CN117279949A - 包含cldn18.2单域抗体的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

包含cldn18.2单域抗体的嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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Abstract

一种包含CLDN18.2单域抗体的嵌合抗原受体及其应用。所构建的嵌合抗原受体特异性好，在体内使用具有更高的安全性，毒性更小，能够为目前放化疗及手术治疗晚期胃癌高表达等CLDN18.2蛋白的患者提供治疗方案。

Description

包含CLDN18.2单域抗体的嵌合抗原受体及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年5月27日提交的专利申请CN2022105948645的优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及包含CLDN18.2单域抗体的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
目前，晚期胃癌的治疗原则仍是以全身化疗为主的综合治疗，包括全身化疗、手术切除、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗以及中医中药治疗等。随着化疗药物及化疗方案的不断优化，晚期胃癌患者的生存期有明显延长，但患者的中位生存时间仍难以超过1年。
近些年免疫疗法的发展为肿瘤治疗领域带来深刻的改变，尤其是以CTLA-4，PD1/PDL1通路抑制剂为代表的免疫检查点疗法和以CAR-T为代表的过继性细胞疗法。过继性细胞疗法包括TIL,NK,TCR-T,CAR-T/NK/NKT/TIL/等。其中靶向CD19的CAR-T疗法在B细胞肿瘤中取得了优秀的临床疗效，并且在2017年有两款CAR-T产品被FDA批准用于B细胞白血病或者淋巴瘤的治疗。
虽然靶向治疗和免疫检查点抑制剂已经为特定人群带来福音，但在进展期胃癌中寻找其他靶点势在必行。
Claudins是一个蛋白质家族，其作用是维持控制细胞间分子交换的紧密连接。其广泛分布于胃、胰腺和肺组织，可用于诊断和治疗。CLDN18.2亚型是一种胃特异性亚型，自从Sahin发现CLDN18.2是一种高度选择性的分子，并且只在癌细胞中广泛表达，它就成为一种理想的靶点。CLDN18.2通常埋藏在胃粘膜中，正常组织中的单克隆抗体基本上接触不到，恶性肿瘤的发生会导致紧密连接的破坏，使肿瘤细胞表面的CLDN18.2表位暴露出来，成为特定的靶点。因此，CLDN18.2赋予靶向治疗的特异性。它在多种癌症中有表达，包括80％的胃肠道腺癌、60％的胰腺癌以及胆道癌、卵巢癌、肺癌。
目前，全球针对CLDN18.2的产品类型包括单克隆抗体、双特异性抗体、CAR-T和ADC。其中，开发中的单克隆抗体数量最多。目前针对CLDN18.2开发的药物中进展最快的是德国Ganymed公司开发的IMAB362(Zolbetuximab，claudiximab)。IMAB362是一种人鼠嵌合型抗体，能特异性识别并结合claudin18.2蛋白的细胞膜外结构域ECL1而不与任何其他claudin家族成员结合(包括与claudin18.1)。目前，已经进入III期临床试验。
虽然CAR-T在血液瘤中取得了重大进展，但CAR-T在实体瘤治疗中效果差，其中一个重要原因为实体肿瘤没有像血液瘤中一样很好的靶点，且传统CAR-T的受体序列来源于鼠源，亲和力较强，造成实体瘤CAR-T往往有更强的on-target off-tumor作用，副作用较大，另外来源于鼠的scfv摩尔质量较大，免疫原性较强，很容易在患者体内形成抗抗体，导致CAR-T在体内快速被宿主产生的抗体清除，无法起到持续缓解患者肿瘤的作用，这也造成了CAR-T在实体瘤上效果较差的原因之一。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种嵌合抗原受体，其胞外域包含CLDN18.2单域抗体，所述单域抗体的重链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1～3所示。
本发明还涉及如上所述嵌合抗原受体相关的核酸及载体。
本发明还提供免疫细胞，其表达有如上所述嵌合抗原受体。
本发明还涉及药物组合物，其包含如上所述的免疫细胞。
本发明还涉及如上所述的免疫球蛋白可变结构域或免疫细胞在制备用于杀伤CLDN18.2阳性的肿瘤细胞的药物中的应用。
本发明的发明人经过试验，意外发现本发明所选用的单域抗体在构建为嵌合抗原受体时能获得优异的技术效果。所构建的嵌合抗原受体特异性好，在体内使用具有更高的安全性，毒性更小，能够为目前放化疗及手术治疗晚期胃癌高表达等CLDN18.2蛋白的患者提供的一种可能更好的治疗方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为IMC002 CAR-T结构示意图；
图2为CLDN18.2在人正常组织上的IHC染色；
图3为CLDN18.2在人胃癌组织上表达；
