和参考文献中的每一个相关联的序列通过引用并入本文。
用于实施本公开的模式
本发明提供了针对CLDN 18.2的新型抗体及其组合物和使用方法。更具体地，本发明提供了用于治疗表达CLDN 18.2的肿瘤(例如GI肿瘤，其包括但不限于胃、胰腺、食道、胆道、结直肠、结肠、直肠、卵巢和肺癌)的新型抗CLDN 18.2抗体。靶标CLDN 18.2在这些肿瘤的大多数中高度表达，但脱靶阳性率受到限制，因此具有理想的安全性。因此，一方面，所述组合物特别可用于治疗表达或过表达CLDN 18.2的肿瘤或癌细胞。
在一方面，本发明提供了分离的抗体，所述抗体包含重链(HC)免疫球蛋白可变域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变域序列，其中所述抗体结合CLDN 18.2的表位。一方面，抗体结合CLDN 18.2的表位，但不结合CLDN 18.1的表位。一方面，该抗体是人源化抗体，其包含表3中鉴定的CDR中的一个或更多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个或全部八个。在另一方面，所述抗体以高特异性结合，即它们以与表达CLDN18.2的细胞的结合的大于80％、或者大于85％、或者大于90％、或者大于95％的亲和力与CLDN 18.2结合，而以小于20％、或者小于15％、或者小于10％，或者小于5％的亲和力与CLDN 18.1结合。这样的例子在图1a、1b和9中示出。在那里，抗体对于表达CLDN18.2的肿瘤细胞更具特异性，并且由于它们不与表达CLDN18.1的正常细胞结合而具有较低的毒性。
在一些实施方案中，抗体是对第二靶蛋白具有结合特异性的双特异性抗体。在一些实施方案中，第二靶蛋白选自IL-1、CD3、CD16、CD19、CD28、CD47、CD64、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、CD28、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM、BTLA以及KIR。在一些实施方案中，抗体被包含在抗体和另一种试剂(例如毒素或药物)之间形成的抗体药物缀合物(ADC)中。在一些实施方案中，抗体可以缀合至治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应修饰剂、药剂和/或聚乙二醇(PEG)。
在另一方面，本发明提供了本文所公开的分离的抗CLDN 18.2抗体或其片段以及可检测或纯化的标记，其单独存在或与CLDN 18.2抗原或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR 1、CDR 2、CDR3)一起，其在一方面彼此结合形成抗原/抗体复合物。本文进一步提供了包含该抗原/抗体复合物的离体细胞。
本发明的方面涉及一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR 2、CDR3)；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；以及(d)细胞内结构域。本发明的其他方面涉及一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR 1、CDR 2、CDR3)；(b)铰链结构域；(c)CD28跨膜结构域；(d)选自CD28共刺激信号传导区域、4-1BB共刺激信号传导区域、ICOS共刺激信号传导区域和OX40共刺激区域的一个或多个共刺激区域；以及(e)CD3ζ信号传导结构域及其替代物。
在另一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)抗CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR 1、CDR 2、CDR3)，(b)CD8α铰链结构域；(c)CD8α跨膜结构域；(d)CD28和/或4-1BB共刺激信号传导区域；以及(e)CD3ζ信号传导结构域及其替代物。
在另一方面，本发明提供了一种分离的核酸序列，其编码抗CLDN 18.2抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或抗CLDN 18.2 CAR。
在另一方面，本发明提供了一种载体，其包含编码抗CLDN 18.2抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体或抗CLDN 18.2 CAR的分离的核酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种载体，其包含编码抗CLDN 18.2抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体或抗CLDN 18.2 CAR的分离的核酸序列，其与指导和任选地增强核酸序列表达的序列可操作地连接。这些序列包括启动子和增强子序列。
在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含载体和以下中的一种或多种：抗CLDN 18.2抗体；和/或双特异性抗体；和/或嵌合抗体；和/或人源化抗体；和/或抗CLDN18.2 CAR；和/或编码抗CLDN 18.2抗体双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体或抗CLDN18.2 CAR的分离的核酸；和/或包含编码抗CLDN 18.2抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体或抗CLDN 18.2 CAR的分离的核酸序列的载体；和/或包含抗CLDN 18.2 CAR的分离细胞。
在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含载体和以下中的一种或多种，或基本上由其组成，或由其组成：抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR 1、CDR 2、CDR3)，编码抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR 2、CDR3)的核酸，包含编码抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR 2、CDR3)的核酸的载体，包含抗CLDN 18.2 CAR和/或编码抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR2、CDR3)的多核苷酸的分离的细胞；和/或编码CAR的分离的核酸；和/或包含编码CAR的核酸的载体；和/或表达抗CLDN 18.2CAR的分离的细胞；和/或抗CLDN18.2抗体；和/或双特异性抗体；和/或人源化抗体。
本发明还提供了组合物。在一个实施方案中，组合物包含本发明的抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR 2、CDR3)、融合蛋白、或CAR和/或CAR表达细胞和药学上可接受的载体。本发明还提供了分离的细胞，其包含本发明的编码抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR 2、CDR3)的多核苷酸或融合蛋白或双特异性抗体中的一种或多种。
本发明进一步提供了一种治疗表达CLND 18.2抗原的肿瘤或生长(如在有需要的患者中的癌症或纤维瘤)的方法，其包括向该患者施用本发明的抗体或其片段(例如VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3，重链和轻链CDR1、CDR 2、CDR3)、融合蛋白、或CAR和/或CAR表达细胞。癌症的非限制性实例包括GI癌、膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胆道癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌和甲状腺癌。可以将这些方法与诊断方法相结合，以识别更可能对治疗产生反应的患者或对象。
抗体及其用途
I.组合物
抗体的一般结构在本领域中是已知的，这里将仅简要概述。免疫球蛋白单体包含通过二硫键连接的两条重链和两条轻链。每条重链与轻链之一成对，轻链之一通过二硫键与其直接结合。每条重链包含恒定区(其随抗体的同种型而变化)和可变区。可变区包括三个高变区(或互补决定区)，它们被命名为CDRH1、CDRH2和CDRH3，并被支撑在框架区内。每条轻链包含恒定区和可变区，其中可变区包括三个高变区(标为CDRL1、CDRL2和CDRL3)，所述三个高变区由框架区以与重链可变区类似的方式支撑。
每对重链和轻链的高变区相互配合以提供能够结合靶抗原的抗原结合位点。一对重链和轻链的结合特异性由重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的序列定义。因此，一旦确定了引起特定结合特异性的一组CDR序列(即重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的序列)，原则上就可以将这组CDR序列插入与任何抗体恒定区连接的任何其他抗体框架区域内的适当位置，以提供具有相同抗原结合特异性的不同抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的抗体，其包含重链(HC)免疫球蛋白可变域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变域序列，其中所述抗体结合表位CLDN 18.2。
在一方面，抗体的HC包含以下中的一个或多个，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含选自以下的氨基酸序列：(i)GFTFSSYA，(ii)GFTFSDYY，(iii)GFNIKDYF，(iv)GFTFSDYY，(v)GYSFTGYN，(vi)GFSLTSYG，(vii)GYNMN或其每一个的等效物；和/或CDR2，其包含选自以下的氨基酸序列：(i)ISGGGST，(ii)ISDGGGDT，(iii)IDPENGDT，(iv)ISNGGGST，(v)INPYNGGT，(vi)IWSDGRT，(vii)LINPYNGGTRYNQKFKG或其每一个的等效物；和/或CDR3，其包含选自以下的氨基酸序列：(i)ARGGNIYDGYPYYFDY，(ii)GGNIYDGYPYYFDY，(iii)ARHRGSLDY，(iv)NVLGYGNYGHFYYAMDY，(v)ARHRGSLDF，(vi)ARMGLGNAMDY，(vii)ARHGRYDPYAMDY，(viii)MGLGNAMDY或其每一个的等效物；和/或LC包含以下中的一个或多个，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含选自以下的氨基酸序列：(i)QNLLNSSNQKNY，(ii)ESVDNYGFSF，(iii)QSLVHSNGNTY，(iv)QNLLNSGNQKNY，(v)KSSQNLLNSGNQKNYLT或其每一个的等效物；和/或CDR2，其包含选自以下的氨基酸序列：(i)FAS，(ii)RAS，(iii)KVS，(iv)WAS，(v)WASTMES或其每一个的等效物；和/或CDR3，其包含选自以下的氨基酸序列：(i)QQHYSTPLT，(ii)QQSNQGPLT，(iii)SQNTHVPRT，(iv)QQSNKVPLT，(v)QNDYIYPLP或其每一个的等效物。
在一方面，抗体的HC包含以下中的一个或多个，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列GFTFSSYA或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列ISGGGST或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列GGNIYDGYPYYFDY或其等效物；和/或抗体的LC包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列QNLLNSSNQKNY或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列FAS或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列QQHYSTPLT或其等效物。
在一方面，抗体的HC包含以下中的一个或多个，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列GFTFSDYY或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列ISDGGGDT或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列ARHRGSLDY或其等效物；和/或抗体的LC包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列ESVDNYGFSF或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列RAS或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列QQSNQGPLT或其等效物。
在一方面，抗体的HC包含以下中的一个或多个，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列GFNIKDYF或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列IDPENGDT或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列NVLGYGNYGHFYYAMDY或其等效物；和/或抗体的LC包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列QSLVHSNGNTY或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列KVS或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列SQNTHVPRT或其等效物。
在一方面，抗体的HC包含以下中的一个或多个，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列GFTFSDYY或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列ISNGGGST或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列ARHRGSLDF或其等效物；和/或抗体的LC包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列ESVDNYGFSF或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列RAS或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列QQSNKVPLT或其等效物。
在一方面，抗体的HC包含以下中的一个或多个，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列GYSFTGYN或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列INPYNGGT或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列ARMGLGNAMDY或其等效物；和/或抗体的LC包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列QNLLNSGNQKNY或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列WAS或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列QNDYIYPLP或其等效物。
在一方面，抗体的HC包含以下中的一个或多个，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列GFSLTSYG或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列IWSDGRT或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列ARHGRYDPYAMDY或其等效物；和/或抗体的LC包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列ESVDNYGFSF或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列RAS或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列QQSNQGPLT或其等效物。
在一方面，抗体的HC包含以下中的一个或多个，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列KSSQNLLNSGNQKNYLT或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列WASTMES或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列QNDYIYPLP或其等效物；和/或抗体的LC包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：CDR1，其包含氨基酸序列GYNMN或其等效物；和/或CDR2，其包含氨基酸序列LINPYNGGTRYNQKFKG或其等效物；和/或CDR3，其包含氨基酸序列MGLGNAMDY或其等效物。
在一方面，重链可变区包含本文公开的抗CLDN 18.2抗体的重链氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成，并且轻链可变区包含本文公开的抗CLDN 18.2抗体的轻链氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成，或其等效物，如下(CDR用下划线标出)：
抗CLDN 18.2重链氨基酸序列(T155S2):
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISGGGSTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSYLRSEDTAVYYCARGGNIYDGYPYYFDYWGQGTTLTVSS，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链氨基酸序列(T155S2):
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQNLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链氨基酸序列(T158S2):
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMFWIRQTPEKRLEWVASISDGGGDTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARHRGSLDYWGQGTTLTVSS，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链氨基酸序列(T158S2):
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGFSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLASGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNQGPLTFGAGTKLELK，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链氨基酸序列(T224S8):
EVQLQQSGTELVRSGASVKLSCTTSGFNIKDYFLHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTKYAPKFQDKVTMTVDTSSNTACLHLSSLTSDDTAVYYCNVLGYGNYGHFYYAMDYWGQGTSVTVSS，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链氨基酸序列(T224S8):
