JP2023085509A - 融合タンパク質を用いたtcrの再プログラミングのための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)、1つ以上のTFPを発現するように改変されたT細胞、及び、がんを含めた疾患の治療のためのそれらの使用方法を提供する。【解決手段】T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPがTCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び、CD3イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット、ならびに抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する、単離された組み換え核酸分子である。【選択図】図1
Description
相互参照
本出願は、2015年5月18日に出願された米国仮出願第62/163,342号の利益を主張する。該仮出願は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2015年5月18日に出願された米国仮出願第62/163,342号の利益を主張する。該仮出願は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
血液学的悪性腫瘍または末期の固形腫瘍を有するほとんどの患者は、標準的治療では治癒不可能である。さらに、従来の治療法の選択肢は、多くの場合重篤な副作用がある。がん性細胞を拒絶するために患者の免疫系を関わらせる多くの試み、すなわち、集合的にがん免疫療法と呼ばれる方法がなされている。しかしながら、いくつかの障害が、その臨床効果の達成をやや困難にしている。何百ものいわゆる腫瘍抗原が特定されているが、これらは多くの場合、自己由来であるため、がん免疫療法を健康な組織に向かわせる可能性があるか、または免疫原性に乏しい。さらに、がん細胞は多重機構を用いてそれら自身を見えなくしたり、がん免疫療法による免疫攻撃の開始及び伝播に敵対したりする。
がん細胞の適切な細胞表面分子に、遺伝子操作されたT細胞を向け直すことに頼るキメラ抗原受容体(CAR)変性自己T細胞治療を用いた最近の発展は、免疫系の力のB細胞悪性腫瘍の治療における利用に期待できる結果を示している(例えば、Sadelain
et al., Cancer Discovery 3:388-398 (2013)参照)。CD19特異的CAR T細胞(CTL019と呼ばれる)での臨床結果は、慢性リンパ性白血病(CLL)ならびに小児急性リンパ性白血病(ALL)の患者に完全寛解を示した(例えば、Kalos et al., Sci Transl Med
3:95ra73 (2011), Porter et al., NEJM 365:725-733 (2011), Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)参照)。代替的な方法は、自己T細胞の遺伝子操作のために、腫瘍関連ペプチド抗原に選ばれたT細胞受容体(TCR)アルファ及びベータ鎖の使用である。これらのTCR鎖は、完全なTCR複合体を形成し、該T細胞に第二の定義された特異性に対するTCRを与える。NY-ESO-1特異的TCRアルファ及びベータ鎖を発現する改変自己T細胞によって、滑膜がんの患者で有望な結果が得られた。
et al., Cancer Discovery 3:388-398 (2013)参照)。CD19特異的CAR T細胞(CTL019と呼ばれる)での臨床結果は、慢性リンパ性白血病(CLL)ならびに小児急性リンパ性白血病(ALL)の患者に完全寛解を示した(例えば、Kalos et al., Sci Transl Med
3:95ra73 (2011), Porter et al., NEJM 365:725-733 (2011), Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)参照)。代替的な方法は、自己T細胞の遺伝子操作のために、腫瘍関連ペプチド抗原に選ばれたT細胞受容体(TCR)アルファ及びベータ鎖の使用である。これらのTCR鎖は、完全なTCR複合体を形成し、該T細胞に第二の定義された特異性に対するTCRを与える。NY-ESO-1特異的TCRアルファ及びベータ鎖を発現する改変自己T細胞によって、滑膜がんの患者で有望な結果が得られた。
CARまたは第二のTCRを発現する遺伝子組み換えT細胞に関するインビトロ/エキソビボでそれぞれの標的細胞を認識及び破壊する能力に加えて、改変T細胞での成功した患者の治療は、該T細胞に強力な活性化、増殖、経時的な持続性の能力があること、及び、再発性疾患の場合、「記憶」反応を有効にすることを要求する。CAR T細胞の高く扱いやすい臨床効果は、現在のところCD19陽性B細胞悪性腫瘍及び、HLA-A2を発現するNY-ESO-1ペプチド発現滑膜肉腫患者に限られる。遺伝子操作されたT細胞を様々なヒトの悪性腫瘍に対してより広く作用するように改良する明確な必要性がある。本明細書では、CD3イプシロン、CD3ガンマ、及びCD3デルタを含めたTCRサブユニット、ならびに、既存の方法の限界を克服する可能性を有する細胞表面抗原に特異的な結合ドメインを備えたTCRアルファ及びTCRベータ鎖の新規な融合タンパク質を記載する。本明細書では、CARより標的細胞を効率的に死滅させるが、炎症性サイトカインを同等またはより少ないレベルで放出する新規な融合タンパク質を記載する。これらサイトカイン値の上昇は、養子CAR-T療法に対する用量制限毒性と関連しているため、これらの融合タンパク質及びそれらの使用方法は、CARと比較してTFPの有効性を表す。
T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)、1つ以上のTFPを発現するように改変されたT細胞、及び疾患の治療のためのそれらの使用方法を本明細書に提供する。
1つの態様において、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、該TFPがTCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び、CD3イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット、ならびに抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、該TCRサブユニット及び該抗体ドメインが作動可能に連結され、該TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する分子を本明細書に提供する。
1つの態様において、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、該TFPがTCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び、CD3ガンマの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット、ならびに抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、該TCRサブユニット及び該抗体ドメインが作動可能に連結され、該TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する分子を本明細書に提供する。
1つの態様において、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、該TFPがTCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び、CD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット、ならびに抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、該TCRサブユニット及び該抗体ドメインが作動可能に連結され、該TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する分子を本明細書に提供する。
1つの態様において、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、該TFPがTCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び、TCRアルファの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット、ならびに抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、該TCRサブユニット及び該抗体ドメインが作動可能に連結され、該TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する分子を本明細書に提供する。
1つの態様において、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、該TFPがTCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び、TCRベータの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット、ならびに抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、該TCRサブユニット及び該抗体ドメインが作動可能に連結され、該TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する分子を本明細書に提供する。
1つの態様において、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、該TFPがTCRサブユニット及び、抗CD19結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む分子を本明細書に提供する。
1つの態様において、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、該TFPがTCRサブユニット及び、抗B細胞成熟抗原(BCMA)結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む分子を本明細書に提供する。
いくつかの例では、該TCRサブユニット及び該抗体ドメインは、作動可能に連結される。いくつかの例では、該TFPは、T細胞で発現される際にTCRに合体する。いくつかの例では、該コードされた抗原結合ドメインは、リンカー配列によって該TCRの細胞外ドメインにつながれる。いくつかの例では、該コードされたリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=1~4である。いくつかの例では、該TCRサブユニットは、TCRの細胞外ドメインを含む。いくつかの例では、該TCRサブユニットは、TCRの膜貫通ドメインを含む。いくつかの例では、該TCRサブユニットは、TCRの細胞内ドメインを含む。いくつかの例では、該TCRサブユニットは、(i)TCRの細胞外ドメイン、(ii)TCRの膜貫通ドメイン、及び(iii)TCRの細胞内ドメインを含むとともに、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つは同じTCRサブユニット由来である。いくつかの例では、該TCRサブユニットは、CD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または少なくとも1つ、2つ、もしくは3つのそれに対する修飾を有するアミノ酸配列を含むTCRの細胞内ドメインを含む。いくつかの例では、該TCRサブユニットは、4-1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または少なくとも1つのそれに対する修飾を有するアミノ酸配列を含む細胞内ドメインを含む。いくつかの例では、該ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、抗体フラグメントを含む。いくつかの例では、該ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、scFvまたはVHドメインを含む。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、(i)それぞれ配列番号25、配列番号27、及び配列番号29に70~100%の配列同一性がある、抗CD19軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)それぞれ配列番号31、配列番号33、及び配列番号35に70~100%の配列同一性がある、抗CD19重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3をコードする。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、軽鎖可変領域をコードするとともに、該軽鎖可変領域は、配列番号49の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号49の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、重鎖可変領域をコードするとともに、該重鎖可変領域は、配列番号51の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号51の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、(i)それぞれ配列番号37、配列番号39、及び配列番号41に70~100%の配列同一性がある、抗BCMA軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC
CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)それぞれ配列番号43、配列番号45、及び配列番号47に70~100%の配列同一性がある、抗BCMA重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3をコードする。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、軽鎖可変領域をコードするとともに、該軽鎖可変領域は、配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、重鎖可変領域をコードするとともに、該重鎖可変領域は、配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む。いくつかの例では、該TFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ
鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCRサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの例では、該コードされたTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。いくつかの例では、該コードされたTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、さらに、共刺激ドメインをコードする配列を含む。いくつかの例では、該共刺激ドメインは、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4-1BB(CD137)、ならびに少なくとも1つから最大20までのそれに対する修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、さらにリーダー配列を含む。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、mRNAである。
CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)それぞれ配列番号43、配列番号45、及び配列番号47に70~100%の配列同一性がある、抗BCMA重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3をコードする。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、軽鎖可変領域をコードするとともに、該軽鎖可変領域は、配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、重鎖可変領域をコードするとともに、該重鎖可変領域は、配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む。いくつかの例では、該TFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ
鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCRサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの例では、該コードされたTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。いくつかの例では、該コードされたTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、さらに、共刺激ドメインをコードする配列を含む。いくつかの例では、該共刺激ドメインは、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4-1BB(CD137)、ならびに少なくとも1つから最大20までのそれに対する修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、さらにリーダー配列を含む。いくつかの例では、該単離された核酸分子は、mRNAである。
いくつかの例では、該TFPは、TCRサブユニットの免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含み、該サブユニットは、CD3ゼータのTCRサブユニット、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、TCRゼータ鎖、Fcイプシロン受容体1鎖、Fcイプシロン受容体2鎖、Fcガンマ受容体1鎖、Fcガンマ受容体2a鎖、Fcガンマ受容体2b1鎖、Fcガンマ受容体2b2鎖、Fcガンマ受容体3a鎖、Fcガンマ受容体3b鎖、Fcベータ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までのそれに対する修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質のITAMまたはその一部を含む。いくつかの例では、該ITAMは、CD3ガンマ、CD3デルタ、またはCD3イプシロンのITAMを置き換える。いくつかの例では、該ITAMは、CD3ゼータのTCRサブユニット、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、及びCD3デルタのTCRサブユニットからなる群から選択されるとともに、CD3ゼータのTCRサブユニット、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、及びCD3デルタのTCRサブユニットからなる群から選択される異なるITAMを置き換える。
いくつかの例では、該核酸は、ヌクレオチド類似体を含む。いくつかの例では、該ヌクレオチド類似体は、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)、2’-O-アミノプロピル、2’-デオキシ、T-デオキシ-2’-フルオロ、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)、2’-O-ジメチルアミノエチル(2’-O-DMAOE)、2’-O-ジメチルアミノプロピル(2’-O-DMAP)、T-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)修飾、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’-アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モ
ルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び2’-フルオロN3-P5’-ホスホルアミダイトからなる群から選択される。
ルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び2’-フルオロN3-P5’-ホスホルアミダイトからなる群から選択される。
1つの態様において、本明細書で提供される核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド分子を本明細書に提供する。
1つの態様において、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む単離されたTFP分子を本明細書に提供する。
1つの態様において、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたTFP分子であって、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能な該TFP分子を本明細書に提供する。
1つの態様において、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたTFP分子であって、内因性TCR複合体に機能的に統合することが可能な該TFP分子を本明細書に提供する。
いくつかの例では、該単離されたTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む。いくつかの例では、該抗CD19結合ドメインは、scFvまたはVHドメインである。いくつかの例では、該抗CD19結合ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある重鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、該抗CD19結合ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある軽鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、該単離されたTFP分子は、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCRの細胞外ドメインを含む。いくつかの例では、該抗CD19結合ドメインは、リンカー配列によって該TCRの細胞外ドメインにつながれる。いくつかの例では、該リンカー領域は、(G4S)nを含み、この場合n=1~4である。
1つの態様において、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む単離されたTFP分子を本明細書に提供する。
1つの態様において、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたTFP分子であって、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能な該TFP分子を本明細書に提供する。
1つの態様において、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたTFP分子であって、内因性TCR複合体に機能的に統合することが可能な該TFP分子を本明細書に提供する。
いくつかの例では、該単離されたTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む。いくつかの例では、該抗BCMA結合ドメインは、scFvまたはVHドメインである。いくつかの例では、該抗BCMA結合ドメインは、配列番号55のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある重鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、該抗BCMA結合ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある軽鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、該単離されたTFP分子は、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCRの細胞外ドメインを含む。いくつかの例では、該抗BCMA結合ドメインは、リンカー配列によって該TCRの細胞外ドメインにつながれる。いくつかの例では、該リンカー領域は、(G4S)nを含み、この場合n=1~4である。いくつかの例では、該単離されたTFP分子は、さらに、共刺激ドメインをコードする配列を含む。いくつかの例では、該単離されたTFP分子は、さらに、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。いくつかの例では、該単離されたTFP分子は、さらにリーダー配列を含む。
1つの態様において、本明細書で提供されるTFPをコードする核酸分子を含むベクターを本明細書に提供する。いくつかの例では、該ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの例では、該ベクターは、さらにプロモーターを含む。いくつかの例では、該ベクターは、インビトロで転写されたベクターである。いくつかの例では、該ベクターの核酸配列は、さらにポリ(A)尾部を含む。いくつかの例では、該ベクターの核酸配列は、さらに3’UTRを含む。
1つの態様において、本明細書で提供されるベクターを含む細胞を本明細書に提供する。いくつかの例では、該細胞はヒトT細胞である。いくつかの例では、該T細胞は、CD8+またはCD4+T細胞である。いくつかの例では、該細胞は、さらに、細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第二のポリペプチドに会合した、抑制分子の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸を含む。いくつかの例では、該抑制分子は、PD1の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドならびに共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第二のポリペプチドを含む。
1つの態様において、ヒトCD8+またはCD4+T細胞であって、少なくとも2つのTFP分子を含み、該TFP分子がヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、該TFP分子が該ヒトCD8+またはCD4+T細胞の中で、該細胞において、及び/または該細胞の表面で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能な該T細胞を本明細書に提供する。
1つの態様において、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子、ならびに少なくとも1つの内因性TCR複合体を含むタンパク質複合体を本明細書に提供する。
いくつかの例では、該TCRは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロ
ンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、及びCD3デルタのTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。いくつかの例では、該抗CD19結合ドメインは、リンカー配列によって該TCRの細胞外ドメインにつながれる。いくつかの例では、該リンカー領域は、(G4S)nを含み、この場合n=1~4である。
ンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、及びCD3デルタのTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。いくつかの例では、該抗CD19結合ドメインは、リンカー配列によって該TCRの細胞外ドメインにつながれる。いくつかの例では、該リンカー領域は、(G4S)nを含み、この場合n=1~4である。
1つの態様において、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子、ならびに少なくとも1つの内因性TCR複合体を含むタンパク質複合体を本明細書に提供する。
いくつかの例では、該TCRは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、及びCD3デルタのTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。いくつかの例では、該抗BCMA結合ドメインは、リンカー配列によって該TCRの細胞外ドメインにつながれる。いくつかの例では、該リンカー領域は、(G4S)nを含み、この場合n=1~4である。
1つの態様において、本明細書で提供されるタンパク質複合体あたり、少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含むヒトCD8+またはCD4+T細胞を本明細書に提供する。
1つの態様において、本明細書で提供されるベクターでT細胞に形質導入することを含む細胞の作製方法を本明細書に提供する。
1つの態様において、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含む、RNA改変細胞集団の生成方法であって、該RNAが本明細書で提供されるTFP分子をコードする核酸を含むものである方法を本明細書に提供する。
1つの態様において、哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、該哺乳類に対して、有効量の本明細書で提供されるTFP分子を発現する、または本明細書で提供されるポリペプチド分子を発現する細胞を投与することを含む方法を本明細書に提供する。
いくつかの例では、該細胞は自己T細胞である。いくつかの例では、該細胞は同種異系T細胞である。いくつかの例では、該哺乳類はヒトである。
1つの態様において、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患を有する哺乳類の治療方法であって、該哺乳類に対して、有効量の本明細書で提供されるTFP分子、本明細書で提供される細胞、または本明細書で提供されるポリペプチド分子を投与することを含む方法を本明細書に提供する。
いくつかの例では、CD19またはBCMAの発現を伴う該疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、前白血病、CD19の発現を伴う非がん関連の適応症からなる群から選択される。いくつかの例では、該疾患は、B細胞急性リンパ性白血病(B-ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)、急性リンパ性白血病(ALL);慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞濾胞性リンパ腫、大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ヴァルデンストレームマクログロブリ
ン血症、前白血病、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患、及びこれらの組合せからなる群から選択される血液がんである。いくつかの例では、TFP分子を発現する該細胞は、TFP分子を発現する細胞の効果を高める薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの例では、該哺乳類では、有効量の抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)または抗BCMA CARを発現するT細胞を投与した哺乳類と比較して、サイトカインの放出が少ない。いくつかの例では、TFP分子を発現する該細胞は、TFP分子を発現する細胞の投与に伴う1つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの例では、TFP分子を発現する該細胞は、CD19またはBCMAに関連する疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される。
ン血症、前白血病、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患、及びこれらの組合せからなる群から選択される血液がんである。いくつかの例では、TFP分子を発現する該細胞は、TFP分子を発現する細胞の効果を高める薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの例では、該哺乳類では、有効量の抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)または抗BCMA CARを発現するT細胞を投与した哺乳類と比較して、サイトカインの放出が少ない。いくつかの例では、TFP分子を発現する該細胞は、TFP分子を発現する細胞の投与に伴う1つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの例では、TFP分子を発現する該細胞は、CD19またはBCMAに関連する疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される。
1つの態様において、本明細書で提供される単離された核酸分子、本明細書で提供される単離されたポリペプチド分子、本明細書で提供される単離されたTFP、本明細書で提供される複合体、本明細書で提供されるベクター、または本明細書で提供される細胞は、薬剤用である。
1つの態様において、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患を有する哺乳類の治療方法であって、該哺乳類に対して、有効量の本明細書で提供されるTFP分子、本明細書で提供される細胞、または本明細書で提供されるポリペプチド分子を投与することを含み、該哺乳類では、抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)または抗BCMA CARを発現するT細胞の有効量を投与された哺乳類と比較して、サイトカインの放出が少ないものである方法を本明細書に提供する。
参照による引用
本明細書で言及するすべての出版物、特許、及び特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に、参照することによって組み込まれることが示された場合と同じ程度まで、参照することによって本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及するすべての出版物、特許、及び特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に、参照することによって組み込まれることが示された場合と同じ程度まで、参照することによって本明細書に組み込まれる。
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に明記する。本発明の特徴及び利点のさらなる理解は、本発明の原理が利用される具体的な実施形態を明記する以下の詳細な説明、ならびに添付の図面を参照することによって得られるであろう。
発明の詳細な説明
1つの態様において、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された核酸分子であって、該TFPが、TCRサブユニット、及び抗CD19結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む分子を本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、該TCRサブユニットは、TCRの細胞外ドメインを含む。他の実施形態では、該TCRサブユニットは、TCRの膜貫通ドメインを含む。さらに他の実施形態では、該TCRサブユニットは、TCRの細胞内ドメインを含む。さらなる実施形態では、該TCRサブユニットは、(i)TCRの細胞外ドメイン、(ii)TCRの膜貫通ドメイン、及び(iii)TCRの細胞内ドメインを含むとともに、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つは同じTCRサブユニット由来である。さらに別の実施形態では、該TCRサブユニットは、CD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または少なくとも1つ、2つ、もしくは3つのそれに対する修飾を有するアミノ酸配列を含むTCRの細胞内ドメインを含む。さらに別の実施形態では、該TCRサブユニットは、4-1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、またはそれに対する少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの修飾を有するアミノ酸配列を含む細胞内ドメインを含む。
1つの態様において、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された核酸分子であって、該TFPが、TCRサブユニット、及び抗CD19結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む分子を本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、該TCRサブユニットは、TCRの細胞外ドメインを含む。他の実施形態では、該TCRサブユニットは、TCRの膜貫通ドメインを含む。さらに他の実施形態では、該TCRサブユニットは、TCRの細胞内ドメインを含む。さらなる実施形態では、該TCRサブユニットは、(i)TCRの細胞外ドメイン、(ii)TCRの膜貫通ドメイン、及び(iii)TCRの細胞内ドメインを含むとともに、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つは同じTCRサブユニット由来である。さらに別の実施形態では、該TCRサブユニットは、CD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または少なくとも1つ、2つ、もしくは3つのそれに対する修飾を有するアミノ酸配列を含むTCRの細胞内ドメインを含む。さらに別の実施形態では、該TCRサブユニットは、4-1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、またはそれに対する少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの修飾を有するアミノ酸配列を含む細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、該ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、抗体フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、該ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、scFvまたはVHドメインを含む。
いくつかの実施形態では、該単離された核酸分子は、(i)本明細書で提供されるいずれかの抗CD19軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC CD
R2、及びLC CDR3、及び/または(ii)本明細書で提供されるいずれかの抗CD19重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3を含む。
R2、及びLC CDR3、及び/または(ii)本明細書で提供されるいずれかの抗CD19重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、該軽鎖可変領域は、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの修飾から最大30、20、もしくは10までの修飾を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む。他の実施形態では、該重鎖可変領域は、本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの修飾から最大30、20、もしくは10までの修飾を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む。
いくつかの実施形態では、該TFPは、T細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、CD3デルタ、CD3イプシロン、またはCD3ガンマからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインもしくはその一部、もしくはその機能的フラグメント、またはそれに対する少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの修飾から最大20、10、もしくは5つまでの修飾を有するアミノ酸配列を含むTCRサブユニットの細胞外ドメインを含む。他の実施形態では、該コードされたTFPは、TCRのアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはTCRサブユニットのCD3イプシロン、CD3ガンマ、及びCD3デルタからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメイン、またはそれらの機能的フラグメント、もしくはそれに対する少なくとも1つ、2つ、もしくは3つから最大20、10、もしくは5までの修飾を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、該コードされたTFPは、TCRのアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、またはCD3イプシロン、CD3ガンマ、及びCD3デルタ CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ならびにCD154からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメイン、もしくはその機能的フラグメント、またはそれに対する少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの修飾から最大20、10、もしくは5までの修飾を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、該コードされた抗CD19結合ドメインは、リンカー配列によって該TCRの細胞外ドメインにつながれる。いくつかの例では、該コードされたリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=1~4である。いくつかの例では、該コードされたリンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの例では、該コードされた長いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=2~4である。いくつかの例では、該コードされたリンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの例では、該コードされた短いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=1~3である。
いくつかの実施形態では、該単離された核酸分子は、さらに、共刺激ドメインをコードする配列を含む。いくつかの例では、該共刺激ドメインは、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4-1BB(CD137)からなる群から選択されるタンパク質、またはそれに対する少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの修飾から最大20、10、もしくは5つまでの修飾を有するアミノ酸配列から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。
いくつかの実施形態では、該単離された核酸分子は、さらにリーダー配列を含む。
また、前述の核酸分子のいずれかによってコードされる単離されたポリペプチド分子を本明細書に提供する。
また、別の態様において、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む単離されたT細胞受容体融合タンパク質(TFP)分子を本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、該単離されたTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む。