图4为CLDN18.2在不同靶细胞上表达；
图5为CAR表达检测；
图6为CAR-T杀伤靶细胞能力检测；
图7为CAR-T杀伤靶细胞后IFN-γ分泌能力检测；
图8为21047等CAR-T细胞毒性试验结果；
图9为21050 CAR-T细胞毒性试验结果；
图10为21047等CAR-T细胞在小鼠体内抑制NUGC4-luc皮下移植瘤的生长；
图11为21047与原代细胞(系)结合；
图12为21047CAR-T对于人和小鼠肺组织杀伤能力；
图13为21047等CAR-T对人原代细胞/组织杀伤能力；
图14为21047CAR-T替换不同结构域后的几种变体的功能验证。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明涉及一种嵌合抗原受体，其胞外域包含CLDN18.2单域抗体，所述单域抗体的重链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1～3所示。
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是指包含能够结合抗原的胞外结构域、衍生自不同于衍生胞外结构域的多肽的多肽的跨膜结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。“嵌合抗原受体(CAR)”有时称为“嵌合受体”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指可结合特定抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知在细胞中作为传输信号以引起生物过程的活化或抑制的结构域起作用的任何寡肽或多肽。
单域抗体(Singledomain antibody，sdAb)，是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体，因其分子量小，也被称为纳米抗体(Nanobody)[注意：纳米抗体TM(NanobodyTM，NanobodiesTM)和纳米克隆TM(NanocloneTM)是Ablynx N.V.的商标]。单域抗体可以具有或不具有恒定区。在一些语境下，其可以与VHH区段通用。
单域抗体可以通过用特定抗原激活单峰骆驼、双峰骆驼、羊驼、大羊驼或者鲨鱼的免疫系统，然后分离产生重链抗体的mRNA来取得。其具有恒定区，恒定区可来自单峰骆驼、双峰骆驼、羊驼、大羊驼或者鲨鱼。在一些实施方式中，其具有恒定区CH1～CH5(如IgNAR)。在一些实施方式中，其具有恒定区CH2和CH3(hcIgG)。
如本文进一步所述，单域抗体的氨基酸序列和结构(然而不受其限制)包括四个构架区或“FR”，所述构架区由三个互补决定区或“CDR”间隔开。
在一些实施方式中，所述的单域抗体经过人源化。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将第一动物源性(如鼠、兔等)的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量第一动物源性蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(www.mrccpe.com.ac.uk/vbase)获得，以及在Kabat，E.A.等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本发明的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。人的抗体可变区框架经过设计选择，例如，其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列，来源于人种系重链IGHV1-18*01和hjh6.1的组合序列，或人种系重链IGHV1-3*01和hjh6.1的组合序列；其中所述抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，来源于人种系重链IGKV1-39*01和hjk4.1的组合序列。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。
在一些实施方式中，所述的单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
单域抗体的修饰形式也在本发明的保护范围内，例如通过聚乙二醇或其他合适聚合物的共价附着修饰的。单域抗体的变体也在本发明范围内，其中所述CDR1～CDR3的变体与SEQ ID NO:1～3所示互补决定区组合中的任一组相比，可以分别包含至多3个氨基酸的突变(例如1个、2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；优选地，所述突变为保守突变。“保守置换”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。