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSESGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQNTHVPRTFGGGTKLEIR，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链氨基酸序列(T192S2):
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISNGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARHRGSLDFWGQGTTLTVSS，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链氨基酸序列(T192S2):
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGFSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSWSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNKVPLTFGAGTKLELK，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链氨基酸序列(T252S4):
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYNMNWVKQTHGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYFCARMGLGNAMDYWGQGTSVTVSS，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链氨基酸序列(T252S4):
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQNLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTMESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYIYPLPFGAGTKLELK，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链氨基酸序列(T88S1):
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTISGFSLTSYGIHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGRTTYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARHGRYDPYAMDYWGQGTSVTVSS，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链氨基酸序列(T88S1):
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGFSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLASGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNQGPLTFGAGTKLELK，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链氨基酸序列(嵌合T252S4):
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYNMNWVKQTHGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYFCARMGLGNAMDYWGQGTSVTVSS，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链氨基酸序列(嵌合T252S4):
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQNLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTMESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYIYPLPFGAGTKLELK，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链氨基酸序列(HuVH1 T252S4):
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTGYNMNWVRQMPGKGLEWMGLINPYNGGTRYNQKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYFCARMGLGNAMDYWGQGTTVTVSS，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链氨基酸序列(HuVH2 T252S4):
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTGYNMNWVRQMPGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYFCARMGLGNAMDYWGQGTTVTVSS，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链氨基酸序列(HuVH3 T252S4):
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTGYNMNWVRQMPGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGKATLSVDKSISTAYLQWSSLKASDTAMYFCARMGLGNAMDYWGQGTTVTVSS，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链氨基酸序列(HuVL1 T252S4):
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTMESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYIYPLPFGQGTKLEIK，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链氨基酸序列(HuVL2 T252S4):
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNLLQSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYIYPLPFGQGTKLEIK，或其等效物。
在一方面，重链可变区包含由本文公开的抗CLDN 18.2抗体的核酸序列编码的重链，或基本上由其组成，或由其组成，并且轻链可变区包含由本文公开的抗CLDN18.2抗体的核酸序列编码的轻链，或基本上由其组成，或由其组成，或其等效物，如下(CDR用下划线标出)：
抗CLDN 18.2重链核酸序列(T155S2):
GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTGGTGGTGGTAGCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCTATCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAGGAGG GAATATCTATGATGGTTACCCGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链核酸序列(T155S2):
GACATTGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGGCTATGTCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAACCTTTTAAATAGTAGCAATCAAAAGAACTATTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGTCTCCTAAACTTCTGGTATACTTTGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAG CACTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链核酸序列(T158S2):
GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTTTTGGATTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCCTCCATTAGTGATGGTGGTGGTGACACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACA TAGGGGCTCTCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链核酸序列(T158S2):
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAGAGTGTGGATAACTATGGCTTTAGTTTTCTGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAGCATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAGACTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATCAGGGTCC ACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链核酸序列(T224S8):
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGACAGAGCTTGTGAGGTCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAACTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTTTTTACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTAAATATGCCCCGAAGTTCCAGGACAAGGTCACCATGACTGTGGACACATCCTCCAACACAGCCTGCCTGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACACTGCCGTCTATTACTGTAATGTACT AGGCTACGGTAATTACGGACATTTTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCT，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链核酸序列(T224S8):
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAGGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGAATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTTCTGCTCTCAAAATACACATGT TCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAGA，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链核酸序列(T192S2):
GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAATGGTGGTGGTTCCACCTATTATCCAGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACA TAGGGGCTCTCTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链核酸序列(T192S2):
GACATAGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATAATTATGGCTTTAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTTGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAGACTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATAAGGTTCC GCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链核酸序列(T252S4):
GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACAACATGAACTGGGTGAAGCAGACCCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATTGGACTTATTAATCCTTACAATGGTGGTACTAGGTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTAACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGGAT GGGACTTGGAAATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链核酸序列(T252S4):
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAATCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTATGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAT TTATCCGCTCCCGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA，或其等效物。
抗CLDN 18.2重链核酸序列(T88S1):
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCATCTCAGGGTTCTCATTAACCAGCTATGGTATACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGTAGTGATATGGAGTGATGGAAGAACAACCTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTCCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGACATGG TAGATACGACCCCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA，或其等效物。
抗CLDN 18.2轻链核酸序列(T88S1):
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAGAGTGTGGATAACTATGGCTTTAGTTTTCTGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAGCATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAGACTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATCAGGGTCC ACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA，或其等效物。
抗CLDN 18.2嵌合重链核酸序列(T252S4):
GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACAACATGAACTGGGTGAAGCAGACCCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATTGGACTTATTAATCCTTACAATGGTGGTACTAGGTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTAACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGGATGGGA CTTGGAAATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
抗CLDN 18.2人源化重链核酸序列1(Hu VH1 T252S4):
GAAGTCCAGCTCGTGCAGTCTGGTGCGGAGGTCAAAAAACCCGGCGAGTCTCTCAAAATTAGTTGCAAAGGCTCCGGTTATTCATTCACGGGTTACAATATGAACTGGGTTCGACAAATGCCGGGTAAGGGACTTGAATGGATGGGATTGATCAACCCCTATAACGGAGGTACCAGATACAACCAAAAATTTAAGGGCCAGGTGACTATTAGTGCAGATAAAAGTATCTCCACCGCTTACCTCCAATGGTCTAGTTTGAAGGCGTCTGACACTGCTATGTACTTTTGCGCGAGAATGGGG TTGGGAAATGCGATGGACTACTGGGGTCAGGGCACTACGGTTACGGTCTCCTCT
抗CLDN 18.2人源化重链核酸序列2(Hu VH2 T252S4):
GAGGTACAGCTCGTGCAATCTGGGGCCGAAGTAAAGAAACCTGGAGAAAGTCTTAAAATAAGCTGCAAGGGCAGTGGGTATAGCTTCACGGGCTACAATATGAACTGGGTTAGACAAATGCCAGGTAAGAACCTCGAATGGATAGGATTGATCAACCCATACAATGGTGGTACGCGCTACAACCAGAAATTCAAAGGTCAGGTTACCATCTCTGCGGATAAAAGCATCTCAACGGCGTATCTTCAATGGTCCTCACTGAAAGCATCCGACACAGCAATGTATTTTTGCGCTAGAATGGGA TTGGGTAATGCCATGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTTACAGTCTCTTCC
抗CLDN 18.2人源化重链核酸序列3(Hu VH3 T252S4):
GAAGTTCAGCTGGTGCAAAGTGGGGCTGAGGTAAAGAAGCCTGGCGAGAGCCTCAAGATTTCTTGCAAGGGTAGCGGATACAGTTTTACGGGATATAACATGAATTGGGTTCGCCAGATGCCGGGGAAGAACCTTGAATGGATAGGACTGATAAACCCCTATAATGGGGGAACCCGATATAATCAGAAGTTTAAGGGAAAAGCAACTTTGTCAGTTGACAAGTCTATCAGCACGGCCTATCTTCAGTGGTCCAGTCTGAAAGCAAGCGACACGGCTATGTACTTTTGTGCACGCATGGGG CTTGGTAACGCAATGGACTATTGGGGACAAGGAACTACCGTCACTGTCTCTTCA
抗CLDN 18.2嵌合轻链核酸序列3(嵌合VL T252S4):
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAATCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTATGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATATTTAT CCGCTCCCGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