いくつかの実施形態では、該抗CD19結合ドメインは、scFvまたはVHドメインである。他の実施形態では、該抗CD19結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖、もしくはそれらの機能的フラグメント、もしくは本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの修飾から最大30、20、もしくは10までの修飾を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供されるアミノ酸配列に95~99%の同一性がある配列を含む。
いくつかの実施形態では、該単離されたTFP分子は、T細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、CD3デルタ、CD3イプシロン、またはCD3ガンマからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインもしくはその一部、またはそれに対する少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの修飾から最大20、10、もしくは5つまでの修飾を有するアミノ酸配列を含むTCRの細胞外ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、該CD19結合ドメインは、リンカー配列によって該TCRの細胞外ドメインにつながれる。いくつかの例では、該リンカー領域は、(G4S)nを含み、この場合n=1~4である。いくつかの例では、該リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの例では、該長いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=2~4である。いくつかの例では、該リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの例では、該短いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=1~3である。
いくつかの実施形態では、該単離されたTFP分子は、さらに、共刺激ドメインをコードする配列を含む。他の実施形態では、該単離されたTFP分子は、さらに、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。さらに他の実施形態では、該単離されたTFP分子は、さらにリーダー配列を含む。
また、前述のTFP分子のいずれかをコードする核酸分子を含むベクターを本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、該ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該ベクターは、さらにプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、該ベクターは、インビトロで転写されたベクターである。いくつかの実施形態では、該ベクターの核酸配列は、さらにポリ(A)尾部を含む。いくつかの実施形態では、該ベクターの核酸配列は、さらに3’UTRを含む。
また、記載のベクターのいずれかを含む細胞を本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、該細胞はヒトT細胞である。いくつかの実施形態では、該細胞は、CD8+またはCD4+T細胞である。他の実施形態では、該細胞は、さらに、細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第二のポリペプチドに会合した、抑制分子の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、該抑制分子は、PD1の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドならびに共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第二のポリペプチドを含む。
別の態様において、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたTFP分子であって、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能な該TFP分子を本明細書に提供する。
別の態様において、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたTFP分子であって、内因性TCR複合体に機能的に統合することが可能な該TFP分子を本明細書に提供する。
別の態様において、ヒトCD8+またはCD4+T細胞であって、少なくとも2つのTFP分子を含み、該TFP分子がヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、該TFP分子が該ヒトCD8+またはCD4+T細胞の中で、該細胞において、及び/または該細胞の表面で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能な該T細胞を本明細書に提供する。
別の態様において、i)ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子、ならびにii)少なくとも1つの内因性TCR複合体を含むタンパク質複合体を本明細書に提供する。
いくつかの実施形態では、該TCRは、T細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、CD3デルタ、CD3イプシロン、またはCD3ガンマからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインもしくはその一部を含む。いくつかの実施形態では、該抗CD19結合ドメインは、リンカー配列によって該TCRの細胞外ドメインにつながれる。いくつかの例では、該リンカー領域は、(G4S)nを含み、この場合n=1~4である。いくつかの例では、該リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの例では、該長いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=2~4である。いくつかの例では、該リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの例では、該短いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=1~3である。
また、記載のいずれかのタンパク質複合体あたり、少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含むヒトCD8+またはCD4+T細胞を本明細書に提供する。
別の態様において、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、該集団の該T細胞が個々にまたは集合的に少なくとも2つのTFP分子を含み、該TFP分子がヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメインもしくは抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、該TFP分子が該ヒトCD8+またはCD4+T細胞の中で、該細胞において、及び/または該細胞の表面で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能な該T細胞集団を本明細書に提供する。
別の態様において、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、該集団の該T細胞が個々にまたは集合的に、本明細書で提供される単離された核酸分子によってコードされる少なくとも2つのTFP分子を含む該T細胞集団を本明細書に提供する。
別の態様において、T細胞に記載のベクターのいずれかで形質導入することを含む細胞の作製方法を本明細書に提供する。
別の態様において、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含む、RNA改変細胞集団の生成方法であって、該RNAが記載のTFP分子のいずれかをコードする核酸を含むものである方法を本明細書に提供する。
別の態様において、哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、該哺乳類に対して、記載のTFP分子のいずれかを発現する細胞の有効量を投与することを含む方法を本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、該細胞は自己T細胞である。いくつかの実施形態では、該細胞は、同種異系T細胞である。いくつかの実施形態では、該哺乳類はヒトである。
別の態様において、CD19の発現を伴う疾患を有する哺乳類の治療方法であって、該哺乳類に対して、記載のTFP分子のいずれかを含む細胞の有効量を投与することを含む方法を本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、CD19の発現を伴う該疾患は、増殖性疾患、例えば、がんもしくは悪性腫瘍、または前がん状態、例えば、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病、またはCD19の発現を伴う非がん関連の適応症から選択される。いくつかの実施形態では、該疾患は、B細胞急性リンパ性白血病(「B-ALL」)、T細胞急性リンパ性白血病(「T-ALL」)、急性リンパ性白血病(ALL)が挙げられるがこれらに限定されない1つ以上の急性白血病;慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)が挙げられるがこれらに限定されない1つ以上の慢性白血病;B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及び骨髄の血液細胞の無効な産生(または異形成)によってまとめられる様々な血液疾患の集まりである「前白血病」が挙げられるがこれらに限定されないさらなる血液がんまたは血液疾患、及び非定型及び/または非古典的がん、悪性腫瘍、CD19を発現する前がん状態もしくは増殖性疾患が挙げられるがこれらに限定されないCD19の発現を伴う疾患;及びそれらの組合せがからなる群から選択される血液がんである。
いくつかの実施形態では、記載のTFP分子のいずれかを発現する細胞は、TFP分子を発現する細胞の投与に伴う1つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、記載のTFP分子のいずれかを発現する該細胞は、CD19に関連する疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される。
また、記載の単離された核酸分子のいずれか、記載の単離されたポリペプチド分子のいずれか、記載の単離されたTFP分子のいずれか、記載のタンパク質複合体のいずれか、記載のベクターのいずれか、または記載の細胞のいずれかは、薬剤用である。
定義
別段の定義のない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
別段の定義のない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
用語「a」及び「an」は、該冠詞の文法上の目的語の1つまたは1つより多く(すなわち、少なくとも1つ)を指す。例として、「an element(要素)」は、1つの要素または1つより多い要素を意味する。
本明細書で用いられる、「約」は、状況及び当業者が知るまたは知り得ることに応じて、プラスマイナス1パーセント未満もしくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、または30パーセント超を意味することができる。
、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、または30パーセント超を意味することができる。
本明細書で用いられる、「subject(対象)」もしくは「subjects(対象)」または「individuals(個体)」には、哺乳類、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳類、例えば、家畜、農業用、または野生の動物、ならびに鳥類及び水生動物が含まれ得るがこれらに限定されない。「patient(患者)」は、疾患、障害、もしくは状態に罹患している、もしくはその発病の危険性がある対象、または他の面では、本明細書で提供される組成物及び方法を必要とする対象である。
本明細書で用いられる、「treating(治療すること)」または「treatment(治療)」は、該疾患もしくは状態の治療または改善における成功の任意の兆候を指す。治療することには、例えば、該疾患もしくは状態の1つ以上の症状の重症度を縮小すること、遅らせること、または軽減することが含まれる場合も、患者が経験する疾患、不具合、障害、または悪条件等の症状の頻度を減少させることが含まれる場合もある。本明細書で用いられる、「treat or prevent(治療または予防)」は、該疾患もしくは状態のある程度の治療または改善をもたらす方法を指すために本明細書で用いられることがあり、また、該状態の完全な予防が挙げられるがこれに限定されないその目的に向けられた様々な結果を企図する。
本明細書で用いられる、「preventing(予防すること)」は、患者における疾患または状態、例えば、腫瘍形成の予防を指す。例えば、腫瘍または他のがんの形態の発症の危険性がある個体が本発明の方法で治療され、後に該腫瘍または他のがんの形態を発症しない場合、該疾患は少なくともある期間にわたってその個体において予防されている。
本明細書で用いられる、「治療有効量」は、組成物またはその活性成分の、該組成物が投与される個体に対して有益な効果を与えるのに、またはそうでなければ有害な有益でない事象を減少させるのに十分な量である。「治療有効用量」は、本明細書では、1つ以上の所望のまたは望ましい(例えば、有益な)効果を生み出すために投与される用量を意味し、かかる投与は特定期間に1回以上存在する。正確な用量は、当該治療の目的に依存し、既知の技術を用いて当業者によって解明可能である(例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992);Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999);及びPickar, Dosage Calculations (1999)参照)。
本明細書で用いられる、「T細胞受容体(TCR)融合タンパク質」または「TFP」は、該TCRを含む様々なポリペプチド由来の組み換えポリペプチドを含み、該TCRは、概してi)標的細胞上の表面抗原に結合すること、及びii)通常はT細胞内またはその表面上で同一の場所に配置された場合に、無傷のTCR複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することが可能である。
本明細書で用いられる、用語「CD19」は、表面抗原分類19のタンパク質を指し、これは、B細胞白血病前駆細胞、他の悪性B細胞、及び正常B細胞系列のほとんどの細胞上で検出可能な抗原決定基である。ヒト及びマウスのアミノ酸ならびに核酸配列は、公共のデータベース、例えば、GenBank、UniProt、及びSwiss-Protに見出すことができる。例えば、ヒトCD19のアミノ酸配列は、UniProt/Swiss-Protアクセッション番号P15391として見出すことができる。ヒトCD
19ポリペプチドの標準的な配列は、UniProtアクセッション番号P15391(またはP15391-1):
19ポリペプチドの標準的な配列は、UniProtアクセッション番号P15391(またはP15391-1):
ヒトCD19をコードするヌクレオチド配列は、アクセッション番号NM001178098で見出すことができる。CD19は、例えば、ALL、CLL、及び非ホジキンリンパ腫(NHL)を含めたほとんどのB細胞系列のがんで発現される。CD19を発現する他の細胞は、「CD19の発現を伴う疾患」の定義内で以下に示す。それはまた、正常B細胞の前駆細胞の初期マーカーである。例えば、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)参照。一例では、TFPの抗原結合部位は、悪性及び正常B細胞で発現されるCD19タンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープを認識し、これに結合する。
本明細書で用いられる、用語「BCMA」は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17(TNFRSF17)としても知られるB細胞成熟抗原を指し、表面抗原分類269のタンパク質(CD269)は、TNFRSF17遺伝子によってヒトにおいてコードされるタンパク質である。TNFRSF17は、B細胞活性化因子(BAFF)を認識するTNF受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である(例えば、Laabi
et al., EMBO 11 (11): 3897-904 (1992)参照。この受容体は、成熟Bリンパ球で発現し、B細胞発生及び自己免疫反応にとって重要であり得る。ヒト及びマウスのアミノ酸ならびに核酸配列は、公共のデータベース、例えば、GenBank、UniProt、及びSwiss-Protに見出すことができる。例えば、ヒトBCMAのアミノ酸配列は、UniProt/Swiss-Protアクセッション番号Q02223で見出すことができる。ヒトBCMAポリペプチドの標準的な配列は、UniProtアクセッション番号Q02223(またはQ02223-1):
et al., EMBO 11 (11): 3897-904 (1992)参照。この受容体は、成熟Bリンパ球で発現し、B細胞発生及び自己免疫反応にとって重要であり得る。ヒト及びマウスのアミノ酸ならびに核酸配列は、公共のデータベース、例えば、GenBank、UniProt、及びSwiss-Protに見出すことができる。例えば、ヒトBCMAのアミノ酸配列は、UniProt/Swiss-Protアクセッション番号Q02223で見出すことができる。ヒトBCMAポリペプチドの標準的な配列は、UniProtアクセッション番号Q02223(またはQ02223-1):
ヒトBCMAをコードするヌクレオチド配列は、アクセッション番号NM001192
で見出すことができる。BCMAは、例えば、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫を含めたほとんどのB系列のがんで発現される。BCMAを発現する他の細胞は、「BCMAの発現を伴う疾患」の定義内で以下に示す。この受容体は、腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー13b(TNFSF13B/TALL-1/BAFF)に特異的に結合すること、ならびにNF-カッパB及びMAPK8/JNK活性化につながることが示されている。この受容体は、様々なTRAFファミリーメンバーにも結合し、ひいては細胞の生存及び増殖のためのシグナルを伝達することができる(例えば、Laabi et al., Nucleic Acids Research 22 (7):
1147-54 (1994)参照。一例では、TFPの抗原結合部位は、悪性及び正常B細胞で発現されるBCMAタンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープを認識し、これに結合する。
で見出すことができる。BCMAは、例えば、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫を含めたほとんどのB系列のがんで発現される。BCMAを発現する他の細胞は、「BCMAの発現を伴う疾患」の定義内で以下に示す。この受容体は、腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー13b(TNFSF13B/TALL-1/BAFF)に特異的に結合すること、ならびにNF-カッパB及びMAPK8/JNK活性化につながることが示されている。この受容体は、様々なTRAFファミリーメンバーにも結合し、ひいては細胞の生存及び増殖のためのシグナルを伝達することができる(例えば、Laabi et al., Nucleic Acids Research 22 (7):
1147-54 (1994)参照。一例では、TFPの抗原結合部位は、悪性及び正常B細胞で発現されるBCMAタンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープを認識し、これに結合する。
本明細書で用いられる、用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル起源の無傷の免疫グロブリンであってもそれらのフラグメントであってもよく、天然源由来でも組み換え源由来でもよい。
用語「抗体フラグメント」または「抗体結合ドメイン」は、抗体の少なくとも一部、またはその組み換え変異体を指し、これは抗原結合ドメイン、すなわち、無傷の抗体の抗原決定可変領域を含み、これは該抗体フラグメントの標的、例えば、抗原及びその明らかなエピトープに対する認識ならびに特異的結合を付与するのに十分である。抗体フラグメントの例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFvフラグメント、一本鎖(sc)Fv(「scFv」)抗体フラグメント、線形抗体、単一ドメイン抗体、例えば、sdAb(VLまたはVHのいずれか)、ラクダ科VHHドメイン、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
用語「scFv」は、軽鎖可変領域を含む少なくとも1つの抗体フラグメント及び重鎖可変領域を含む少なくとも1つの抗体フラグメントを含む融合タンパク質を指すとともに、該軽鎖及び重鎖可変領域は、短い可動性ポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、単一のポリペプチド鎖として発現され得、該scFvはそれが由来する無傷の抗体の特異性を保持している。
抗体に関する「重鎖可変領域」または「VH」は、フレームワーク領域として知られるフランキングストレッチ間に介在する3つのCDRを含む重鎖のフラグメントを指し、これらのフレームワーク領域は、一般に該CDRよりも高度に保存され、該CDRを支持する骨格を形成する。
指定されない限り、本明細書で用いられるscFvは、VL及びVHの可変領域を、例えば、当該ポリペプチドのN末端及びC末端に関していずれの順序で有してもよく、すなわち、scFvは、VL-リンカー-VHを含んでも、VH-リンカー-VLを含んでもよい。
抗体またはその抗体フラグメントを含む本発明のTFP組成物の部分は、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(sdAb)、マウス、ヒト化またはヒト抗体由来の一本鎖抗体(scFv)等の該抗原結合ドメインが連続ポリペプチド鎖の一部として発現される様々な形態で存在し得る(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.;Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.;
Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883;Bird et al., 1988,
Science 242:423-426)。1つの態様において、本発明のTFP組成物の該抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、該TFPは、scFvまたはsdAbを含む抗体フラグメントを含む。
Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883;Bird et al., 1988,
Science 242:423-426)。1つの態様において、本発明のTFP組成物の該抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、該TFPは、scFvまたはsdAbを含む抗体フラグメントを含む。
用語「抗体重鎖」は、抗体分子に天然起源のコンホメーションで含まれる2つのタイプのポリペプチド鎖のうちの大きい方を指し、これは通常、当該抗体が属するクラスを決定する。
用語「抗体軽鎖」は、抗体分子に天然起源のコンホメーションで含まれる2つのタイプのポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ(「κ」)及びラムダ(「λ」)軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖のアイソタイプを指す。
用語「組み換え抗体」は、組み換えDNA技術を用いて生成された抗体、例えば、バクテリオファージまたは酵母の発現系によって発現される抗体を指す。該用語はまた、当該抗体をコードし、抗体タンパク質を発現するDNA分子、または該抗体を特定するアミノ酸配列の合成によって生成された抗体を意味すると解釈されるものとし、この場合、該DNAまたはアミノ酸配列は、当技術分野で利用可能かつ周知の組み換えDNAまたはアミノ酸配列技術を用いて得られたものである。
用語「抗原」または「Ag」は、抗体によって特異的に結合され得る、または他の場合には免疫反応を誘発する分子を指す。この免疫反応は、抗体産生もしくは特異的な免疫適格細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含み得る。
当業者には、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含めた任意の高分子が抗原の役割を果たすことができることが理解されよう。さらに、抗原は組み換えまたはゲノムDNAから誘導することができる。当業者には、免疫反応を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、ひいては本明細書で用いられる用語「抗原」をコードすることが理解されよう。さらに、当業者には、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によって完全にコードされる必要はないことが理解されよう。本発明が、限定されないが、複数の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列が、所望の免疫反応を誘発するポリペプチドをコードする様々な組合せで配置されることは容易にわかる。さらに、当業者には、抗原は「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことが理解されよう。抗原は生成されても合成されてもよいし、生体試料由来であってもよいし、ポリペプチド以外の高分子の場合もあることは容易にわかる。かかる生体試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞、または他の生物学的要素の液体を挙げることができるがこれらに限定されない。
用語「抗腫瘍効果」は、様々な手段で明らかにすることができる生物学的効果を指し、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存率の低下、またはがん性状態に関連する様々な生理学的症状の改善が挙げられるがこれらに限定されない。「抗腫瘍効果」は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、及び抗体の最初の段階での腫瘍の発生の予防能力によっても明らかにすることができる。
用語「自己」は、任意の材料であって、後にそれが再導入される個体と同じ個体由来のものを指す。
用語「同種異系」は、任意の材料であって、同じ種の異なる動物、または該材料が導入
される個体と異なる患者由来のものを指す。遺伝子が1つ以上の遺伝子座で同一ではない場合、2つ以上の個体は互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様において、同じ種の個体由来の同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝学的に異なり得る。
される個体と異なる患者由来のものを指す。遺伝子が1つ以上の遺伝子座で同一ではない場合、2つ以上の個体は互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様において、同じ種の個体由来の同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝学的に異なり得る。
用語「異種」は、異なる種の動物由来の移植片を指す。
用語「がん」は、異常細胞の急速かつ制御されない増殖を特徴とする疾患を指す。がん細胞は、局所的にも、血流及びリンパ系を介して体の他の部分に広がることもできる。様々ながんの例は本明細書で記載されており、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん等が挙げられるがこれらに限定されない。
成句「CD19の発現を伴う疾患」及び「BCMAの発現を伴う疾患」としては、がんや悪性腫瘍等の増殖性疾患、もしくは骨髄異形成、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病等の前がん状態;またはCD19もしくはBCMAを発現する細胞に関連する非がん関連の適応症を含めたCD19もしくはBCMAの発現を伴う疾患またはCD19もしくはBCMAを発現する細胞に関連する状態が挙げられるがこれらに限定されない。1つの態様において、CD19またはBCMAの発現を伴うがんは、血液がんである。1つの態様において、該血液がんは、白血病またはリンパ腫である。1つの態様において、CD19またはBCMAの発現を伴うがんとしては、例えば、B細胞ALL、T細胞急性リンパ性白血病(TALL)が挙げられるがこれらに限定されない1つ以上の急性白血病、例えば、CLLまたは慢性骨髄性白血病(CML)が挙げられるがこれらに限定されない例えば1つ以上の慢性白血病が挙げられるがこれらに限定されないがん及び悪性腫瘍が挙げられる。CD19の発現を伴うさらなるがんまたは血液疾患は、例えば、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに骨髄の血液細胞の無効な産生(または異形成)によってまとめられる様々な血液疾患の集まりである「前白血病」等を含むがこれらに限定されない。CD19またはBCMA発現の発現を伴うさらなる疾患としては、例えば、非定型及び/または非古典的がん、悪性腫瘍、CD19またはBCMAの発現を伴う前がん状態もしくは増殖性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。CD19またはBCMAの発現を伴う非がん関連の適応症としては、例えば、自己免疫疾患(例えば、狼瘡、リウマチ性関節炎、大腸炎)、炎症性疾患(アレルギー及び喘息)、ならびに移植が挙げられるがこれらに限定されない。
用語「保存的配列修飾」は、当該アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特性に大きく作用しないか、これを大きく変えないアミノ酸修飾を指す。かかる保存的修飾としては、アミノ酸の置換、付加、及び欠失が挙げられる。修飾は、当技術分野で既知の標準的技術、例えば、部位特異的突然変異誘発法及びPCR媒介突然変異誘発法等によって、本発明の抗体または抗体フラグメントに導入することができる。保存的アミノ酸置換は、該アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソ
ロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)のアミノ酸が挙げられる。従って、本発明のTFP内の1つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができるとともに、変更されたTFPは、本明細書に記載の機能アッセイを用いて検査することができる。
ロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)のアミノ酸が挙げられる。従って、本発明のTFP内の1つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができるとともに、変更されたTFPは、本明細書に記載の機能アッセイを用いて検査することができる。
用語「刺激」は、刺激ドメインまたは刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体)がその同族リガンドと結合し、それによって、限定されないが、該TCR/CD3複合体を介したシグナル伝達等のシグナル伝達事象を媒介することによって誘導される一次応答を指す。刺激は、特定の分子の変化した発現、及び/または細胞骨格構造の再構成等を媒介することができる。
用語「刺激分子」または「刺激ドメイン」は、T細胞によって発現される分子またはその一部を指し、該T細胞は一次細胞質シグナル伝達配列(複数可)を提供し、該シグナル伝達配列(複数可)は、該T細胞のシグナル伝達経路の少なくともある局面に対して当該TCR複合体の一次活性化を促進的に調節する。1つの態様において、該一次シグナルは、例えば、TCR/CD3複合体が、ペプチドをロードされたMHC分子と結合することによって開始され、これが、増殖、活性化、分化等を含むがこれらに限定されないT細胞応答の媒介につながる。促進的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列(「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる)は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたは「ITAM」として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に用いられる一次細胞質シグナル伝達配列を含むITAMの例としては、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(「ICOS」としても知られる)、及びCD66d由来のものが挙げられるがこれらに限定されない。
用語「抗原提示細胞」または「APC」は、その表面の主要組織適合複合体(MHC)で複合化された外来抗原を提示するアクセサリー細胞(例えば、B細胞、樹状細胞等)等の免疫系細胞を指す。T細胞は、それらのT細胞受容体(TCR)を用いてこれらの複合体を認識する。APCは、抗原を加工し、それらをT細胞に提示する。
本明細書で用いられる用語、「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、分子の細胞内部分を指す。該細胞内シグナル伝達ドメインは、TFP含有細胞、例えば、TFP発現T細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、TFP発現T細胞における免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解反応及びサイトカインの分泌を含めたTヘルパー細胞活性が挙げられる。実施形態では、該細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激、または抗原依存性刺激に関与する分子由来のものが挙げられる。実施形態では、該細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含むことができる。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとしては、共刺激シグナル、または抗原非依存性刺激に関与する分子由来のものが挙げられる。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ITAM(「免疫受容活性化チロシンモチーフ」)を含むことができる。ITAMを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、CD3ゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、ならびにCD66d DAP10及びDAP12由来のものが挙げられるがこれらに限定されない。
用語「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、例えば、限定されないが、増殖等のT細胞による共刺激反応を媒介する、T細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫反応に必要とされる、抗原受容体またはそれら
のリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、MHCクラス1分子、BTLA及びTollリガンド受容体、ならびにOX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、及び4-1BB(CD137)が挙げられるがこれらに限定されない。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分である場合がある。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリーで表すことができる:TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、及び活性化NK細胞受容体。かかる分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、リンパ球機能関連抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、及びCD83に特異的に結合するリガンド等が挙げられる。該細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の全細胞内部分もしくは全天然細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその機能的フラグメントを含むことができる。用語「4-1BB」は、GenBankアクセッション番号AAA62478.2として与えられたアミノ酸配列、または、非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿等由来の同等の残基のTNFRスーパーファミリーのメンバーを指し、「4-1BB共刺激ドメイン」は、GenBankアクセッション番号AAA62478.2のアミノ酸残基214~255、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿等由来の同等の残基として定義される。
のリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、MHCクラス1分子、BTLA及びTollリガンド受容体、ならびにOX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、及び4-1BB(CD137)が挙げられるがこれらに限定されない。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分である場合がある。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリーで表すことができる:TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、及び活性化NK細胞受容体。かかる分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、リンパ球機能関連抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、及びCD83に特異的に結合するリガンド等が挙げられる。該細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の全細胞内部分もしくは全天然細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその機能的フラグメントを含むことができる。用語「4-1BB」は、GenBankアクセッション番号AAA62478.2として与えられたアミノ酸配列、または、非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿等由来の同等の残基のTNFRスーパーファミリーのメンバーを指し、「4-1BB共刺激ドメイン」は、GenBankアクセッション番号AAA62478.2のアミノ酸残基214~255、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿等由来の同等の残基として定義される。
用語「encoding(コードすること)」は、定義されたヌクレオチド配列(例えば、rRNA、tRNA、及びmRNA)または定義されたアミノ酸配列及びそれに起因する生物学的特性を有する生物学的過程における他のポリマーならびに高分子の合成用の鋳型の役割を果たすための遺伝子、cDNA、またはmRNA等のポリヌクレオチド内のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。従って、遺伝子、cDNA、またはRNAは、その遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳が細胞または他の生体系内の当該タンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常配列表に示されるコード鎖、及び遺伝子またはcDNAの転写の鋳型として用いられる非コード鎖の両方が、該タンパク質またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産物をコードすると見なすことができる。
別段の指定のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いに縮重した型であり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列という成句は、該タンパク質をコードする該ヌクレオチド配列が型によっては1つ以上のイントロンを含む場合があるという程度まで、イントロン含む場合もある。
用語「有効量」または「治療有効量」は、本明細書では交換可能に用いられ、本明細書に記載される化合物、処方、材料、または組成物の特定の生物学的または治療上の効果を達成するのに有効な量を指す。
用語「内因性」は、有機体、細胞、組織、もしくは系由来の、またはその内部で産生される任意の材料を指す。
用語「外因性」は、有機体、細胞、組織、もしくは系から導入される、またはその外部で産生される任意の材料を指す。
用語「発現」は、プロモーターによって動作される特定のヌクレオチド配列の転写及び/または翻訳を指す。
用語「転移ベクター」は、単離された核酸を含み、該単離された核酸を細胞の内部に送達するために用いることができる組成物を指す。線状ポリヌクレオチド、イオン性もしくは両親媒性化合物に会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが挙げられるがこれらに限定されない多くのベクターが当技術分野で知られている。従って、用語「転移ベクター」には、自己複製プラスミドまたはウイルスが含まれる。該用語は、さらに、細胞内への核酸の転移を促進する非プラスミド及び非ウイルス性化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソーム等を含むとも解釈されるものとする。ウイルス性転移ベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられるがこれらに限定されない。
用語「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシスエレメントを含み、発現用の他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系で供給され得る。発現ベクターには、組み換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド(例えば、裸の、またはリポソームに含まれる)、ならびにウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)を含めた、当技術分野で知られるすべてのものが挙げられる。
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、レトロウイルスの中でも非分裂細胞に感染することができることで独特である。レンチウイルスは、宿主細胞のDNAに大量の遺伝情報を送達することができるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIV、及びFIVは、すべてレンチウイルスの例である。
用語「レンチウイルスベクター」は、特に、Milone et al., Mol.
Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)に示される自己不活性化レンチウイルスベクターを含めたレンチウイルスゲノムの少なくとも一部由来のベクターを指す。臨床で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例としては、例えば、Oxford BioMedicaのLENTIVECTOR(商標)遺伝子送達技術、LentigenのLENTIMAX(商標)ベクターシステム等が挙げられるがこれらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者には既知である。
Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)に示される自己不活性化レンチウイルスベクターを含めたレンチウイルスゲノムの少なくとも一部由来のベクターを指す。臨床で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例としては、例えば、Oxford BioMedicaのLENTIVECTOR(商標)遺伝子送達技術、LentigenのLENTIMAX(商標)ベクターシステム等が挙げられるがこれらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者には既知である。
用語「相同」または「同一性」は、2つのポリマー分子間、例えば、2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子等の2つの核酸分子間、または2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。該2つの分子の両方のサブユニット部分が同じモノマーサブユニットで占められている場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれの位置がアデニンで占められている場合、それらはその位置で相同または同一である。2配列間の相同性は、一致または相同位置の数の一次関数であり、例えば、2つの配列の位置の半分(例えば、長さ10サブユニットのポリマー中5つの位置)が相同である場合、該2配列は50%相同であり、位置の90%(例えば、10のうちの9)が一致または相同の場合、該2配列は90%相同である。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、最小限の非ヒト免疫グロブリン由来の配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント(例えば、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、もしくは抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体及びその抗体フラグメントは、ヒト免疫グロブリン(レシピエントの抗体または抗体フラグメント)であって、該レシピエントの相補性決定領域(CDR)由来の残基は、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、またはウサギ等の非ヒト種(ドナー抗体)のCDR由来の残基で置き換えら
れる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体/抗体フラグメントは、レシピエントの抗体にも、取り込まれたCDRやフレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体または抗体フラグメントの性能をさらに洗練及び最適化することができる。一般に、該ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、少なくとも1つ及び通常は2つの可変ドメインを実質的にすべて含み、非ヒト免疫グロブリンのものに対応するすべてのまたは実質的にすべてのCDR領域ならびにFR領域のすべてまたはかなりの部分が、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体フラグメントは、免疫グロブリン定常領域(Fc)、通常はヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含み得る。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986;Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988;Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照されたい。
れる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体/抗体フラグメントは、レシピエントの抗体にも、取り込まれたCDRやフレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体または抗体フラグメントの性能をさらに洗練及び最適化することができる。一般に、該ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、少なくとも1つ及び通常は2つの可変ドメインを実質的にすべて含み、非ヒト免疫グロブリンのものに対応するすべてのまたは実質的にすべてのCDR領域ならびにFR領域のすべてまたはかなりの部分が、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体フラグメントは、免疫グロブリン定常領域(Fc)、通常はヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含み得る。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986;Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988;Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照されたい。
「ヒト」または「完全ヒト」は、抗体または抗体フラグメント等の免疫グロブリンであって、分子全体がヒト由来のものであるか、または該抗体もしくは免疫グロブリンのヒト型に対して同一のアミノ酸配列からなるものを指す。
用語「単離された」は、自然状態から変更されたまたは除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離された」ものではないが、その自然状態の共存物質から部分的に、もしくは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離された」ものである。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形で存在することも、例えば、宿主細胞等の非天然環境に存在することもできる。
本発明の中で、一般に存在する核酸塩基について以下の略語が使用される。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
用語「作動可能に連結された」または「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列の間の機能的連結を指し、後者の発現をもたらす。例えば、第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、第一の核酸配列は、第二の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたDNA配列は、互いに隣接することができ、例えば、2つのタンパク質のコード領域を結合するために必要な場合、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語には、例えば、皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)、もしくは胸骨内、腫瘍内、または注入技術が含まれる。
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)及びそのポリマーを指す。特に限定されない限り、該用語は、参照の核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示された配列だけでなく、暗黙的に、保存的に修飾されたその変異体(例えば、縮重コドン置換)、対立遺伝子、オルソログ、SNP、及び相補的配列も包含する。特に、縮重コドン置換は、1つ以上の選択された(またはすべての)コドンの3番目の位置が混合塩基及び/またはデオキシイノシン残基
で置換された配列を生成することによって達成され得る(Batzer et al.,
Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991);Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);及びRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
で置換された配列を生成することによって達成され得る(Batzer et al.,
Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991);Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);及びRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、交換可能に用いられ、ペプチド結合で共有結合されたアミノ酸配列からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限は設けられていない。ポリペプチドには、ペプチド結合で互いに結合された2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で用いられる該用語は、当技術分野で一般に例えば、ペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも呼ばれる短鎖、ならびに、当技術分野で一般にタンパク質と呼ばれ、多くのタイプがある長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、変性ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質等が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組み換えペプチド、またはそれらの組合せが含まれる。
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要な、細胞の転写機構もしくは導入された合成機構によって認識されるDNA配列を指す。
用語「プロモーター/調節配列」は、該プロモーター/調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を指す。いくつかの例では、この配列は、コアプロモーター配列の場合があり、他の例では、この配列は、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列及び他の調節エレメントも含む場合がある。該プロモーター/調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現するものの場合がある。
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、当該細胞のほとんどまたはすべての生理条件下で、細胞内に該遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、該プロモーターに対応する誘導因子が当該細胞に存在する場合に実質的に唯一、細胞内に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子によってコードまたは特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、当該細胞が該プロモーターに対応する組織型の細胞の場合に実質的に唯一、細胞内に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
scFvとの関連で用いられる用語「リンカー」及び「可動性ポリペプチドリンカー」は、単独でまたは組み合わせて用いて可変重鎖及び可変軽鎖領域を連結するグリシン及び/またはセリン残基等のアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。1つの実施形態では、該可動性ポリペプチドリンカーは、Gly/Serリンカーであり、アミノ酸配列(Gly-Gly-Gly-Ser)nを含み、この場合nは1以上の正の整数である。例えば、n=1、n=2、n=3、n=4、n=5、n=6、n=7、n=8、n=9、及びn=10。1つの実施形態では、該可動性ポリペプチドリンカーには、(Gly4Ser)4または(Gly4Ser)3が含まれるがこれに限定されない。別の実施形態では、該リンカーには、(Gly2Ser)、(GlySer)、または(Gly3Ser)の多重反復が含まれる。同様に本発明の範囲内に含まれるのは、WO2012/13847
5(参照することによって本明細書に組み込まれる)に記載のリンカーである。いくつかの例では、該リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの例では、該長いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合、n=2~4である。いくつかの例では、該リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの例では、該短いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合、n=1~3である。
5(参照することによって本明細書に組み込まれる)に記載のリンカーである。いくつかの例では、該リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの例では、該長いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合、n=2~4である。いくつかの例では、該リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの例では、該短いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合、n=1~3である。
本明細書で用いられる、5’キャップ(RNAキャップ、RNA7-メチルグアノシンキャップ、またはRNA m7Gキャップとも呼ばれる)は、転写開始の直後に真核生物のメッセンジャーRNAの「フロント」または5’末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。該5’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びRNアーゼからの保護に不可欠である。キャップの付加は転写と対になっており、各々が他方に影響を与えるように同時転写的に起こる。転写開始の直後、合成されるmRNAの5’末端は、RNAポリメラーゼと会合したキャップ合成複合体によって結合される。この酵素複合体は、mRNAのキャッピングに必要とされる化学反応を触媒する。合成は、多段階の生化学反応として進行する。該キャッピング部分は、mRNAの機能、例えば、その安定性や翻訳効率を調節するために修飾され得る。
本明細書で用いられる、「インビトロで転写されたRNA」は、インビトロで合成されたRNA、好ましくはmRNAを指す。一般に、該インビトロで転写されたRNAは、インビトロ転写ベクターから生成される。該インビトロ転写ベクターは、該インビトロで転写されたRNAを生成するために用いられる鋳型を含む。
本明細書で用いられる、「ポリ(A)」は、ポリアデニル化によってmRNAに加えられる一連のアデノシンである。一過性発現用の構築物の好ましい実施形態では、該ポリAは、50~5000であり、好ましくは64より多く、より好ましくは100より多く、最も好ましくは300または400より多い。ポリ(A)配列は、局在化、安定性、または翻訳効率等のmRNAの機能を調節するために化学的または酵素的に修飾され得る。
本明細書で用いられる、「ポリアデニル化」は、メッセンジャーRNA分子に対するポリアデニリル部分またはその修飾変異体の共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーRNA(mRNA)分子は3’末端でポリアデニル化される。該3’ポリ(A)尾部は、酵素ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用を介して、プレmRNAに付加された長い配列のアデニンヌクレオチド(多くの場合数百)である。高等真核生物では、該ポリ(A)尾部は、特定の配列、すなわち、ポリアデニル化シグナルを含む転写産物に付加される。該ポリ(A)尾部及びそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からのmRNAの保護に役立つ。ポリアデニル化はまた、転写の終結、核からのmRNAの取り出し、及び転写にとっても重要である。ポリアデニル化は、DNAのRNAへの転写の直後、核内で起こるが、後に細胞質内でもさらに起こる場合もある。転写が終結した後、該mRNA鎖は、RNAポリメラーゼと会合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用を介して切断される。該切断部位は、通常、該切断部位近傍の塩基配列AAUAAAの存在を特徴とする。該mRNAが切断された後、アデノシン残基が該切断部位の遊離の3’末端に付加される。
本明細書で用いられる、「一過性」は、融合していない導入遺伝子の数時間、数日、または数週間の発現を指し、この場合、発現の期間は、該遺伝子がゲノムに融合された場合、または宿主細胞の安定なプラスミドレプリコン内に含まれた場合の発現に対する期間より短い。
用語「シグナル伝達経路」は、細胞の1つの部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝
達に関与する様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。成句「細胞表面受容体」には、シグナルを受け取り、細胞膜を越えてシグナルを伝達することが可能な分子及び分子の複合体が含まれる。
達に関与する様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。成句「細胞表面受容体」には、シグナルを受け取り、細胞膜を越えてシグナルを伝達することが可能な分子及び分子の複合体が含まれる。
用語「対象」は、免疫反応が誘発され得る生体(例えば、哺乳類、ヒト)を含むことが意図される。
用語「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞はまた、その天然に存在する状態では通常会合している他の細胞型から分離された細胞も指す。いくつかの例では、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞の集団を指す。他の例では、この用語は単に、それらがその天然の状態では自然に会合している細胞から分離された細胞を指す。いくつかの態様において、該細胞は、インビトロで培養される。他の態様において、該細胞はインビトロでは培養されない。
本明細書で用いられる、用語「therapeutic(治療的)」は、treatment(治療)を意味する。治療効果は、病態の減少、抑制、寛解、または根絶によって得られる。
本明細書で用いられる、用語「prophylaxis(予防)」は、疾患もしくは病態に対する予防または保護治療を意味する。
本発明の中で、「腫瘍抗原」、もしくは「過剰増殖性疾患抗原」、または「過剰増殖性疾患に関連する抗原」は、特定の過剰増殖性疾患に共通の抗原を指す。特定の態様において、本発明の該過剰増殖性疾患抗原は、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、NHL、白血病、子宮がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、及び腺がん、例えば、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がん等が挙げられるがこれらに限定されないがん由来である。
用語「トランスフェクトされた」、もしくは「変換された」、または「形質導入された」は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入される過程を指す。「トランスフェクトされた」、もしくは「変換された」、または「形質導入された」細胞は、外因性の核酸でトランスフェクトされた、変換された、または形質導入されたものである。該細胞は初代対象細胞及びその後代を含む。
用語「特異的に結合する」は、試料中に含まれる同族結合パートナー(例えば、CD19)を認識及びこれに結合するが、必ずしも実質的に該試料中の他の分子を認識することもこれに結合することも必要ではない抗体、抗体フラグメント、または特定のリガンドを指す。
範囲:本開示を通して、本発明の様々な態様は、範囲の形式で示され得る。範囲の形式での記述は、単に便宜のため及び簡略して表現するためであると理解されるものとし、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限と解釈されるものとはしない。従って、範囲の記述は、その範囲内の個々の数値だけでなく、具体的に開示されるすべての可能な部分的な範囲を有すると見なされるものとする。例えば、1~6等の範囲の記述は、1~3、1~4、1~5、2~4、2~6、3~6等のように具体的に開示される部分的な範囲、ならびに、その範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、及び6を有すると見なされるものとする。別の例として、95~99%同一等の範囲は、95%、96%、97%、98%、または99%同一のものを含み、かつ、96~99%、96~98%、96~97%、97~99%、97~98%、及び98~99%同一等の部分的な範囲を含む。これは、当該範囲の幅にかかわらず適用される。
説明
T細胞受容体(TCR)融合タンパク質を用いたがん等の疾患の治療用の組成物及び使用方法を本明細書に提供する。本明細書で用いられる、「T細胞受容体(TCR)融合タンパク質」または「TFP」は、該TCRを含む様々なポリペプチド由来の組み換えポリペプチドを含み、該TCRは、概してi)標的細胞上の表面抗原に結合すること、及びii)通常はT細胞内またはその表面上で同一の場所に配置された場合に、無傷のTCR複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することが可能である。本明細書で提供されるTFPは、キメラ抗原受容体と比較して、かなりの利点を提供する。用語「キメラ抗原受容体」または代替的に「CAR」は、scFvの形で細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び以下に定義される刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる)を含む組み換えポリペプチドを指す。一般に、CARの中心細胞内シグナル伝達ドメインは、通常TCR複合体と会合して見出されるCD3ゼータ鎖由来である。該CD3ゼータシグナル伝達ドメインは、4-1BB(すなわち、CD137)、CD27、及び/またはCD28等の少なくとも1つの共刺激分子由来の1つ以上の機能的シグナル伝達ドメインと融合することができる。
T細胞受容体(TCR)融合タンパク質を用いたがん等の疾患の治療用の組成物及び使用方法を本明細書に提供する。本明細書で用いられる、「T細胞受容体(TCR)融合タンパク質」または「TFP」は、該TCRを含む様々なポリペプチド由来の組み換えポリペプチドを含み、該TCRは、概してi)標的細胞上の表面抗原に結合すること、及びii)通常はT細胞内またはその表面上で同一の場所に配置された場合に、無傷のTCR複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することが可能である。本明細書で提供されるTFPは、キメラ抗原受容体と比較して、かなりの利点を提供する。用語「キメラ抗原受容体」または代替的に「CAR」は、scFvの形で細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び以下に定義される刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる)を含む組み換えポリペプチドを指す。一般に、CARの中心細胞内シグナル伝達ドメインは、通常TCR複合体と会合して見出されるCD3ゼータ鎖由来である。該CD3ゼータシグナル伝達ドメインは、4-1BB(すなわち、CD137)、CD27、及び/またはCD28等の少なくとも1つの共刺激分子由来の1つ以上の機能的シグナル伝達ドメインと融合することができる。
T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)
本発明は、TFPをコードする組み換えDNA構築物であって、該TFPがCD19、例えばヒトCD19に特異的に結合する抗体フラグメントを含み、該抗体フラグメントの配列が、TCRサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と隣接し、かつそれと同じリーディングフレーム内にある構築物を包含する。本発明は、TFPをコードする組み換えDNA構築物であって、該TFPがBCMA、例えばヒトBCMAに特異的に結合する抗体フラグメントを含み、該抗体フラグメントの配列が、TCRサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と隣接し、かつそれと同じリーディングフレーム内にある構築物を包含する。本明細書で提供されるTFPは、1つ以上の内因性(または代替的に、1つ以上の外因性、もしくは内因性及び外因性の組合せ)TCRサブユニットと会合し、機能的TCR複合体を形成することが可能である。
本発明は、TFPをコードする組み換えDNA構築物であって、該TFPがCD19、例えばヒトCD19に特異的に結合する抗体フラグメントを含み、該抗体フラグメントの配列が、TCRサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と隣接し、かつそれと同じリーディングフレーム内にある構築物を包含する。本発明は、TFPをコードする組み換えDNA構築物であって、該TFPがBCMA、例えばヒトBCMAに特異的に結合する抗体フラグメントを含み、該抗体フラグメントの配列が、TCRサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と隣接し、かつそれと同じリーディングフレーム内にある構築物を包含する。本明細書で提供されるTFPは、1つ以上の内因性(または代替的に、1つ以上の外因性、もしくは内因性及び外因性の組合せ)TCRサブユニットと会合し、機能的TCR複合体を形成することが可能である。
1つの態様において、本発明のTFPは、標的特異的結合因子、別名抗原結合ドメインを含む。部分の選択は、標的細胞の表面を決定する標的抗原の型と数に依存する。例えば、該抗原結合ドメインは、特定の病態と関連する標的細胞の細胞表面マーカーとして作用する標的抗原を認識するために選択され得る。従って、本発明のTFPにおける抗原結合ドメインに対して標的抗原の役割をし得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌、及び寄生虫感染症;自己免疫疾患;ならびにがん性疾患(例えば、悪性疾患)に関連するものが挙げられる。
1つの態様において、該TFP媒介T細胞応答は、所望の抗原に特異的に結合するTFP内に抗原結合ドメインを組み込む方法によって、目的の抗原に向かわせることができる。
1つの態様において、該抗原結合ドメインを含むTFPの部分は、CD19を標的とする抗原結合ドメインを含む。1つの態様において、該抗原結合ドメインはヒトCD19を標的とする。1つの態様において、該抗原結合ドメインを含むTFPの部分は、BCMAを標的とする抗原結合ドメインを含む。1つの態様において、該抗原結合ドメインは、ヒトBCMAを標的とする。
該抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びその機能的フラグメントを含むがこれらに限定されない抗原に
結合する任意のドメインであることができ、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン(VH)、軽鎖可変ドメイン(VL)、及びラクダ科由来ナノボディの可変ドメイン(VHH)、ならびに当技術分野で抗原結合ドメインとして機能することが知られる代替骨格、例えば、組み換えフィブロネクチンドメイン、アンチカリン(anticalin)、DARPIN等が挙げられるがこれらに限定されない。同様に、当該標的抗原を特異的に認識し、これに結合する天然または合成リガンドが、該TFPに対する抗原結合ドメインとして使用され得る。いくつかの例では、該抗原結合ドメインが、該TFPが最終的に用いられるのと同じ種由来であることが有益である。例えば、ヒトでの使用については、該TFPの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインに対してヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
結合する任意のドメインであることができ、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン(VH)、軽鎖可変ドメイン(VL)、及びラクダ科由来ナノボディの可変ドメイン(VHH)、ならびに当技術分野で抗原結合ドメインとして機能することが知られる代替骨格、例えば、組み換えフィブロネクチンドメイン、アンチカリン(anticalin)、DARPIN等が挙げられるがこれらに限定されない。同様に、当該標的抗原を特異的に認識し、これに結合する天然または合成リガンドが、該TFPに対する抗原結合ドメインとして使用され得る。いくつかの例では、該抗原結合ドメインが、該TFPが最終的に用いられるのと同じ種由来であることが有益である。例えば、ヒトでの使用については、該TFPの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインに対してヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
従って、1つの態様において、該抗原結合ドメインは、ヒト化またはヒト抗体もしくはヒト化またはヒト抗体フラグメント、またはマウス抗体もしくはマウス抗体フラグメントを含む。1つの実施形態では、該ヒト化もしくはヒト抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化もしくはヒト抗CD19または抗BCMA結合ドメインの軽鎖相補性決定領域1(LC CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LC CDR2)、及び軽鎖相補性決定領域3(LC CDR3)の1つ以上(例えば、3つすべて)、及び/または、本明細書に記載のヒト化もしくはヒト抗CD19結合ドメインの重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)、及び重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)の1つ以上(例えば、3つすべて)を含み、例えば、ヒト化もしくはヒト抗CD19または抗BCMA結合ドメインは1つ以上、例えば、3つすべてのLC CDR及び1つ以上、例えば、3つすべてのHC CDRを含む。1つの実施形態では、該ヒト化またはヒト抗CD19結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化もしくはヒト抗CD19または抗BCMA結合ドメインの重鎖相補性決定領域1(HC
CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)、及び重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)の1つ以上(例えば、3つすべて)を含み、例えば、該ヒト化もしくはヒト抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、それぞれが本明細書に記載のHC CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3を含む2つの可変重鎖領域を有する。1つの実施形態では、該ヒト化もしくはヒト抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化もしくはヒト軽鎖可変領域及び/または本明細書に記載のヒト化もしくはヒト重鎖可変領域を含む。1つの実施形態では、該ヒト化もしくはヒト抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化重鎖可変領域、例えば、少なくとも2つの本明細書に記載のヒト化またはヒト重鎖可変領域を含む。1つの実施形態では、該抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むscFvである。実施形態では、該抗CD19または抗BCMA結合ドメイン(例えば、scFv)は、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの修飾(例えば、置換)から最大30、20、もしくは10までの修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供されるアミノ酸配列と95~99%の同一性がある配列を含む軽鎖可変領域、及び/または、本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの修飾(例えば、置換)から最大30、20、もしくは10までの修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む重鎖可変領域を含む。1つの実施形態では、該ヒト化もしくはヒト抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、scFvであり、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、本明細書に記載のリンカーを介して取り付けられる。1つの実施形態では、該ヒト化抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、(Gly4-Ser)nリンカーを含み、この場合、nは1、2、3、4、5、もしくは6であり、好ましくは3または4である。scFvの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、以下の配向のいずれかの場合がある:軽鎖可変領域-リンカー-重鎖可変領域または重鎖可変領
域-リンカー-軽鎖可変領域。いくつかの例では、該リンカー配列は長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの例では、該長いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=2~4である。いくつかの例では、該リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの例では、該短いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=1~3である。
CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)、及び重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)の1つ以上(例えば、3つすべて)を含み、例えば、該ヒト化もしくはヒト抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、それぞれが本明細書に記載のHC CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3を含む2つの可変重鎖領域を有する。1つの実施形態では、該ヒト化もしくはヒト抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化もしくはヒト軽鎖可変領域及び/または本明細書に記載のヒト化もしくはヒト重鎖可変領域を含む。1つの実施形態では、該ヒト化もしくはヒト抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化重鎖可変領域、例えば、少なくとも2つの本明細書に記載のヒト化またはヒト重鎖可変領域を含む。1つの実施形態では、該抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むscFvである。実施形態では、該抗CD19または抗BCMA結合ドメイン(例えば、scFv)は、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの修飾(例えば、置換)から最大30、20、もしくは10までの修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供されるアミノ酸配列と95~99%の同一性がある配列を含む軽鎖可変領域、及び/または、本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの修飾(例えば、置換)から最大30、20、もしくは10までの修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む重鎖可変領域を含む。1つの実施形態では、該ヒト化もしくはヒト抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、scFvであり、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、本明細書に記載のリンカーを介して取り付けられる。1つの実施形態では、該ヒト化抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、(Gly4-Ser)nリンカーを含み、この場合、nは1、2、3、4、5、もしくは6であり、好ましくは3または4である。scFvの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、以下の配向のいずれかの場合がある:軽鎖可変領域-リンカー-重鎖可変領域または重鎖可変領
域-リンカー-軽鎖可変領域。いくつかの例では、該リンカー配列は長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの例では、該長いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=2~4である。いくつかの例では、該リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの例では、該短いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=1~3である。
いくつかの態様において、非ヒト抗体はヒト化され、そこで該抗体の特定の配列または領域は、ヒトにおいて自然に産生される抗体またはそのフラグメントとの類似性を増すように修飾される。1つの態様において、該抗原結合ドメインはヒト化される。
ヒト化抗体は、CDR移植(例えば、欧州特許第EP239,400号;国際公開第WO91/09967号;ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、及び第5,585,089号参照。これらの各々は、参照することによってそれらの全体が本明細書に組み込まれる)、ベニアリングまたはリサーフェーシング(例えば、欧州特許第EP592,106号及び第EP519,596号;Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498;Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814;及びRoguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973参照。これらの各々は、参照することによってそれらの全体が本明細書に組み込まれる)、鎖シャフリング(例えば、米国特許第5,565,332号参照。参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる)、ならびに例えば、各々が参照することによって全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第US2005/0042664号、米国特許出願公開第US2005/0048617号、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、国際公開第WO9317105号, Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et
al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994),及びPedersen et al., J. Mol. Biol.,
235(3):959-73 (1994)に開示される技術が挙げられるがこれらに限定されない当技術分野で既知の様々な技術を用いて産生することができる。多くの場合、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基で置換され、抗原結合を変更、例えば、改善する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって特定され、例えば、該CDRとフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって抗原結合及び配列比較に重要なフレームワーク残基を特定し、特定の位置で他とは異なるフレームワーク残基を特定する(例えば、Queen et al.,米国特許第5,585,089号;及びRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323参照。これらは参照することによってそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。
al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994),及びPedersen et al., J. Mol. Biol.,
235(3):959-73 (1994)に開示される技術が挙げられるがこれらに限定されない当技術分野で既知の様々な技術を用いて産生することができる。多くの場合、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基で置換され、抗原結合を変更、例えば、改善する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって特定され、例えば、該CDRとフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって抗原結合及び配列比較に重要なフレームワーク残基を特定し、特定の位置で他とは異なるフレームワーク残基を特定する(例えば、Queen et al.,米国特許第5,585,089号;及びRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323参照。これらは参照することによってそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒト起源由来のそれに残る1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「import(取り込み)」残基と呼ばれ、これらは通常、「取り込み」可変ドメインから取り出される。本明細書で提供される、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒト免疫グロブリン分子由
来の1つ以上のCDR及びフレームワーク領域を含むとともに、該フレームワークを構成するアミノ酸残基は、完全にまたは大部分ヒト生殖細胞系由来である。抗体または抗体フラグメントのヒト化に対する多数の技術は、当技術分野で周知であり、Winter及び共同研究者らの方法(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))に従い、げっ歯類のCDRまたはCDR配列を対応する配列のヒト抗体の代わりに用いることによって、すなわちCDR移植で基本的に行うことができる(EP239,400号;PCT公開第WO91/09967号;及び米国特許第4,816,567号;第6,331,415号;第5,225,539号;第5,530,101号;第5,585,089号;第6,548,640号。これらの内容は、参照することによってそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。かかるヒト化抗体及び抗体フラグメントにおいて、非ヒト種由来の対応する配列による置換は、無傷のヒト可変ドメインよりかなり少ない。ヒト化抗体は、多くの場合、いくつかのCDR残基及び場合によりいくつかのフレームワーク(FR)残基がげっ歯類抗体における類似部位由来の残基によって置換されるヒト抗体である。抗体及び抗体フラグメントのヒト化は、ベニアリングもしくはリサーフェーシング(EP592,106;EP519,596;Padlan, 1991, Molecular Immunology,
28(4/5):489-498;Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994);及びRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994))、または鎖シャフリング(米国特許第5,565,332号)によっても達成され得る。これらの内容は、参照することによってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
来の1つ以上のCDR及びフレームワーク領域を含むとともに、該フレームワークを構成するアミノ酸残基は、完全にまたは大部分ヒト生殖細胞系由来である。抗体または抗体フラグメントのヒト化に対する多数の技術は、当技術分野で周知であり、Winter及び共同研究者らの方法(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))に従い、げっ歯類のCDRまたはCDR配列を対応する配列のヒト抗体の代わりに用いることによって、すなわちCDR移植で基本的に行うことができる(EP239,400号;PCT公開第WO91/09967号;及び米国特許第4,816,567号;第6,331,415号;第5,225,539号;第5,530,101号;第5,585,089号;第6,548,640号。これらの内容は、参照することによってそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。かかるヒト化抗体及び抗体フラグメントにおいて、非ヒト種由来の対応する配列による置換は、無傷のヒト可変ドメインよりかなり少ない。ヒト化抗体は、多くの場合、いくつかのCDR残基及び場合によりいくつかのフレームワーク(FR)残基がげっ歯類抗体における類似部位由来の残基によって置換されるヒト抗体である。抗体及び抗体フラグメントのヒト化は、ベニアリングもしくはリサーフェーシング(EP592,106;EP519,596;Padlan, 1991, Molecular Immunology,
28(4/5):489-498;Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994);及びRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994))、または鎖シャフリング(米国特許第5,565,332号)によっても達成され得る。これらの内容は、参照することによってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
該ヒト化抗体の作製に用いられる軽及び重の両方のヒト可変ドメインを選ぶことは、抗原性を減らすことである。いわゆる「最良適合」法によれば、げっ歯類抗体の該可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングされる。げっ歯類のものに最も近い該ヒト配列は、次に該ヒト化抗体用のヒトフレームワーク(FR)として認められる(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993);Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)。これらの内容は、参照することによってそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の亜群のすべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に用いる場合がある(例えば、Nicholson
et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997);Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)参照。これらの内容は、参照することによってそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。いくつかの実施形態では、該フレームワーク領域、例えば、重鎖可変領域の4つのすべてのフレームワーク領域は、VH4-4-59生殖細胞系列配列由来である。1つの実施形態では、該フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列でのアミノ酸から、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの修飾、例えば、置換を含み得る。1つの実施形態では、該フレームワーク領域、例えば、該軽鎖可変領域の4つのすべてのフレームワーク領域は、VK3-1.25生殖細胞系列配列由来である。1つの実施形態では、該フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列でのアミノ酸から、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの修飾、例えば、置換を含み得る。
et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997);Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)参照。これらの内容は、参照することによってそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。いくつかの実施形態では、該フレームワーク領域、例えば、重鎖可変領域の4つのすべてのフレームワーク領域は、VH4-4-59生殖細胞系列配列由来である。1つの実施形態では、該フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列でのアミノ酸から、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの修飾、例えば、置換を含み得る。1つの実施形態では、該フレームワーク領域、例えば、該軽鎖可変領域の4つのすべてのフレームワーク領域は、VK3-1.25生殖細胞系列配列由来である。1つの実施形態では、該フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列でのアミノ酸から、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの修飾、例えば、置換を含み得る。
いくつかの態様において、抗体フラグメントを含む本発明のTFP組成物の部分は、標的抗原に対する高い親和性及び他の有益な生物学的特性を保持しながらヒト化される。本
発明の1つの態様によれば、ヒト化抗体及び抗体フラグメントは、当該親配列及びヒト化配列の3次元モデルを用いて、該親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析過程によって調製される。3次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。コンピュータプログラムが利用可能であり、これは、選択された候補の免疫グロブリン配列の推定される3次元立体配座構造を説明及び表示する。これらの表示の検査は、候補の免疫グロブリン配列の機能性における当該残基の可能性のある役割の分析、例えば、該候補の免疫グロブリンの標的抗原を結合する能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このように、FR残基は、所望の抗体または抗体フラグメントの特性、例えば、標的抗原に対する親和性の増加が達成されるように、当該レシピエント及び取り込み配列から選択ならびに組み合わせることができる。一般に、該CDR残基は、抗原結合への影響に直接及び最も実質的に関与している。
発明の1つの態様によれば、ヒト化抗体及び抗体フラグメントは、当該親配列及びヒト化配列の3次元モデルを用いて、該親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析過程によって調製される。3次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。コンピュータプログラムが利用可能であり、これは、選択された候補の免疫グロブリン配列の推定される3次元立体配座構造を説明及び表示する。これらの表示の検査は、候補の免疫グロブリン配列の機能性における当該残基の可能性のある役割の分析、例えば、該候補の免疫グロブリンの標的抗原を結合する能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このように、FR残基は、所望の抗体または抗体フラグメントの特性、例えば、標的抗原に対する親和性の増加が達成されるように、当該レシピエント及び取り込み配列から選択ならびに組み合わせることができる。一般に、該CDR残基は、抗原結合への影響に直接及び最も実質的に関与している。
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、元の抗体と同様の抗原特異性、例えば、本発明では、ヒトCD19に対する結合能を保持し得る。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体または抗体フラグメントでは、ヒトCD19またはヒトBCMAに対する結合の親和性及び/または特異性が向上する場合がある。
1つの態様において、該抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的特色または特性によって特徴づけられる。例えば、1つの態様において、抗原結合ドメインを含む本発明のTFP組成物の部分は、ヒトCD19またはヒトBCMAに特異的に結合する。1つの態様において、該抗原結合ドメインは、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)に記載のFMC63 scFvと同じまたは同様のヒトCD19に対する結合特異性を有する。1つの態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメントを含むとともにCD19もしくはBCMAタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗原結合ドメインに関し、該抗体または抗体フラグメントは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び/または可変重鎖を含むものである。特定の態様において、該scFvは、リーダー配列に隣接し及びこれと同じリーディングフレーム内にある。
1つの態様において、該抗CD19または抗BCMA結合ドメインは、フラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント(scFv)である。1つの態様において、該抗CD19結合ドメインは、Fv、Fab、(Fab’)2、または二官能性(例えば、二重特異性)ハイブリッド抗体(例えば、Lanzavecchia et al., Eur.