通常视为保守置换的置换是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此置换、羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香残基Phe、Tyr间的置换。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含铰链区、跨膜区和胞内信号传导区。
如本文所用，所述嵌合抗原受体中所包含的“区”或者“域”是指多肽中的一个区，其可以独立于其它区而折叠成为特定结构。这些“区”或者“域”可以是鼠源或其他动物源性的序列，优选为人源序列。此外，“区”或者“域”在未特别区分或强调时，应理解为公知的序列，可以是全长或者是部分具有活性的区段。
在一些实施方式中，所述铰链区CD8、CD28、IgG1、IgG4、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80、CD7的铰链区，或CH3、CH2-CH3恒定区。优选CD28 hinge区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示，CD8 hinge区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8所示。
跨膜区可以选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和NKG2C中的一种。在一些实施方式中，所述跨膜区优选CD8a、CD28、CD4、ICOS、CD7、CD2、CD80、CD40、OX40、CD27、LFA-1、4-1BB、ICOS、CD3ζ或CD3ε的跨膜区；更优选CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，优选CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在一些实施方式中，所述胞内信号传导区包括CD3ζ信号传导域，优选的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在一些实施方式中，所述胞内信号传导区还包含选自如下表所示的蛋白或其胞内信号传导区(或称共刺激区)；在一些实施方式中，所述胞内信号传导区还包含选自如下蛋白或其胞内信号传导区中的一种或多种：CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、MYD88、KIR2DS2、DAP10、DAP12、CD3ζ、TLRs、CD2、LFA-1、CD8α、CD40、CD80以及CD3ε。
可用于本发明的示例性的胞内信号传导区以及相应的示例性的序列如下表所示：
在一些具体的实施方式中，所述胞内信号传导区还包含氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的CD28；或包含氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的OX40；或包含氨基酸序列如SEQID NO:14所示的4-1BB；或包含氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的ICOS。
在一些实施方式中，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
SEQ ID NO：4/5的变体亦在本发明的保护范围内，变体可与SEQ ID NO：4/5所示序列具有诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体也可具有如上所描述的保守置换。
根据本发明的再一方面，还涉及分离的核酸，其能够表达得到如上所述的嵌合抗原受体。
在本文中，核酸包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列，亦包括通过密码子优化以在期望的宿主细胞中更高效表达的变体。核酸通常是RNA或DNA，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。当其连入载体时优选采用DNA核酸。
本发明还涉及载体，其含有如上所述的核酸。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；CRISPR/CAS质粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
本发明还涉及表达有如上所述嵌合抗原受体的免疫细胞。免疫细胞例如T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞等中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述的免疫细胞为T细胞。
T细胞可以为本领域所熟知的亚类，例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、MAIT细胞、NKT细胞以及γδT细胞中的一种或多种。
根据本发明的再一方面，还涉及药用组合物，其包含如上所述的免疫细胞。