抗CLDN 18.2人源化轻链核酸序列1(Hu VL1 T252S4):
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCGGACAGTCTGGCAGTCAGTCTTGGGGAAAGAGCTACCATAAACTGCAAATCCAGCCAAAACCTTCTTAATAGCGGCAACCAAAAGAATTACTTGACTTGGTATCAGCAAAAACCGGGTCAGCCGCCCAAACTCTTGATATACTGGGCGTCTACGATGGAAAGCGGCGTCCCCGACCGCTTCAGCGGGAGTGGGTCAGGGACTGATTTCACTTTGACAATCAGTTCCCTTCAGGCAGAGGACGTAGCAGTCTACTACTGTCAGAATGATTATATATAT CCTCTTCCGTTCGGCCAGGGGACGAAGTTGGAGATCAAA
抗CLDN 18.2人源化轻链核酸序列3(Hu VL2 T252S4):
GACATCGTGATGACTCAAAGTCCTGACTCCCTTGCTGTTTCACTTGGCGAAAGGGCCACTATCAACTGTAAGAGTTCTCAGAATCTCTTGCAATCAGGAAACCAGAAGAATTACTTGACCTGGTATCAACAGAAGCCTGGACAACCACCTAAGCTCTTGATTTACTGGGCTAGTACAAGGGAGTCCGGCGTCCCAGACAGATTTTCCGGTTCTGGATCAGGCACGGACTTCACTCTGACAATCTCTAGTCTTCAAGCCGAGGATGTGGCCGTTTATTATTGCCAGAACGATTACATTTAC CCTTTGCCATTTGGTCAAGGTACTAAGTTGGAGATAAAA
在一方面，表4中还提供了具有上述VH和VL组合的人源化抗体。
在一方面，本发明提供了针对CLDN 18.2片段产生的分离的抗CLDN 18.2抗体。
在本技术的另一方面，分离的抗体包括以下特征中的一个或多个：
(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列包含与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域的CDR至少85％相同的一个或多个CDR；
(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列包含与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域的CDR至少85％相同的一个或多个CDR；
(c)轻链免疫球蛋白可变结构域序列与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域至少85％相同；
(d)HC免疫球蛋白可变结构域序列与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域至少85％相同；以及
(e)所述抗体结合的表位与被公开的序列中的任一个结合的表位有重叠。
在一方面，本发明提供了与本文公开的抗CLDN 18.2抗体至少85％相同的分离的抗体。
在本文提供的抗体的一些方面，该抗体以小于10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10- 9M、10-10M、10-11M或10-12M的解离常数(KD)结合人CLDN 18.2。在本文提供的抗体的某些方面，抗原结合位点特异性结合人CLDN18.2。
在本文提供的抗体的一些方面，该抗体是可溶性Fab。
在本文提供的抗体的一些方面，HC和LC可变域序列是同一多肽链的组分。在本文提供的抗体的一些方面，HC和LC可变域序列是不同多肽链的组分。
在另一个实施方案中，所述抗体是包含抗CLDN 18.2重链可变区和抗CLDN18.2轻链可变区的单克隆抗体，所述抗CLDN 18.2重链可变区包含本文所公开的多肽或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成，所述抗CLDN 18.2轻链可变区包含本文所公开的多肽或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。
在另一方面，抗CLDN 18.2抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
在本文提供的抗体的一些方面，该抗体是单克隆抗体。
在本文提供的抗体的一些方面，该抗体是全长抗体。在另一方面，提供了抗体的抗原结合片段。
在本文提供的抗体的一些方面，抗体片段选自Fab、F(ab)'2、Fab’、scFv和Fv。
在其他方面，本文提供的抗体的CDR中的一个或多个氨基酸残基被另一氨基酸取代。就相同氨基酸家族内的取代而言，该取代可以是“保守的”。天然存在的氨基酸可分为以下四个家族，并且在这些家族中将进行保守取代。
1)具有碱性侧链的氨基酸：赖氨酸，精氨酸，组氨酸；
2)具有酸性侧链的氨基酸：天冬氨酸，谷氨酸；
3)具有不带电荷的极性侧链的氨基酸：天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸；
4)具有非极性侧链的氨基酸：甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸，半胱氨酸。
在另一方面，一个或多个氨基酸残基被添加至抗体的一个或多个CDR或从其中缺失。这样的添加或缺失发生在CDR的N或C末端或CDR内的位置。
通过经由氨基酸的添加、缺失或取代来改变抗体的CDR的氨基酸序列，可以获得各种效果，例如对靶抗原的增加的结合亲和力。
应当理解，包含这种变化的CDR序列的本发明的抗体仍以与所公开的抗体相似的特异性和敏感性概况结合CLDN 18.2。这可以通过结合测定法进行测试。
抗体的恒定区也可以变化。例如，可以为抗体提供任何同种型的Fc区：IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或IgM。
人IgD恒定区，Uniprot:P01880
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK，或其等效物。
人IgG1恒定区，Uniprot:P01857
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK，或其等效物。
人IgG2恒定区，Uniprot:P01859
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK，或其等效物。
人IgG3恒定区，Uniprot:P01860
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK，或其等效物。
人IgM恒定区，Uniprot:P01871
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY，或其等效物。
人IgG4恒定区，Uniprot:P01861
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK，或其等效物。
人IgA1恒定区，Uniprot:P01876
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY，或其等效物。
人IgA2恒定区，Uniprot:P01877
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY，或其等效物。
人Igκ恒定区，Uniprot:P01834 SEQ ID NO:52
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC，或其等效物。
在本文提供的抗体的一些方面，该抗体包含结构修饰以促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，CLDN 18.2抗体含有在抗体的CH2恒定重链区中的缺失，以促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，Fab片段用于促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，F(ab)'2片段用于促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。
抗体、片段及其等效物可以与载体(例如药学上可接受的载体或其他试剂)组合，以提供用于使用和/或储存的制剂。
进一步提供了分离的多肽，其包含可用于产生结合CLDN 18.2的抗体的CLDN18.2的氨基酸序列或其片段以及编码它们的分离的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。一方面，分离的多肽或多核苷酸还包含操作地与该多肽或多核苷酸偶联的标记和/或连续的多肽序列(例如匙孔血蓝蛋白(KLH)载体蛋白)或者编码该序列的多核苷酸(在多核苷酸的情况下)。多肽或多核苷酸可以与各种载体(例如磷酸盐缓冲盐水)结合。还提供了包含分离的多肽或多核苷酸的宿主细胞，例如原核或真核细胞，例如细菌、酵母、哺乳动物(大鼠、猿猴、仓鼠或人)。宿主细胞可以与载体结合。
还进一步提供了编码本文公开的抗体及其片段的分离的核酸。它们可以与载体(vector)或合适的宿主细胞和/或合适的载体(carrier)组合以用于诊断或治疗用途。一方面，核酸与宿主细胞一起被包含，用于重组产生多肽和蛋白质。宿主细胞可以是真核的或原核的。
II.用于制备组合物的方法
抗体、它们的制造和用途是众所周知的，并且在例如Harlow,E.and Lane,D.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1999中公开。可以使用本领域已知的标准方法来产生抗体。抗体的实例包括(但不限于)抗体的单克隆、单链和功能片段。
可以在一系列宿主(例如山羊、兔、大鼠、小鼠、人类等)内产生抗体。可以通过使用具有免疫原性性质的靶标抗原或其片段或寡肽(例如CLDN 18.2的N端或C端片段或分离的多肽)注射宿主来免疫抗体。根据宿主种类，可以添加各种佐剂用于增加免疫应答。此类佐剂包括但不限于Freund's、矿物凝胶(例如氢氧化铝)和表面活性物质(例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔戚血蓝素和二硝基苯酚)。在用于人类的佐剂中，BCG(卡介苗)和小型棒状杆菌(Corynebacterium parvum)特别有用。本公开还提供了分离的多肽和佐剂。
在某些方面，本发明的抗体是多克隆抗体，即具有不同的氨基酸序列的多个类型的抗CLDN 18.2抗体的混合物。在一个方面，所述多克隆抗体包括具有不同的CDR的多个类型的抗CLDN 18.2抗体的混合物。因此，培养产生不同的抗体的细胞的混合物，并且可以使用从所产生的培养物纯化出的抗体(参见WO 2004/061104)。
单克隆抗体产生。可以使用能够通过培养物中的连续细胞系来产生抗体分子的任何技术来制备针对CLDN 18.2的单克隆抗体。这类技术包括但不限于杂交瘤技术(参见例如Kohler&Milstein,Nature 256:495-497(1975))、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参见例如Kozbor,et al.,Immunol.Today 4:72(1983))和EBV杂交瘤技术以产生人类单克隆抗体(参见例如Cole,et al.,in:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96(1985))。人单克隆抗体可以被用在本技术的实践中，并且可以使用人杂交瘤(参见例如Proc.Natl.Acad.Sci.80:2026-2030(1983))或者通过用Epstein Barr病毒体外转染人B细胞(参见例如Cole,et al.,in:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96(1985))来产生。例如，可以分离编码抗体的区域的核酸群体。使用采用衍生自编码抗体的保守区域的序列的引物的PCR，来扩增抗体的来自该群体的部分的序列，然后重建编码来自该被扩增的序列的抗体或其片段(例如可变结构域)的DNA。这样的被扩增的序列也可以被融合至编码其他蛋白(例如噬菌体外壳、或细菌细胞表面蛋白)的DNA，用于在噬菌体或细菌上表达和展示融合多肽。然后可以根据例如被表达的抗体或其片段对于存在于CLDN 18.2多肽上的抗原或表位的亲和力，表达和进一步选择或分离被扩增的序列。替代性地，可以通过例如使用包含CLDN 18.2的氨基酸序列或其片段(或替代性地基本上由其组成，或进一步地由其组成)的分离的多肽使对象免疫，然后使用常规方法来从所述对象的脾分离杂交瘤，制备表达抗CLDN 18.2单克隆抗体的杂交瘤。参见例如Milstein et al.,(Galfre and Milstein,Methods Enzymol 73:3-46(1981))。使用标准方法来筛选杂交瘤将产生不同特异性(即对不同表位的特异性)和亲和力的单克隆抗体。具有期望的性质(例如CLDN 18.2结合)的选择的单克隆抗体可以(i)被用作通过杂交瘤来表达，(ii)被结合至例如聚乙二醇(PEG)的分子以改变其性质，或(iii)可以通过各种方法来分离、测序和操纵编码所述单克隆抗体的cDNA。在一个方面，通过杂交瘤来产生抗CLDN18.2单克隆抗体，该杂交瘤包括从转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，其中该转基因非人动物具有包含被融合至永生化细胞的人类重链转基因和轻链转基因的基因组。杂交瘤技术包括本领域已知的技术，以及在Harlow et al.,Antibodies:A LaboratoryManual Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,349(1988)；Hammerling et al.,Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas,563-681(1981)中教导的技术。
噬菌体展示技术。如上所述，可以通过应用重组DNA和噬菌体展示技术来产生本发明的抗体。例如，可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来制备抗CLDN18.2抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。通过直接使用抗原进行选择，通常是被结合或者被捕获至固体表面或珠粒的抗原，从全部的或组合的抗体文库(例如人或小鼠)中选择具有期望的结合性质的噬菌体。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体(filamentous phage)，包括fd和M13，其中Fab、Fv或二硫化稳定化的Fv抗体结构域被重组地融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白。此外，方法可以适用于构建Fab表达文库(参见例如Huse,et al.,Science 246:1275-1281,1989)，以允许具有CLDN18.2多肽(例如多肽或其衍生物、片段、类似物或同系物)的所需的特异性的单克隆Fab片段的快速和有效的鉴定。可以被用来制造本公开的分离的人源化的抗体的噬菌体展示方法的其他实施例包括在以下文献中公开的方法：Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883(1988)；Chaudhary et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:1066-1070(1990)；Brinkman et al.,J.Immunol.Methods 182:41-50(1995)；Ames et al.,J.Immunol.Methods 184:177-186(1995)；Kettleborough et al.,Eur.J.Immunol.24:952-958(1994)；Persic et al.,Gene187:9-18(1997)；Burton et al.,Advances in Immunology 57:191-280(1994)；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO 96/06213；WO 92/01047(Medical Research Council et al.)；WO97/08320(Morphosys)；WO 92/01047(CAT/MRC)；WO 91/17271(Affymax)；以及美国专利号5,698,426,5,223,409,5,403,484,5,580,717,5,427,908,5,750,753,5,821,047,5,571,698,5,427,908,5,516,637,5,780,225,5,658,727和5,733,743。
Lohning的美国专利号6,753,136已经描述了可用于通过经由二硫键来连接多肽而在噬菌体颗粒的表面上展示多肽的方法。如在以上参考文献中描述的，在噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区域可以被分离并且被用来产生整个抗体(包括人类抗体、或任何其他期望的抗原结合片段)，并且被表达在任何期望的宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中。例如，还可以使用本领域中已知的方法来采用重组地产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术，例如在WO 92/22324；Mullinax et al.,BioTechniques12:864-869(1992)；Sawai et al.,AJRI 34:26-34(1995)；以及Better et al.,Science240:1041-1043(1988)中所公开的。
通常，可以针对合适的抗原来选择被克隆进展示载体的杂交抗体或杂交抗体片段，从而鉴定维持良好的结合活性的变体，因为所述抗体或抗体片段将会被呈现在噬菌体或噬菌粒颗粒的表面。参见例如Barbas III et al.,Phage Display,A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001)。然而，其他载体形式可以被用于该方法，例如将抗体片段文库克隆进溶解性噬菌体载体(被修饰的T7或Lambda Zap系统)以用于选择和/或筛选。
抗体产生的替代性方法。还可以通过诱导淋巴细胞群体中的体内产生，或者通过筛选高度特异性结合试剂的重组免疫球蛋白文库或组，来产生抗体(Orlandi et al.,PNAS86:3833-3837(1989)；Winter,G.et al.,Nature,349:293-299(1991))。
替代性地，可以使用用于产生单链抗体的技术。单链抗体(scFv)包括通过连接子肽(通常长度为5至25个氨基酸)连接的重链可变区域和轻链可变区域。在scFv中，重链和轻链的可变区域可以衍生自相同的抗体或不同的抗体。可以使用重组技术来合成scFv，例如通过编码该scFv的载体在宿主生物(例如大肠杆菌(E.coli))中的表达。可以通过以下方法获得编码scFv的DNA：使用部分DNA作为模板进行扩增，其中该部分DNA编码选自编码上述抗体的重链或重链的可变区域的DNA和编码其轻链或轻链的可变区域的DNA的DNA的整个或所需的氨基酸序列，通过使用定义其两个末端的引物对的PCR，并且进一步结合编码多肽连接子部分的DNA和定义其两个末端的引物对来进行扩增，从而将连接子的两个末端分别连接至重链和轻链。可以根据本领域已知的常规方法来获得含有编码scFv的DNA的表达载体和由该表达载体转化的宿主。
还可以产生抗原结合片段，例如F(ab′)2片段可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化来产生，而Fab片段可以通过减少F(ab′)2片段的二硫键而产生。替代性地，可以构建Fab表达文库来进行具有期望的特异性的单克隆Fab片段的快速和简单的鉴定(Huse et al.,Science,256:1275-1281(1989))。
抗体修饰。本发明的抗体可以被多聚化来提高对抗原的亲和力。要被多聚化的抗体可以是一种抗体或识别相同抗原的多个表位的多种抗体。作为抗体的多聚化的方法，例如可以是将IgG CH3结构域结合至两个scFv分子、结合至链霉亲和素、引入螺旋-转角-螺旋基序等。