J. Immunol. 17, 105 (1987))である。1つの態様において、本発明の抗体及びそれらのフラグメントは、野生型または親和性が向上されたCD19タンパク質に結合する。
J. Immunol. 17, 105 (1987))である。1つの態様において、本発明の抗体及びそれらのフラグメントは、野生型または親和性が向上されたCD19タンパク質に結合する。
また、標的抗原(例えば、CD19、BCMA、または融合部分結合ドメインの標的について本明細書の他の箇所に記載される任意の標的抗原)に特異的な抗体抗原結合ドメインを得るための方法であって、本明細書に示されるVHドメインのアミノ酸配列内の1つ以上のアミノ酸の付加、削除、置換、または挿入を経由して、該VHドメインのアミノ酸配列変異体であるVHドメインを準備し、任意に、このようにして準備されたVHドメインを1つ以上のVLドメインと組み合せ、該VHドメインまたはVH/VLの組合せもしくは複数の組合せを試験し、特定の結合メンバー、または、任意に1つ以上の所望の特性を有する目的の標的抗原(例えば、CD19またはBCMA)に特異的な抗体抗原結合ドメインを特定することを含む方法を本明細書に提供する。
いくつかの例では、VHドメイン及びscFvは当技術分野で既知の方法に従って調製することができる(例えば、Bird et al., (1988) Science
242:423-426 and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。scFv分子は、VH及びVL領域を、可動性ポリペプチドリンカーを用いて連結させることによって産生することができる。該scFv分子は、最適化された長さ及び/またはアミノ酸組成のリンカー(例えば、Ser-Glyリンカー)を含む。該リンカーの長さは、scFvの可変領域の折りたたみ方及び相互作用のし方に大きく影響し得る。実際、短いポリペプチドリンカーが用いられる場合(例えば、5~10アミノ酸)、鎖内の折りたたみは防止される。鎖間の折りたたみもまた、該2つの可変領域を一緒にして機能的エピトープ結合部位を形成するために必要である。いくつかの例では、該リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの例では、該長いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=2~4である。いくつかの例では、該リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの例では、該短いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=1~3である。リンカーの配向及びサイズの例については、例えば、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448,米国特許出願公開第2005/0100543号、第2005/0175606号、第2007/0014794号、ならびにPCT公開第WO2006/020258号、及び第WO2007/024715号を参照されたい。これらは参照することによって本明細書に組み込まれる。
242:423-426 and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。scFv分子は、VH及びVL領域を、可動性ポリペプチドリンカーを用いて連結させることによって産生することができる。該scFv分子は、最適化された長さ及び/またはアミノ酸組成のリンカー(例えば、Ser-Glyリンカー)を含む。該リンカーの長さは、scFvの可変領域の折りたたみ方及び相互作用のし方に大きく影響し得る。実際、短いポリペプチドリンカーが用いられる場合(例えば、5~10アミノ酸)、鎖内の折りたたみは防止される。鎖間の折りたたみもまた、該2つの可変領域を一緒にして機能的エピトープ結合部位を形成するために必要である。いくつかの例では、該リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの例では、該長いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=2~4である。いくつかの例では、該リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの例では、該短いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=1~3である。リンカーの配向及びサイズの例については、例えば、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448,米国特許出願公開第2005/0100543号、第2005/0175606号、第2007/0014794号、ならびにPCT公開第WO2006/020258号、及び第WO2007/024715号を参照されたい。これらは参照することによって本明細書に組み込まれる。
scFvは、そのVL及びVH領域間に約10、11、12、13、14、15、または15を超える残基のリンカーを含むことができる。該リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、該リンカー配列は、アミノ酸のグリシン及びセリンを含む。別の実施形態では、該リンカー配列は、(Gly4Ser)n等のグリシンとセリンの繰り返しの組を含み、この場合、nは1以上の正の整数である。1つの実施形態では、該リンカーは、(Gly4Ser)4または(Gly4Ser)3であり得る。該リンカーの長さの変動は、活性を保持または向上させる場合があり、活性研究における優れた有効性を生じさせる。いくつかの例では、該リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの例では、該長いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=2~4である。いくつかの例では、該リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの例では、該短いリンカー配列は、(G4S)nを含み、この場合n=1~3である。
安定性及び変異
抗CD19または抗BCMA結合ドメイン、例えば、scFv分子(例えば、可溶性scFv)の安定性は、従来の対照scFv分子または完全長抗体の生物物理学的特性(例えば、熱安定性)に関して評価することができる。1つの実施形態では、該ヒト化またはヒトscFvは、記載のアッセイにおいて、親のscFvより、約0.1、約0.25、約0.5、約0.75、約1、約1.25、約1.5、約1.75、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃、または約15℃高い熱安定性を有する。
抗CD19または抗BCMA結合ドメイン、例えば、scFv分子(例えば、可溶性scFv)の安定性は、従来の対照scFv分子または完全長抗体の生物物理学的特性(例えば、熱安定性)に関して評価することができる。1つの実施形態では、該ヒト化またはヒトscFvは、記載のアッセイにおいて、親のscFvより、約0.1、約0.25、約0.5、約0.75、約1、約1.25、約1.5、約1.75、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃、または約15℃高い熱安定性を有する。
該抗CD19または抗BCMA結合ドメイン、例えば、scFvの熱安定性の改良は、続いてCD19-TFP構築物全体にもたらされ、該抗CD19または抗BCMA TFP構築物の治療特性の改良につながる。該抗CD19または抗BCMA結合ドメイン、例えば、scFvの熱安定性は、従来の抗体と比較して少なくとも約2℃または3℃改良され得る。1つの実施形態では、該抗CD19または抗BCMA結合ドメイン、例えば、scFvは、従来の抗体と比較して1℃改良された熱安定性を有する。別の実施形態では、該抗CD19結合ドメイン、例えば、scFvは、従来の抗体と比較して2℃改良された熱安定性を有する。別の実施形態では、該scFvは、従来の抗体と比較して、4℃、5
℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、または15℃改良された熱安定性を有する。比較は、例えば、本明細書に開示のscFv分子と、該scFv VH及びVLが由来する抗体のscFv分子またはFabフラグメント間でなされ得る。熱安定性は、当技術分野で既知の方法を用いて測定することができる。例えば、1つの実施形態では、TMが測定され得る。TMの測定方法及びタンパク質の安定性の他の決定方法は、以下により詳しく記載される。
℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、または15℃改良された熱安定性を有する。比較は、例えば、本明細書に開示のscFv分子と、該scFv VH及びVLが由来する抗体のscFv分子またはFabフラグメント間でなされ得る。熱安定性は、当技術分野で既知の方法を用いて測定することができる。例えば、1つの実施形態では、TMが測定され得る。TMの測定方法及びタンパク質の安定性の他の決定方法は、以下により詳しく記載される。
scFvの変異(可溶性scFvのヒト化または直接突然変異誘発を介して生じる)は、該scFvの安定性を変化させ、該scFv及び該抗CD19または抗BCMA TFP構築物の全体的な安定性を改良する。ヒト化scFvの安定性は、TM、温度変性、及び温度凝集等の測定結果を用いて、マウスのscFvに対して比較される。1つの実施形態では、該抗CD19または抗BCMA結合ドメイン、例えば、scFvは、変異したscFvが該抗CD19 TFP構築物に改良された安定性を付与するように、該ヒト化過程から生じる少なくとも1つの変異を含む。別の実施形態では、該抗CD19結合ドメイン、例えば、scFvは、変異したscFvが該CD19-TFPまたはBCMA-TFP構築物に改良された安定性を付与するように、該ヒト化過程から生じる少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10の変異を含む。
1つの態様において、該TFPの抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗原結合ドメインのアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含み、該抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗CD19または抗BCMA抗体フラグメントの所望の機能特性を保持する。1つの特定の態様において、本発明のTFP組成物は、抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、その抗体フラグメントはscFvを含む。
様々な態様において、該TFPの抗原結合ドメインは、一方または両方の可変領域(例えば、VH及び/またはVL)内、例えば、1つ以上のCDR領域内、及び/または1つ以上のフレームワーク領域内の1つ以上のアミノ酸を修飾することによって改変される。1つの特定の態様において、本発明のTFP組成物は、抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、その抗体フラグメントはscFvを含む。
当業者には、本発明の抗体または抗体フラグメントがさらに、それらがアミノ酸配列の点で異なる(例えば、野生型から)が、所望の活性の点では変化しないように修飾されてもよいことが理解されよう。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換をもたらすさらなるヌクレオチド置換を該タンパク質に施してもよい。例えば、分子内の非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えてもよい。別の実施形態では、一連のアミノ酸を、側鎖ファミリーのメンバーの順序及び/または組成が異なる構造的に同様の一連のもので置き換えることができ、例えば、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる保存的置換が行われ得る。
同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列における同一性率は、同じである2つ以上の配列を指す。2つの配列が、最大一致のために比較ウィンドウ上、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いて、もしくはマニュアルアラインメント及び目視による調査で測
定される指定された領域で比較ならびに整列された場合、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合有するとき、2つの配列は「実質的に同一」である(例えば、特定の領域にわたって、または特定されていない場合、全配列にわたって60%同一、任意に70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一)。任意に、該同一性は、少なくとも長さ約50ヌクレオチド(または10アミノ酸)の領域にわたって、またはより好ましくは、長さ100~500もしくは1000以上のヌクレオチド(または20、50、200、もしくはそれ以上のアミノ酸)の領域にわたって存在する。
定される指定された領域で比較ならびに整列された場合、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合有するとき、2つの配列は「実質的に同一」である(例えば、特定の領域にわたって、または特定されていない場合、全配列にわたって60%同一、任意に70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一)。任意に、該同一性は、少なくとも長さ約50ヌクレオチド(または10アミノ酸)の領域にわたって、またはより好ましくは、長さ100~500もしくは1000以上のヌクレオチド(または20、50、200、もしくはそれ以上のアミノ酸)の領域にわたって存在する。
配列比較については、通常、1つの配列が参照配列の役割を果たし、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを用いてもよいし、別のパラメータを指定してもよい。該配列比較アルゴリズムは、その後、該プログラムパラメータに基づいて、該参照配列に対する該試験配列の配列同一性率を計算する。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、局所的相同性アルゴリズムのSmith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c、相同性アラインメントアルゴリズムのNeedleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443、類似法検索のPearson and Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA
85:2444、これらアルゴリズムのコンピュータによる実施(Wisconsin
Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,ウィスコンシン州マジソンにおいて、GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)、または、マニュアルアラインメント及び目視による調査(例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology参照)によって行うことができる。配列同一性及び配列類似性率の測定に適したアルゴリズムの2つの例は、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402;及びAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)によって公開されている。
85:2444、これらアルゴリズムのコンピュータによる実施(Wisconsin
Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,ウィスコンシン州マジソンにおいて、GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)、または、マニュアルアラインメント及び目視による調査(例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology参照)によって行うことができる。配列同一性及び配列類似性率の測定に適したアルゴリズムの2つの例は、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402;及びAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)によって公開されている。
1つの態様において、本発明は、機能的に等価な分子を産生する出発抗体またはフラグメント(例えば、scFv)のアミノ酸配列の修飾を企図する。例えば、TFPに含まれる抗CD19または抗BCMA結合ドメインのVHまたはVL、例えば、scFvは、該抗CD19結合ドメイン、例えば、scFvの出発VHまたはVLフレームワーク領域の少なくとも約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を保持するように修飾され得る。本発明は、全TFP構築物の修飾、例えば、機能的に等価な分子を産生するための該TFP構築物の様々なドメインの1つ以上のアミノ酸配列の修飾を企図する。該TFP構築物は、出発TFP構築物の少なくとも約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%
、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を保持するように修飾され得る。
、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を保持するように修飾され得る。
細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、天然または組み換え起源のいずれかから誘導され得る。該起源が天然の場合、該ドメインは、任意のタンパク質由来でよいが、具体的には膜結合または膜貫通タンパク質以外である。1つの態様において、該細胞外ドメインは、該膜貫通ドメインと会合することが可能である。本発明における特定の用途の細胞外ドメインは、例えば、T細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、またはCD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタ、または別の実施形態では、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154の少なくとも細胞外領域(複数可)を含み得る。
細胞外ドメインは、天然または組み換え起源のいずれかから誘導され得る。該起源が天然の場合、該ドメインは、任意のタンパク質由来でよいが、具体的には膜結合または膜貫通タンパク質以外である。1つの態様において、該細胞外ドメインは、該膜貫通ドメインと会合することが可能である。本発明における特定の用途の細胞外ドメインは、例えば、T細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、またはCD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタ、または別の実施形態では、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154の少なくとも細胞外領域(複数可)を含み得る。
膜貫通ドメイン
一般に、TFP配列は、単一のゲノム配列によってコードされる細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含む。別の実施形態では、TFPは、該TFPの細胞外ドメインに対して異種の膜貫通ドメインを含むように設計され得る。膜貫通ドメインは、該膜貫通領域に隣接した1つ以上のさらなるアミノ酸、例えば、該膜貫通が由来したタンパク質の細胞外領域に会合した1つ以上のアミノ酸(例えば、該細胞外領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または15までのアミノ酸)及び/または該膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と会合した1つ以上のさらなるアミノ酸(例えば、該細胞内領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または15までのアミノ酸)を含み得る。1つの態様において、該膜貫通ドメインは、該TFPの他のドメインの1つと会合しているものであり、使用される。いくつかの例では、該膜貫通ドメインは、かかるドメインが同じまたは異なる膜表面タンパク質の膜貫通ドメインに結合しないように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、選択またはアミノ酸置換で修飾され得る。1つの態様において、該膜貫通ドメインは、TFP-T細胞表面の別のTFPとホモ二量化することが可能である。異なる態様において、該膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じTFPに存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小にするために修飾または置換され得る。
一般に、TFP配列は、単一のゲノム配列によってコードされる細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含む。別の実施形態では、TFPは、該TFPの細胞外ドメインに対して異種の膜貫通ドメインを含むように設計され得る。膜貫通ドメインは、該膜貫通領域に隣接した1つ以上のさらなるアミノ酸、例えば、該膜貫通が由来したタンパク質の細胞外領域に会合した1つ以上のアミノ酸(例えば、該細胞外領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または15までのアミノ酸)及び/または該膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と会合した1つ以上のさらなるアミノ酸(例えば、該細胞内領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または15までのアミノ酸)を含み得る。1つの態様において、該膜貫通ドメインは、該TFPの他のドメインの1つと会合しているものであり、使用される。いくつかの例では、該膜貫通ドメインは、かかるドメインが同じまたは異なる膜表面タンパク質の膜貫通ドメインに結合しないように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、選択またはアミノ酸置換で修飾され得る。1つの態様において、該膜貫通ドメインは、TFP-T細胞表面の別のTFPとホモ二量化することが可能である。異なる態様において、該膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じTFPに存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小にするために修飾または置換され得る。
該膜貫通ドメインは、天然または組み換え起源のいずれかから誘導され得る。該起源が天然の場合、該ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質由来でよい。1つの態様において、該膜貫通ドメインは、該TFPが標的に結合している場合はいつでも、該細胞内ドメイン(複数可)にシグナル伝達することが可能である。本発明において、特定の用途の膜貫通ドメインは、例えば、T細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154の少なくとも膜貫通領域(複数可)を含み得る。
いくつかの例では、該膜貫通ドメインは、TFPの細胞外領域、例えば、TFPの抗原結合ドメインに、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジを介して取り付けることができる。例えば、1つの実施形態では、該ヒンジは、ヒト免疫グロブリン(Ig)のヒンジ、例えば、IgG4のヒンジ、またはCD8aのヒンジであり得る。
リンカー
任意に、長さ2~10アミノ酸の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーは、TFPの膜貫通ドメインと細胞質領域間の結合を形成し得る。グリシン-セリンダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。例えば、1つの態様において、該リンカーはGGGGSG
GGGS(配列番号3)のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(配列番号4)のヌクレオチド配列によってコードされる。
任意に、長さ2~10アミノ酸の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーは、TFPの膜貫通ドメインと細胞質領域間の結合を形成し得る。グリシン-セリンダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。例えば、1つの態様において、該リンカーはGGGGSG
GGGS(配列番号3)のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(配列番号4)のヌクレオチド配列によってコードされる。
細胞質ドメイン
TFPの細胞質ドメインは、該TFPがCD3ガンマ、デルタ、またはイプシロンポリペプチドを含む場合、細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。すなわち、TCRアルファ及びTCRベータサブユニットは、一般にシグナル伝達ドメインを欠いている。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、該TFPが導入されている免疫細胞の少なくとも1つの正常なエフェクター機能の活性化に関与する。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊な機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性であり得る。従って、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、該エフェクター機能のシグナルを伝達し、該細胞に特殊機能を行うように指示するタンパク質の部分を指す。通常全細胞内シグナル伝達ドメインが使用され得るが、多くの場合、全鎖を使用する必要はない。該細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が用いられる限りでは、かかる切断部分は、それがエフェクター機能のシグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに用いることができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、従って、該エフェクター機能のシグナルを伝達するのに十分な該細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含めることを意図されている。
TFPの細胞質ドメインは、該TFPがCD3ガンマ、デルタ、またはイプシロンポリペプチドを含む場合、細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。すなわち、TCRアルファ及びTCRベータサブユニットは、一般にシグナル伝達ドメインを欠いている。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、該TFPが導入されている免疫細胞の少なくとも1つの正常なエフェクター機能の活性化に関与する。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊な機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性であり得る。従って、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、該エフェクター機能のシグナルを伝達し、該細胞に特殊機能を行うように指示するタンパク質の部分を指す。通常全細胞内シグナル伝達ドメインが使用され得るが、多くの場合、全鎖を使用する必要はない。該細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が用いられる限りでは、かかる切断部分は、それがエフェクター機能のシグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに用いることができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、従って、該エフェクター機能のシグナルを伝達するのに十分な該細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含めることを意図されている。
本発明のTFPに用いる細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、同時に作用して、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始するT細胞受容体(TCR)及び共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体及び同じ機能を有する任意の組み換え配列が挙げられる。
TCRのみを介して生成されるシグナルは、ナイーブT細胞の完全な活性化には不十分であること、ならびに二次及び/または共刺激シグナルが必要であることが知られている。従って、ナイーブT細胞の活性化は、2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、すなわち、TCRを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)、及び、抗原非依存的様式で作用し、二次または共刺激シグナルを与えるもの(二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン)によって媒介されると言える。
一次シグナル伝達ドメインは、促進的方法または抑制的方法のいずれかで、TCR複合体の一次活性化を調節する。促進的な方法で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明において特に用いられる一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むITAMの例としては、CD3ゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及びCD66dのものが挙げられる。1つの実施形態では、本発明のTFPは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、CD3イプシロンの一次シグナル伝達ドメインを含む。1つの実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、変性ITAMドメイン、例えば、天然のITAMドメインと比較して、活性が変化(例えば、増加または減少)している変異ITAMドメインを含む。1つの実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、変性ITAM含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化された及び/または切断されたITAM含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれより多いITAMモチーフを含む。
TFPの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータシグナル伝達ドメインをそれ自
体で含むことも、本発明のTFPとの関連で有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメイン(複数可)と組み合わせることもできる。例えば、該TFPの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3イプシロン鎖部分及び共刺激シグナル伝達ドメインを含むことができる。
該共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むTFPの部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な反応に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。かかる分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及びCD83に特異的に結合するリガンド等が挙げられる。例えば、CD27の共刺激は、ヒトTFP-T細胞のインビトロでの増殖、エフェクター機能、及び生存率を向上させることが明らかにされており、インビボでのヒトT細胞の持続及び抗腫瘍活性を増大させる(Song et al. Blood. 2012;119(3):696-706)。
体で含むことも、本発明のTFPとの関連で有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメイン(複数可)と組み合わせることもできる。例えば、該TFPの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3イプシロン鎖部分及び共刺激シグナル伝達ドメインを含むことができる。
該共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むTFPの部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な反応に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。かかる分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及びCD83に特異的に結合するリガンド等が挙げられる。例えば、CD27の共刺激は、ヒトTFP-T細胞のインビトロでの増殖、エフェクター機能、及び生存率を向上させることが明らかにされており、インビボでのヒトT細胞の持続及び抗腫瘍活性を増大させる(Song et al. Blood. 2012;119(3):696-706)。
本発明のTFPの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムまたは特定の順序で互いに連結されている場合がある。任意に、例えば、長さ2~10アミノ酸(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸)の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーは細胞内シグナル伝達配列間の結合を形成し得る。
1つの実施形態では、グリシン-セリンダブレットが適切なリンカーとして使用され得る。1つの実施形態では、単一のアミノ酸,例えば、アラニン、グリシンが適切なリンカーとして使用され得る。
1つの態様において、本明細書に記載のTFP発現細胞は、さらに、第二のTFP、例えば、異なる抗原結合ドメイン、例えば、同じ標的(CD19もしくはBCMA)または異なる標的(例えば、CD123)に対するものを含む第二のTFPを含むことができる。1つの実施形態では、該TFP発現細胞が2つ以上の異なるTFPを含む場合、該異なるTFPの抗原結合ドメインは、該抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようにもなり得る。例えば、第一及び第二のTFPを発現する細胞は、第一のTFPの抗原結合ドメインを例えば、フラグメント、例えば、scFvとして有することができ、これは、第二のTFPの抗原結合ドメインと会合を形成しないものであり、例えば、該第二のTFPの抗原結合ドメインはVHHである。
別の態様では、本明細書に記載のTFP発現細胞は、さらに、別の作用物質、例えば、TFP発現細胞の活性を高める作用物質を発現することができる。例えば、1つの実施形態では、該作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質でありうる。抑制分子、例えば、PD1は、いくつかの実施形態では、TFP発現細胞の免疫エフェクター反応の開始能力を弱める場合がある。抑制分子の例としては、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、及びTGFRベータが挙げられる。1つの実施形態では、抑制分子を阻害する該作用物質は、第一のポリペプチド、例えば、陽性シグナルを細胞、例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインに与える第二のポリペプチドに会合した抑制分子を含む。1つの実施形態では、該作用物質は、第一のポリペプチド、例えば、PD1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4、及びTIGIT、またはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)等の抑制分子のもの、ならびに、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、4-1BB、CD27、またはCD28、例えば、本明細書に記載の)及び/または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載のCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む)である第二のポリペプチドを含む。1つの実
施形態では、該作用物質は、PD1の第一のポリペプチドまたはそのフラグメント(例えば、PD1の細胞外ドメインの少なくとも一部)、及び本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインの第二のポリペプチド(例えば、本明細書に記載のCD28シグナル伝達ドメイン及び/または本明細書に記載のCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。PD1は、CD28、CTLA-4、ICOS、及びBTLAも含む受容体のCD28ファミリーの抑制性メンバーである。PD-1は、活性化B細胞、T細胞、及び骨髄細胞上で発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。PD1に対する2つのリガンド、すなわち、PD-L1及びPD-L2が、PD1への結合時、T細胞の活性化を下方制御することが示された(Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34;Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8;Carter
et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1は、ヒトのがんに豊富に含まれている(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7;Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314;Konishi