所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载剂。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括当与活性组分组合时允许所述组分保持生物学活性并且与受试者的免疫系统不发生反应的任何材料。实例包括但不限于标准药物载剂(诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水乳液))和各种类型的润湿剂中的任一者。用于气雾剂或肠胃外施用的示例性稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9％)盐水。包含此类载剂的组合物通过熟知的常规方法来配制(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，A.Gennaro编,Mack PublishingCo.,Easton,PA,1990；和Remington,The Science and Practice ofPharmacy,第21版,Mack Publishing,2005)。
根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的免疫细胞在制备用于杀伤CLDN18.2阳性的肿瘤细胞的药物中的应用。
在一些实施方式中，所述药物用于防治胃癌。
根据本发明的再一方面，还涉及一种治疗有需要的患者的肿瘤的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的如上所述的免疫细胞或药物组合物。
肿瘤优选实体瘤，在本发明中，“实体瘤”包括：骨、骨连接、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、静脉、毛细血管、淋巴结、淋巴管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、阑尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴部、阴囊、睾丸、输精管、阴茎、眼、耳、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、脊髓、脑脊液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺以及腮腺中任一处病变生成的肿瘤。
在一些实施方式中，肿瘤中的肿瘤细胞为CLDN18.2阳性。
在一些实施方式中，肿瘤为胃癌、胰腺癌或食管癌。
应该理解的是，设想的治疗方法还将包括施用其他免疫治疗实体，特别优选为免疫治疗实体，包括病毒癌症疫苗(例如，编码癌症特异性抗原的腺病毒载体)、细菌癌症疫苗(例如，表达一种或多种癌症特异性抗原的非热原性大肠杆菌)、酵母癌症疫苗、N-803(也被称为ALT-803，ALTOR生物科学公司)、和抗体(例如，与肿瘤相关抗原或患者特异性肿瘤新抗原结合)、干细胞移植物(例如，异体或自体)和肿瘤靶向细胞因子(例如，NHS-IL12，IL-12与肿瘤靶向抗体或其片段偶联)。
“患者”是哺乳动物，哺乳动物包括但不限于人、猴子、猪和其他农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、大熊猫、啮齿动物(包括小鼠、大鼠、豚鼠)等。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例
1.CLDN 18.2靶点组织表达情况研究
人类CLDN18基因有两个可选的第一外显子，产生了两个不同的蛋白异构体CLDN18.1和CLDN18.2(CLDN18.1和CLDN18.2胞外区1中仅存在8个氨基酸差别)。两个亚型具有不同的谱系功能，CLDN18.1主要表达于肺组织，而CLDN18.2则主要表现出胃特异性。CLDN18.2蛋白作为一种高度选择性的胃谱系标记物，表达于短周期分化细胞，不表达于胃黏膜的干细胞区。
为了研究CLDN18.2在人正常组织器官上的分布，我们使用CLDN18.2特异性IHC抗体检测CLDN18.2在人主要正常器官上的表达，结果如图2所示，CLDN18.2主要表达在胃部组织，另外胰腺组织有少量表达，其他组织上几乎不表达CLDN18.2。
为了进一步研究CLDN18.2在胃部肿瘤组织上表达情况，我们使用CLDN18.2特异性抗体检测CLDN18.2在人胃部肿瘤组织上表达，检测结果表明，CLDN18.2在30％以上的胃癌细胞膜上表达比例较高，在正常胃组织及胃癌旁组织腺上皮细胞上高表达，结果如图3所示。
2.CLDN18.2 CAR-T细胞的体外功能研究
我们首先研究了21008、21009、21011、21047、21050等不同胞外区(序列依次如SEQID NO：16、17、18、4和19所示)引导的CLDN18.2CAR-T细胞的体外杀伤靶细胞和细胞因子分泌能力；它们的CAR其他部分所采用的片段与SEQ ID NO：5相同，即由SEQ ID NO：6～8拼接得到的片段。由于CLDN18.2与其另一亚型CLDN18.1胞外区相差仅7个氨基酸，为了研究CAR-T是否能识别CLDN18.2与CLDN18.1之间的差异，我们首先构建了表达CLDN18.2及CLDN18.1细胞系，鉴定了CLDN18.2及CLDN18.1在不同靶细胞上的表达水平。通过流式细胞术(FCM)染色，结果如图4所示，胃癌细胞系NUGC4细胞高表达CLDN18.2，N87-luc-18.1中度表达CLDN18.1、不表达CLDN18.2，293T细胞不表达CLDN18.1及CLDN18.2。