本文公开的抗体组合物可以是在任何这些抗体和另一种试剂之间形成的缀合物的形式(例如抗体药物缀合物(ADC)或免疫缀合物)。适用于与本文公开的抗体缀合或融合的非限制性实例包括：治疗剂，例如可检测的标记，例如放射性标记，免疫调节剂，激素，酶，寡核苷酸，光活性治疗或诊断剂，细胞毒剂，药物或毒素，超声增强剂，非放射性标记，它们的组合和本领域已知的其他此类试剂。在一些实施方案中，抗体可以缀合至治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应修饰剂，药剂和/或聚乙二醇(PEG)。
双特异性抗体。CLDN18.2在癌组织中过表达，但脱靶阳性率受到限制。预期将抗CLDN18.2抗体或片段与对细胞因子、免疫检查点、或癌症或肿瘤抗原具有特异性(第二特异性)的另一分子或片段结合的双功能分子将在治疗中具有协同作用。因此，本文公开的抗体组合物可以是双特异性抗体的形式，其包含公开的抗体的结合结构域和具有第二特异性的结合结构域。在一些实施方案中，第二特异性针对选自IL-1、CD3、CD16、CD19、CD28和CD64的分子。其他示例包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3(也称为CD223)、CD28、CD122、4-1BB(也称为CD137)、TIM3、OX-40或OX40L、CD40或CD40L、CD47、LIGHT、ICOS/ICOSL、GITR/GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM或BTLA(也称为CD272)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。大量的肿瘤抗原在本领域中是已知的，并且可以通过筛选容易地鉴定出新的肿瘤抗原。肿瘤抗原的非限制性实例包括EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CD73、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整联蛋白、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和腱生蛋白(Tenascin)。
还提供了不同形式的双特异性抗体。在一些实施方案中，抗CLDN18.2片段和第二片段各自独立地选自Fab片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体进一步包括Fc片段。
还提供了不仅包括抗体或抗原结合片段的双功能分子。作为肿瘤抗原靶向分子，对CLDN18.2特异的抗体或抗原结合片段(例如此处所述的抗体)或抗原结合片段可以任选通过肽接头与免疫细胞因子或配体结合。连接的免疫细胞因子或配体包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、GM-CSF、TNF-α、CD40L、OX40L、CD27L、CD30L、4-1BBL、LIGHT和GITRL。这样的双功能分子可以导致特定的肿瘤部位局部免疫调节。
抗体筛选。可以使用多种免疫测试来进行筛选，以鉴定具有期望的特异性的抗体。使用具有已建立的特异性的多克隆或单克隆抗体进行竞争性结合或免疫放射测试的许多程序在本领域中是已知的。这些免疫测试通常涉及测量在CLDN 18.2或其任何片段或寡肽和其特异性抗体之间的复合物形成。可以使用采用对两个非干扰的CLDN 18.2表位特异的单克隆抗体进行的双位点、基于单克隆的免疫测试，但是也可以采用竞争性结合测试(Maddox et al.,J.Exp.Med.,158:1211-1216(1983))。
可以使用Ventana Medical Systems,Inc(VMSI)Discovery XT和福尔马林固定、石蜡包埋的人类组织在载玻片上进行潜在抗CLDN 18.2抗体的自动免疫组织化学(IHC)筛选。组织样品首先进行去石蜡，抗原回收，然后添加潜在的抗CLDN 18.2抗体和检测抗体。使用来自VMSI的色原检测试剂将检测抗体可视化。将染色的载玻片在显微镜下手动筛选。选择具有正确的一抗染色模式的样品作为潜在的抗CLDN 18.2候选样品。
抗体纯化。可以将本文公开的抗体纯化至同质。可以采用常规的蛋白分离和纯化方法，进行抗体的分离和纯化。
仅仅作为实施例，可以通过色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等的适当选择和组合使用分离和纯化抗体。参见Strategies forProtein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual,DanielR.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies:ALaboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)。
色谱法的实施例包括亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱以及吸附色谱。在一个方面，可以采用液相色谱(例如HPLC或FPLC)进行色谱法。
在一方面，在亲和色谱中可以使用Protein A柱或Protein G柱。其他示例性的柱包括Protein A柱、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)等。
CAR T细胞是基因改造的自体T细胞，其中单链抗体片段(scFv)或配体连接到能够促进T细胞活化的T细胞信号传导域上(Maher,J.(2012)ISRN Oncol.2012:278093；Curran,K.J.et al.(2012)J.Gene Med.14:405-415；Fedorov,V.D.et al.(2014)Cancer J.20:160-165；Barrett,D.M.et al.(2014)Annu.Rev.Med.65:333-347)。CAR结合了不依赖HLA的单克隆抗体靶向特异性与活化T细胞的溶细胞活性和归巢特性。这些特性使得能够识别具有降低的HLA表达或下调抗原加工途径的靶细胞，这是肿瘤用于逃避宿主免疫反应的两种常用方法(Jakobsen,M.K.et al.(1995)J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.17:222-228；Lou,Y.et al.(2008)Clin.Cancer Res.14:1494–1501；Singh,R.et al.(2007)CancerRes.67:1887–1892)。CAR修饰的T细胞在临床前和临床环境中已显示出巨大的希望，可作为包括卵巢癌在内的各种疾病的新疗法(Chu,C.S.et al.(2008)Expert Rev.AnticancerTher.8:243–257；Chekmasova,A.A.et al.(2010)Discov.Med.9:62–70；Porter,D.L.etal.(2011)NEJM 365:725-733)。迄今为止，CAR T细胞针对多种靶标产生。此外，已经公开并批准了针对CLDN 18.2的抗体，用于治疗某些癌症。与这些原理和发现一致，本公开提供以下实施例。
III.使用方法
概述。本文公开的抗体可用于与CLDN 18.2多肽的定位和/或定量有关的本领域已知方法(例如，用于测量适当生理样品中CLDN 18.2多肽的水平，用于诊断方法，用于多肽成像等)。本文公开的抗体可用于通过标准技术(例如亲和层析或免疫沉淀)分离CLDN 18.2多肽。本文公开的CLDN 18.2抗体可以促进从生物样品(例如哺乳动物血清或细胞以及在宿主系统中表达的重组产生的CLDN 18.2多肽)中纯化天然CLDN 18.2多肽。此外，CLDN 18.2抗体可用于检测CLDN 18.2多肽(例如，在血浆、细胞裂解液或细胞上清液中)，以评估该多肽的丰度和表达模式。本文公开的CLDN 18.2抗体可作为临床测试程序的一部分诊断地用于监测组织中CLDN 18.2的水平，例如，以确定给定治疗方案的功效和/或确定和识别最有可能因为肿瘤或癌细胞表达抗原而对治疗有反应的对象或患者。通过将本文公开的CLDN18.2抗体偶联(即物理连接)到可检测物质可以促进检测。
在另一方面，本文提供了一种组合物，其包含与包含例如人CLDN 18.2蛋白或其片段的肽结合的本文所公开的抗体或抗原结合片段。一方面，该肽与细胞相联。例如，该组合物可以包含用本文公开的抗体或抗体片段标记的分解的细胞样品，该组合物可用于例如亲和色谱法中分离细胞或用于基于流式细胞术的细胞分析或细胞分选。作为另一个实例，该组合物可以包含用本文公开的抗体或抗体片段标记的固定的组织样品或细胞涂片，该组合物可用于例如免疫组织化学或细胞学分析。在另一方面，抗体或抗体片段与固体支持物结合，其可用于例如ELISA、亲和层析或免疫沉淀方法，用于分离CLDN 18.2蛋白或其片段、CLDN 18.2阳性细胞、或含有CLDN 18.2和其他细胞成分的复合物。在另一方面，该肽与固体支持物结合。例如，该肽可以通过对该肽特异的第二抗体与固相支持物结合，这在例如夹心ELISA中是有用的。作为另一个实例，可以将肽结合到色谱柱上，其可用于例如根据本技术的抗体的分离或纯化。在另一方面，将肽置于溶液中，例如裂解溶液或包含分级细胞的亚细胞级分的溶液，其可用于例如ELISA和亲和层析或免疫沉淀方法，用于分离CLDN 18.2蛋白质或其片段或含有CLDN 18.2和其他细胞成分的复合物。在另一方面，该肽与基质(例如凝胶电泳凝胶或通常用于蛋白质印迹的基质(例如由硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯制成的膜))结合，该组合物可用于电泳和//或免疫印迹技术，例如蛋白质印迹。
CLDN 18.2多肽的检测。用于检测生物样品中CLDN 18.2多肽水平的示例性方法涉及从对象获得生物样品，并使该生物样品与本文公开的能够检测CLDN 18.2多肽的CLDN18.2抗体接触。
在一方面，CLDN 18.2抗体T155S2、T158S2、T224S8、T192S2和T252S4或其片段被可检测地标记。关于抗体的术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即物理连接)至抗体而直接标记抗体，以及通过与直接标记的另一种化合物的反应性而间接标记抗体。间接标记的非限制性实例包括使用荧光标记的二抗检测一抗，以及用生物素对DNA探针进行末端标记，从而可以用荧光标记的链霉亲和素对其进行检测。
本发明的检测方法可以用于在体外以及体内检测生物样品中CLDN 18.2多肽的表达水平。用于检测CLDN 18.2多肽的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、流式细胞仪、免疫沉淀、放射免疫测定和免疫荧光(例如IHC)。此外，用于检测CLDN 18.2多肽的体内技术包括将标记的抗CLDN 18.2抗体引入对象。仅作为示例，可以用放射性标记物标记抗体，该放射性标记物在对象中的存在和位置可以通过标准成像技术检测。一方面，生物样品包含来自测试对象的多肽分子。
免疫测定和成像。使用基于抗体的技术，本文公开的CLDN 18.2抗体可用于测定生物学样品(例如人血浆)中的CLDN 18.2多肽水平。例如，可以使用经典的免疫组织化学(IHC)染色方法研究组织中的蛋白质表达。Jalkanen,M.et al.,J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；Jalkanen,M.et al.,J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987)。可用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的，包括酶标记，例如葡萄糖氧化酶和放射性同位素或其他放射性试剂，例如碘(125I、121I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc)，以及荧光标记，例如荧光素和若丹明，以及生物素。
除了测定生物学样品中的CLDN 18.2多肽水平外，还可通过成像在体内检测CLDN18.2多肽水平。可以掺入抗CLDN 18.2抗体以对CLDN 18.2多肽水平进行体内成像的标记包括可通过X射线照相、NMR或ESR检测到的标记。对于X射线照相，合适的标记包括放射性同位素，例如钡或铯，它们发出可检测的辐射，但不会对受试者造成明显伤害。NMR和ESR的合适标记包括具有可检测特征自旋的标记，例如氘，其可以通过标记相关scFv克隆的营养成分而掺入CLDN 18.2抗体中。
将已经用适当的可检测的成像部分标记的CLDN 18.2抗体引入对象(例如通过肠胃外、皮下或腹膜内)，所述可检测的成像部分例如是放射性同位素(例如131I、112In、99mTc)、不透射线的物质或可通过核磁共振检测的材料。在本领域中将理解，对象的大小和所使用的成像系统将确定产生诊断图像所需的成像部分的数量。在放射性同位素部分的情况下，对于人类对象，所注入的放射性量通常将在约5到20毫厘的99mTc的范围内。然后，标记的CLDN 18.2抗体将优先在含有特定靶多肽的细胞位置积聚。例如，体内肿瘤成像在S.W.Burchiel et al.,Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer 13(1982)中有所描述。
在一些方面，包含有助于快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放的结构修饰的CLDN18.2抗体可用于体内成像检测方法。在一些方面，CLDN 18.2抗体在抗体的CH2恒定重链区中含有缺失，以促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，Fab片段用于促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，F(ab)'2片段用于促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。
CLDN 18.2抗体的诊断用途。本文公开的CLDN 18.2抗体组合物可用于诊断和预后方法。这样，本发明提供了使用本文公开的抗体来诊断对象中的CLDN 18.2相关医学病症的方法。可以选择本文公开的抗体，使得它们具有对CLDN 18.2多肽的高水平的表位结合特异性和高结合亲和力。通常，抗体的结合亲和力越高，就可以在免疫测定中执行更严格的洗涤条件以去除非特异性结合的物质而不去除靶多肽。因此，可用于诊断测定的本技术的CLDN18.2抗体通常具有至少10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11或10-12M的结合亲和力。在某些方面，用作诊断试剂的CLDN 18.2抗体具有足够的动力学开启速率以在标准条件下在至少12小时、至少5小时、至少1小时或至少30分钟内达到平衡。
本技术的一些方法采用抗CLDN 18.2抗体的多克隆制剂和多克隆抗CLDN 18.2抗体组合物作为诊断试剂，而其他方法采用单克隆分离株。在采用根据上述方法制备的多克隆人抗CLDN 18.2抗体的方法中，该制剂通常包含各种CLDN 18.2抗体，例如对靶多肽具有不同表位特异性的抗体。本发明的单克隆抗CLDN 18.2抗体可用于在存在或潜在存在密切相关的抗原的情况下检测单个抗原。
本发明的CLDN 18.2抗体可以用作任何种类的生物样品的诊断试剂。一方面，本文公开的CLDN 18.2抗体可用作人类生物样品的诊断试剂。CLDN 18.2抗体可以用于检测多种标准测定形式的CLDN 18.2多肽。这样的形式包括免疫沉淀、蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定、流式细胞术、IHC和免疫测定。参见Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Publications,New York,1988)；美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,879,262；4,034,074,3,791,932；3,817,837；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；以及4,098,876。可以从对象的任何组织(包括活组织检查)、细胞或体液中获得生物样品。
CLDN 18.2抗体的预后用途。本发明还提供了用于确定对象是否处于发展与CLDN18.2多肽表达或活性增加相关的医学疾病或病状的风险(例如，癌前细胞的检测)的预后(或预测)测定法。这样的测定可以用于预后或预测目的，从而在以CLDN 18.2多肽表达为特征或与之相关的医学疾病或病症发作之前预防性地治疗个体。
本发明的另一方面提供了用于确定对象中的CLDN 18.2表达的方法，从而为该对象选择合适的治疗或预防化合物。
替代地，可以使用预后测定法来鉴定患有或有风险发展成胃癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌或肺癌的对象。因此，本发明提供了一种用于鉴定与CLDN 18.2多肽表达水平升高相关的疾病或病症的方法，其中从对象获得测试样品并检测CLDN 18.2多肽，其中与对照样品相比CLDN 18.2多肽水平升高的存在，预示对象患有或有风险发展成与CLDN 18.2多肽表达水平增加相关的疾病或病症。在一些方面，与CLDN 18.2多肽表达水平增加有关的疾病或病状选自胃癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌和肺癌。
在另一方面，本发明提供了用于确定对象是否可以用用于与CLDN 18.2多肽表达增加有关的病症或病状的化合物有效治疗的方法，其中从对象获得生物学样品，并且使用CLDN 18.2抗体检测CLDN 18.2多肽。确定从对象获得的生物样品中CLDN 18.2多肽的表达水平，并将其与在从无疾病的对象获得的生物样品中发现的CLDN 18.2表达水平进行比较。与从健康对象获得的样品相比，从怀疑患有疾病或病状的对象获得的样品中CLDN 18.2多肽的水平升高指示了在测试对象中与CLDN 18.2相关的疾病或病状。
在许多疾病状态中，已知CLDN 18.2多肽的表达水平升高指示患有该疾病的对象是否可能对特定类型的疗法或治疗产生反应。因此，检测生物学样品中的CLDN18.2多肽的方法可以用作预后方法，例如，以评估对象对疗法或治疗产生反应的可能性。确定来自对象的合适的组织或体液样品中CLDN 18.2多肽的水平，并将其与合适的对照进行比较，例如，患有相同疾病但对治疗反应良好的对象的水平。
在一方面，本发明提供了监测试剂(例如药物、化合物或小分子)对CLDN 18.2多肽表达的影响的方法。此类测定法可用于基础药物筛选和临床试验。例如，可以在表现出CLDN18.2表达升高的对象(例如被诊断为癌症的患者)的临床试验中监测试剂降低CLDN 18.2多肽水平的有效性。可以通过施用试剂并观察应答来鉴定影响CLDN 18.2多肽表达的试剂。以这种方式，CLDN 18.2多肽的表达模式可以用作标记，指示对象对试剂的生理反应。因此，可以在用药剂治疗对象之前和期间的各个点确定该反应状态。
本发明的其他方面涉及用于确定患者是可能还是不太可能对CLDN 18.2 CAR疗法产生反应的方法。在特定的实施方案中，该方法包括使从患者中分离出的肿瘤样品与有效量的CLDN 18.2抗体接触，并检测与该肿瘤样品结合的任何抗体的存在。在进一步的实施方案中，与肿瘤样品结合的抗体的存在表明患者可能对CLDN 18.2 CAR疗法产生反应，而与肿瘤样品结合的抗体的不存在表明患者不太可能对CLDN 18.2疗法产生反应。在一些实施方案中，该方法包括向被确定可能对CLDN 18.2 CAR疗法产生反应的患者施用有效量的CLDN18.2 CAR疗法的额外步骤。
自动化的实施方式。本领域普通技术人员将理解，使用本文公开的CLDN 18.2抗体的方法的各方面可以是自动化的。CLDN 18.2染色程序的特定方面可以使用各种自动化过程进行。
IV.试剂盒
如本文所述，本公开提供了用于确定CLDN 18.2的表达水平的诊断方法。在一个特定的方面，本公开提供了用于执行这些方法的试剂盒以及用于执行本发明的方法的说明书，例如收集组织和/或进行筛查和/或分析结果。
试剂盒包含本文公开的CLDN 18.2抗体组合物(例如单克隆抗体)或使用说明书，或基本上由其组成，或由其组成。该试剂盒可用于检测生物样品中生物样品中CLDN 18.2多肽的存在，所述生物样品例如是任何体液，包括但不限于痰、血清、血浆、淋巴液、囊性液、尿液、粪便、脑脊髓液、胃液或血液，包括人体组织的活检样本。测试样品还可以是肿瘤细胞、与肿瘤相邻的正常细胞、与肿瘤组织类型相对应的正常细胞、血细胞、外周血淋巴细胞或其组合。在上述方法中使用的测试样品将根据测定形式、检测方法的性质以及用作待测定样品的组织、细胞或提取物而有所不同。制备细胞的蛋白质提取物或细胞膜提取物的方法是本领域已知的，并且可以容易地调整以获得与所用系统兼容的样品。