et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、PD1とPD-L1の局所的相互作用を阻害することによって覆され得る。
施形態では、該作用物質は、PD1の第一のポリペプチドまたはそのフラグメント(例えば、PD1の細胞外ドメインの少なくとも一部)、及び本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインの第二のポリペプチド(例えば、本明細書に記載のCD28シグナル伝達ドメイン及び/または本明細書に記載のCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。PD1は、CD28、CTLA-4、ICOS、及びBTLAも含む受容体のCD28ファミリーの抑制性メンバーである。PD-1は、活性化B細胞、T細胞、及び骨髄細胞上で発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。PD1に対する2つのリガンド、すなわち、PD-L1及びPD-L2が、PD1への結合時、T細胞の活性化を下方制御することが示された(Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34;Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8;Carter
et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1は、ヒトのがんに豊富に含まれている(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7;Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314;Konishi
et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、PD1とPD-L1の局所的相互作用を阻害することによって覆され得る。
1つの実施形態では、該作用物質は、抑制分子の細胞外ドメイン(ECD)を含み、例えば、プログラム死1(Programmed Death 1)(PD1)は、膜貫通ドメインならびに任意に細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、41BB及びCD3ゼータと融合することができる(本明細書ではPD1 TFPとも呼ばれる)。1つの実施形態では、該PD1 TFPは、本明細書に記載の抗CD19 TFPと組み合わせて使用された場合、T細胞の持続性を向上させる。1つの実施形態では、TFPは、PD 1の細胞外ドメインを含むPD1 TFPである。選択的に、抗体または抗体フラグメント、例えば、プログラム死リガンド1(PD-L1)またはプログラム死リガンド2(PD-L2)に特異的に結合するscFvを含むTFPを提供する。
別の態様において、本発明は、TFP発現T細胞、例えば、TFP-T細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、該TFP発現T細胞の集団は、異なるTFPを発現する細胞の混合物を含む、例えば、1つの実施形態では、該TFP-T細胞の集団は、本明細書に記載の抗CD19または抗BCMA結合ドメインを有するTFPを発現する第一の細胞、及び異なる抗CD19または抗BCMA結合ドメイン、例えば、該第一の細胞によって発現されるTFP内の抗CD19結合ドメインとは異なる本明細書に記載の抗CD19または抗BCMA結合ドメインを含むことができる。別の例として、該TFP発現細胞の集団は、抗CD19または抗BCMA結合ドメイン、例えば、本明細書に記載のものを含むTFPを発現する第一の細胞、及びCD19やBCMA以外の標的(例えば、別の腫瘍関連抗原)に対する抗原結合ドメインを含むTFPを発現する第二の細胞を含むことができる。
別の態様において、本発明は、当該集団内の少なくとも1つの細胞が本明細書に記載の抗CD19または抗BCMA結合ドメインを有するTFPを発現する細胞の集団、及び別の作用物質、例えば、TFP発現細胞の活性を高める作用物質を発現する第二の細胞を提供する。例えば、1つの実施形態では、該作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子は、例えば、いくつかの実施形態では、TFP発現細胞の免疫エフェクター反応の開始能力を弱める場合がある。抑制分子の例としては、PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、及びTGFRベータが挙げられる。1つの実施形態では、抑制分子を阻害する該作用物質は、第一のポリペプチド、例えば、陽性シグナルを細胞、例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインに与える第二のポリペプチドに
会合した抑制分子を含む。
会合した抑制分子を含む。
TFPをコードするインビトロで転写されたRNAの産生方法を本明細書に開示する。また、本発明は、細胞に直接トランスフェクトすることができるTFPをコードするRNA構築物を含む。トランスフェクションに用いるmRNAの生成方法は、特別に設計されたプライマーでの鋳型のインビトロ転写(IVT)に続いてポリA付加を含んで、3’及び5’非翻訳配列(「UTR」)、5’キャップ、及び/または配列内リボソーム進入部位(IRES)、発現される核酸、及び通常は50~2000塩基の長さのポリA尾部を含む構築物を産生することができる。このようにして産生されたRNAは、異なる種類の細胞を効率的にトランスフェクトすることができる。1つの態様において、該鋳型は、TFPに対する配列を含む。
1つの態様において、該抗CD19または抗BCMA TFPは、メッセンジャーRNA(mRNA)によってコードされる。1つの態様において、該抗CD19または抗BCMA TFPをコードするmRNAは、TFP-T細胞の産生のため、T細胞に導入される。1つの実施形態では、該インビトロで転写されたRNA TFPは、一過性トランスフェクションとして細胞に導入され得る。該RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で生成される鋳型を用いたインビトロ転写によって産生される。任意の起源由来の目的のDNAは、PCRによってインビトロmRNA合成用の鋳型に、適切なプライマー及びRNAポリメラーゼを用いて直接変換することができる。該DNAの起源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列、または任意の他の適切なDNA起源でよい。インビトロ転写用の所望の鋳型は、本発明のTFPである。1つの実施形態では、PCRに使用されるDNAは、オープンリーディングフレームを含む。該DNAは、有機体のゲノム由来の天然DNA配列由来でよい。1つの実施形態では、該核酸は、5’及び/または3’非翻訳領域(UTR)の一部または全部を含み得る。該核酸はエキソン及びイントロンを含み得る。1つの実施形態では、PCRに使用されるDNAは、ヒト核酸配列である。別の実施形態では、PCRに使用されるDNAは、5’及び3’UTRを含むヒト核酸配列である。該DNAは、代替的に、天然に存在する有機体で通常発現されない人工DNA配列でよい。例示的な人口DNA配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するために合わせて連結される遺伝子の部分を含むものである。合わせて連結されるDNAの該部分は、単一の有機体由来でも、複数の有機体由来でもよい。
PCRを用いて、トランスフェクションに用いられるmRNAのインビトロ転写用の鋳型を生成する。PCRの実施方法は、当技術分野で周知である。PCR用のプライマーは、該PCR用の鋳型として用いられるDNAの領域に実質的に相補的な領域を有するように設計される。本明細書で用いられる、「実質的に相補的」とは、プライマー配列における塩基の大部分もしくはすべてが相補的である、または、1つ以上の塩基が非相補的、もしくは不一致であるヌクレオチド配列を指す。実質的に相補的な配列は、PCRに用いられるアニーリング条件下で、アニーリングまたは目的のDNA標的とのハイブリッド形成が可能である。該プライマーは、DNA鋳型の任意の部分と実質的に相補的になるように設計され得る。例えば、該プライマーは、細胞内で通常転写される核酸(オープンリーディングフレーム)の部分を5’及び3’UTRを含めて増幅するように設計され得る。また、該プライマーは、目的の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するように設計することもできる。1つの実施形態では、該プライマーは、ヒトcDNAのコード領域を5’及び3’UTRのすべてまたは一部を含めて増幅するように設計される。PCRに有用なプライマーは、当技術分野で周知の合成方法によって産生され得る。「フォワードプライマー」は、増幅されるDNA配列の上流であるDNA鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」は、コード鎖に関して増幅されるDNA配列に対する5の位置を指すために本明細書で用いられる。「リバー
スプライマー」は、増幅されるDNA配列の下流である二本鎖DNA鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」は、コード鎖に関して増幅されるDNA配列に対する3’の位置を指すために本明細書で用いられる。
スプライマー」は、増幅されるDNA配列の下流である二本鎖DNA鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」は、コード鎖に関して増幅されるDNA配列に対する3’の位置を指すために本明細書で用いられる。
PCRに有用な任意のDNAポリメラーゼを本明細書に開示の方法に用いることができる。当該試薬とポリメラーゼは、複数の供給源から市販されている。
安定性及び/または翻訳効率を促進する能力がある化学構造も用いることができる。該RNAは、好ましくは5’及び3’UTRを有する。1つの実施形態では、該5’UTRは、1~3000ヌクレオチドの長さである。コード領域に付加される5’及び3’UTR配列の長さは、当該UTRの異なる領域にアニーリングするPCR用のプライマー設計を含むがこれに限定されない異なる方法によって変更することができる。この方法を用いて、当業者は、転写されたRNAのトランスフェクションに続いて、最適な翻訳効率を達成するために必要な5’及び3’UTRの長さを変更することができる。
該5’及び3’UTRは、目的の核酸に対する天然に存在する内因性5’及び3’UTRであってよい。別の方法として、目的の核酸にとって内因性でないUTR配列を、該UTR配列をフォワード及びリバースプライマーに組み込むことによって、または当該鋳型の任意の他の修飾によって付加することができる。目的の核酸にとって内因性でないUTR配列の使用は、該RNAの安定性及び/または翻訳効率を変更するために有用な場合がある。例えば、3’UTR配列内のAUリッチ領域は、mRNAの安定性を弱め得ることが知られている。従って、3’UTRは、当技術分野で周知のUTRの特性に基づいて、転写されたRNAの安定性を高めるように選択または設計され得る。
1つの実施形態では、該5’UTRは、内因性核酸のコザック配列を含み得る。別の方法として、目的の核酸にとって内因性でない5’UTRが上記の通りPCRによって付加される場合、コンセンサスコザック配列は、該5’UTR配列の付加によって再設計され得る。コザック配列は、いくつかのRNA転写産物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするためにすべてのRNAに必要であるとは思われない。多くのmRNAに対するコザック配列の必要性は当技術分野で知られている。他の実施形態では、該5’UTRは、そのRNAゲノムが細胞内で安定であるRNAウイルスの5’UTRであってよい。他の実施形態では、該3’または5’UTRに様々なヌクレオチド類似体を用いて当該mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨げることができる。
遺伝子クローニングを必要とせずに、DNA鋳型からのRNA合成を可能にするために、転写プロモーターが転写される配列の上流のDNA鋳型に取り付けられるべきである。RNAポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの5’末端に付加される場合、該RNAポリメラーゼのプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のPCR産物に取り込まれる。1つの好ましい実施形態では、該プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載されるT7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、T3及びSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。T7、T3、及びSP6プロモーターに対するコンセンサスヌクレオチド配列は、当技術分野で知られている。
好ましい実施形態では、mRNAは、5’末端のキャップ及び3’ポリ(A)尾部の両方を有し、これらは細胞内でのmRNAのリボソーム結合、転写の開始、及び安定性を決定する。環状DNA鋳型、例えば、プラスミドDNA上で、RNAポリメラーゼは、真核細胞での発現に適さない長い鎖状体産物を産生する。3’UTRの末端で線形化したプラスミドDNAの転写で、通常のサイズのmRNAができるが、これが転写後にポリアデニル化されても、真核生物のトランスフェクションには有効ではない。
線状DNA鋳型上で、ファージT7 RNAポリメラーゼは、該転写産物の3’末端を該鋳型の最後の塩基を越えて延長することができる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985);Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。
DNA鋳型内へのポリA/Tストレッチの従来の統合法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドDNA内に統合されたポリA/T配列は、プラスミドの不安定性の原因となるため、細菌の細胞由来のプラスミドDNA鋳型は、多くの場合、欠失及び他の異常によって高度に不純である。このことが、クローニング法を面倒で時間がかかるだけでなく、しばしば信頼できないものにする。そのようなわけで、クローニングすることなくポリA/T3’ストレッチを備えたDNA鋳型の構築を可能にする方法が非常に望ましい。
転写DNA鋳型のポリA/Tセグメントは、ポリT尾部、例えば、100T尾部(サイズは50~5000Tでよい)を含むリバースプライマーを用いてPCRの過程で、または、DNA連結反応もしくはインビトロ組み換えを含むがこれに限定されない任意の他の方法によるPCR後に産生され得る。ポリ(A)尾部はまた、RNAに安定性をもたらし、それらの分解を減少させる。一般に、ポリ(A)尾部の長さは、転写されたRNAの安定性と正の相関がある。1つの実施形態では、該ポリ(A)尾部は、100~5000アデノシンである。
RNAのポリ(A)尾部は、ポリ(A)ポリメラーゼ、例えば、E. coliのポリAポリメラーゼ(E-PAP)を用いてインビトロ転写後にさらに延長され得る。1つの実施形態では、ポリ(A)尾部の長さを100ヌクレオチドから300~400ヌクレオチドまで増加させることは、当該RNAの翻訳効率において約2倍の増加をもたらす。さらに、3’末端への異なる化学基の連結は、mRNAの安定性を増加させうる。かかる連結は、変性/人口ヌクレオチド、アプタマー、及び他の化合物を含むことができる。例えば、ポリ(A)ポリメラーゼを用いて、該ポリ(A)尾部にATP類似体を組み入れることができる。ATP類似体は、さらに当該RNAの安定性を高める。
5’キャップを付けることは、同様にRNA分子に安定性をもたらす。好ましい実施形態では、本明細書に開示の方法で産生されるRNAは、5’キャップを含む。5’キャップは、当技術分野で知られているとともに本明細書に記載される技術を用いて提供される(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001);Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001);Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966
(2005))。
(2005))。
本明細書に開示の方法によって産生されるRNAは、配列内リボソーム進入部位(IRES)の配列も含むことができる。該IRES配列は、任意のウイルス、染色体、または人工的に設計された配列でよく、これがmRNAに対するキャップ非依存性リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促す。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、酸化防止剤、及び界面活性剤等の、細胞の透過性及び生存能力を促進する因子を含み得る細胞のエレクトロポレーションに適した任意の溶質を含めることができる。
RNAは、複数の異なる方法、例えば、エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems、ドイツ、ケルン))、
(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments、マサチューセッツ州ボストン)、もしくはGene Pulser II(BioRad、コロラド州デンバー)、Multiporator(Eppendort、ドイツ、ハンブルク)、リポフェクションを用いたカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクション、または微粒子銃粒子送達システム、例えば、「遺伝子銃」(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)が挙げられるがこれらに限定されない商業的に利用可能な方法のいずれかを用いて、標的細胞に導入することができる。
(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments、マサチューセッツ州ボストン)、もしくはGene Pulser II(BioRad、コロラド州デンバー)、Multiporator(Eppendort、ドイツ、ハンブルク)、リポフェクションを用いたカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクション、または微粒子銃粒子送達システム、例えば、「遺伝子銃」(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)が挙げられるがこれらに限定されない商業的に利用可能な方法のいずれかを用いて、標的細胞に導入することができる。
TFPをコードする核酸構築物
本発明は、本明細書に記載の1つ以上のTFP構築物をコードする核酸分子もまた提供する。1つの態様において、該核酸分子は、メッセンジャーRNA転写物として提供される。1つの態様において、該核酸分子は、DNA構築物として提供される。
本発明は、本明細書に記載の1つ以上のTFP構築物をコードする核酸分子もまた提供する。1つの態様において、該核酸分子は、メッセンジャーRNA転写物として提供される。1つの態様において、該核酸分子は、DNA構築物として提供される。
所望の分子をコードする核酸配列は、当技術分野で知られている組み換え法を用いて、例えば、該遺伝子を発現する細胞のライブラリのスクリーニングによって、それを含むことが知られているベクターから当該遺伝子を抽出することによって、またはそれを含む細胞及び組織から直接単離することによって、標準的な技術を用いて得ることができる。別の方法として、目的の遺伝子は、クローンではなく、合成的に産生することができる。
本発明は、本発明のDNAが挿入されるベクターもまた提供する。レンチウイルス等のレトロウイルス由来のベクターは、それらが長期間にわたる安定した導入遺伝子の統合及び娘細胞におけるその増殖を可能にするため、長期間にわたる遺伝子導入を達成するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、それらが肝細胞等の非増殖性細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルス等のオンコレトロウイルス由来のベクターより追加された利点を有する。それらはまた、追加された低免疫原性の利点を有する。
別の実施形態では、本発明の所望のTFPをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(A5/35)である。別の実施形態では、TFPをコードする核酸の発現は、スリーピングビューティー、クリスパー(crisper)、CAS9、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ等のトランスポゾンを用いて達成され得る。下記参照June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
本発明の発現構築物は、標準的な遺伝子導入プロトコルを用いて核酸免疫付与及び遺伝子治療にも用いることができる。遺伝子導入方法は、当技術分野で知られている(例えば、米国特許第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号参照。参照することによってそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。別の実施形態では、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
該核酸は、複数のタイプのベクターにクローニングされ得る。例えば、該核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドが挙げられるがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に重要であるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが含まれる。
さらに、該発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えばSambrook et al.,
2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY)、ならびに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの有機体で機能する複製起点、プロモーター配列、都合の良い制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1つ以上の選択マーカーを含む(例えば、WO01/96584;WO01/29058;及び米国特許第6,326,193号)。
2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY)、ならびに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの有機体で機能する複製起点、プロモーター配列、都合の良い制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1つ以上の選択マーカーを含む(例えば、WO01/96584;WO01/29058;及び米国特許第6,326,193号)。
複数のウイルスベースの系が、哺乳類細胞への遺伝子導入用に開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子導入系に都合の良いプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、ベクターに挿入され、当技術分野で知られている技術を用いてレトロウイルス粒子内に包装され得る。該組み換えウイルスは次に単離され、インビボまたはエキソビボのいずれかで、目的の細胞に導入され得る。複数のレトロウイルス系が当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが用いられる。複数のアデノウイルスベクターが当技術分野で知られている。1つの実施形態では、レンチウイルスベクターが用いられる。
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。通常、これらは、開始部位の30~110bp上流の領域に位置しているが、複数のプロモーターが該開始部位の下流に同様に機能要素を含むことが示されている。要素が互いに反転または互いに連動される場合にプロモーターの機能が保存されるように、プロモーター要素間の間隔にはしばしば柔軟性がある。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターにおいて、プロモーター要素間の間隔は、活性が低下し始める前に50bp離れるまで増加し得る。プロモーターに応じて、個々の要素は、協調的または独立的に機能して転写を活性化し得ると思われる。
哺乳類のT細胞においてTFP導入遺伝子を発現することが可能なプロモーターの例は、EF1aプロモーターである。天然EF1aプロモーターは、アミノアシルtRNAのリボソームへの酵素的導入に関与する伸長因子1複合体のアルファサブユニットの発現を動作させる。該EF1aプロモーターは、哺乳類の発現プラスミドに広く用いられており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からのTFP発現を動作させるのに有効であることが示されている(例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)参照)。プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を動作させることができる強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳がんウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の長い末端反復(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに、ヒト遺伝子のプロモーター、例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子1aプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない他の構成的プロモーター配列もまた使用され得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されないものとする。誘導性プロモーターもまた本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を、かかる発現が望まれる場合にオンにすること、または発現が望まれない場合には該発現をオフにすることが可能な分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオネイン(metallothioni
ne)プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリン調節プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
ne)プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリン調節プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
TFPポリペプチドまたはその一部の発現を評価するため、細胞に導入される発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含んで、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとする細胞の集団からの発現細胞の特定及び選択を容易にすることができる。他の態様において、該選択マーカーは、DNAの別々の片上に担持され、同時トランスフェクション法に用いられる場合がある。選択マーカーとレポーター遺伝子の両方が、当該宿主細胞内での発現を可能にするために適切な調節配列に隣接されてもよい。有用な選択マーカーとしては、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子、例えば、neo等が挙げられる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を特定するため、及び調節配列の機能を評価するために用いられる。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの有機体または組織内に含まれない、またはこれらによって発現されず、その発現が、多少容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、当該DNAが当該レシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリフォスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS
Letters 479: 79-82)。適切な発現系は周知であり、既知の技術を用いて調製しても、商業的に入手してもよい。一般に、最も高いレポーター遺伝子の発現レベルを示す最小の5’隣接領域を備えた構築物は、プロモーターとして特定される。かかるプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーターに動作される転写を調節する能力について作用物質を評価するために使用され得る。
Letters 479: 79-82)。適切な発現系は周知であり、既知の技術を用いて調製しても、商業的に入手してもよい。一般に、最も高いレポーター遺伝子の発現レベルを示す最小の5’隣接領域を備えた構築物は、プロモーターとして特定される。かかるプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーターに動作される転写を調節する能力について作用物質を評価するために使用され得る。
細胞内に遺伝子を導入及び発現させる方法は、当技術分野で知られている。発現ベクターとの関連では、該ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳類、細菌、酵母、または昆虫の細胞に、当技術分野の任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、該発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に移植することができる。
宿主細胞内へポリヌクレオチドを導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が含まれる。ベクター及び/または外因性核酸を含む細胞の産生方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes
1-4, Cold Spring Harbor Press, NY参照)。宿主細胞内へのポリヌクレオチドの導入のための好ましい方法は、リン酸カルシウム法である。
1-4, Cold Spring Harbor Press, NY参照)。宿主細胞内へのポリヌクレオチドの導入のための好ましい方法は、リン酸カルシウム法である。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための生物学的方法には、DNA及びRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳類、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く用いられる方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス等から誘導され得る(例えば、米国特許第5,350,674号及び第5,585,362号参照。
宿主細胞内へポリヌクレオチドを導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例
えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含めた脂質ベースの系が含まれる。インビトロ及びインビボでの送達媒体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。他の最先端の核酸の標的化送達、例えば、標的化ナノ粒子または他の適切なサブミクロンサイズの送達システムでのポリヌクレオチドの送達が利用可能である。
えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含めた脂質ベースの系が含まれる。インビトロ及びインビボでの送達媒体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。他の最先端の核酸の標的化送達、例えば、標的化ナノ粒子または他の適切なサブミクロンサイズの送達システムでのポリヌクレオチドの送達が利用可能である。
非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞内への核酸の導入(インビトロ、エキソビボ、またはインビボ)を企図する。別の態様において、該核酸は、脂質と会合され得る。脂質に会合した核酸は、リポソームの水性内部に封入、リポソームの脂質二重層内に散在、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方に会合した連結分子を介してリポソームに付着、リポソーム内に封入、リポソームと複合化、脂質含有溶液に分散、脂質と混合、脂質と統合、脂質中に懸濁液として含有、ミセルとともに含有もしくは複合化、または他の場合には脂質と会合され得る。脂質、脂質/DNA、または脂質/発現ベクター関連組成物は、溶液中でいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それらは二層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在してもよい。それらはまた、単に溶液に散在されてもよく、サイズも形も均一でない凝集体を形成すると思われる。脂質は、脂肪性の物質であり、天然に存在する脂質でも合成脂質でもよい。例えば、脂質には、細胞質に天然に存在する脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドを含む化合物のクラスが含まれる。
使用に適した脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、ミズーリ州セントルイスSigmaから入手可能であり;リン酸ジセチル(「DCP」)は、K & K Laboratories(ニューヨーク州プレーンビュー)から入手可能であり;コレステロール(「Choi」)は、Calbiochem-Behringから入手可能であり;ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)及び他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.(アラバマ州バーミングハム)から入手され得る。脂質のクロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中での原液は、約-20℃で保存され得る。クロロホルムは、メタノールより容易に蒸発するため、唯一の溶媒として用いられる。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される様々な単層または多重膜の脂質媒体を包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重膜及び内側の水性媒体を備えた小胞構造を有することを特徴とし得る。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁された場合に自然に生じる。該脂質成分は、自己再編成を経て、閉鎖構造を形成し、当該脂質二重層間に水及び溶解した溶質を封入する(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、通常の小胞構造とは溶液中での構造が異なる組成物も包含される。例えば、該脂質は、ミセル構造をとってもよいし、単に脂質分子の不均一な凝集体として存在してもよい。リポフェクタミン・核酸複合体もまた企図される。
宿主細胞内へ外因性核酸を導入するのに用いられる方法、または他の場合には本発明の阻害剤に細胞を暴露するのに用いられる方法にかかわらず、宿主細胞内での組み換えDNA配列の存在を確認するために様々なアッセイが行われ得る。かかるアッセイとしては、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザン及びノーザンブロット法、RT-PCR、及びPCR;「生化学的」アッセイ、例えば、特定のペプチドの有無を例えば、免疫学的手段(ELISA及びウェスタンブロット法)によって、または本明細書に記載のアッセイによって検出し、本発明の範囲に含まれる作用物質を特定することが挙げられる。
本発明はさらに、TFPをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。1つの態様において、TFPベクターは、細胞、例えば、T細胞に直接導入することができる。1つの態様において、該ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば、1つ以上のプラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体)、レトロウイルスベクター構築物及びレンチウイルスベクター構築物が挙げられるがこれらに限定されないベクターである。1つの態様において、該ベクターは、哺乳類のT細胞でTFP構築物を発現することが可能である。1つの態様において、該哺乳類のT細胞は、ヒトT細胞である。
T細胞源
増殖及び遺伝子組み換えに先立って、T細胞源を対象から採取する。用語「対象」は、免疫反応が誘発され得る生体(例えば、哺乳類)を含むことが意図されている。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含めた複数の起源から採取することができる。本発明の特定の態様において、当技術分野で入手可能な様々なT細胞株が用いられる場合がある。本発明の特定の態様において、T細胞は、当業者に知られる様々な技術、例えば、Ficoll(商標)分離を用いて対象から採取された血液の単位から得ることができる。1つの好ましい態様において、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって採取される。該アフェレーシス産物は、通常、T細胞を含めたリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球細胞、赤血球、及び血小板を含む。1つの態様において、アフェレーシスによって採取された細胞は、血漿画分を除去し、該細胞をその後の処理段階に適切な緩衝液または媒体に配するために洗浄され得る。本発明の1つの態様において、該細胞はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄される。別の態様において、該洗浄液は、カルシウムを欠いており、かつ、マグネシウムを欠く場合も2価カチオンのすべてではないがその多くを欠く場合もある。カルシウムの非存在下での最初の活性化段階は、活性化の拡大につながり得る。当業者には容易に理解されるように、洗浄段階は当業者に知られる方法によって、例えば、半自動の「フロースルー」遠心分離(例えば、Cobe 2991セルプロセッサー、Baxter CytoMate、またはHaemonetics Cell Saver 5)を用いて、メーカーの指示に従って達成され得る。洗浄後、細胞を様々な生体適合性緩衝液、例えば、CaフリーでMgフリーのPBS、PlasmaLyte A、または、緩衝液を含むもしくは含まない他の生理食塩水に再懸濁され得る。別の方法として、該アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を直接培地に再懸濁してもよい。