为了研究21008、21009、21011、21047、21050等CAR-T细胞是否被CLDN18.2靶细胞特异性激活，我们构建了几种CAR-T细胞并鉴定CAR的表达，结果见图5。
将上述构建的CAR-T细胞与靶细胞共孵育，使用LDH方法检测效应细胞裂解靶细胞的能力。结果如图6所示，所测试的五种CAR-T都可以明显杀伤CLDN18.2阳性靶细胞NUGC4，同时不杀伤阴性靶细胞N87-luc-CLDN18.1及293T，说明五种CAR-T细胞可以特异性识别CLDN18.2，不识别CLDN18.1；
将上述构建的CAR-T细胞与靶细胞共孵育后，检测细胞因子IFN-γ的释放。结果如图7所示，21047等五种CAR-T与CLDN18.2阳性靶细胞NUGC4共孵育后，IFN-γ分泌能力被激活，IFN-γ分泌水平则达到5000pg/mL以上，与阴性靶细胞N87-luc-18.1及293T共孵育后，因子分泌低于100pg/mL，说明所测试CAR-T可以被NUGC4特异性激活，而在与阴性靶细胞N87-luc-18.1及293T共孵育后不能被激活；
3.CLDN18.2 CAR-T细胞单次给药的体内安全性研究
我们进一步研究了21008、21009、21011、21047、21050等五个CAR-T在体内安全性。
在一个体内实验中我们对比了21008,21009,21011,21047四个CAR-T，我们在NSG小鼠模型中进行了单次CAR-T给药，剂量为5×106cells/只。输注后每周两次观察小鼠状态和称量体重。在整个实验期间，21047CAR-T5M组小鼠未观察到明显异常，小鼠体重在整个研究期间未发生明显下降(图8)，21011有明显的体重下降过程并在后续中逐渐恢复。在研究终点我们收集了各小鼠的重要脏器进行了H&E染色，病理结果如下表所示：
除21047和unT组外，21008、21009、21011治疗组小鼠器官均出现一定组织损伤或明显组织学改变(包括：脑、心、肝、肺、肾、胃)。综上所述，21047CAR-T细胞在小鼠模型中具有良好的安全性。
在另一个实验中我们对比了21050与unT个在NSG小鼠模型中单次CAR-T给药的安全性，剂量为5×106cells/只。输注后每周两次观察小鼠状态和称量体重。在整个实验期间，21050 CAR-T 5M组小鼠观察到明显异常，小鼠体重在整个研究期间有明显下降并发生死亡(图9A/B)，说明21050在小鼠模型上也具有明显毒性。
4.CLDN18.2 CAR-T细胞的体内药效研究
为了研究21047等五个CAR-T在体内清除肿瘤细胞的能力，我们基于NCG免疫缺陷小鼠构建了NUGC4-luc细胞皮下移植瘤模型并在其中研究了CAR-T的药效。具体来说，用1ml的注射器取100μl(细胞数：5×106)人胃癌细胞系NUGC4-luc经NCG小鼠背部皮下接种，建立皮下移植瘤模型，待肿瘤达到约50-150mm3时，开始输注CAR-T细胞。如图10所示，不同组小鼠分别回输1×106CAR-T或者未转导T细胞(unT)。之后连续监测肿瘤生长情况及小鼠体重、健康状况等，最终采用Graph Pad Prism7.0作图软件绘制小鼠皮下肿瘤生长曲线和小鼠体重增长曲线(mean±s.e.m.)。结果如图10A所示，在研究终点，21050和21047分子均实现了肿瘤清零。而21008和21009分子均未实现肿瘤完全清除。我们进一步对比D35时肿瘤的大小，肿瘤大小排序为21050<21047<21009≈21008(图10B)。且21008和21009治疗组肿瘤大小与unT组无明显差异，说明药效较弱(图10B)。在研究期间21047治疗组体重未发生明显变化，而21008、21009、21011、21050组均有一只或多只小鼠发生体重明显降低，状态变差或死亡(图10C和10D)。以上结果说明，相对于其它分子，21047具有明显的安全性优势，同时具有明显的药效。
5.CLDN18.2 CAR-T体外安全性研究
进一步为了验证21047与原代细胞的非特异性结合，我们将21047稀释至不同浓度与CLDN18.2阳性靶细胞NUGC4或原代细胞(系)孵育后流式检测MFI，IMAB362作为阳性对照抗体，isotype作为阴性对照抗体，结果显示21047及IMAB362与CLDN18.2阳性靶细胞NUGC4正常结合，与colon，ARPE-19，Beas-2B，Intestine等原代细胞不结合，结果如图11。
由于肺组织细胞表达CLDN18.1，为了研究CLDN18.2 CAR-T对于肺组织是否存在毒性，我们研究了其在杀伤人肺组织、肺癌、癌旁组织及小鼠肺组织时的细胞因子释放能力。结果如图12所示，21047CAR-T细胞与人和小鼠肺组织共孵育后，IFN-γ分泌水平没有明显升高，同时在与293-CLDN18.218.2细胞共孵育时有高达10000pg/ml以上的IFN-γ分泌水平，作为阴性对照，在与N87-luc-18.1共孵育时IFN-γ分泌水平没有明显升高，上述结果说明21047CAR-T对肺部组织无明显毒性。