在一些方面，试剂盒可以包含：一种或多种能够结合生物样品中的CLDN 18.2多肽的CLDN 18.2抗体(例如，具有与CLDN 18.2抗体B7H4 5F6、B7H4#33-14或B7H4#36-1相同的抗原结合特异性的抗体或其抗原结合片段)；用于确定样品中CLDN 18.2多肽的量的装置；以及用于将样品中CLDN 18.2多肽的量与标准物进行比较的装置。可以标记一种或多种CLDN 18.2抗体。试剂盒组分(例如试剂)可以包装在合适的容器中。试剂盒可进一步包含使用试剂盒检测CLDN 18.2多肽的说明书。在某些方面，试剂盒包含：一抗，例如连接至固相支持物的一抗，其与CLDN 18.2多肽结合；以及任选的2)不同的二抗，其与CLDN 18.2多肽或一抗结合并缀合至可检测的标记。
试剂盒还可以包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可以包含检测可检测标记所必需的组分，例如酶或底物。试剂盒还可以包含对照样品或一系列对照样品，可以对其进行分析并将其与测试样品进行比较。试剂盒的每个组件都可以封装在单独的容器中，所有各种容器都可以在单个包装中，与解释使用该试剂盒进行的测定结果的说明一起。本发明的试剂盒可以在试剂盒容器上或之中包含书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒中包含的试剂。
可以适当地，这些建议的试剂盒组分可以以本领域技术人员惯用的方式包装。例如，这些建议的试剂盒组分可以以溶液或液体分散体等形式提供。
V.载体
抗体或CLDN 18.2 CAR也可以与许多不同的载体结合。因此，本发明还提供了包含抗体和另一种活性或惰性物质的组合物。众所周知的载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。为了本发明的目的，载体的性质可以是可溶的或不溶的。本领域技术人员将知道用于结合抗体的其他合适的载体，或者将能够使用常规实验来确定抗体。
嵌合抗原受体及其用途
I.组合物
本公开提供了结合CLDN 18.2的嵌合抗原受体(CAR)，所述CLDN 18.2包含细胞外和细胞内结构域或基本上由其组成。细胞外结构域包含靶标特异性结合元件，或者称为抗原结合结构域。细胞内结构域或胞质结构域包含共刺激信号传导区域和ζ链部分。CAR可以任选地进一步包含至多300个氨基酸、优选10至100个氨基酸、更优选25至50个氨基酸的间隔域。
抗原结合结构域。在某些方面，本发明提供了一种CAR，其包含对CLDN 18.2特异的抗原结合结构域，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含抗CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域，或基本上由其组成，或由其组成。在进一步的实施方案中，抗CLDN 18.2抗体的重链可变区和轻链可变区包含抗CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域，或基本上由其组成，或由其组成。这些抗体及其序列在本文中公开。对本领域技术人员显而易见的是，本文公开的针对CLDN 18.2的抗体片段可用于产生CAR。因此，相关公开内容并入本文。
跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然的或合成的来源。在来源是天然的情况中，结构域可以衍生自任何膜结合或者跨膜蛋白。具有在本发明中的特定用途的跨膜区域可以衍生自CD8、CD28、CD3、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TCR。替代性地，跨膜结构域可以是合成的，在该情况中它将主要包括疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成的跨膜结构域的每个末端将会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽连接子(优选长度为2至10个氨基酸)可以形成CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的连接子。
细胞质结构域。CAR的细胞质结构域(胞质域)或细胞内信号传导结构域负责在其中置有CAR的免疫细胞的传统效应器功能中的至少一个的激活。细胞内信号传导结构域是指蛋白的转导效应器功能信号并引导免疫细胞进行其特定功能的一部分。可以使用整个信号传导结构域或其截短的部分，只要该截短的部分足够来转导效应器功能信号。TCR和共受体的细胞质序列以及其衍生物或变体能够作用为细胞内信号传导结构域以在CAR中使用。具有在本发明中的特定用途的细胞内信号传导结构域可以衍生自FcR、TCR、CD3、CDS、CD22、CD79a、CD79b、CD66d。由于仅通过TCR生成的信号不足以完全激活T细胞，因此可能还需要辅助或共刺激信号。因此，共刺激信号分子的细胞内区域包括但不限于CD27、CD28、4-IBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或与CD83特异性结合的配体也可以包含在CAR的胞质结构域中。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的细胞激活部分是T细胞信号传导结构域，其包括以下中的一个或多个蛋白或其片段，或基本上由其组成，或由其组成：CD8蛋白、CD28蛋白、4-1BB蛋白和CD3ζ蛋白。
在具体的实施方案中，CAR包含以下序列、或基本上由其组成、或由其组成：抗CLDN18.2抗体的抗原结合结构域、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、共刺激信号传导区域、以及CD3ζ信号传导结构域。在进一步的实施方案中，共刺激信号传导区域包含CD28共刺激信号传导区域和4-1BB共刺激信号传导区域中的一个或两个。
在一些实施方案中，CAR可以进一步包含可检测标记或纯化标记。
II.用于制备CAR的方法
本发明的方面涉及一种包含CAR的分离的细胞以及产生这种细胞的方法。该细胞是原核或真核细胞。一方面，该细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、其任何亚群、或任何其他免疫细胞。真核细胞可以来自任何优选的物种，例如动物细胞、哺乳动物细胞，例如人、猫或犬细胞。这些细胞可以来自患者、供体、或细胞系，例如现成的细胞。
在特定的实施方案中，分离的细胞包含外源CAR，或基本上由其组成，或由其组成，所述外源CAR包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：抗CLDN18.2抗体的抗原结合结构域、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域和CD3ζ信号传导结构域。在某些实施方案中，分离的细胞是T细胞，例如动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫T细胞、犬T细胞或人T细胞。在某些实施方案中，分离的细胞是NK细胞，例如动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫NK细胞、犬NK细胞或人NK细胞。在某些实施方案中，分离的细胞是B细胞，例如动物B细胞、哺乳动物B细胞、猫B细胞、犬B细胞或人B细胞。应当理解，对于树突细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、这些的任何亚型或所述的T细胞、NK细胞和B细胞、和/或任何其他免疫细胞，每种物种的相同或相似的实施方案都适用。
在某些实施方案中，公开了产生表达CAR的细胞的方法，该方法包括以下步骤，或者基本上由以下步骤组成，或者由以下步骤组成：用编码CAR的核酸序列转导分离的细胞群体。在另一方面，选择已经用所述核酸序列成功地转导的细胞的亚群。在一些实施方案中，分离的细胞是T细胞、动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫T细胞、犬T细胞或人T细胞，从而产生CAR T细胞。在某些实施方案中，分离的细胞是NK细胞，例如动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫NK细胞、犬NK细胞或人NK细胞，从而产生CAR NK细胞。在一些实施方案中，分离的细胞是B细胞、动物B细胞、哺乳动物B细胞、猫B细胞、犬B细胞或人B细胞，从而产生CAR B细胞。应当理解，对于树突细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、这些的任何亚型或所述的T细胞、NK细胞和B细胞、和/或任何其他免疫细胞，每种物种的相同或相似的实施方案都适用。
分离细胞的来源。在扩增和遗传修饰本文公开的细胞之前，可以从对象获得细胞(例如在涉及自体疗法的实施方案中)，或从市售培养物中获得细胞。
细胞可得自对象的多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。
分离相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下实施例中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于LifeTechnologies
Figure BDA0002979842930000561
系统；STEMcell Technologies EasySepTM、RoboSepTM、RosetteSepTM、SepMateTM；Miltenyi Biotec MACSTM细胞分离试剂盒、以及其他商业上可获得的细胞分离和纯化试剂盒。可以通过使用在对独特的细胞表面标记物特异的这样的试剂盒中可用的珠粒或其他结合试剂，分离免疫细胞的特定的亚群。例如，MACSTMCD4+和CD8+MicroBeads可以被用来分离CD4+和CD8+T细胞。可以根据已知技术分离的细胞的其他非限制性实例包括大量的T细胞、NK T细胞和γδT细胞。
替代性地，细胞可以通过商业上可用的细胞培养物而获得，其包括但不限于：对T细胞，BCL2(AAA)Jurkat(
Figure BDA0002979842930000562
CRL-2902TM)、BCL2(S70A)Jurkat(
Figure BDA0002979842930000563
CRL-2900TM)、BCL2(S87A)Jurkat(
Figure BDA0002979842930000564
CRL-2901TM)、BCL2Jurkat(
Figure BDA0002979842930000565
CRL-2899TM)、Neo Jurkat(
Figure BDA0002979842930000566
CRL-2898TM)细胞系；对于B细胞，AHH-1(
Figure BDA0002979842930000567
CRL-8146TM)、BC-1(
Figure BDA0002979842930000568
CRL-2230TM)、BC-2(
Figure BDA0002979842930000569
CRL-2231TM)、BC-3(
Figure BDA00029798429300005610
CRL-2277TM)、CA46(
Figure BDA00029798429300005611
CRL-1648TM)、DG-75[D.G.-75](
Figure BDA00029798429300005612
CRL-2625TM)、DS-1(
Figure BDA00029798429300005613
CRL-11102TM)、EB-3[EB3](
Figure BDA00029798429300005614
CCL-85TM)、Z-138(ATCC#CRL-3001)、DB(ATCC CRL-2289)、Toledo(ATCC CRL-2631)、Pfiffer(ATCC CRL-2632)、SR(ATCC CRL-2262)、JM-1(ATCC CRL-10421)、NFS-5C-1(ATCC CRL-1693)；NFS-70C10(ATCC CRL-1694)、NFS-25C-3(ATCC CRL-1695)和SUP-B15(ATCC CRL-1929)细胞系；对于NK细胞，NK-92(
Figure BDA00029798429300005615
CRL-2407TM)、NK-92MI(
Figure BDA00029798429300005616
CRL-2408TM)细胞系。进一步的实施例包括但不限于：成熟的T细胞系，例如Deglis、EBT-8、HPB-MLp-W、HUT 78、HUT102、Karpas 384、Ki 225、My-La、Se-Ax、SKW-3、SMZ-1和T34；未成熟的T细胞系，例如ALL-SIL、Be13、CCRF-CEM、CML-T1、DND-41、DU.528、EU-9、HD-Mar、HPB-ALL、H-SB2、HT-1、JK-T1、Jurkat、Karpas 45、KE-37、KOPT-K1、K-T1、L-KAW、Loucy、MAT、MOLT-1、MOLT 3、MOLT-4、MOLT 13、MOLT-16、MT-1、MT-ALL、P12/Ichikawa、Peer、PER0117、PER-255、PF-382、PFI-285、RPMI-8402、ST-4、SUP-T1至T14、TALL-1、TALL-101、TALL-103/2、TALL-104、TALL-105、TALL-106、TALL-107、TALL-197、TK-6、TLBR-1、-2、-3、以及-4、CCRF-HSB-2(CCL-120.1)、J.RT3-T3.5(ATCC TIB-153)、J45.01(ATCC CRL-1990)、J.CaM1.6(ATCC CRL-2063)、RS4；11(ATCC CRL-1873)、CCRF-CEM(ATCC CRM-CCL-119)；皮肤T细胞淋巴瘤细胞系，例如HuT78(ATCC CRM-TIB-161)、MJ[G11](ATCC CRL-8294)、HuT102(ATCC TIB-162)；来自间变性和大细胞淋巴瘤的B细胞系，例如DEL、DL-40、FE-PD、JB6、Karpas 299、Ki-JK、Mac-2APly1、SR-786、SU-DHL-1、-2、-4,-5,-6,-7,-8,-9,-10、以及-16、DOHH-2、NU-DHL-1、U-937、Granda 519、USC-DHL-1、RL；霍奇金淋巴瘤，例如DEV、HD-70、HDLM-2、HD-MyZ、HKB-1、KM-H2、L 428、L 540、L1236、SBH-1、SUP-HD1和SU/RH-HD-l；以及NK细胞系，例如HANK1、KHYG-1、NKL、NK-YS、NOI-90和YT。无白血病(Null leukemia)细胞系，包括但不限于REH、NALL-1、KM-3、L92-221，是免疫细胞的另一种商业上可获得的来源，同样的是衍生自其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例如K562红白血病、THP-1单核细胞白血病、U937淋巴瘤、HEL红白血病、HL60白血病、HMC-1白血病、KG-1白血病、U266骨髓瘤。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括American Type Culture Collection或ATCC(www.atcc.org/)以及GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures(https://www.dsmz.de/)。
在一些实施方案中，可以进一步修饰表达所公开的CAR的T细胞，以减少或消除内源TCR的表达。减少或消除内源性TCR可以减少脱靶效应并提高T细胞的有效性。可以使用多种方法来产生稳定地缺乏功能性TCR表达的T细胞。T细胞以复合物的形式内在化、分选和降解整个T细胞受体，在静止T细胞中的半衰期约为10小时，在受激T细胞中的半衰期为3小时(von Essen,M.et al.(2004)J.Immunol.173:384-393)。TCR复合物的正确功能需要组成TCR复合物的蛋白质的化学计量比正确。TCR功能还需要两个具有ITAM基序的功能正常的TCRζ蛋白。MCR肽配体结合后，TCR的激活需要在同一T细胞上结合多个TCR，所有都必须正确发出信号。因此，如果TCR复合物被无法正确结合或无法最佳信号传递的蛋白质所破坏，则T细胞将无法充分激活以开始细胞反应。
因此，在一些实施方案中，可使用RNA干扰(例如shRNA、siRNA、miRNA等)、CRISPR或靶向原代T细胞中编码特定TCR(例如TCR-α和TCR-β)和/或CD3链的核酸的其他方法消除TCR表达。通过阻断一种或多种这些蛋白的表达，T细胞将不再产生TCR复合物的一种或多种关键成分，从而使TCR复合物不稳定并阻止功能性TCR的细胞表面表达。即使如此，但当使用RNA干扰时某些TCR复合物可以回收到细胞表面，RNA(例如shRNA、siRNA、miRNA等)也会阻止TCR蛋白的新产生，从而导致整个TCR复合物的降解和去除，导致产生功能性TCR表达稳定缺乏的T细胞。
抑制性RNA(例如shRNA、siRNA、miRNA等)在原代T细胞中的表达可以使用任何常规的表达系统(例如慢病毒表达系统)来实现。尽管慢病毒可用于靶向静止的原代T细胞，但并非所有T细胞都会表达shRNA。这些T细胞中的某些可能无法表达足够数量的RNA，从而无法充分抑制TCR表达，从而改变T细胞的功能活性。因此，可以例如通过细胞分选或分离技术去除在病毒转导后保留中等至高TCR表达的T细胞，从而使剩余的T细胞缺乏细胞表面TCR或CD3，从而使功能性TCR或CD3表达不足的T细胞的分离的群体得以扩增。
CRISPR在原代T细胞中的表达可以使用常规CRISPR/Cas系统实现，并指导对靶标TCR特异的RNA。合适的表达系统(例如慢病毒或腺病毒表达系统)是本领域已知的。类似于抑制剂RNA的递送，CRISPR系统可以被用于特异性靶向静止的原代T细胞或其他合适的免疫细胞进行CAR细胞治疗。此外，就CRISPR编辑不成功的程度而言，可以根据上述方法选择成功的细胞。例如，如上所述，可以例如通过细胞分选或分离技术去除在病毒转导后保留中等至高TCR表达的T细胞，从而使剩余的T细胞缺乏细胞表面TCR或CD3，从而使分离的缺乏功能性TCR或CD3表达的T细胞群体得以扩增。进一步认识到，CRISPR编辑构建体可以被用于敲除内源TCR和敲入本文公开的CAR构建体。因此，可以理解的是，CRISPR系统可以被设计用于实现这些目的中的一个或两者。
载体。可以使用载体制备CAR细胞。本发明的方面涉及一种分离的核酸序列，其编码(i)CAR或(ii)编码免疫调节分子的多核苷酸，以及载体，其包含这些核酸和/或其互补序列和/或等效物中的任一项或二者，或基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，分离的核酸序列编码CAR，其包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：癌症或肿瘤靶向抗体的抗原结合结构域，CD8α铰链结构域，CD8α跨膜结构域，CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域以及CD3ζ信号传导结构域。在特定的实施方案中，分离的核酸序列包含编码以下的序列，或基本上由其组成，或由其组成：(a)抗CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域，其后是(b)CD8α铰链结构域的序列，(c)CD8α跨膜结构域，其后是(d)CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域，其后是(e)CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，分离的核酸序列编码CAR，并且在编码抗CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域的序列的上游包含Kozak共有序列，或基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，分离的核酸包含可检测的标记和/或赋予抗生素抗性的多核苷酸。一方面，标记或多核苷酸可用于选择用分离的核酸成功地转导的细胞。
在一些实施方案中，分离的核酸序列包含在载体内。在某些实施方案中，载体是质粒。在其他实施方案中，载体是病毒载体。这样的非限制性实例包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。在特定的实施方案中，载体是慢病毒载体。
在以下实施例中详细地讨论了示例性的载体的制备和使用所述载体来生产表达CAR的细胞。总的来说，通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体加入表达载体，实现编码CAR的天然的或合成的核酸的表达。可以使用类似的方法来构建包含编码免疫调节分子的多核苷酸的分离的核酸序列。所述载体可以适于复制和整合到真核生物中。用于生产包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)。