増殖及び遺伝子組み換えに先立って、T細胞源を対象から採取する。用語「対象」は、免疫反応が誘発され得る生体(例えば、哺乳類)を含むことが意図されている。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含めた複数の起源から採取することができる。本発明の特定の態様において、当技術分野で入手可能な様々なT細胞株が用いられる場合がある。本発明の特定の態様において、T細胞は、当業者に知られる様々な技術、例えば、Ficoll(商標)分離を用いて対象から採取された血液の単位から得ることができる。1つの好ましい態様において、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって採取される。該アフェレーシス産物は、通常、T細胞を含めたリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球細胞、赤血球、及び血小板を含む。1つの態様において、アフェレーシスによって採取された細胞は、血漿画分を除去し、該細胞をその後の処理段階に適切な緩衝液または媒体に配するために洗浄され得る。本発明の1つの態様において、該細胞はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄される。別の態様において、該洗浄液は、カルシウムを欠いており、かつ、マグネシウムを欠く場合も2価カチオンのすべてではないがその多くを欠く場合もある。カルシウムの非存在下での最初の活性化段階は、活性化の拡大につながり得る。当業者には容易に理解されるように、洗浄段階は当業者に知られる方法によって、例えば、半自動の「フロースルー」遠心分離(例えば、Cobe 2991セルプロセッサー、Baxter CytoMate、またはHaemonetics Cell Saver 5)を用いて、メーカーの指示に従って達成され得る。洗浄後、細胞を様々な生体適合性緩衝液、例えば、CaフリーでMgフリーのPBS、PlasmaLyte A、または、緩衝液を含むもしくは含まない他の生理食塩水に再懸濁され得る。別の方法として、該アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を直接培地に再懸濁してもよい。
1つの態様において、T細胞は、赤血球を溶解し、単球を、例えば、PERCOLL(商標)勾配を介した遠心分離によって、または向流遠心水簸によって、枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。T細胞の特定の亜集団、例えば、CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、及びCD45RO+T細胞をさらに、正のまたは負の選択技術によって単離することができる。例えば、1つの態様において、T細胞は、抗CD3/抗CD28(例えば、3×28)結合ビーズ、例えば、DYNABEADS(商標)M-450 CD3/CD28 Tとともに、所望のT細胞の正の選択に十分な期間インキュベートすることによって単離される。1つの態様において、該期間は、約30分である。さらなる態様において、該期間は30分から36時間またはそれ以上及びその間のすべての整数値に及ぶ。さらなる態様において、該期間は、少なくとも1、2、3、4、5、または6時間である。さらに別の好ましい態様において、該期間は、10~24時間である。1つの態様において、該インキュベート期間は、24時間である。腫瘍組織または免疫不全の個体から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を単離するような、他の細胞型と比較してT細胞が少ない任意の状況でT細胞を単離するために、より長いイン
キュベート時間を用いてもよい。さらに、より長いインキュベート時間を用いることで、CD8+T細胞の捕捉の効率を高めることができる。従って、T細胞を該CD3/CD28ビーズに結合させる時間を単に短縮または延長することによって、及び/またはT細胞に対する該ビーズの割合を増加または減少させる(本明細書にさらに記載される)ことによって、T細胞の亜集団が優先的に培養開始時または当該工程の他の時点で選択または反選択され得る。さらに、該ビーズもしくは他の表面上で抗CD3及び/または抗CD28抗体の比を増加もしくは減少させることによって、T細胞の亜集団は、優先的に培養開始時または他の所望の時点で選択または反選択され得る。当業者であれば、本発明の中で複数の選択期間もまた使用することができることが認められよう。特定の態様において、該選択手順を行い、「選択されていない」細胞を活性化及び増殖工程で用いることが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞は、さらなる選択期間に供することもできる。
キュベート時間を用いてもよい。さらに、より長いインキュベート時間を用いることで、CD8+T細胞の捕捉の効率を高めることができる。従って、T細胞を該CD3/CD28ビーズに結合させる時間を単に短縮または延長することによって、及び/またはT細胞に対する該ビーズの割合を増加または減少させる(本明細書にさらに記載される)ことによって、T細胞の亜集団が優先的に培養開始時または当該工程の他の時点で選択または反選択され得る。さらに、該ビーズもしくは他の表面上で抗CD3及び/または抗CD28抗体の比を増加もしくは減少させることによって、T細胞の亜集団は、優先的に培養開始時または他の所望の時点で選択または反選択され得る。当業者であれば、本発明の中で複数の選択期間もまた使用することができることが認められよう。特定の態様において、該選択手順を行い、「選択されていない」細胞を活性化及び増殖工程で用いることが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞は、さらなる選択期間に供することもできる。
負の選択によるT細胞集団の濃縮は、負に選択された細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組合せを用いて達成することができる。1つの方法は、負に選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを用いる負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーを介した細胞選別及び/または選択である。例えば、負の選択によってCD4+細胞を濃縮するためには、モノクローナル抗体カクテルは通常、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、及びCD8に対する抗体を含む。特定の態様において、通常CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、及びFoxP3+を発現する調節性T細胞を濃縮または正に選択することが望ましい場合がある。別の方法として、特定の態様において、調節性T細胞は、抗C25結合ビーズまたは他の同様の選択方法によって枯渇される。
1つの実施形態では、IFN-γ、TNF-アルファ、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、グランザイムB、及びパーフォリン、または他の適切な分子、例えば、他のサイトカインのうちの1つ以上を発現するT細胞集団が選択され得る。細胞発現のスクリーニング方法は、例えば、PCT公開第WO2013/126712号に記載の方法によって、決定することができる。
正または負の選択による所望の細胞集団の単離のため、細胞濃度及び表面(例えば、ビーズ等の粒子)は変更され得る。特定の態様において、ビーズと細胞が混合される体積を大幅に減少させ(例えば、細胞濃度を増加させ)、細胞とビーズを最大に接触させることが望ましい場合がある。例えば、1つの態様において、20億個の細胞/mLの濃度が用いられる。1つの態様において、10億個の細胞/mLの濃度が用いられる。さらなる態様において、1億個超の細胞/mLが用いられる。さらなる態様において、1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万、または5000万個の細胞/mLの細胞濃度が用いられる。さらに1つの態様において、7500万、8000万、8500万、9000万、9500万、または1億個の細胞/mLからの細胞濃度が用いられる。さらなる態様において、1億2500万または1億5000万個の細胞/mLの濃度を用いることができる。高濃度の使用は、細胞収率、細胞活性化、及び細胞増殖の増加をもたらすことができる。さらに、高細胞濃度の使用は、目的の標的抗原の発現が弱い可能性がある細胞、例えば、CD28陰性T細胞、または多くの腫瘍細胞が存在する試料(例えば、白血病血液、腫瘍組織等)からの細胞のより効率的な捕捉を可能にする。かかる細胞集団は、治療的価値を有する場合があり、得ることが望ましい。例えば、高細胞濃度の使用は、通常CD28の発現が弱いCD8+T細胞のより効率的な選択を可能にする。
関連する態様において、より低濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。T細胞と表面(例えば、ビーズ等の粒子)の混合物を大幅に希釈することによって、該粒子と細胞間の相互作用が最小化される。これは、該粒子に結合される所望の抗原を豊富に発現
する細胞を選択する。例えば、CD4+T細胞は高レベルのCD28を発現し、希釈濃度において、CD8+T細胞より効率的に捕捉される。1つの態様において、使用される細胞濃度は5×106/mLである。他の態様において、使用される濃度は約1×105/mL~1×106/mL、及びその間の任意の整数値であり得る。他の態様において、該細胞は、回転装置上で様々な長さの時間、様々な速度で、2~10℃または室温のいずれかでインキュベートされ得る。
する細胞を選択する。例えば、CD4+T細胞は高レベルのCD28を発現し、希釈濃度において、CD8+T細胞より効率的に捕捉される。1つの態様において、使用される細胞濃度は5×106/mLである。他の態様において、使用される濃度は約1×105/mL~1×106/mL、及びその間の任意の整数値であり得る。他の態様において、該細胞は、回転装置上で様々な長さの時間、様々な速度で、2~10℃または室温のいずれかでインキュベートされ得る。
刺激用のT細胞は、洗浄段階の後、凍結させることもできる。理論に拘束されることを望むものではないが、凍結及びそれに続く解凍段階は、当該細胞集団の顆粒球及びある程度の単球を除去することによってより均一な産物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄段階の後、該細胞は、凍結溶液に懸濁され得る。多くの凍結溶液及びパラメータが当技術分野で知られており、これに関して有用であるが、1つの方法は、20%DMSO及び8%ヒト血清アルブミンを含むPBS、または、10%デキストラン40及び5%デキストロース、20%ヒト血清アルブミン及び7.5%DMSO、もしくは31.25%Plasmalyte-A、31.25%デキストロース5%、0.45%NaCl、10%デキストラン40及び5%デキストロース、20%ヒト血清アルブミン、ならびに7.5%DMSOを含む培地、または例えば、Hespan及びPlasmaLyte Aを含む他の適切な細胞凍結媒体の使用を含み、該細胞をその後-80℃に毎分1の速度で凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相で保存する。他の制御凍結法は、-20℃でのまたは液体窒素中での制御されていない即時凍結と同様に使用され得る。特定の態様において、凍結保存細胞は、本明細書に記載の通り解凍及び洗浄され、室温で1時間静置され、その後本発明の方法を用いて活性化される。
本発明の中で同様に企図されるのは、本明細書に記載の増殖細胞が必要とされる前の期間における対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の採取である。従って、増殖される細胞源は、任意の必要な時点で採取され、所望の細胞、例えば、T細胞は、T細胞療法で恩恵を受ける様々な疾患または状態、例えば、本明細書に記載のそれらのためのT細胞療法における後の使用のために単離及び凍結される。1つの態様において、血液試料またはアフェレーシスは、概して健康な対象から採取される。特定の態様において、血液試料またはアフェレーシスは、疾患の発症の危険性があるがまだ発病していない概して健康な対象から採取し、目的の細胞を後の使用のために単離及び凍結する。特定の態様において、該T細胞は、増殖され、凍結され、その後使用され得る。特定の態様において、試料は、本明細書に記載の特定の疾患の診断の直後で、いずれかの治療の前の患者から採取される。さらなる態様において、該細胞は、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及びFK506、抗体、または他の免疫消失薬、例えば、CAMPATH、抗CD3抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、ならびに放射線照射等の薬剤での治療が挙げられるがこれに限定されない様々な関連する治療法に先立って、対象からの血液試料またはアフェレーシスから単離される。
本発明のさらなる態様において、T細胞は、当該対象に機能的T細胞を残す治療の後に、患者から直接採取される。その点について、特定のがん治療の後、免疫系に損傷を与える薬物での特定の治療において、治療の直後、患者が当該治療から通常回復する期間に、得られたT細胞の品質は、エキソビボでのそれらの増殖能が最適であるか、または改善されている可能性がある。同様に、本明細書に記載の方法を用いたエキソビボ操作の後、これらの細胞は、生着及びインビボ増殖の向上に好ましい状態にあり得る。従って、本発明の中に、T細胞を含めた血液細胞、樹状細胞、または造血系の他の細胞をこの回復期に採取することが企図される。さらに、特定の態様において、動員(例えば、GM-CSFでの動員)及び前処置レジメンを用いて、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び/ま
たは増殖が促進される対象における、特に治療後の所定の時間窓での条件を作成することができる。例示的な細胞型としては、T細胞、B細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
たは増殖が促進される対象における、特に治療後の所定の時間窓での条件を作成することができる。例示的な細胞型としては、T細胞、B細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
T細胞の活性化及び増殖
T細胞は、例えば、米国特許第6,352,694号;第6,534,055号;第6,905,680号;第6,692,964号;第5,858,358号;第6,887,466号;第6,905,681号;第7,144,575号;第7,067,318号;第7,172,869号;第7,232,566号;第7,175,843号;第5,883,223号;第6,905,874号;第6,797,514号;第6,867,041号;及び米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を用いて通常活性化及び増殖され得る。
T細胞は、例えば、米国特許第6,352,694号;第6,534,055号;第6,905,680号;第6,692,964号;第5,858,358号;第6,887,466号;第6,905,681号;第7,144,575号;第7,067,318号;第7,172,869号;第7,232,566号;第7,175,843号;第5,883,223号;第6,905,874号;第6,797,514号;第6,867,041号;及び米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を用いて通常活性化及び増殖され得る。
一般に、本発明のT細胞は、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する作用物質を付着された表面及び該T細胞の表面の共刺激分子を刺激するリガンドとの接触によって増殖され得る。特に、T細胞集団は、本明細書に記載の通り、例えば、抗CD3抗体もしくはその抗原結合フラグメント、もしくは表面に固定化された抗CD2抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと組み合わせてプロテインキナーゼC活性化剤(例えば、ブリオスタチン)との接触によって刺激され得る。T細胞表面のアクセサリー分子の共刺激に対しては、該アクセサリー分子に結合するリガンドが用いられる。例えば、T細胞集団は、該T細胞の増殖を刺激するために適切な条件下、抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触され得る。CD4+T細胞またはCD8+T細胞のいずれかの増殖を刺激するためには、抗CD3抗体及び抗CD28抗体。抗CD28抗体の例としては、9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone、フランス、ブザンソン)が挙げられ、当技術分野で一般に知られる他の方法を用いてもよい(Berg et al.、Transplant Proc. 30(8):3975-3977、1998;Haanen et al.、J. Exp. Med. 190(9):13191328、1999;Garland et al.、J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63、1999)。
多様な刺激時間に曝露されたT細胞は、異なる特性を呈し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスで得られた末梢血の単核細胞産物は、ヘルパーT細胞集団(TH、CD4+)を有し、これは細胞傷害性やサプレッサーT細胞集団(TC、CD8+)より多い。CD3及びCD28受容体を刺激することによるT細胞のエキソビボでの増殖は、約8~9日目より前には、主にTH細胞からなるT細胞集団を産生するが、約8~9日目より後は、T細胞集団は次第に増加するTC細胞集団を含む。従って、治療の目的に応じて、主にTH細胞を含むT細胞集団を対象に注入することが有利な場合がある。同様に、抗原特異的なTC細胞のサブセットが単離された場合、このサブセットをさらに増殖させることが有益な場合がある。
さらに、CD4及びCD8のマーカーに加えて、該細胞増殖工程において、他の表現型のマーカーは大きく変化するが、大部分は再現性がよい。従って、かかる再現性が、活性化T細胞産物を特定の目的用に調整する能力を可能にする。
抗CD19または抗BCMA TFPが構築されると、様々なアッセイを用いて該分子の活性、例えば、抗原刺激後のT細胞を増殖する能力、再刺激の非存在下でT細胞増殖を維持する能力、及び適切なインビトロ及び動物モデルでの抗がん活性等であるがこれらに限定されない活性を評価することができる。抗CD19または抗BCMA TFPの効果を評価するアッセイは、以下にさらに詳細に説明する。
一次T細胞におけるTFP発現のウェスタンブロット分析を用いて、モノマー及びダイマーの存在を検出することができる(例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照)。極めて簡潔には、該TFPを発現するT細胞(CD4+とCD8+T細胞の1:1混合物)を、インビトロで10日より長く増殖させ、その後溶解し還元条件でSDS-PAGEに供する。TFPは、TCR鎖に対する抗体を用いてウェスタンブロット法によって検出される。同じT細胞のサブセットを、非還元条件でのSDS-PAGE分析に用い共有結合ダイマーの生成の評価を可能にする。
抗原刺激後のTFP+T細胞のインビトロでの増殖は、フローサイトメトリーで測定することができる。例えば、CD4+及びCD8+T細胞の混合物を、アルファCD3/アルファCD28及びAPCで刺激し、その後分析されるプロモーターの制御下で、GFPを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。例示的なプロモーターとしては、CMV IE遺伝子、EF-1アルファ、ユビキチンC、またはホスホグリセロキナーゼ(PGK)プロモーターが挙げられる。GFPの蛍光は、CD4+及び/またはCD8+T細胞のサブセット中での培養の6日目に、フローサイトメトリーによって評価される(例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照)。別の方法として、CD4+及びCD8+T細胞の混合物をアルファCD3/アルファCD28被覆磁気ビーズで0日目に刺激し、1日目に、TFPを発現するバイシストロニックなレンチウイルスベクターを用い、eGFPとともに、2Aリボソームスキッピング配列を用いてTFPで形質導入する。培養物を洗浄後、CD19+K562細胞(K562-CD19)、野生型K562細胞(K562野生型)、または抗CD3及び抗CD28抗体の存在下でhCD32及び4-1BBLを発現するK562細胞(K562-BBL3/28)のいずれかで再刺激する。外因性IL-2を該培養物に1日おきに100IU/mLで添加する。GFP+T細胞は、ビーズに基づく計数を用いてフローサイトメトリーによって数えられる(例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照)。
再刺激の非存在下で持続するTFP+T細胞の増殖もまた測定することができる(例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照)。簡潔には、アルファCD3/アルファCD28被覆磁気ビーズで0日目に刺激し、指示されたTFPで1日目に形質導入した後、培養の8日目に、平均T細胞体積(fl)をCoulter Multisizer III粒子計測器を用いて測定する。
動物モデルを用いてTFP-T活性を測定することもできる。例えば、免疫不全マウスにおいて初代ヒトプレB ALLを治療するためのヒトCD19特異的TFP+T細胞を用いた異種移植モデルを用いることができる(例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照)。極めて簡潔には、ALLの定着後、マウスを治療群に応じてランダム化する。異なる数の改変T細胞を1:1の比でB-ALLを有するNOD/SCID/γ-/-マウスに同時注入する。マウス由来の脾臓DNAにおける各ベクターのコピー数を、T細胞の注入後の様々な時点で評価する。動物を1週間間隔で白血病について評価する。末梢血CD19+B-ALL芽細胞数を、アルファCD19-ゼータTFP+T細胞またはmock形質導入T細胞を注入されたマウスで測定する。これらの群についての生存曲線を、ログランク検定を用いて比較する。さらに、NOD/SCID/γ-/-マウスにおけるT細胞注入の4週間後の末梢血CD4+及びCD8+T細胞の絶対数も分析することができる。マウスに白血病細胞を注入し、3週間後、eGFPに連結されたTFPをコードするバイシストロニックなレンチウイルスベクターによって、TFPを発現するように改変
されたT細胞を注入する。T細胞は、注入に先立って、mock形質導入細胞と混合することによって、45~50%入力GFP+T細胞に正規化され、フローサイトメトリーによって確認される。動物を1週間間隔で白血病について評価する。TFP+T細胞群についての生存曲線を、ログランク検定を用いて比較する。
されたT細胞を注入する。T細胞は、注入に先立って、mock形質導入細胞と混合することによって、45~50%入力GFP+T細胞に正規化され、フローサイトメトリーによって確認される。動物を1週間間隔で白血病について評価する。TFP+T細胞群についての生存曲線を、ログランク検定を用いて比較する。
用量依存的なTFP治療反応が評価され得る(例えば、Milone et al.,
Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照)。例えば、末梢血を、21日目にTFP T細胞、もしくは同数のmock形質導入T細胞を注入した、またはT細胞を注入しないマウスにおいて、白血病の成立後35~70日で採取する。35日目及び49日目に、末梢血CD19+ALL芽細胞数の測定のため、各群のマウスをランダムに採血し、その後殺処分する。残りの動物は57日目及び70日目に評価する。
Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照)。例えば、末梢血を、21日目にTFP T細胞、もしくは同数のmock形質導入T細胞を注入した、またはT細胞を注入しないマウスにおいて、白血病の成立後35~70日で採取する。35日目及び49日目に、末梢血CD19+ALL芽細胞数の測定のため、各群のマウスをランダムに採血し、その後殺処分する。残りの動物は57日目及び70日目に評価する。
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価は、以前に例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)で記載されている。簡潔には、TFP媒介増殖の評価は、マイクロタイタープレートにて、洗浄したT細胞を、CD19を発現するK562細胞(K19)またはCD32及びCD137を発現するK562細胞(KT32-BBL)と、最終的なT細胞:K562比が2:1になるように混合することによって行われる。K562細胞には、使用に先立ってガンマ線を照射する。抗CD3(クローンOKT3)及び抗CD28(クローン9.3)モノクローナル抗体を、KT32-BBL細胞との培養物に加えてT細胞増殖刺激用陽性対照とする。これは、これらのシグナルが長期的なCD8+T細胞のエキソビボでの増殖を裏付けるためである。T細胞は、CountBright(商標)蛍光ビーズ(Invitrogen)及びフローサイトメトリーを用いて培養下でメーカーの記載通りに数える。TFP+T細胞は、eGFP-2Aが連結されたTFP発現レンチウイルスベクターで改変されたT細胞を用いてGFPの発現によって特定される。GFPを発現しないTFP+T細胞については、該TFP+T細胞は、ビオチン化組み換えCD19タンパク質及び二次アビジン・PE複合体で検出される。T細胞上でのCD4+及びCD8+の発現は、特定のモノクローナル抗体(BD Biosciences)でも同時に検出される。サイトカインの測定は、再刺激の24時間後に採取された上清にて、ヒトTH1/TH2サイトカインサイトメトリービーズアレイキット(BD Biosciences)を用い、メーカーの指示に従って行う。蛍光は、FACScaliburフローサイトメーターを用いて評価し、データはメーカーの指示に従って分析する。
細胞傷害性は、標準的な51Cr放出アッセイによって評価することができる(例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8):
1453-1464 (2009)参照)。簡潔には、標的細胞(K562系列及び初代プロB-ALL細胞)に、37℃で2時間、頻繁に攪拌しながら51Cr(NaCrO4として、New England Nuclear)をロードし、これを完全RPMIで2度洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターT細胞を、該ウェル内で、完全RPMI中で標的細胞と、様々なエフェクター細胞:標的細胞(E:T)比で混合する。培地のみを含む(自然放出、SR)または界面活性剤トリトン-X100の1%溶液を含む(総放出、TR)さらなるウェルも用意する。37℃で4時間の培養後、各ウェルから上清を採取する。放出された51Crをその後ガンマパーティクルカウンター(Packard Instrument Co.、マサチューセッツ州ウォルサム)を用いて測定する。各条件を少なくとも3連で行い、溶解率を式:溶解%=(ER-SR)/(TR-SR)を用いて計算する。式中、ERは各実験条件についての51Cr放出の平均を表す。
1453-1464 (2009)参照)。簡潔には、標的細胞(K562系列及び初代プロB-ALL細胞)に、37℃で2時間、頻繁に攪拌しながら51Cr(NaCrO4として、New England Nuclear)をロードし、これを完全RPMIで2度洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターT細胞を、該ウェル内で、完全RPMI中で標的細胞と、様々なエフェクター細胞:標的細胞(E:T)比で混合する。培地のみを含む(自然放出、SR)または界面活性剤トリトン-X100の1%溶液を含む(総放出、TR)さらなるウェルも用意する。37℃で4時間の培養後、各ウェルから上清を採取する。放出された51Crをその後ガンマパーティクルカウンター(Packard Instrument Co.、マサチューセッツ州ウォルサム)を用いて測定する。各条件を少なくとも3連で行い、溶解率を式:溶解%=(ER-SR)/(TR-SR)を用いて計算する。式中、ERは各実験条件についての51Cr放出の平均を表す。
画像技術を用いて、腫瘍を有する動物モデルにおけるTFPの特異的輸送及び増殖を評
価することができる。かかるアッセイは、例えば、Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)に記載されている。簡潔には、NOD/SCID/γc-/-(NSG)マウスに、Nalm-6細胞に続いて7日後、TFP構築物でのエレクトロポレーションの4時間後にT細胞を静注する。該T細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現させるためにレンチウイルス構築物を安定的にトランスフェクトされ、マウスは生物発光に対して撮像される。別の方法として、Nalm-6異種移植モデルにおけるTFP+T細胞の単回注射の治療効果及び特異性は以下の通りに測定することができる:NSGマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入したNalm-6を注射し、続いて7日後にCD19 TFPをエレクトロポレーションしたT細胞を単回尾静脈注射する。動物を注射後の様々な時点で撮像する。例えば、代表的なマウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病光子密度ヒートマップを5日目(処置の2日前)及び8日目(TFP+PBLの24時間後)に生成することができる。
価することができる。かかるアッセイは、例えば、Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)に記載されている。簡潔には、NOD/SCID/γc-/-(NSG)マウスに、Nalm-6細胞に続いて7日後、TFP構築物でのエレクトロポレーションの4時間後にT細胞を静注する。該T細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現させるためにレンチウイルス構築物を安定的にトランスフェクトされ、マウスは生物発光に対して撮像される。別の方法として、Nalm-6異種移植モデルにおけるTFP+T細胞の単回注射の治療効果及び特異性は以下の通りに測定することができる:NSGマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入したNalm-6を注射し、続いて7日後にCD19 TFPをエレクトロポレーションしたT細胞を単回尾静脈注射する。動物を注射後の様々な時点で撮像する。例えば、代表的なマウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病光子密度ヒートマップを5日目(処置の2日前)及び8日目(TFP+PBLの24時間後)に生成することができる。
本明細書の実施例の節に記載のものならびに当技術分野で既知のものを含めた他のアッセイもまた、本発明の抗CD19または抗BCMA TFP構築物を評価するために用いることができる。
治療への応用
CD19またはBCMA関連疾患及び/または障害
1つの態様において、本発明は、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患の治療方法を提供する。1つの態様において、本発明は、腫瘍の一部がCD19またはBCMAに対して陰性であり、腫瘍の一部がCD19またはBCMAに対して陽性である疾患の治療方法を提供する。例えば、本発明のTFPは、CD19またはBCMAの発現の上昇を伴う疾患の治療を受けた対象の治療に有用であり、この場合、CD19またはBCMAのレベルの上昇の治療を受けた該対象は、CD19またはBCMAのレベルの上昇を伴う疾患を呈する。
CD19またはBCMA関連疾患及び/または障害
1つの態様において、本発明は、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患の治療方法を提供する。1つの態様において、本発明は、腫瘍の一部がCD19またはBCMAに対して陰性であり、腫瘍の一部がCD19またはBCMAに対して陽性である疾患の治療方法を提供する。例えば、本発明のTFPは、CD19またはBCMAの発現の上昇を伴う疾患の治療を受けた対象の治療に有用であり、この場合、CD19またはBCMAのレベルの上昇の治療を受けた該対象は、CD19またはBCMAのレベルの上昇を伴う疾患を呈する。
1つの態様において、本発明は、哺乳類のT細胞での発現用のプロモーターに作動可能に連結された抗CD19またはBCMA TFPを含むベクターに関する。1つの態様において、本発明は、CD19またはBCMAを発現する腫瘍の治療用のCD19またはBCMA TFPを発現する組み換えT細胞を提供し、該CD19またはBCMA TFPを発現する組み換えT細胞は、CD19またはBCMA TFP-Tと呼ばれる。1つの態様において、本発明のCD19またはBCMA TFP-Tは、該TFP-Tが腫瘍細胞を標的とし、該腫瘍の成長が阻害されるように、腫瘍細胞を、その表面で発現する少なくとも1つの本発明のCD19またはBCMA TFPと接触させることが可能である。
1つの態様において、本発明は、CD19またはBCMAを発現する腫瘍細胞の成長の阻害方法であって、該TFP-Tが抗原に反応して活性化され、がん細胞を標的化し、該腫瘍の成長が阻害されるように、該腫瘍細胞を本発明のCD19またはBCMA TFP-T細胞と接触させることを含む方法に関する。
1つの態様において、本発明は、対象におけるがんの治療方法に関する。該方法は、該がんが該対象において治療されるように、本発明のCD19またはBCMA TFP-T細胞を該対象に投与することを含む。本発明のCD19またはBCMA TFP-T細胞で治療可能ながんの例は、CD19またはBCMAの発現を伴うがんである。1つの態様において、CD19またはBCMAの発現を伴う該がんは血液がんである。1つの態様において、該血液がんは、白血病またはリンパ腫である。1つの態様において、CD19の発現を伴うがんには、例えば、B細胞急性リンパ性白血病(「BALL」)、T細胞急性リンパ性白血病(「TALL」)、急性リンパ性白血病(ALL)が挙げられるがこれら
に限定されない例えば1つ以上の急性白血病;例えば、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)が挙げられるがこれらに限定されない1つ以上の慢性白血病が挙げられるがこれらに限定されないがん及び悪性腫瘍が挙げられる。CD19またはBCMAの発現を伴うさらなるがんまたは血液疾患としては、例えば、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに骨髄の血液細胞の無効な産生(または異形成)によってまとめられる様々な血液疾患の集まりである「前白血病」等が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患としては、例えば、非定型及び/または非古典的がん、悪性腫瘍、CD19もしくはBCMAの発現を伴う前がん状態または増殖性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。
に限定されない例えば1つ以上の急性白血病;例えば、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)が挙げられるがこれらに限定されない1つ以上の慢性白血病が挙げられるがこれらに限定されないがん及び悪性腫瘍が挙げられる。CD19またはBCMAの発現を伴うさらなるがんまたは血液疾患としては、例えば、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに骨髄の血液細胞の無効な産生(または異形成)によってまとめられる様々な血液疾患の集まりである「前白血病」等が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患としては、例えば、非定型及び/または非古典的がん、悪性腫瘍、CD19もしくはBCMAの発現を伴う前がん状態または増殖性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、CD19またはBCMA TFP、例えば、本明細書に記載のもので治療され得るがんは、多発性骨髄腫である。多発性骨髄腫は、血液のがんであり、骨髄での形質細胞クローンの蓄積を特徴とする。多発性骨髄腫に対する現行の治療は、サリドマイド類似体であるレナリドミドでの治療が挙げられるがこれに限定されない。レナリドミドは、抗腫瘍活性、血管形成阻害、及び免疫修飾を含む活性を有する。一般に、骨髄腫細胞は、フローサイトメトリーによって、CD19またはBCMAの発現に対して陰性であると考えられている。本発明は、骨髄腫の腫瘍細胞の数パーセントがCD19またはBCMAを発現することの認識を包含する。従って、いくつかの実施形態では、C19またはBCMA TFP、例えば、本明細書に記載のものは、骨髄腫細胞を標的化するために使用され得る。いくつかの実施形態では、CD19またはBCMA TFP治療は、1つ以上のさらなる治療、例えば、レナリドミド治療と組み合わせて使用され得る。
本発明は、T細胞がTFPを発現するように遺伝子組み換えされ、該TFP発現T細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、一種の細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を死滅させることが可能である。抗体療法と異なり、TFP発現T細胞は、インビボで複製することが可能であり、長期持続をもたらし、それが腫瘍の持続的制御につながり得る。様々な態様において、患者に投与された該T細胞、またはそれらの後代は、患者に該T細胞を投与後、少なくとも4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、13ヶ月、14ヶ月、15ヶ月、16ヶ月、17ヶ月、18ヶ月、19ヶ月、20ヶ月、21ヶ月、22ヶ月、23ヶ月、2年、3年、4年、または5年間、当該患者内で存続する。