进一步为了验证21047CAR-T的安全性，我们分析了三个不同来源donor的PBMC制备的21047等CAR-T细胞对于人原代组织/细胞(系)的杀伤能力，包括Beas-2B(人肺原代细胞系)，ARPE-19(人视网膜上皮细胞)，primary colon cells(人原代结肠细胞)，HIBEpiC(人肝内胆管上皮细胞)，primary intestine cells(人原代小肠细胞)，人肺组织，小鼠肺组织，结果如图13A/C所示，21011及21050与原代组织/细胞(系)共孵育后，个别如细胞结肠细胞或肺原代细胞，CAR-T出现明显IFN-γ升高，说明21011和21050可能有潜在的组织毒性等；而21047CAR-T及unT(Untransduced T cells)细胞与人原代细胞(系)共孵育后，IFN-γ分泌水平没有明显升高，同时在与CLDN18.2阳性细胞NUGC4共孵育时有高达5000pg/ml以上的IFN-γ分泌水平，结果如图13B/D；上述结果说明21047CAR-T对人肺，眼，结肠，小肠，肝内胆管上皮细胞无非特异性结合以及激活，安全性较好。
6.CLDN18.2 CAR-T不同信号域体外功能研究
为了研究不同铰链区(hinge区)，跨膜区及胞内信号域组合对CAR-T功能的影响，我们在21047基础上另外构建了四种不同铰链区，跨膜区及胞内域组合，结构如下表所示：
在体外对比了不同结构之间对靶细胞杀伤能力，杀伤靶细胞后因子分泌，结果如图14所示，上述结果说明不同铰链区，跨膜区及共刺激域结构的CAR-T都可以杀伤阳性靶细胞，正常分泌细胞因子IL2及IFN-γ等。21047lib-35B(CD8-OX40-CD3ζ结构)，21047lib-41B(CD28-41BB-CD3ζ结构)、21047lib-42B(CD8-ICOS-CD3ζ结构)等分子杀伤靶细胞和细胞因子分泌能力与原始21047(CD28-CD3ζ结构)相比无显著差异。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (17)

1.嵌合抗原受体，其胞外域包含CLDN18.2单域抗体，所述单域抗体的重链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1～3所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述单域抗体是人源化的。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.根据权利要求1～3任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其包含铰链区、跨膜区和胞内信号传导区。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区选自CD8、CD28、IgG1、IgG4、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80、CD7的铰链区，或CH3、CH2-CH3恒定区。
6.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区选自CD8a、CD28、CD4、ICOS、CD7、CD2、CD80、CD40、OX40、CD27、LFA-1、4-1BB、ICOS、CD3ζ或CD3ε的跨膜区。
7.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号传导区包括CD3ζ信号传导域。
8.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号传导区还包含选自如下蛋白或其胞内信号传导区中的一种或多种：CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、MYD88、KIR2DS2、DAP10、DAP12、CD3ζ、TLRs、CD2、LFA-1、CD8α、CD40、CD80以及CD3ε。
9.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
10.分离的核酸，其特征在于，能够表达得到权利要求1～9任一项所述的嵌合抗原受体。
11.含有权利要求10所述核酸的载体。
12.表达有权利要求1～9任一项所述嵌合抗原受体的免疫细胞。
13.根据权利要求12所述的免疫细胞，其特征在于，选自T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞。
14.根据权利要求13所述的免疫细胞，其特征在于，所述T细胞选自辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、MAIT细胞、NKT细胞以及γδT细胞。
15.药物组合物，其包含权利要求12～14任一项所述的免疫细胞。
16.权利要求12～14任一项所述的免疫细胞在制备用于杀伤CLDN18.2阳性的肿瘤细胞的药物中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述药物用于防治胃癌、胰腺癌或食管癌。
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