在一方面，术语“载体”是指保留了感染和转导非分裂和/或缓慢分裂的细胞并整合到靶细胞的基因组中的能力的重组载体。在一些方面，载体衍生自或者基于野生型病毒。在进一步的方面，载体衍生自或者基于野生型慢病毒。这样的实施例包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。替代性地，应该理解的是，其他逆转录病毒可以被用作载体骨架的基础，例如鼠白血病病毒(MLV)。很明显，根据本公开的病毒载体不必被局限于特定病毒的组分。病毒载体可以包含衍生自两种或更多种不同病毒的组分，并且还可以包括合成的组分。载体组分可以被操纵来获得所需的特性，例如靶细胞特异性。
本发明的重组载体可以衍生自灵长类和非灵长类。灵长类慢病毒的实施例包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子、以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒群组包括“慢病毒”原型visna/maedi病毒(VMV)、以及相关的山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和更近期地被描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。现有技术的重组慢病毒载体在本领域中是已知的，例如参见美国专利号6,924,123、7,056,699、7,07,993、7,419,829和7,442,551，其以引用的方式合并入本文中。
美国专利号6,924,123公开了某些逆转录病毒序列促进向靶细胞基因组的整合。该专利教导了每个逆转录病毒包含被称为gag、pol和env的基因，其编码病毒粒子蛋白和酶。这些基因通过被称为长末端重复(LTR)的区域而被处于两个末端的侧翼。LTR负责前病毒整合和转录。它们也用作增强子-启动子序列。换句话说，LTR可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的封装通过位于病毒基因组的5'末端的psi序列而发生。LTR自身是可以被分为三种元件的相同的序列，其被称为U3、R和U5。U3衍生自对RNA的3'末端独特的序列。R衍生自在RNA的两个末端重复的序列，而U5衍生自RNA的5'末端独特的序列。在不同的逆转录病毒之间这三种元件的尺寸可以发生较大的变化。对于病毒基因组，多聚(A)加成(终止)的位点是在LRT右边的R和U5之间的边界处。U3含有前病毒的大多数转录控制元件，其包括启动子和多重增强子序列，它们响应于细胞的(在某些情况下为病毒的)转录激活蛋白。
关于结构基因gag、pol和env自身，gag编码病毒的内部结构蛋白。gag蛋白被蛋白水解地处理成成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(RT)，其包括DNA聚合酶、相关的RNA酶H和整合酶(IN)，它们介导基因组的复制。
对于病毒载体颗粒的生产，载体RNA基因组被在宿主细胞中由编码它的DNA构建体表达。通过在宿主细胞中表达的其他核酸序列(“包装系统”，其通常包括gag/pol和env中的一个或两个)，以反式的形式提供不被所述载体基因组编码的颗粒组分。可以通过瞬时转染将生产病毒载体颗粒所需的一组序列引入宿主细胞，或者它们可以被整合进宿主细胞基因组，或者它们可以以混合物的方式被提供。涉及的技术对于本领域技术人员来说是已知的。
用于在本发明中使用的逆转录病毒载体包括但不限于：Invitrogen的pLenti系列版本4、6和6.2“ViraPower”系统，由Lentigen Corp.制造；pHIV-7-GFP，由City of HopeResearch Institute实验室生成和使用；“Lenti-X”慢病毒载体，pLVX，由Clontech制造；pLKO.1-puro，由Sigma-Aldrich制造；pLemiR，由Open Biosystems制造；以及pLV，由Virology(CBF),Berlin,Germany的CharitéMedical School,Institute实验室生成和使用。
将外源核酸引入本领域的其他方法是已知的，包括但不限于使用RNA电穿孔、纳米技术、睡眠美容载体、逆转录病毒和/或腺病毒中的一种或多种进行基因递送。
不管被用来将外源性核酸引入宿主细胞或将细胞暴露至本发明的抑制剂的方法如何，为了确认重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测试。这样的测试包括：例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如检测特定的肽是否存在，例如通过免疫学手段(ELlSA和蛋白免疫印迹)或者通过本文描述的测试来识别落入本发明的范围之内的试剂。
包装载体和细胞系。可以通过使用包装载体和细胞系，将分离的核酸包装进逆转录病毒包装系统。包装载体包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。包装载体含有促进遗传物质递送进细胞的元件和序列。例如，逆转录病毒构建体是这样的包装质粒，其包含至少一种逆转录病毒辅助DNA序列，其衍生自复制缺陷型逆转录病毒基因组，其以反式的方式编码包装复制缺陷型逆转录病毒载体所需的所有病毒粒子蛋白，并且用于生产能够以高滴度包装复制缺陷型逆转录病毒载体而不会产生复制完整型辅助病毒的病毒粒子蛋白。逆转录病毒DNA序列缺少编码病毒的病毒性5′LTR的天然增强子和/或启动子的区域，并且缺少负责包装辅助基因组的psi功能序列和3′LTR，但是编码外来的聚腺苷酸化位点(例如SV40聚腺苷酸化位点)、以及引导其中需要病毒生产的细胞类型中的有效转录的外来增强子和/或启动子。逆转录病毒是白血病病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、或长臂猿白血病病毒(GALV)。外来增强子和/或启动子可以是人类巨细胞病毒(HCMV)即早期(IE)增强子和启动子、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MMSV)的增强子和启动子(U3区域)、Rous肉瘤病毒(RSV)的U3区域、脾病灶形成病毒(SFFV)的U3区域、或连接到天然莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)启动子的HCMV IE增强子。逆转录病毒包装质粒可以由两个逆转录病毒辅助DNA序列组成，它们由基于质粒的表达载体编码，例如其中第一辅助序列包括编码嗜亲性MMLV或GALV的gag和pol蛋白的cDNA，并且第二辅助序列包括编码env蛋白的cDNA。Env基因，其确定宿主范围，可以衍生自编码以下的基因：嗜异性的、双嗜性的、嗜亲性、多嗜性的(貂病灶形成)或10A1鼠白血病病毒env蛋白、或长臂猿白血病病毒(GALV)env蛋白、人类免疫缺陷病毒env(gp160)蛋白、水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白、人类T细胞白血病(HTLV)I型和II型env基因产物，或嵌合包膜基因，其衍生自前述env基因或编码前述env基因产物的细胞质和跨膜结构域的嵌合包膜基因中的一个或多个以及针对在所需的靶细胞上的特异性表面分子的单克隆抗体的组合。
在包装过程中，包装载体和逆转录病毒载体被瞬时地共转染进能够产生病毒的哺乳动物细胞的第一群体中，该细胞例如是人类胚胎肾细胞，例如293细胞(ATCCNo.CRL1573,ATCC,Rockville,Md.)，从而生产高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。在本发明的另一种方法中，该细胞的瞬时转染的第一群体然后与哺乳动物靶细胞(例如人类淋巴细胞)共培养，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。在本发明的另一种方法中，来自上述细胞的瞬时转染的第一群体的上清液与哺乳动物靶细胞(例如人类淋巴细胞或造血干细胞)一起孵育，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。
在另一方面，在能够产生病毒的哺乳动物细胞(例如人类胚胎肾细胞，例如293细胞)的第一群体中稳定地表达包装载体。通过使用可选择的标记物进行共转染或者使用假型病毒进行感染，将逆转录病毒或慢病毒载体引入细胞中。在两种情况中，载体都发生整合。替代性地，载体可以被引入游离地(episomally)维持的质粒中。生产了高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。
CAR细胞的激活和扩增。无论是在表达所需的CAR的细胞的遗传修饰之前还是之后，都可以使用通常已知的方法来激活和扩增细胞，这些方法例如是在美国专利号6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041，以及例如Lapateva et al.(2014)Crit Rev Oncog 19(1-2):121-32；Tam et al.(2003)Cytotherapy 5(3):259-72；Garcia-Marquez et al.(2014)Cytotherapy16(11):1537-44的参考文献中描述的方法。使用CLDN 18.2抗原离体刺激能够激活并扩增表达所选的CAR的细胞亚群体。替代性地，可以通过与CLDN 18.2抗原相互作用而在体内激活细胞。
在某些免疫细胞的情况下，可能需要另外的细胞群、可溶性配体和/或细胞因子或刺激剂来活化和扩增细胞。相关试剂是本领域公知的，并且根据已知的免疫学原理进行选择。例如，可溶性CD-40配体可能有助于激活和扩展某些B细胞群体。类似地，辐照的饲养细胞可用于激活和扩增NK细胞的程序中。
激活相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下实施例中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于LifeTechnologies
Figure BDA0002979842930000631
系统激活和扩增试剂盒；BD Biosciences PhosflowTM激活试剂盒、Miltenyi Biotec MACSTM激活/扩增试剂盒、以及对相关细胞的激活部分特异性的其他商业上可获得的细胞试剂盒。可以通过使用在这样的试剂盒中可用的珠粒或其他试剂，激活或扩增免疫细胞的特定的亚群体。例如，α-CD3/α-CD28
Figure BDA0002979842930000632
可以被用来激活和扩增分离的T细胞的群体。
如上所述，嵌合抗原受体包含抗原识别部分和细胞活化部分。本发明的方面涉及包含对CLDN 18.2特异的抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。
在一个实施方案中，本发明的CAR的特征在于其包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：抗黄体生成激素受体(“CLDN 18.2”)抗体的抗原结合结构域，CD8α铰链结构域；CD8α跨膜结构域；CD28和/或4-1BB共刺激信号传导区域；以及CD3ζ信号传导结构域。
在另一个实施方案中，抗CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域包含抗CLDN 18.2重链可变区和抗CLDN 18.2轻链可变区。对于本领域技术人员显而易见的是，具有详细元件的抗体也在本发明的范围内。
在一些实施方案中，分离的核酸进一步包含位于抗CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域上游的Kozak共有序列，或基本上由其组成，或由其组成。
在本发明的一些方面，分离的核酸序列进一步包含编码抗生素抗性标记的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种载体，其包含编码如上所述的抗CLDN18.2 CAR多肽或其互补序列的分离的核酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，可将多核苷酸掺入载体中。这样的非限制性实例包括逆转录病毒载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。
在一个实施方案中，本发明内容是分离的细胞，其包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：如上所述的编码抗CLDN 18.2 CAR的外源添加的多核苷酸，其单独存在或与如上所述的载体组合；和/或外源添加的抗CLDN 18.2 CAR；如上所述。
在本发明的一方面，分离的细胞可以是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
III.使用方法
治疗应用。本发明的CAR T细胞可用于治疗肿瘤和癌症。本发明的CAR-T细胞可以单独地或与稀释剂、已知的抗癌治疗剂和/或与其他组分(例如细胞因子或其他具有免疫刺激作用的细胞)组合施用。
本发明的方法方面涉及用于在有需要的对象中抑制肿瘤生长和/或用于治疗有需要的癌症患者的方法。在一些实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤/癌症是胃、胰腺、食道、卵巢或肺部肿瘤/癌症。在一些实施方案中，肿瘤或癌症表达或过表达CLDN 18.2。在某些实施方案中，这些方法包括向对象或患者施用有效量的分离的细胞，或基本上由其组成，或由其组成。在进一步的实施方案中，该分离的细胞包含CLDN 18.2 CAR。在其他实施方案中，分离的细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，分离的细胞对于所治疗的对象或患者是自体同源的。在另一方面，所述肿瘤表达CLDN 18.2抗原，并且已经通过诊断方法(例如本文所述的诊断方法)选择了所述对象用于治疗。
本文所公开的CAR细胞可以单独地或与稀释剂、已知的抗癌治疗剂和/或与其他组分(例如细胞因子或其他具有免疫刺激性的细胞群)组合施用。它们可能是一线、二线、三线、四线或其他治疗方法。可以与其他疗法结合使用。这样的非限制性实例包括化学疗法或生物制剂。适当的治疗方案将由主治医师或兽医确定。
包含本发明的CLDN 18.2 CAR的药物组合物可以适合于待治疗或预防的疾病的方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但是给药的量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性等因素来确定。
在另一方面，本发明提供了一种在有需要的对象中抑制实体瘤生长的方法，该方法包括向该对象施用有效量的分离的抗CLDN 18.2 CAR T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，分离的T细胞或NK细胞对于所治疗的对象是自体同源的。在另一个实施方案中，所述肿瘤是胃、结肠、结肠直肠、胰腺、食道、卵巢或肺肿瘤。抑制肿瘤生长的方法可以应用于对象，包括但不限于人、狗、猫、马和其他物种。
在另一方面，本公开内容提供了一种治疗有需要的癌症患者的方法，该方法包括向对象施用有效量的抗CLDN 18.2T细胞或NK细胞的分离的细胞，或基本上由其组成，或者由其组成。分离的T细胞或NK细胞可以对于所治疗的对象是自体同源的。肿瘤是胃癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌或肺癌。在一个实施方案中，治疗癌症的对象是人类患者。
在一个实施方案中，本公开提供了一种用于确定患者是可能还是不太可能对抗CLDN 18.2 CAR疗法产生反应的方法，该方法包括以下步骤，或基本上由其组成，或者进一步由其组成：使从患者体内分离的肿瘤样品与有效量的抗CLDN 18.2抗体接触并检测与该肿瘤样品结合的任何抗体的存在，其中与该肿瘤样品结合的抗体的存在表明该患者可能会对抗CLDN 18.2 CAR疗法的产生反应，以及与肿瘤样品结合的抗体的不存在表明患者不太可能对抗CARD疗法产生反应。在另一个实施方案中，该方法进一步包括将有效量的抗CLDN18.2 CAR治疗施用于被确定可能对抗CLDN18.2 CAR治疗产生反应的患者。在这种方法中，患者可以患有胃癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌或肺癌。
本发明还提供了用于确定CLDN 18.2的表达水平的诊断方法。在一个特定的方面，本发明提供了用于执行这些方法的试剂盒以及用于执行本发明的方法的说明书，例如收集组织和/或进行筛查和/或分析结果。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测生物样品中的CLDN 18.2的方法，该方法包括以下步骤，或基本上由其组成，或由其组成：使样品与抗CLDN 18.2抗体或能够与包含SEQ ID NO：42和43的肽结合的抗原结合片段接触，并检测通过抗体或抗原结合片段与CLDN 18.2结合形成的复合物。
在一方面，样品包括细胞样品或组织样品。
在一方面，样品获自被诊断患有癌症、怀疑患有癌症或有风险患有癌症的对象。
在另一方面，癌症是胃癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌或肺癌。在另一方面，癌细胞或肿瘤细胞表达或过表达CLDN 18.2。
在一方面，所述检测包括免疫组织化学(IHC)、蛋白质印迹、流式细胞术或ELISA中的一种或多种，或基本上由其组成，或由其组成。
在一方面，该方法包括从对象中分离生物样品，或基本上由其组成，或由其组成。
在一方面，所述对象是哺乳动物。
在另一方面，哺乳动物选自：人、动物、非人类灵长类、狗、猫、绵羊、小鼠、马或牛。
在一个实施方案中，本公开内容提供了一种检测从对象中分离的样品中的病理细胞的方法，该方法包括以下步骤，或基本上由其组成，或由其组成：(a)通过检测由抗CLDN18.2抗体或能够结合包含CLDN 18.2的肽的抗原结合片段形成的复合物而检测来自对象的生物学样品中CLDN 18.2的水平，以及(b)将在步骤(a)中观察到的CLDN 18.2的水平与在对照生物样品中观察到的CLDN 18.2的水平进行比较；其中当与对照生物样品中观察到的水平相比CLDN 18.2的水平升高时，检测到病理细胞。
在一方面，对象的生物样品包含从胃、胰腺、食道、卵巢或肺组织分离的样品，或基本上由其组成，或由其组成。
在另一方面，所述检测包括免疫组织化学(IHC)、蛋白质印迹、流式细胞术或ELISA中的一种或多种，或基本上由其组成，或由其组成。
在一方面，所述方法包括从对象中分离生物样品，或基本上由其组成，或由其组成。
在一方面，所述对象是哺乳动物。
在另一方面，哺乳动物选自：人、动物、非人类灵长类、狗、猫、绵羊、小鼠、马或牛。
IV.载体
本发明的其他方面涉及组合物，其包含载体和一种或多种本发明描述的产品，例如，包含CLDN 18.2 CAR的分离细胞、分离的核酸、载体、任何抗CLDN 18.2抗体或CAR细胞的分离细胞、抗CLDN 18.2。
简单来说，本发明的药物组合物，包括但不限于如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。本发明的组合物可以被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外施用。在某些实施方案中，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。
简单来说，本发明的药物组合物，包括但不限于如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内给药。
本发明的药物组合物可以适合于要治疗或预防的疾病的方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但是给药的量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性等因素来确定。
提供以下实施例以说明而非限制本公开。
实施例
实施例1：抗人CLDN18.2的小鼠单克隆抗体的产生
使用杂交瘤技术产生抗人CLDN18.2小鼠单克隆抗体。
抗原：a)编码人CLDN18.2EC1(细胞外结构域1)人Fc蛋白的cDNA；b)人CLDN18.2EC1(细胞外结构域1)人Fc蛋白；c)表达全长人CLDN18.2的CHO细胞。
免疫：为了产生针对人CLDN18.2的小鼠单克隆抗体，首先以40ug/小鼠用编码人CLDN18.2EC1人Fc蛋白的cDNA免疫4-6周的雌性Swiss Webster小鼠。第一次免疫后第21和35天，每只小鼠用30ug人CLDN18.2EC1人Fc蛋白加强免疫。用表达全长人CLDN18.2的CHO细胞进一步加强免疫接种的小鼠。为了选择产生结合人CLDN18.2的抗体的小鼠，通过ELISA和FACS分析测试来自免疫小鼠的血清。