また、本発明は、T細胞が、TFPを一過性に発現するために、例えば、インビトロで転写されたRNAによって改変され、該TFP発現T細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、一種の細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を死滅させることが可能である。従って、様々な態様において、患者に投与された該T細胞は、患者に該T細胞を投与後、1ヶ月未満、例えば、3週間、2週間、または1週間存在する。
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、該TFP発現T細胞によって誘発される抗腫瘍免疫反応は、能動でも受動免疫反応でもよく、代替的に、直接対間接免疫反応によってもよい。1つの態様において、該TFPを形質導入したT細胞は、該CD19またはBCMA抗原を発現するヒトがん細胞に反応して特定の炎症性サイトカイン分泌及び強力な細胞溶解反応を呈し、可溶性CD19またはBCMA阻害に耐性であり、バイスタンダー殺傷を媒介し、定着したヒト腫瘍の退行を媒介する。例えば、CD1
9を発現するまたはBCMAを発現する腫瘍の異種フィールド内の抗原のない腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性がん細胞にすでに反応しているCD19再指向性またはBCMA再指向性T細胞による間接的な破壊に対して敏感である可能性がある。
9を発現するまたはBCMAを発現する腫瘍の異種フィールド内の抗原のない腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性がん細胞にすでに反応しているCD19再指向性またはBCMA再指向性T細胞による間接的な破壊に対して敏感である可能性がある。
1つの態様において、本発明のヒトTFP改変T細胞は、哺乳類における、エキソビボでの免疫付与及び/またはインビボ治療用の一種のワクチンであり得る。1つの態様において、該哺乳類はヒトである。
エキソビボでの免疫付与に関しては、該細胞を哺乳類に投与する前に、以下のうちの少なくとも1つがインビトロで行われる:i)該細胞の増殖、ii)TFPをコードする核酸を該細胞に導入する、またはiii)該細胞の凍結保存。
エキソビボ手順は、当技術分野で周知であり、以下により詳細に論じる。簡潔には、細胞を哺乳類(例えば、ヒト)から単離し、本明細書に開示のTFPを発現するベクターで遺伝子組み換えする(すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクトする)。該TFPで改変された細胞を哺乳類レシピエントに投与し、治療効果を得ることができる。該哺乳類レシピエントは、ヒトでよく、該TFPで改変された細胞は、該レシピエントに関して自己移植の場合がある。別の方法として、該細胞は、該レシピエントに関して同種異系、同系、または異種の場合がある。
造血幹及び前駆細胞のエキソビボでの増殖手順は、参照することによって本明細書に組み込まれる米国特許第5,199,942号に記載されており、本発明の細胞に適用することができる。他の適切な方法は当技術分野で知られており、従って、本発明は、該細胞の任意の特定のエキソビボでの増殖方法に限定されない。簡潔には、T細胞のエキソビボでの培養及び増殖は:(1)末梢血採取または骨髄外植片から、哺乳類由来のCD34+造血幹及び前駆細胞を採取し;(2)かかる細胞をエキソビボで増殖させることを含む。米国特許第5,199,942号に記載の細胞増殖因子に加えて、flt3-L、IL-1、IL-3、及びc-kitリガンド等の他の因子を該細胞の培養及び増殖のために用いることができる。
エキソビボでの免疫付与において、細胞ベースのワクチンの使用に加えて本発明は、患者の抗原に対する免疫反応を誘発するインビボでの免疫付与のための組成物及び方法もまた提供する。
一般に、本明細書に記載の活性化及び増殖された細胞は、免疫不全の個体で生じる疾患の治療及び予防に利用され得る。特に、本発明のTFPで改変されたT細胞は、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患、障害、及び状態の治療に用いられる。特定の態様において、本発明の細胞は、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患、障害、及び状態を発症する危険性がある患者の治療に用いられる。従って、本発明は、治療有効量の本発明のTFPで改変されたT細胞を、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患、障害、及び状態の治療または予防を必要とする対象に投与することを含む、該治療または予防のための方法を提供する。
1つの態様において、本発明のTFP-T細胞は、がんや悪性腫瘍などの増殖性疾患、または骨髄異形成、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病などの前がん状態の治療に使用され得る。1つの態様において、該がんは血液がんである。1つの態様において、該血液がんは、白血病またはリンパ腫である。1つの態様において、本発明のTFP-T細胞は、例えば、B細胞急性リンパ性白血病(「BALL」)、T細胞急性リンパ性白血病(「TALL」)、急性リンパ性白血病(ALL)が挙げられるがこれらに限定されない例えば急性白血病;例えば、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)が
挙げられるがこれらに限定されない1つ以上の慢性白血病;例えば、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに骨髄の血液細胞の無効な産生(または異形成)によってまとめられる様々な血液疾患の集まりである「前白血病」等が挙げられるがこれらに限定されないさらなる血液がんまたは血液疾患等であるがこれらに限定されないがん及び悪性腫瘍を治療するために使用され得る。さらに、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患としては、例えば、非定型及び/または非古典的がん、悪性腫瘍、CD19もしくはBCMAを発現する前がん状態または増殖性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。CD19またはBCMAの発現を伴う非がん関連の適応症としては、例えば、自己免疫疾患(例えば、狼瘡)、炎症性疾患(アレルギー及び喘息)、ならびに移植が挙げられるがこれらに限定されない。
挙げられるがこれらに限定されない1つ以上の慢性白血病;例えば、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに骨髄の血液細胞の無効な産生(または異形成)によってまとめられる様々な血液疾患の集まりである「前白血病」等が挙げられるがこれらに限定されないさらなる血液がんまたは血液疾患等であるがこれらに限定されないがん及び悪性腫瘍を治療するために使用され得る。さらに、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患としては、例えば、非定型及び/または非古典的がん、悪性腫瘍、CD19もしくはBCMAを発現する前がん状態または増殖性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。CD19またはBCMAの発現を伴う非がん関連の適応症としては、例えば、自己免疫疾患(例えば、狼瘡)、炎症性疾患(アレルギー及び喘息)、ならびに移植が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明のTFPで改変されたT細胞は、単独で投与しても、希釈剤及び/または他の成分、例えば、IL-2もしくは他のサイトカイン、または細胞集団と組み合わせて医薬組成物として投与してもよい。
血液がん
血液がん疾患は、白血病及び悪性リンパ増殖性疾患等の、血液、骨髄、ならびにリンパ系に影響を与える種類のがんである。
血液がん疾患は、白血病及び悪性リンパ増殖性疾患等の、血液、骨髄、ならびにリンパ系に影響を与える種類のがんである。
白血病は、急性白血病と慢性白血病に分類することができる。急性白血病は、さらに急性骨髄性白血病(AML)及び急性リンパ性白血病(ALL)として分類することができる。慢性白血病には、慢性骨髄性白血病(CML)及び慢性リンパ性白血病(CLL)が含まれる。他の関連する疾患としては、骨髄の血液細胞の無効な産生(または異形成)及びAMLへの転換の危険性によってまとめられる様々な血液疾患の集まりである骨髄異形成症候群(MDS、かつて「前白血病」として知られていた)が挙げられる。
本発明は、がんの治療用の組成物及び方法を提供する。1つの態様において、該がんは、白血病またはリンパ腫が挙げられるがこれに限定されない血液がんである。1つの態様において、本発明のTFP-T細胞は、例えば、B細胞急性リンパ性白血病(「BALL」)、T細胞急性リンパ性白血病(「TALL」)、急性リンパ性白血病(ALL)が挙げられるがこれらに限定されない例えば急性白血病;例えば、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)が挙げられるがこれらに限定されない1つ以上の慢性白血病;例えば、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに骨髄の血液細胞の無効な産生(または異形成)によってまとめられる様々な血液疾患の集まりである「前白血病」等が挙げられるがこれらに限定されないさらなる血液がんまたは血液疾患等であるがこれらに限定されないがん及び悪性腫瘍を治療するために使用され得る。さらに、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患としては、例えば、非定型及び/または非古典的がん、悪性腫瘍、CD19もしくはBCMAを発現する前がん状態または増殖性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。
また、本発明は、CD19またはBCMAを発現する細胞集団の増殖を阻害、または該集団を減少させる方法であって、CD19またはBCMAを発現する細胞を含む細胞集団
を、CD19またはBCMAを発現する細胞に結合する本発明の抗CD19または抗BCMA TFP-T細胞と接触させることを含む方法を提供する。特定の態様において、本発明は、CD19またはBCMAを発現するがん細胞集団の増殖を阻害、または該集団を減少させる方法であって、CD19またはBCMAを発現するがん細胞集団を、CD19またはBCMAを発現する細胞に結合する本発明の抗CD19または抗BCMA TFP-T細胞と接触させることを含む方法を提供する。1つの態様において、本発明は、CD19またはBCMAを発現するがん細胞集団の増殖を阻害、または該集団を減少させる方法であって、CD19またはBCMAを発現するがん細胞集団を、CD19またはBCMAを発現する細胞に結合する本発明の抗CD19または抗BCMA TFP-T細胞と接触させることを含む方法を提供する。特定の態様において、本発明の抗CD19または抗BCMA TFP-T細胞は、細胞及び/またはがん細胞の分量、数、量、または割合を、骨髄性白血病または他のCD19またはBCMAを発現する細胞に関連するがんを有する対象またはそれに対する動物モデルにおいて、陰性対照と比較して、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも65%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、または少なくとも99%低下させる。1つの態様において、該対象はヒトである。
を、CD19またはBCMAを発現する細胞に結合する本発明の抗CD19または抗BCMA TFP-T細胞と接触させることを含む方法を提供する。特定の態様において、本発明は、CD19またはBCMAを発現するがん細胞集団の増殖を阻害、または該集団を減少させる方法であって、CD19またはBCMAを発現するがん細胞集団を、CD19またはBCMAを発現する細胞に結合する本発明の抗CD19または抗BCMA TFP-T細胞と接触させることを含む方法を提供する。1つの態様において、本発明は、CD19またはBCMAを発現するがん細胞集団の増殖を阻害、または該集団を減少させる方法であって、CD19またはBCMAを発現するがん細胞集団を、CD19またはBCMAを発現する細胞に結合する本発明の抗CD19または抗BCMA TFP-T細胞と接触させることを含む方法を提供する。特定の態様において、本発明の抗CD19または抗BCMA TFP-T細胞は、細胞及び/またはがん細胞の分量、数、量、または割合を、骨髄性白血病または他のCD19またはBCMAを発現する細胞に関連するがんを有する対象またはそれに対する動物モデルにおいて、陰性対照と比較して、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも65%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、または少なくとも99%低下させる。1つの態様において、該対象はヒトである。
また、本発明は、CD19またはBCMAを発現する細胞に関連する疾患(例えば、CD19またはBCMAを発現する血液がんまたは非定型がん)を予防、治療、及び/または管理する方法であって、必要とする対象に対して、CD19またはBCMAを発現する細胞に結合する本発明の抗CD19または抗BCMA TFP-T細胞を投与することを含む方法を提供する。1つの態様において、該対象はヒトである。CD19またはBCMAを発現する細胞に関連する疾患の非限定的な例としては、自己免疫疾患(狼瘡等)、炎症性疾患(アレルギー及び喘息等)、ならびにがん(血液がんまたはCD19もしくはBCMAを発現する非定型がん等)が挙げられる。
また、本発明は、CD19またはBCMAを発現する細胞に関連する疾患を予防、治療、及び/または管理する方法であって、必要とする対象に対して、CD19またはBCMAを発現する細胞に結合する本発明の抗CD19または抗BCMA TFP-T細胞を投与することを含む方法を提供する。1つの態様において、該対象はヒトである。
本発明は、CD19またはBCMAを発現する細胞に関連するがんの再発の予防方法であって、それを必要とする対象に対して、CD19またはBCMAを発現する細胞に結合する本発明の抗CD19または抗BCMA TFP-T細胞を投与することを含む方法を提供する。1つの態様において、該方法は、それを必要とする対象に対して、CD19またはBCMAを発現する細胞に結合する本明細書に記載の抗CD19または抗BCMA TFP-T細胞の有効量を別の治療の有効量と組み合わせて投与することを含む。
併用療法
本明細書に記載のTFP発現細胞は、他の既知の薬剤及び治療と組み合わせて使用してもよい。本明細書で用いられる、「組み合わせて」投与されるとは、対象に対して、2つ(またはそれ以上)の異なる治療が、該対象の疾患の苦痛の過程において送達されること、例えば、該2つ以上の治療が、該対象が該障害と診断された後、該障害が治癒もしくは除去される前、または治療が他の理由のために中止される前に送達されることを意味する。いくつかの実施形態では、投与に関して重複があるように、1つの治療の送達は、第二の送達の開始時に依然として行われている。これは、本明細書では「同時」または「同時送達」と呼ばれる場合がある。他の実施形態では、1つの治療の送達は、他方の治療の送達の開始前に終了する。いずれかの場合のいくつかの実施形態では、該治療は、併用投与のためにより効果的である。例えば、該第二の治療はより効果的であり、例えば、該第一の治療なしで該第二の治療が施される場合に見られるより、より少ない該第二の治療で同
等の効果が見られるか、または、該第二の治療は症状を大幅に減少させ、類似の状況は該第一の治療でも見られる。いくつかの実施形態では、送達は、症状、または、障害に関連する他のパラメータの減少が、他方の非存在下で送達される1つの治療で観察されるものより大きくなるようになされる。該2つの治療の効果は、一部相加的であるか、完全に相加的であるか、または相加的を超える場合がある。該送達は、送達された第一の治療の効果が、第二の治療が送達される際に依然として検出可能であるようになされ得る。
本明細書に記載のTFP発現細胞は、他の既知の薬剤及び治療と組み合わせて使用してもよい。本明細書で用いられる、「組み合わせて」投与されるとは、対象に対して、2つ(またはそれ以上)の異なる治療が、該対象の疾患の苦痛の過程において送達されること、例えば、該2つ以上の治療が、該対象が該障害と診断された後、該障害が治癒もしくは除去される前、または治療が他の理由のために中止される前に送達されることを意味する。いくつかの実施形態では、投与に関して重複があるように、1つの治療の送達は、第二の送達の開始時に依然として行われている。これは、本明細書では「同時」または「同時送達」と呼ばれる場合がある。他の実施形態では、1つの治療の送達は、他方の治療の送達の開始前に終了する。いずれかの場合のいくつかの実施形態では、該治療は、併用投与のためにより効果的である。例えば、該第二の治療はより効果的であり、例えば、該第一の治療なしで該第二の治療が施される場合に見られるより、より少ない該第二の治療で同
等の効果が見られるか、または、該第二の治療は症状を大幅に減少させ、類似の状況は該第一の治療でも見られる。いくつかの実施形態では、送達は、症状、または、障害に関連する他のパラメータの減少が、他方の非存在下で送達される1つの治療で観察されるものより大きくなるようになされる。該2つの治療の効果は、一部相加的であるか、完全に相加的であるか、または相加的を超える場合がある。該送達は、送達された第一の治療の効果が、第二の治療が送達される際に依然として検出可能であるようになされ得る。
いくつかの実施形態では、「少なくとも1つの追加の治療薬」には、TFP発現細胞が含まれる。また、同じもしくは異なる標的抗原、または同じ標的抗原上の同じもしくは異なるエピトープに結合する複数のTFPを発現するT細胞を提供する。また、第一のT細胞のサブセットが第一のTFPを発現し、第二のT細胞のサブセットが第二のTFPを発現するT細胞の集団を提供する。
本明細書に記載のTFP発現細胞及び少なくとも1つの追加の治療薬は、同時に、同じもしくは別々の組成物中で、または連続的に投与され得る。連続投与については、本明細書に記載のTFP発現細胞を第一に投与し、該追加の薬剤を第二に投与してもよいし、該投与順序を入れ替えてもよい。
さらなる態様において、本明細書に記載のTFP発現細胞は、手術、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及びFK506、抗体、もしくは他の免疫消失薬、例えば、CAMPATH、抗CD3抗体、または他の抗体療法、シトキシン(cytoxin)、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、及び放射線照射、ペプチドワクチン、例えば、Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971に記載のものと組み合わせて治療計画に使用され得る。
1つの実施形態では、該対象は、TFP発現細胞の投与に伴う副作用を減少または改善する薬剤を投与される場合がある。TFP発現細胞の投与に伴う副作用としては、サイトカイン放出症候群(CRS)、及びマクロファージ活性化症候群(MAS)とも呼ばれる血球貪食性リンパ組織球症(HLH)が挙げられるがこれらに限定されない。CRSの症状としては、高熱、吐き気、一過性低血圧、低酸素症等が挙げられる。従って、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のTFP発現細胞を対象に投与し、さらにTFP発現細胞での治療を起因とする可溶性因子レベルの上昇を管理する薬剤を投与することを含むことができる。1つの実施形態では、該対象内で上昇される可溶性因子は、IFN-γ、TNFα、IL-2、及びIL-6のうちの1つ以上である。従って、この副作用を治療するために投与される薬剤は、1つ以上のこれらの可溶性因子を中和する薬剤であり得る。かかる薬剤としては、ステロイド、TNFαの阻害剤、及びIL-6の阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。TNFα阻害剤の例は、エンタネルセプト(entanercept)である。IL-6阻害剤の例はトシリズマブ(toc)である。
1つの実施形態では、対象は、TFP発現細胞の活性を高める薬剤を投与される場合がある。例えば、1つの実施形態では、該薬剤は、抑制分子を阻害する薬剤であり得る。抑制分子、例えば、プログラム死1(PD1)は、いくつかの実施形態では、TFP発現細胞の免疫エフェクター反応の開始能力を弱める場合がある。抑制分子の例としては、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、及びTGFRベータが挙げられる。抑制分子の、例えば、DNA、RNA、またはタンパク質レベルの阻害による阻害は、TFP発現細胞の性能を最適化する可能性がある。実施形態では、抑制性核酸、例えば、抑制性核酸、例えば、dsRNA、例えば、siRNA、またはshRNAは、該TFP発現細胞において
抑制分子の発現を阻害するために使用され得る。実施形態では、該阻害剤はshRNAである。実施形態では、該抑制分子は、TFP発現細胞内で阻害される。これらの実施形態では、該抑制分子の発現を阻害するdsRNA分子が、該TFPの成分、例えばすべての成分をコードする核酸に結合される。1つの実施形態では、抑制シグナルの阻害剤は、例えば、抑制分子に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、該薬剤は、PD1、PD-L1、PD-L2、またはCTLA4(例えば、イピリムマブ(MDX-010及びMDX-101とも呼ばれ、Yervoy(商標)として市販されている;Bristol-Myers Squibb;トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なIgG2モノクローナル抗体、かつてチシリムマブとして知られていたもの、CP-675,206))に結合する抗体また抗体フラグメントであり得る。実施形態では、該薬剤は、TIM3に結合する抗体または抗体フラグメントである。実施形態では、該薬剤は、LAG3に結合する抗体または抗体フラグメントである。
抑制分子の発現を阻害するために使用され得る。実施形態では、該阻害剤はshRNAである。実施形態では、該抑制分子は、TFP発現細胞内で阻害される。これらの実施形態では、該抑制分子の発現を阻害するdsRNA分子が、該TFPの成分、例えばすべての成分をコードする核酸に結合される。1つの実施形態では、抑制シグナルの阻害剤は、例えば、抑制分子に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、該薬剤は、PD1、PD-L1、PD-L2、またはCTLA4(例えば、イピリムマブ(MDX-010及びMDX-101とも呼ばれ、Yervoy(商標)として市販されている;Bristol-Myers Squibb;トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なIgG2モノクローナル抗体、かつてチシリムマブとして知られていたもの、CP-675,206))に結合する抗体また抗体フラグメントであり得る。実施形態では、該薬剤は、TIM3に結合する抗体または抗体フラグメントである。実施形態では、該薬剤は、LAG3に結合する抗体または抗体フラグメントである。
いくつかの実施形態では、TFP発現細胞の活性を高める薬剤、例えば、第一のドメイン及び第二のドメインを含み、該第一のドメインが抑制分子またはそのフラグメントであり、該第二のドメインが陽性シグナルに関連するポリペプチド、例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、陽性シグナルに関連している該ポリペプチドは、CD28、CD27、ICOSの共刺激ドメイン、例えば、CD28、CD27、及び/またはICOSの細胞内シグナル伝達ドメイン、及び/または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、CD3ゼータの、例えば、本明細書に記載のものを含み得る。1つの実施形態では、該融合タンパク質は、TFPを発現するのと同じ細胞によって発現される。別の実施形態では、該融合タンパク質は、細胞、例えば、抗CD19 TFPを発現しないT細胞によって発現される。
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、TFP発現細胞、例えば、本明細書に記載の複数のTFP発現細胞を、1つ以上の医薬的にもしくは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含み得る。かかる組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等;炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースもしくはデキストラン、マンニトール;タンパク質;ポリペプチドもしくはアミノ酸、例えば、グリシン;酸化防止剤;キレート剤、例えば、EDTAもしくはグルタチオン;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);ならびに保存料を含んでよい。本発明の組成物は、1つの態様において、静脈内投与用に処方される。
本発明の医薬組成物は、TFP発現細胞、例えば、本明細書に記載の複数のTFP発現細胞を、1つ以上の医薬的にもしくは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含み得る。かかる組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等;炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースもしくはデキストラン、マンニトール;タンパク質;ポリペプチドもしくはアミノ酸、例えば、グリシン;酸化防止剤;キレート剤、例えば、EDTAもしくはグルタチオン;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);ならびに保存料を含んでよい。本発明の組成物は、1つの態様において、静脈内投与用に処方される。
本発明の医薬組成物は、治療される(または予防される)疾患に適切な方法で投与され得る。投与の量及び頻度は、当該患者の状態ならびに該患者の疾患のタイプ及び重症度等の要因によって決定されるが、適切な用量は臨床試験で決定される場合がある。
1つの実施形態では、該医薬組成物は、混入物質、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、自己複製レンチウイルス(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残存抗CD3/抗CD28被覆ビーズ、マウス抗体、保存ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培地成分、ベクターパッケージング細胞もしくはプラスミド成分、細菌、及び真菌からなる群から選択される混入物質が実質的になく、例えば、検出レベルの該混入物質がない。1つの実施形態では、該細菌は、Alcaligenes faecalis、Candida albicans、Escherichia coli、Haemophilus influenza、Neisseria meningitides、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Streptococcus pneumonia、及びStreptococcus pyogenesA群からなる群から選択される少なくとも1つである。
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、当該患者(対象)の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染もしくは転移の程度、及び状態の個体差を考慮して医師によって決定され得る。本明細書に記載のT細胞を含む医薬組成物は、104~109細胞/kg体重、いくつかの例では105~106細胞/kg体重で、これらの範囲内のすべての整数値を含めた用量で投与され得るということが一般に言える。また、T細胞組成物は、これらの用量において複数回投与され得る。該細胞は、免疫療法で広く知られている注入技術を用いて投与することができる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照)。
特定の態様において、活性化T細胞を対象に投与し、その後続いて再採血し(またはアフェレーシスが行われている)、本発明に従ってそこからT細胞を活性化し、これらの活性化及び増殖されたT細胞を該患者に再注入することが望ましい場合がある。この工程は数週間ごとに複数回行われ得る。特定の態様において、T細胞は10cc~400ccの採血から活性化することができる。特定の態様において、T細胞は、20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、または100ccの採血から活性化される。
目的の組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸液、注入、または移植を含めた任意の都合の良い方法で行ってよい。本明細書に記載の組成物は、患者に対して、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内(i.v.)注射により、または腹腔内に投与され得る。1つの態様では、本発明のT細胞組成物は、患者に対して、皮内または皮下注射によって投与される。1つの態様において、本発明のT細胞組成物は、i.v.注射によって投与される。該T細胞組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注入してもよい。
特定の例示的な態様において、対象は、白血球を採取し、エキソビボで濃縮しまたは枯渇させて目的の細胞、例えば、T細胞を選択及び/または単離する白血球除去療法を受けてもよい。これらのT細胞分離株は、当技術分野で知られている方法によって増殖され、1つ以上の本発明のTFP構築物が導入され得るように処理され、それによって本発明のTFP発現T細胞を生成してもよい。それを必要とする対象は、その後標準的な大量化学療法での治療に続いて末梢血幹細胞移植を受けてもよい。特定の態様において、該移植の後、またはそれと同時に、対象は、本発明の増殖されたTFP T細胞の注入を受ける。さらなる態様において、増殖された細胞は、手術の前または後に投与される。
患者に施される上記治療の用量は、治療される状態の正確な性質及び治療のレシピエントによって変わる。ヒトへの投与に対する用量のスケーリングは、当該分野で認められた慣行に従って行うことができる。例えば、CAMPATHの投与量は通常、成人患者に対して、1~約100mgの範囲であり、通常、1~30日間、毎日投与される。好ましい1日用量は、1~10mg/日であるが、いくつかの例では、より大量の40mg/日までが用いられてもよい(米国特許第6,120,766号に記載されている)。
1つの実施形態では、該TFPは、例えば、インビトロ転写を用いてT細胞内に導入され、対象(例えば、ヒト)は、本発明のTFP T細胞の最初の投与及び1回以上のそれに続く本発明のTFP T細胞の投与を受けるが、該1回以上のそれに続く投与は、先の投与後、15日未満で、例えば、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、または2日で施される。1つの実施形態では、本発明のTFP T細胞の複数回の投与が、該対象(例えば、ヒト)に対して1週間ごとに施され、例えば、本発明のTFP-T細胞の2、3、または4回の投与が1週間ごとに施される。1つの実施形態では、
該対象(例えば、ヒト対象)は、1週間ごとに複数回のTFP T細胞の投与(例えば、1週間ごとに2、3、または4回の投与)(本明細書ではサイクルとも呼ぶ)を受け、続いて1週間はTFP T細胞の投与をせず、その後1回以上の追加のTFP T細胞の投与(例えば、1週間ごとに複数回の該TFP T細胞の投与)が該対象に施される。別の実施形態では、該対象(例えば、ヒト対象)は、複数サイクルのTFP T細胞を受けるとともに、各サイクルの間隔は10、9、8、7、6、5、4、または3日未満である。1つの実施形態では、該TFP-T細胞は、1週間ごとに3回の投与のために1日おきに投与される。1つの実施形態では、本発明のTFP T細胞は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8週間、またはそれ以上投与される。
該対象(例えば、ヒト対象)は、1週間ごとに複数回のTFP T細胞の投与(例えば、1週間ごとに2、3、または4回の投与)(本明細書ではサイクルとも呼ぶ)を受け、続いて1週間はTFP T細胞の投与をせず、その後1回以上の追加のTFP T細胞の投与(例えば、1週間ごとに複数回の該TFP T細胞の投与)が該対象に施される。別の実施形態では、該対象(例えば、ヒト対象)は、複数サイクルのTFP T細胞を受けるとともに、各サイクルの間隔は10、9、8、7、6、5、4、または3日未満である。1つの実施形態では、該TFP-T細胞は、1週間ごとに3回の投与のために1日おきに投与される。1つの実施形態では、本発明のTFP T細胞は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8週間、またはそれ以上投与される。
1つの態様において、CD19 TFP T細胞は、レンチウイルス等のレンチウイルス性ウイルスベクターを用いて生成される。その方法で生成されるTFP-T細胞は、安定的にTFPを発現する。
1つの態様において、TFP T細胞は、形質導入後、TFPベクターを4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15日間一過性に発現する。TFPの一過性の発現は、RNA TFPベクターの送達によってもたらされ得る。1つの態様において、該TFP RNAは、エレクトロポレーションによってT細胞に形質導入される。
一過性に発現するTFP T細胞を用いて(特にマウスscFv担持TFP T細胞で)治療される患者に生じ得る潜在的な問題は、複合的治療後のアナフィラキシーである。
本理論に拘束されるものではないが、かかるアナフィラキシー反応は、体液性抗TFP反応を発症している患者、すなわち、抗IgEアイソタイプを有する抗TFP抗体によって引き起こされる可能性があると考えられる。患者の抗体産生細胞は、抗原への曝露が10~14日間中断された場合、IgGアイソタイプ(これはアナフィラキシーを引き起こさない)からIgEアイソタイプへのクラススイッチを受けていると思われる。
患者が一過性TFP治療(RNA形質導入によって生成されるもの等)の過程で抗TFP抗体反応を生成する危険性が高い場合、TFP T細胞注入の中断は、10~14日より長く続けるべきではない。
本発明を、以下の実験実施例を参照することによってさらに詳細に説明する。これらの実施例は、例示の目的でのみ提供し、特に明記しない限り限定することを意図しない。従って、本発明は、以下の実施例には一切限定されないと解釈されるものとし、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるものとする。さらに説明することなく、当業者には、前述の説明及び以下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製及び利用すること、ならびに請求項に係る方法を実施することが可能であると考えられる。以下の実施例は、本発明の様々な態様を具体的に挙げるが、これらは本開示の残余の部分を限定するとは一切解釈されない。
実施例1:TFP構築物
抗CD19 TFP構築物は、短いリンカー(SL):AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号5)または長いリンカー(LL):AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号6)をコードするDNA配列のいずれかによってCD3またはTCR DNAフラグメントに連結した抗CD19 scFv DNAフラグメントを、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクター((System
Biosciences(SBI))にクローニングすることによって作り出した。
抗CD19 TFP構築物は、短いリンカー(SL):AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号5)または長いリンカー(LL):AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号6)をコードするDNA配列のいずれかによってCD3またはTCR DNAフラグメントに連結した抗CD19 scFv DNAフラグメントを、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクター((System
Biosciences(SBI))にクローニングすることによって作り出した。
生成した抗CD19 TRuC構築物は、p510_抗CD19_LL_TCRα(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒト完全長T細胞受容体α鎖)、p510_抗CD19_LL_TCR αC(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒトT細胞受容体α定常ドメイン鎖)、p510_抗CD19_LL_TCRβ(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒト完全長T細胞受容体β鎖)、p510_抗CD19_LL_TCRβC(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒトT細胞受容体β定常ドメイン鎖)、p510_抗CD19_LL_CD3γ(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒトCD3γ鎖)、p510_抗CD19_LL_CD3δ(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒトCD3δ鎖)、p510_抗CD19_LL_CD3ε(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒトCD3ε鎖)、p510_抗CD19_SL_TCRβ(抗CD19 scFv-短いリンカー-ヒト完全長T細胞受容体β鎖)、p510_抗CD19_SL_CD3γ(抗CD19 scFv-短いリンカー-ヒトCD3γ鎖)、p510_抗CD19_SL_CD3δ(抗CD19 scFv-短いリンカー-ヒトCD3δ鎖)、p510_抗CD19_SL_CD3ε(抗CD19 scFv-短いリンカー-ヒトCD3ε鎖)であった。
抗CD19 CAR構築物であるp510_抗CD19_28ζは、抗CD19、部分的なCD28の細胞外ドメイン、CD28の膜貫通ドメイン、CD28の細胞内ドメイン、及びCD3ゼータをコードする合成DNAを、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクターにクローニングすることによって生成した。
抗BCMA TFP構築物は、リンカー:GGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号7)をコードするDNA配列によってCD3 DNAフラグメントに連結された抗BCMA scFv DNAフラグメントを、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクター(SBI)にクローニングすることによって作り出した。生成した抗BCMA TFP構築物は、p510_抗BCMA_CD3γ(抗BCMA scFv-リンカー-ヒトCD3γ鎖)及びp510_抗BCMA_CD3ε(抗BCMA scFv-リンカー-ヒトCD3ε鎖)であった。