为了进行ELISA测定，用PBS中1μg/ml的人CLDN18.2 EC1人Fc蛋白包被微量滴定板，在4℃以100l/孔过夜，并用100μl/孔的2％BSA在室温下封闭1小时。将来自免疫小鼠的血清稀释液添加到每个孔中，并在室温下孵育1-2小时。将板用PBS/吐温洗涤，然后与与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG抗体在室温孵育1小时。洗涤后，将板用TMB过氧化物酶底物显影，并通过分光光度计在OD450nm下分析。
对于基于FACS的滴度分析，以200,000个细胞/孔用人CLDN18.2/CHO细胞或CLDN18.1/CHO细胞接种96孔微量滴定板。将来自免疫小鼠的血清稀释液添加到每个孔中。将细胞充分混合并在4℃下孵育15分钟。然后将细胞用PBS洗涤3次，然后与PE标记的抗小鼠Fcγ特异性抗体(Jackson Immuno-Research)在4℃孵育15分钟。再次用PBS洗涤细胞3次，并使用FACS Caliber仪器(Becton-Dickinson)进行分析。在融合前3-4天，用30ug人CLDN18.2EC1 huFc蛋白加强对CLDN18.2具有足够特异性滴度的小鼠。
杂交瘤融合是使用BTX2001电细胞操纵器(Harvard Apparatus)和杂交瘤电融合的标准方案完成的。从淋巴结和脾脏分离出的总小鼠淋巴细胞与SP2/0细胞(ATCC)融合，并使用含有Azaserine(Sigma)的培养基选择杂交瘤。使用ELISA和FACS测定法筛选杂交瘤上清液。使用有限稀释法将阳性孔进一步亚克隆。
选择杂交瘤克隆T13S2、T88S1、T138S2、T155S2、T158S2、T192S2、T224S8、T252S4和LN27S4用于杂交瘤测序。简而言之，使用Trizolreagents(Invitrogen)从杂交瘤细胞中提取RNA，并使用PrimeScriptTM逆转录酶制备cDNA。使用cDNA和小鼠Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)PCR扩增抗体重链和轻链V区，并使用标准DNA测序技术获得序列。
抗体的可变区的氨基酸和多核苷酸序列在下表1和表2中提供。
表1.抗CLDN18.2抗体的CDR组合
Figure BDA0002979842930000681
Figure BDA0002979842930000691
表2.抗CLDN18.2 mAb重链和轻链可变区序列。带下划线的是抗体CDR。
Figure BDA0002979842930000692
Figure BDA0002979842930000701
Figure BDA0002979842930000711
Figure BDA0002979842930000721
Figure BDA0002979842930000731
实施例2：抗CLDN18.2小鼠单克隆抗体的结合特异性和亲和力
为了评估抗CLDN18.2小鼠杂交瘤抗体的结合特异性，使用表达人CLDN18.1或人CLDN18.2的CHO细胞通过FACS分析来分析纯化的抗体。如前所述进行FACS分析。如图1a和1b所示，所有9种杂交瘤抗体均与表达人CLDN18.2的CHO细胞结合，但不与表达人CLDN18.1的CHO细胞结合。杂交瘤抗体之一T29S9与CLDN18.1和18.2结合(图2)。
为了评估抗CLDN18.2小鼠杂交瘤抗体与细胞表面表达的人CLDN18.2的结合亲和力，使用表达人CLDN18.2的CHO细胞通过FACS分析抗CLDN18.2纯化的抗体的系列稀释液。如图3所示，某些抗体对细胞表面CLDN18.2具有高结合亲和力，例如T138S2、T155S2、T158S2、T192S2和T252S4，而其他抗体则具有中等至低结合亲和力，例如T13S2、T88S1、T224S8和LN27S4。
抗人CLDN18.2抗体与人CLDN18.2的结合也可以在ELISA测定中评估。简而言之，将96孔微量滴定板用PBS中1μ/ml的人CLDN18.2 huFc蛋白包被，在4℃下100μl/孔包过夜，然后在室温下用100μl/孔的2％BSA封闭1小时。从20μg/ml开始将纯化的小鼠杂交瘤抗体的五倍稀释液添加到每个孔中，并在室温下孵育1-2小时。将板用PBS/吐温洗涤，然后与缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG抗体在室温下孵育1小时。洗涤后，将板用TMB底物显影，并通过分光光度计在OD450nm下分析。如图4所示，所有抗体都可以在不同程度上结合到铺板的包被的人CLDN18.2蛋白。有趣的是，观察到一些以高亲和力与细胞表面CLDN18.2结合的抗体，例如T138S2和T158S2，并未很好地与板包被的CLDN18.2结合(图4)。
实施例3：抗CLDN18.2小鼠单克隆抗体与KATO III细胞的结合
还使用FACS测定法来评估抗CLDN18.2抗体与人胃癌细胞系KATO III的结合。如图5所示，六种抗CLDN18.2杂交瘤抗体可以以不同水平结合KATO III细胞。
实施例4：抗人CLDN18.2小鼠/人嵌合抗体对人CLDN18.2和KATO III细胞的结合亲和力
为了产生抗人CLDN18.2小鼠/人嵌合抗体，将小鼠抗体重链和轻链V区克隆到包含人抗体重链IgG1和轻链恒定区的瞬时表达载体中。所得的抗体重链和轻链表达构建体用于转染HEK293细胞。收获培养物上清液，并上样到蛋白A Sepharose柱(GE Healthcare)上。洗涤柱，然后用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸缓冲液，pH 3.0)洗脱抗体。将收集的级分用1MTris-HCl(pH 8.0)中和，合并在一起，然后用PBS透析。在还原和非还原条件下，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析抗体的纯度。通过考马斯亮蓝染色使蛋白条带可视化。
为了评估抗人CLDN18.2小鼠/人嵌合抗体对人CLDN18.2的结合亲和力，首先将表达人CLDN18.2的CHO细胞与从100μg/ml开始的5倍系列稀释的小鼠/人嵌合mAb孵育在冰上30分钟。然后将细胞用PBS洗涤3次，然后与PE标记的抗人Fcγ特异性抗体(JacksonImmuno-Research)在4℃温育15分钟。再次用PBS洗涤细胞3次，并使用FACS Caliber仪器(Becton-Dickinson)进行分析。如图6所示，所有六种嵌合抗体均以与其杂交瘤对应物相似的亲和力结合CHO-CLDN18.2细胞。D10C是由GanyMed鉴定的抗人CLDN18.2抗体，用作对照。
还通过FACS评估了抗人CLDN18.2嵌合抗体对人胃癌细胞系KATO III的结合亲和力。如图7所示，抗CLDN18.2嵌合抗体仅与小部分KATO III细胞结合。然而，与D10C抗体相比，大多数测试的抗体以更高的水平与KATO III细胞结合(图7)。
实施例5：抗人CLDN18.2抗体诱导的靶细胞中的受体内在化
评价了抗人CLDN18.2抗体诱导的CLDN18/2内在化。按照制造商的说明(Sigma)，将抗人CLDN18.2抗体cT155S2、cT158S2、cT224S8、cT192S2和cT252S4与FITC偶联。CHO-CLDN18.2细胞在4℃下用FITC标记的抗体染色20分钟，并用PBS洗涤两次，然后在37℃下孵育0小时(用于细胞表面结合)或3小时(用于抗体内在化)。然后通过荧光显微镜分析细胞。如图8a-8e所示，所有测试的抗人CLDN18.2抗体，包括cT155S2、cT158S2、cT224S8、cT192S2和cT252S4，均有效地诱导了CHO-CLDN18.2细胞上的CLDN18.2内在化(图8a-8e)。这些数据证明，与细胞毒素或细胞毒性剂偶联的抗CLDN18.2抗体可以被表达CLDN18.2的靶癌细胞内化。因此，抗CLDN18.2抗体-毒素缀合物可用作治疗癌症和其他疾病的抗体-药物缀合物(ADC)。
实施例6：小鼠抗人CLDN18.2抗体T252S4的人源化
使用mAb T252S4可变区基因来产生人源化的MAb。在此过程的第一步中，将MAbT252S4的VH和VK氨基酸序列与可用的人Ig基因序列数据库进行比较，以找到总体上最匹配的人种系Ig基因序列。对于轻链，最接近的人类匹配是IGKV4-1基因，而对于重链，最接近的人类匹配是IGVH5-51基因。
然后设计人源化可变域序列，其中将T252S4轻链的CDR1、CDR2和CDR3序列(表3中带下划线的序列)移植到IGKV4-1基因的框架序列上，并将T252S4重链的CDR1、CDR2和CDR3序列(表3中带下划线的序列)移植到IGVH5-51的框架序列上。然后生成3D模型，以确定是否存在任何构架位置，其中将小鼠氨基酸替换为人氨基酸会影响结合和/或CDR构象。一些人源化抗体的氨基酸和核苷酸序列在下表3中列出。
表3.人源化的T252S4抗体序列(CDR带下划线)
Figure BDA0002979842930000751
Figure BDA0002979842930000761
人源化的VH和VK基因是合成产生的，然后分别克隆到含有人γ1和人κ恒定结构域的载体中。人VH和人VK的配对产生了6种人源化抗体(请参阅表4)。
表4.具有其VH和VL区的人源化T252S4抗体
Figure BDA0002979842930000762
Figure BDA0002979842930000771
实施例7：人源化的T252S4抗体特异性结合稳定表达CLDN18.2的CHO细胞上的细胞表面人CLDN18.2
为了评估人源化的T252S4抗体与细胞表面上人CLDN18.2的结合活性，从HEK293细胞生产了人源化的T252S4抗体。简而言之，将三个HuT252S4抗体重链V区(H1、H2和H3)和两个轻链V区(L1和L2)以不同的组合(表5)配对以转染HEK293细胞，从而产生六种人源化的T252S4抗体。还表达了嵌合的T252S4 H/L用于比较。收获培养物上清液，并上样到蛋白ASepharose柱(GE Healthcare)上。洗涤柱，然后用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸缓冲液，pH 3.0)洗脱抗体。收集的级分用1M Tris-HCl(pH 8.0)中和，合并在一起，然后用PBS透析。在还原和非还原条件下，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析抗体的纯度。
为了评估人源化的T252S4抗体与细胞表面表达的人CLDN18.2的结合活性，使用表达人CLDN18.2的CHO细胞通过FACS分析了纯化的人源化抗CLDN18.2抗体的系列稀释液。如图9所示，所有的人源化T252S4抗体，包括HuT252S4 H1/L1、HuT252S4H2/L1、HuT252S4H3/L1、HuT252S4H1/L2、HuT252S4H2/L2和HuT252S4H3/L2，都对细胞表面CLDN18.2具有高结合亲和力。EC50为0.47至1μg/ml的人源化T252S4抗体与结合至细胞表面CLDN18.2的嵌合T252S4抗体(EC50为1μg/ml)具有相似的亲和力或更高的亲和力(图9)。
等效物
除非另有定义，否则本文所用的所有的技术和科学的术语都具有如本发明的所属领域中的普通技术人员中的一个通常所理解的相同的含义。
可以在缺少在本文没有具体公开的任何元素或限制的情况下，适当地实施本文说明性地描述的本技术。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应该被广泛且没有限制地理解。此外，本文采用的术语和表达已经被用作描述而非限制，在这些术语和表达的使用中，没有意图排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，但是应该认识到，在本发明技术的范围之内各种变化都是可能的。
因此，应该理解的是，在此提供的材料、方法和实施例是优选的方面的代表，是示例性的，并且不旨在作为对本技术的范围的限制。
本文广泛地和一般地描述了本技术。落入一般性描述之内的较窄的种类和亚属分组中的每一个也都形成本技术的一部分。这包括了具有从该属中移除任何主题的附带条件或负面限制的本技术的一般性描述，无论被删除的材料是否在本文中被具体描述。
此外，在以马库什组描述本技术的特征或方面的情况中，本领域技术人员将认识到，还借此以该马库什组中的任何单独成员或成员的亚组描述了本技术。
在本文中提及的所有公开文献、专利申请、专利和其他参考文献，其整体都以引用的方式明确地合并入本文中，至如同每个都单独地以引用的方式合并的相同程度。如发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。
在以下权利要求中阐述了其他方面。

Claims (62)

1.一种分离的抗体，其包含重链（HC）免疫球蛋白可变域序列和轻链（LC）免疫球蛋白可变域序列，其中所述抗体结合CLDN 18.2的表位，并且不结合CLDN 18.1。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述HC包含以下中的一个或多个：
（a）CDR1，其包含选自以下的氨基酸序列：(i) GFTFSSYA，(ii) GFTFSDYY，(iii)GFNIKDYF，(iv) GYSFTGYN，(v) GFSLTSYG，(vi) GYNMN或其每一个的等效物；
（b）CDR2，其包含选自以下的氨基酸序列：(i) ISGGGST，(ii) ISDGGGDT，(iii)IDPENGDT，(iv) ISNGGGST，(v) INPYNGGT，(vi) IWSDGRT，(vii) LINPYNGGTRYNQKFKG或其每一个的等效物；和/或
（c）CDR3，其包含选自以下的氨基酸序列：(i) ARGGNIYDGYPYYFDY，(ii)GGNIYDGYPYYFDY，(iii) ARHRGSLDY，(iv) NVLGYGNYGHFYYAMDY，(v) ARHRGSLDF，(vi)ARMGLGNAMDY，(vii) ARHGRYDPYAMDY，(viii) MGLGNAMDY或其每一个的等效物；
所述LC包含以下中的一个或多个：
（a）CDR1，其包含选自以下的氨基酸序列：(i) QNLLNSSNQKNY，(ii) ESVDNYGFSF，(iii)QSLVHSNGNTY，(iv) QNLLNSGNQKNY，(v) KSSQNLLNSGNQKNYLT或其每一个的等效物；
（b）CDR2，其包含选自以下的氨基酸序列：(i) FAS，(ii) RAS，(iii) KVS，(iv) WAS，(v) WASTMES或其每一个的等效物；和/或
（c）CDR3，其包含选自以下的氨基酸序列：(i) QQHYSTPLT，(ii) QQSNQGPLT，(iii)SQNTHVPRT，(iv) QQSNKVPLT，(v) QNDYIYPLP或其每一个的等效物。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中HC可变区包含选自以下的多肽：
(a)EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISGGGSTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSYLRSEDTAVYYCARGGNIYDGYPYYFDYWGQGTTLTVSS
(b)EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMFWIRQTPEKRLEWVASISDGGGDTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARHRGSLDYWGQGTTLTVSS
(c)EVQLQQSGTELVRSGASVKLSCTTSGFNIKDYFLHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTKYAPKFQDKVTMTVDTSSNTACLHLSSLTSDDTAVYYCNVLGYGNYGHFYYAMDYWGQGTSVTVSS
(d)EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISNGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARHRGSLDFWGQGTTLTVSS
(e)EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYNMNWVKQTHGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYFCARMGLGNAMDYWGQGTSVTVSS
(f)QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTISGFSLTSYGIHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGRTTYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARHGRYDPYAMDYWGQGTSVTVSS
(g)EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYNMNWVKQTHGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYFCAR MGLGNAMDY WGQGTSVTVSS
(h)EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT GYNMN WVRQMPGKGLEWMGLINPYNGGTRYNQKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYFCAR MGLGNAMDY WGQGTTVTVSS
(i)EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT GYNMN WVRQMPGKNLEWIG LINPYNGGTRYNQKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYFCAR MGLGNAMDY WGQGTTVTVSS
LC可变区包含选自以下的多肽：
(a)DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQNLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
(b)DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGFSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLASGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNQGPLTFGAGTKLELK
(c)DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSESGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQNTHVPRTFGGGTKLEIR
(d)DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGFSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSWSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNKVPLTFGAGTKLELK
(e)DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC KSSQNLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTMESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC QNDYIYPLP FGAGTKLELK
(f)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQNLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTMESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QNDYIYPLP FGQGTKLEIK
(g)DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC KSSQNLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTMESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC QNDYIYPLP FGAGTKLELK
(h)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQNLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTMESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QNDYIYPLP FGQGTKLEIK
(i)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQNLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTMESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QNDYIYPLP FGQGTKLEIK，
或其等效物。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是人源化抗体，其包含表4所示的重链和轻链组合。
5.根据权利要求1-3所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体、嵌合或人源化抗体和/或被包含在免疫缀合物或抗体药物缀合物（ADC）中。
6.根据权利要求5所述的抗体，其中所述双特异性抗体具有对第二靶蛋白特异的结合，所述第二靶蛋白选自IL-1、CD3、CD16、CD19、CD20、CD28、CD64、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、CD28、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM、BTLA和KIR。
7.根据权利要求5所述的抗体，其中所述免疫缀合物或所述抗体药物缀合物（ADC）包含所述抗体和另外的试剂。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中所述另外的试剂选自毒素、药物、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应修饰剂、药剂和/或聚乙二醇（PEG）。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含选自Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和Fv的抗原结合片段。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体，其中所述抗体是针对CLDN 18.2片段或其等效物而产生的。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中等效物包括与多肽具有至少80％氨基酸同一性的多肽或由在高严格条件下与编码多肽的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽。
13.一种嵌合抗原受体（CAR），其包含：（a）CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域，（b）CD8α铰链结构域；（c）CD8α跨膜结构域；（d）4-1BB共刺激信号传导区域； 以及（e）CD3ζ信号传导结构域。
14.根据权利要求13所述的CAR，其中所述抗CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域包含抗CLDN 18.2重链（HC）可变区和抗CLDN 18.2轻链（LC）可变区。
15.根据权利要求14所述的CAR，其进一步包含位于抗CLDN 18.2 HC可变区和抗CLDN18.2 LC可变区之间的接头多肽。
16.根据权利要求14或15所述的CAR，其中所述HC包括以下中的一个或多个：
（a）CDR1，其包含选自以下的氨基酸序列：(i) GFTFSSYA，(ii) GFTFSDYY，(iii)GFNIKDYF，(iv) GYSFTGYN，(v) GFSLTSYG，(vi) GYNMN或其每一个的等效物；
（b）CDR2，其包含选自以下的氨基酸序列：(i) ISGGGST，(ii) ISDGGGDT，(iii)IDPENGDT，(iv) ISNGGGST，(v) INPYNGGT，(vi) IWSDGRT，(vii) LINPYNGGTRYNQKFKG或其每一个的等效物；和/或
（c）CDR3，其包含选自以下的氨基酸序列：(i) ARGGNIYDGYPYYFDY，(ii) 0GGNIYDGYPYYFDY，(iii) ARHRGSLDY，(iv) NVLGYGNYGHFYYAMDY，(v) ARHRGSLDF，(vi)ARMGLGNAMDY，(vii) ARHGRYDPYAMDY，(viii) MGLGNAMDY或其每一个的等效物；
所述LC包含以下中的一个或多个：
（a）CDR1，其包含选自以下的氨基酸序列：(i) QNLLNSSNQKNY，(ii) ESVDNYGFSF，(iii)QSLVHSNGNTY，(iv) QNLLNSGNQKNY，(v) KSSQNLLNSGNQKNYLT或其每一个的等效物；
（b）CDR2，其包含选自以下的氨基酸序列：(i) FAS，(ii) RAS，(iii) KVS，(iv) WAS，(v) WASTMES或其每一个的等效物；和/或
（c）CDR3，其包含选自以下的氨基酸序列：(i) QQHYSTPLT，(ii) QQSNQGPLT，(iii)SQNTHVPRT，(iv) QQSNKVPLT，(v) QNDYIYPLP或其每一个的等效物。
17.根据权利要求14或15所述的CAR，其中HC可变区包含选自以下的多肽：
(a)EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISGGGSTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSYLRSEDTAVYYCARGGNIYDGYPYYFDYWGQGTTLTVSS
(b)EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMFWIRQTPEKRLEWVASISDGGGDTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARHRGSLDYWGQGTTLTVSS
(c)EVQLQQSGTELVRSGASVKLSCTTSGFNIKDYFLHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTKYAPKFQDKVTMTVDTSSNTACLHLSSLTSDDTAVYYCNVLGYGNYGHFYYAMDYWGQGTSVTVSS
(d)EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISNGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARHRGSLDFWGQGTTLTVSS
(e)EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYNMNWVKQTHGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYFCARMGLGNAMDYWGQGTSVTVSS
(f)QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTISGFSLTSYGIHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGRTTYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARHGRYDPYAMDYWGQGTSVTVSS
(g)EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYNMNWVKQTHGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYFCAR MGLGNAMDY WGQGTSVTVSS
(h)EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT GYNMN WVRQMPGKGLEWMGLINPYNGGTRYNQKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYFCAR MGLGNAMDY WGQGTTVTVSS
(i)EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT GYNMN WVRQMPGKNLEWIG LINPYNGGTRYNQKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYFCAR MGLGNAMDY WGQGTTVTVSS
LC可变区包含选自以下的多肽：
(a)DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQNLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
(b)DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGFSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLASGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNQGPLTFGAGTKLELK
(c)DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSESGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQNTHVPRTFGGGTKLEIR
(d)DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGFSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSWSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNKVPLTFGAGTKLELK
(e)DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC KSSQNLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTMESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC QNDYIYPLP FGAGTKLELK
(f)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQNLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTMESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QNDYIYPLP FGQGTKLEIK
(g)DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC KSSQNLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTMESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC QNDYIYPLP FGAGTKLELK
(h)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQNLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTMESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QNDYIYPLP FGQGTKLEIK
(i)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQNLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTMESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QNDYIYPLP FGQGTKLEIK，
或其等效物。
18.根据权利要求16或17所述的CAR，其中等效物包括与多肽具有至少80％氨基酸同一性的多肽或由在高严格条件下与编码多肽的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的CAR，其进一步包含可检测标记或纯化标记。
20.一种分离的核酸序列，其编码权利要求1至12中任一项所述的抗体或权利要求13至18中任一项所述的CAR。
21.根据权利要求20所述的分离的核酸，其进一步包含位于所述抗CLDN 18.2抗体的抗原结合结构域上游的Kozak共有序列，或增强子。
22.根据权利要求20或21中任一项所述的分离的核酸序列，其进一步包含抗生素抗性多核苷酸。
23.一种载体，其包含权利要求20至22中任一项所述的分离的核酸序列。
24.根据权利要求23所述的载体，其中所述载体是质粒。
25.根据权利要求23所述的载体，其中所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。
26.一种分离的细胞，其包含权利要求13至19中任一项所述的CAR；和/或权利要求20至22中任一项所述的分离的核酸；和/或权利要求23至25中任一项所述的载体。
27.根据权利要求26所述的分离的细胞，其中所述细胞是T细胞。
28.根据权利要求26所述的分离的细胞，其是天然杀伤（NK）细胞。
29.一种组合物，其包含载体和以下中的一种或多种：权利要求1至12中任一项所述的抗体；和/或权利要求13至19中任一项所述的CAR；和/或权利要求20至22中任一项所述的分离的核酸；和/或权利要求23至25中任一项所述的载体，和/或权利要求26至28中任一项所述的分离的细胞。
30.根据权利要求29所述的组合物，其进一步包含能够结合包含CLDN 18.2片段或其等效物的肽的抗原结合片段。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述肽是全长CLDN 18.2蛋白。
32.根据权利要求30或31所述的组合物，其中所述肽与细胞相联。
33.根据权利要求30或31所述的组合物，其中所述肽结合至固体支持物。
34.根据权利要求30或31所述的组合物，其中所述肽被置于溶液中。
35.根据权利要求30或31所述的组合物，其中所述肽与基质相联。
36.一种产生抗CLDN 18.2 CAR T细胞的方法，包括：
（i）使用编码权利要求13至19中任一项所述的CAR的核酸序列导入T细胞群；以及
（ii）选择已经用步骤（i）的所述核酸序列成功转导的T细胞的亚群，从而产生抗CLDN18.2 CAR T细胞。
37.一种产生抗CLDN 18.2 CAR NK细胞的方法，包括：
（i）使用编码权利要求13至19中任一项所述的CAR的核酸序列导入NK细胞群；以及
（ii）选择已经用步骤（i）的所述核酸序列成功转导的NK细胞的亚群，从而产生抗CLDN18.2 CAR NK细胞。
38.一种在有需要的对象中抑制肿瘤生长的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求1至12中任一项所述的抗体和/或权利要求26至28中任一项所述的分离的细胞和/或权利要求29所述的组合物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述分离的细胞对于所治疗的对象是自体同源的。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述肿瘤表达或过表达CLDN 18.2。
41.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述肿瘤是胃、胰腺、食道、卵巢或肺肿瘤。
42.一种治疗有需要的癌症患者的方法，其包括向对象施用有效量的权利要求1至12中任一项所述的抗体的分离的细胞和/或权利要求27至29中任一项所述的分离的细胞和/或权利要求29所述的组合物。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述分离的细胞对于所治疗的对象是自体同源的。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述肿瘤癌症是胃癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌或肺癌。
45.根据权利要求38至44中任一项所述的方法，其中所述对象是人、动物、非人灵长类动物、狗、猫、绵羊、小鼠、马或牛。
46.一种用于确定患者是可能还是不太可能对抗CLDN 18.2 CAR疗法产生反应的方法，该方法包括使从患者分离的肿瘤样品与有效量的权利要求1至12中任一项所述的抗体接触，以及检测与肿瘤样品结合的任何抗体的存在，其中与肿瘤样品结合的抗体的存在表明该患者可能对抗CLDN 18.2 CAR疗法产生反应，而与肿瘤样品结合的抗体的不存在表明该患者不太可能对抗CAR疗法产生反应。
47.根据权利要求46所述的方法，其进一步包括向被确定可能对抗CLDN 18.2 CAR疗法产生反应的患者施用有效量的权利要求13至19所述的抗CLDN 18.2 CAR。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述患者患有胃癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌或肺癌。
49.一种用于检测CLDN 18.2的试剂盒，其包含权利要求1至12中任一项所述的抗体和使用说明。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述抗体能够结合生物样品中的CLDN 18.2多肽。
51.根据权利要求49或50所述的试剂盒，其进一步包括用于确定生物样品中的CLDN18.2多肽的量的装置，以及用于将样品中的CLDN 18.2多肽的量与标准进行比较的装置。
52.一种检测生物样品中的CLDN 18.2的方法，该方法包括使样品与权利要求1至12中任一项所述的抗体或其等效物接触，以及检测通过抗体或抗原结合片段与CLDN 18.2的结合而形成的复合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述样品包括细胞样品或组织样品。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述样品是从被诊断患有、怀疑患有或有风险患有癌症的对象获得的。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述癌症是胃癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌或肺癌。
56.根据权利要求52至55中任一项所述的方法，其中所述检测包括免疫组织化学（IHC）、蛋白质印迹、流式细胞术或ELISA中的一种或多种。
57.一种检测从对象分离的样品中的病理细胞的方法，其包括
（a）通过检测由权利要求1至12中任一项所述的抗体或其等效物形成的复合物，检测来自对象的生物样品中CLDN 18.2的水平；以及
（b）将步骤（a）中观察到的CLDN 18.2水平与对照生物样品中观察到的CLDN 18.2水平进行比较；
其中当与对照生物样品中观察到的相比CLDN 18.2的水平升高时，检测到病理细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述对象的生物学样品包括从胃、胰腺、食道、卵巢或肺组织分离的样品中的一种或多种。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述检测包括免疫组织化学（IHC）、蛋白质印迹、流式细胞术或ELISA中的一种或多种。
60.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其进一步包括从所述对象分离生物样品。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述哺乳动物选自：人类，动物，非人类灵长类，狗，猫，绵羊，小鼠，马或牛。
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