完全長BCMAを合成し、BamHI及びNheI部位でp514(SBI)にクローニングし、安定な標的細胞株を生成するために用いられる構築物p514_BCMAを生成した。
抗線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)及び抗カルボアンヒドラーゼ-9(CAIX)TFP構築物は、リンカー:GGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号7)をコードするDNA配列によって、CD3 DNAフラグメントに連結された抗FAPまたは抗CAIX scFv DNAフラグメントを、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクター(SBI)にクローニングすることによって作り出した。生成され得る抗FAPまたは抗CAIX TFP構築物としては、p510_抗FAP_CD3γ(抗FAP scFv-リンカー-ヒトCD3γ鎖)及びp510_抗FAP_CD3ε(抗FAP scFv-リンカー-ヒトCD3ε鎖)ならびにp510_抗CAIX_CD3γ(抗CAIX scFv-リンカー-ヒトCD3γ鎖)及びp510_抗CAIX_CD3ε(抗CAIX scFv-リンカー-ヒトCD3ε鎖)が挙げられる。
完全長FAP及びCAIXを合成し、BamHI及びNheI部位でp514(SBI)にクローニングし、構築物p514_FAP及びp514_CAIXを生成することができ、これを安定な標的細胞株を生成するために用いることができる。
例示的な構築物の配列を以下に示す。
構築物の配列
標的構築物
p514_BCMA(配列番号8)
構築物の配列
標的構築物
p514_BCMA(配列番号8)
CAR構築物
p510_抗CD19_28ζ(配列番号9)
p510_抗CD19_28ζ(配列番号9)
p526A_19BBZ(配列番号10)
TFP(TRuC)構築物
p510_抗CD19_LL_TCRアルファ(配列番号11)
p510_抗CD19_LL_TCRアルファ(配列番号11)
p510_抗CD19_LL_TCRアルファC(配列番号12)
p510_抗CD19_LL_TCRベータ(配列番号13)
p510_抗CD19_LL_TCRベータC(配列番号14)
p510_抗CD19_LL_CD3ガンマ(配列番号15)
p510_抗CD19_LL_CDデルタ(配列番号16)
p510_抗CD19_LL_CD3イプシロン(配列番号17)
p510_抗CD19_SL_CD3イプシロン(配列番号18)
p510_抗CD19_SL_CD3ガンマ(配列番号19)
p510_抗CD19_SL_CD3デルタ(配列番号20)
p510_抗CD19_SL_TCRベータ(配列番号21)
p510_抗BCMA_CD3イプシロン(配列番号22)
p510_抗BCMA_CD3ガンマ(配列番号23)
実施例2:抗体配列
抗体配列の生成
ヒトCD19ポリペプチドの標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号P15391(またはP15391-1)である。ヒトBCMAポリペプチドの標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号Q02223(またはQ02223-1)である。ヒトCD19ポリペプチドもしくはヒトBCMAポリペプチドまたはヒトFAPポリペプチドもしくはヒトBCMAポリペプチド、及びそのフラグメントまたはドメインに特異的に結合することが可能な抗体ポリペプチドを提供する。抗CD19、抗FAP、抗CAIX、及び抗BCMA抗体は、様々な技術を用いて生成することができる(例えば、(Nicholson et al, 1997)参照。マウス抗CD19、抗FAP、抗CAIX、または抗BCMA抗体が出発物質として使用される場合、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)治療、すなわち、このTFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMA構築物で形質導入されたT細胞での治療を受ける対象において、これらマウス特異的残基が、ヒト-抗マウス抗原(HAMA)反応を誘導する場合があるマウス抗CD19、抗FAP、抗CAIX、または抗BCMA抗体のヒト化が臨床環境では望まれる。ヒト化は、マウス抗CD19、抗FAP、抗CAIX、または抗BCMA抗体由来のCDR領域を、適切なヒト生殖細胞系列のアクセプターフレ
ームワークに移植することならびに任意にCDR及び/またはフレームワーク領域に対する他の修飾によって達成される。本明細書で提供される、抗体及び抗体フラグメント残基の番号付けは、Kabatに従う(Kabat E. A. et al, 1991;Chothia et al, 1987)。
抗体配列の生成
ヒトCD19ポリペプチドの標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号P15391(またはP15391-1)である。ヒトBCMAポリペプチドの標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号Q02223(またはQ02223-1)である。ヒトCD19ポリペプチドもしくはヒトBCMAポリペプチドまたはヒトFAPポリペプチドもしくはヒトBCMAポリペプチド、及びそのフラグメントまたはドメインに特異的に結合することが可能な抗体ポリペプチドを提供する。抗CD19、抗FAP、抗CAIX、及び抗BCMA抗体は、様々な技術を用いて生成することができる(例えば、(Nicholson et al, 1997)参照。マウス抗CD19、抗FAP、抗CAIX、または抗BCMA抗体が出発物質として使用される場合、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)治療、すなわち、このTFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMA構築物で形質導入されたT細胞での治療を受ける対象において、これらマウス特異的残基が、ヒト-抗マウス抗原(HAMA)反応を誘導する場合があるマウス抗CD19、抗FAP、抗CAIX、または抗BCMA抗体のヒト化が臨床環境では望まれる。ヒト化は、マウス抗CD19、抗FAP、抗CAIX、または抗BCMA抗体由来のCDR領域を、適切なヒト生殖細胞系列のアクセプターフレ
ームワークに移植することならびに任意にCDR及び/またはフレームワーク領域に対する他の修飾によって達成される。本明細書で提供される、抗体及び抗体フラグメント残基の番号付けは、Kabatに従う(Kabat E. A. et al, 1991;Chothia et al, 1987)。
scFvの生成
ヒトもしくはヒト化抗CD19、抗FAP、抗CAIX、または抗BCMA IgGを用いてTFP構築物用のscFv配列を生成する。ヒトまたはヒト化VL及びVHドメインをコードするDNA配列を得、これら構築物のコドンを任意に、ヒト由来の細胞での発現に最適化する。scFvに現れるVL及びVHドメインの順序は様々であり(すなわち、VL-VHまたはVH-VL配向)、「G4S」または「G4S」サブユニットの3つのコピー(G4S)3がこれら可変ドメインをつないでscFvドメインを生成する。抗CD19、抗FAP、抗CAIX、及び抗BCMA scFvプラスミド構築物は、任意のFlag、His、または他のアフィニティタグを有する場合があり、HEK293または他の適切なヒトもしくは哺乳類の細胞株にエレクトロポレートされ、精製される。検証アッセイとしては、FACSによる結合分析、Proteonを用いる動態解析、及びCD19発現細胞の染色が挙げられる。
ヒトもしくはヒト化抗CD19、抗FAP、抗CAIX、または抗BCMA IgGを用いてTFP構築物用のscFv配列を生成する。ヒトまたはヒト化VL及びVHドメインをコードするDNA配列を得、これら構築物のコドンを任意に、ヒト由来の細胞での発現に最適化する。scFvに現れるVL及びVHドメインの順序は様々であり(すなわち、VL-VHまたはVH-VL配向)、「G4S」または「G4S」サブユニットの3つのコピー(G4S)3がこれら可変ドメインをつないでscFvドメインを生成する。抗CD19、抗FAP、抗CAIX、及び抗BCMA scFvプラスミド構築物は、任意のFlag、His、または他のアフィニティタグを有する場合があり、HEK293または他の適切なヒトもしくは哺乳類の細胞株にエレクトロポレートされ、精製される。検証アッセイとしては、FACSによる結合分析、Proteonを用いる動態解析、及びCD19発現細胞の染色が挙げられる。
VL及びVHドメインの例示的な抗CD19または抗BCMA CDRならびにそれらをそれぞれコードするヌクレオチド配列を以下に示す。
抗CD19
抗CD19軽鎖CDR1
コード配列:AGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAA(配列番号24)
アミノ酸配列:RASQDISK(配列番号25)
抗CD19軽鎖CDR1
コード配列:AGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAA(配列番号24)
アミノ酸配列:RASQDISK(配列番号25)
抗CD19軽鎖CDR2
コード配列:ATCTACCATACATCAAGATTA(配列番号26)
アミノ酸配列:IYHTSRL(配列番号27)
コード配列:ATCTACCATACATCAAGATTA(配列番号26)
アミノ酸配列:IYHTSRL(配列番号27)
抗CD19軽鎖CDR3
コード配列:CAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACG(配列番号28)
アミノ酸配列:QQGNTLPYT(配列番号29)
コード配列:CAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACG(配列番号28)
アミノ酸配列:QQGNTLPYT(配列番号29)
抗CD19重鎖CDR1
コード配列:GGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGC(配列番号30)
アミノ酸配列:GVSLPDYGVS(配列番号31)
コード配列:GGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGC(配列番号30)
アミノ酸配列:GVSLPDYGVS(配列番号31)
抗CD19重鎖CDR2
コード配列:GTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTC(配列番号32)
アミノ酸配列:VIWGSETTYYNSAL(配列番号33)
コード配列:GTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTC(配列番号32)
アミノ酸配列:VIWGSETTYYNSAL(配列番号33)
抗CD19重鎖CDR3
コード配列:CATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTAC(配列番号34)
アミノ酸配列:HYYYGGSYAMDY(配列番号35)
コード配列:CATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTAC(配列番号34)
アミノ酸配列:HYYYGGSYAMDY(配列番号35)
抗BCMA
抗BCMA軽鎖CDR1
コード配列:AAAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCATAGCAACGGCAACACCTATCTGCAT(配列番号36)
アミノ酸配列:KSSQSLVHSNGNTYLH(配列番号37)
抗BCMA軽鎖CDR1
コード配列:AAAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCATAGCAACGGCAACACCTATCTGCAT(配列番号36)
アミノ酸配列:KSSQSLVHSNGNTYLH(配列番号37)
抗BCMA軽鎖CDR2
コード配列:AAAGTGAGCAACCGCTTTAGC(配列番号38)
アミノ酸配列:KVSNRFS(配列番号39)
コード配列:AAAGTGAGCAACCGCTTTAGC(配列番号38)
アミノ酸配列:KVSNRFS(配列番号39)
抗BCMA軽鎖CDR3
コード配列:GCGGAAACCAGCCATGTGCCGTGGACC(配列番号40)
アミノ酸配列:AETSHVPWT(配列番号41)
コード配列:GCGGAAACCAGCCATGTGCCGTGGACC(配列番号40)
アミノ酸配列:AETSHVPWT(配列番号41)
抗BCMA重鎖CDR1
コード配列:AAAGCGAGCGGCTATAGCTTTCCGGATTATTATATTAAC(配列番号42)
アミノ酸配列:KASGYSFPDYYIN(配列番号43)
コード配列:AAAGCGAGCGGCTATAGCTTTCCGGATTATTATATTAAC(配列番号42)
アミノ酸配列:KASGYSFPDYYIN(配列番号43)
抗BCMA重鎖CDR2
コード配列:TGGATTTATTTTGCGAGCGGCAACAGCGAATATAACCAGAAATTTACCGGC(配列番号44)
アミノ酸配列:WIYFASGNSEYNQKFTG(配列番号45)
コード配列:TGGATTTATTTTGCGAGCGGCAACAGCGAATATAACCAGAAATTTACCGGC(配列番号44)
アミノ酸配列:WIYFASGNSEYNQKFTG(配列番号45)
抗BCMA重鎖CDR3
コード配列:CTGTATGATTATGATTGGTATTTTGATGTG(配列番号46)
アミノ酸配列:LYDYDWYFDV(配列番号47)
コード配列:CTGTATGATTATGATTGGTATTTTGATGTG(配列番号46)
アミノ酸配列:LYDYDWYFDV(配列番号47)
抗CD19軽鎖可変領域
コード配列:
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA(配列番号48)
アミノ酸配列:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT(配列番号49)
コード配列:
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA(配列番号48)
アミノ酸配列:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT(配列番号49)
抗CD19重鎖可変領域
コード配列:
GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGT
CTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(配列番号50)
アミノ酸配列:
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(配列番号51)
コード配列:
GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGT
CTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(配列番号50)
アミノ酸配列:
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(配列番号51)
抗BCMA軽鎖可変領域
コード配列:
GATATTGTGATGACCCAGACCCCGCTGAGCCTGAGCGTGACCCCGGGCGAACCGGCGAGCATTAGCTGCAAAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCATAGCAACGGCAACACCTATCTGCATTGGTATCTGCAGAAACCGGGCCAGAGCCCGCAGCTGCTGATTTATAAAGTGAGCAACCGCTTTAGCGGCGTGCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCGCGGATTTTACCCTGAAAATTAGCCGCGTGGAAGCGGAAGATGTGGGCGTGTATTATTGCGCGGAAACCAGCCATGTGCCGTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAAAGC(配列番号52)
アミノ酸配列:
DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIKS(配列番号: 53)
コード配列:
GATATTGTGATGACCCAGACCCCGCTGAGCCTGAGCGTGACCCCGGGCGAACCGGCGAGCATTAGCTGCAAAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCATAGCAACGGCAACACCTATCTGCATTGGTATCTGCAGAAACCGGGCCAGAGCCCGCAGCTGCTGATTTATAAAGTGAGCAACCGCTTTAGCGGCGTGCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCGCGGATTTTACCCTGAAAATTAGCCGCGTGGAAGCGGAAGATGTGGGCGTGTATTATTGCGCGGAAACCAGCCATGTGCCGTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAAAGC(配列番号52)
アミノ酸配列:
DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIKS(配列番号: 53)
抗BCMA重鎖可変領域
コード配列:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAGCTTTCCGGATTATTATATTAACTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATTTATTTTGCGAGCGGCAACAGCGAATATAACCAGAAATTTACCGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCAGCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTTTTGCGCGAGCCTGTATGATTATGATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGC(配列番号54)
アミノ酸配列:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS(配列番号55)
コード配列:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAGCTTTCCGGATTATTATATTAACTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATTTATTTTGCGAGCGGCAACAGCGAATATAACCAGAAATTTACCGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCAGCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTTTTGCGCGAGCCTGTATGATTATGATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGC(配列番号54)
アミノ酸配列:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS(配列番号55)
TCRサブユニット源
ヒトT細胞受容体(TCR)複合体のサブユニットはすべて、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。ヒトTCR複合体は、CD3イプシロンポリペプチド、CD3ガンマポリペプチド、CD3デルタポリペプチド、CD3ゼータポリペプチド、TCRアルファ鎖ポリペプチド、及びTCRベータ鎖ポリペプチドを含む。ヒトCD3イプシロンポリペプチドの標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号P07766である。ヒトCD3ガンマポリペプチドの標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号P09693である。ヒトCD3デルタポリペプチドの標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号P043234である。ヒトCD3ゼータポリペプチドの標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号P20963である。ヒトTCRアルファ鎖の標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号Q6ISU1である。ヒトTCRベータ鎖C領域の標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号P01850であり、ヒトTCRベータ鎖V領域の配列は、P04435である。
ヒトT細胞受容体(TCR)複合体のサブユニットはすべて、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。ヒトTCR複合体は、CD3イプシロンポリペプチド、CD3ガンマポリペプチド、CD3デルタポリペプチド、CD3ゼータポリペプチド、TCRアルファ鎖ポリペプチド、及びTCRベータ鎖ポリペプチドを含む。ヒトCD3イプシロンポリペプチドの標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号P07766である。ヒトCD3ガンマポリペプチドの標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号P09693である。ヒトCD3デルタポリペプチドの標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号P043234である。ヒトCD3ゼータポリペプチドの標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号P20963である。ヒトTCRアルファ鎖の標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号Q6ISU1である。ヒトTCRベータ鎖C領域の標準的な配列は、Uniprotアクセッション番号P01850であり、ヒトTCRベータ鎖V領域の配列は、P04435である。
ヒトCD3イプシロンポリペプチドの標準的な配列は:
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(配列番号56)である。
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(配列番号56)である。
ヒトCD3ガンマポリペプチドの標準的な配列は:
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(配列番号57)である。
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(配列番号57)である。
ヒトCD3デルタポリペプチドの標準的な配列は:
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK(配列番号58)である。
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK(配列番号58)である。
ヒトCD3ゼータポリペプチドの標準的な配列は:
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号59)である。
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号59)である。
ヒトTCRアルファ鎖の標準的な配列は:
MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGA
A(配列番号60)である。
MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGA
A(配列番号60)である。
ヒトTCRアルファ鎖C領域の標準的な配列は:
PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(配列番号61)である。
PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(配列番号61)である。
ヒトTCRアルファ鎖V領域CTL-L17の標準的な配列は:
MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAKGAGTASKLTFGTGTRLQVTL(配列番号62)である。
MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAKGAGTASKLTFGTGTRLQVTL(配列番号62)である。
ヒトTCRベータ鎖C領域の標準的な配列は:
EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(配列番号63)である。
EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(配列番号63)である。
ヒトTCRベータ鎖V領域CTL-L17の標準的な配列は:
MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHNITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLAGLNQPQHFGDGTRLSIL(配列番号64)である。
MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHNITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLAGLNQPQHFGDGTRLSIL(配列番号64)である。
ヒトTCRベータ鎖V領域YT35の標準的な配列は:
MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSFSTCSANYGYTFGSGTRLTVV(配列番号65)である。
MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSFSTCSANYGYTFGSGTRLTVV(配列番号65)である。
例示的な抗BCMA重鎖配列は:
TCRドメイン及びscFvからのTFPの生成
CD19またはBCMA scFvは、リンカー配列、例えば、G4S、(G4S)2、(G4S)3、または(G4S)4を用いてCD3イプシロンまたは他のTCRサブユニット(1C参照)に組み換え技術によって連結される。様々なリンカー及びscFvの構造が利用される。TFPの生成のため、TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖を完全長ポリペプチドまたはそれらの定常ドメインのみのいずれかとして用いた。TCRアルファ及びTCRベータ鎖の任意の可変配列が、TFPの作製を可能にする。
CD19またはBCMA scFvは、リンカー配列、例えば、G4S、(G4S)2、(G4S)3、または(G4S)4を用いてCD3イプシロンまたは他のTCRサブユニット(1C参照)に組み換え技術によって連結される。様々なリンカー及びscFvの構造が利用される。TFPの生成のため、TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖を完全長ポリペプチドまたはそれらの定常ドメインのみのいずれかとして用いた。TCRアルファ及びTCRベータ鎖の任意の可変配列が、TFPの作製を可能にする。
TFP発現ベクター
プロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー-プロモーター)、分泌を可能にするためのシグナル伝達配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネータ(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソーム複製及び原核生物における複製を可能にする要素(例えば、SV40起点及びColE1または当技術分野で既知の他のもの)、ならびに選択を可能にする要素(アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー)を含む発現ベクターを提供する。
プロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー-プロモーター)、分泌を可能にするためのシグナル伝達配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネータ(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソーム複製及び原核生物における複製を可能にする要素(例えば、SV40起点及びColE1または当技術分野で既知の他のもの)、ならびに選択を可能にする要素(アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー)を含む発現ベクターを提供する。
好ましくは、TFPをコードする核酸構築物は、レンチウイルス発現ベクターにクローニングされ、発現は、CD19+標的細胞に反応するTFP.CD19形質導入T細胞(「CD19.TFP」もしくは「CD19.TFP T細胞」または「TFP.CD19」もしくは「TFP.CD19 T細胞」)、FAP+標的細胞に反応するTFP.FAP形質導入T細胞(「FAP.TFP」もしくは「FAP.TFP T細胞」または「TFP.FAP」もしくは「TFP.FAP T細胞」)、CAIX+標的細胞に反応するTFP.CAIX形質導入T細胞(「CAIX.TFP」もしくは「CAIX.TFP T細胞」または「TFP.CAIX」もしくは「TFP.CAIX T細胞」)、またはBCMA+標的細胞に反応するTFP.BCMA形質導入T細胞(「BCMA.TFP」もしくは「BCMA.TFP T細胞」または「TFP.BCMA」もしくは「TFP.BCMA T細胞」)のエフェクターT細胞応答の量と質に基づいて認められる。エフェクターT細胞応答としては、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生、及び標的細胞溶解または細胞溶解活性(すなわち、脱顆粒)が挙げられるがこれらに限定されない。
TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMAのレンチウイルス転移ベクターは、VSVg偽型レンチウイルス粒子にパッケージされるゲノム材料を産生するために用いられる。レンチウイルス転移ベクターのDNAをVSVgの3つのパッケージング成分、gag/pol及びrevをリポフェクタミン試薬と組み合わせて混合し、それらを一緒に293細胞にトランスフェクトする。24及び48時間後、培地を採取し、濾過し、超遠心分離によって濃縮する。得られたウイルス調製物を-80Cで保存する。形質導入単位の数は、SupT1細胞での滴定で決定される。再指向性TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMA T細胞は、新たな天然のT細胞を抗CD3x抗CD28ビーズで24時間活性化し、その後適切な数の形質導入単位を加え、所望の割合の形質導入T細胞を得ることによって産生される。これらの改変T細胞を、細胞が休止し、そのサイズが減少するまで増殖させ、この時点で細胞を後の分析用に凍結保存する。細胞の数及びサイズは、coulterのマルチサイザーIIIを用いて測定する。凍結保存の前に、形質導入された細胞(TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMAを細胞表面で発現する)の割合及びその発現のそれらの相対的蛍光強度をフローサイトメトリー分析によって決定する。ヒストグラムのプロットから、これらTFPの相対的発現レベルが、形質導入された割合とそれらの相対的蛍光強度を比較することによって、調べられる。
いくつかの実施形態では、複数のウイルスベクターでのT細胞の形質導入によって、複数のTFPが導入される。
ヒト化TFP再指向性T細胞の細胞溶解活性、増殖能力、及びサイトカイン分泌の評価
TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMA T細胞の細胞表面で発現するTFPを産生し、標的腫瘍細胞を殺傷し、増殖し、サイトカインを分泌する機能的能力は、当技術分野で既知のアッセイを用いて決定される。
TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMA T細胞の細胞表面で発現するTFPを産生し、標的腫瘍細胞を殺傷し、増殖し、サイトカインを分泌する機能的能力は、当技術分野で既知のアッセイを用いて決定される。
ヒトPBMC(例えば、天然のT細胞が、T細胞、すなわちCD4+及びCD8+リンパ球に対して負の選択によって得られる正常なアフェレーシスドナー由来の血液)をヒトインターロイキン-2(IL-2)で処理し、その後抗CD3x抗CD28ビーズで、例えば、10%RPMI中、37℃、5%CO2にて、活性化し、その後TFPをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。フローサイトメトリーアッセイを用いて、例えば、抗FLAG抗体または抗マウス可変ドメイン抗体によって、TFPの細胞表面での存在を確認する。サイトカイン(例えば、IFN-γ)産生は、ELISAまたは他のアッセイを用いて測定される。
実施例3:ヒトALLマウスモデルにおけるヒトTFP T細胞効力
初代ヒトALL細胞は、インビトロでそれらを培養することなく免疫不全マウス(例えば、NSGまたはNOD)で成長することができる。同様に、培養ヒトALL細胞株は、かかるマウスにおいて白血病を誘導することができる。ALLを有するマウスは、例えば、HALLX5447モデルにおいて、ヒトTFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMA T細胞の効力を調べるために用いることができる。このモデルでの読み出しは、ALL細胞の静脈内(i.v.)注入後の、ヒトTFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMA T細胞のi.v.投与の非存在下及び存在下でのマウスの生存率である。
初代ヒトALL細胞は、インビトロでそれらを培養することなく免疫不全マウス(例えば、NSGまたはNOD)で成長することができる。同様に、培養ヒトALL細胞株は、かかるマウスにおいて白血病を誘導することができる。ALLを有するマウスは、例えば、HALLX5447モデルにおいて、ヒトTFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMA T細胞の効力を調べるために用いることができる。このモデルでの読み出しは、ALL細胞の静脈内(i.v.)注入後の、ヒトTFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMA T細胞のi.v.投与の非存在下及び存在下でのマウスの生存率である。
実施例4:インビボ固形腫瘍異種移植マウスモデルにおけるヒトTFP T細胞治療
ヒトTFP.CD19またはTFP.BCMA T細胞の効力もまた、ヒトCD19もしくはBCMAを発現するALL、CLL、またはNHLヒト細胞株由来の皮下固形腫瘍を有する免疫不全マウスモデルで調べることできる。ヒトTFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMA T細胞治療に反応した腫瘍の縮小は、キャリパーによる腫瘍サイズの測定によって、またはGFP発現腫瘍細胞によって放出されるGFPの蛍光シグナルの強度を観察することのいずれかによって評価することができる。
ヒトTFP.CD19またはTFP.BCMA T細胞の効力もまた、ヒトCD19もしくはBCMAを発現するALL、CLL、またはNHLヒト細胞株由来の皮下固形腫瘍を有する免疫不全マウスモデルで調べることできる。ヒトTFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMA T細胞治療に反応した腫瘍の縮小は、キャリパーによる腫瘍サイズの測定によって、またはGFP発現腫瘍細胞によって放出されるGFPの蛍光シグナルの強度を観察することのいずれかによって評価することができる。
初代ヒト固形腫瘍細胞は、インビトロでそれらを培養することなく免疫不全マウスで成長することができる。例示的な固形がん細胞としては、例えば、The Cancer Genome Atlas(TCGA)及び/またはthe Broad Cancer
Cell Line Encyclopedia(CCLE,Barretina et al., Nature 483:603 (2012)参照)に示される固形腫瘍細胞株が挙げられる。例示的な固形がん細胞としては、腎細胞がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、子宮頚がん、脳がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓または胃がんから単離される初代腫瘍細胞が挙げられる。これらのマウスを、ヒト腫瘍異種移植モデルにおいてTFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMA T細胞の効力を調べるために用いることができる(例えば、Morton et al., Nat. Procol. 2:247 (2007)参照)。1×106~1×107個の初代細胞(コラゲナーゼ処理バルク腫瘍のECマトリクス材料懸濁物)または腫瘍フラグメント(ECマトリクス材料中の初代腫瘍フラグメント)の皮下移植もしくは注射に続いて、腫瘍を治療開始に先立って200~500mm3まで成長させる。
Cell Line Encyclopedia(CCLE,Barretina et al., Nature 483:603 (2012)参照)に示される固形腫瘍細胞株が挙げられる。例示的な固形がん細胞としては、腎細胞がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、子宮頚がん、脳がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓または胃がんから単離される初代腫瘍細胞が挙げられる。これらのマウスを、ヒト腫瘍異種移植モデルにおいてTFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはTFP.BCMA T細胞の効力を調べるために用いることができる(例えば、Morton et al., Nat. Procol. 2:247 (2007)参照)。1×106~1×107個の初代細胞(コラゲナーゼ処理バルク腫瘍のECマトリクス材料懸濁物)または腫瘍フラグメント(ECマトリクス材料中の初代腫瘍フラグメント)の皮下移植もしくは注射に続いて、腫瘍を治療開始に先立って200~500mm3まで成長させる。
実施例5:多重TFPポリペプチドの実証、及び多重ヒト化TFP再指向性T細胞の使用
本明細書で提供されるTFPポリペプチドは、内因性TCRサブユニットのポリペプチドと機能的に会合し、機能的TCR複合体を形成することが可能である。ここで、レンチウイルスベクター内の複数のTFPを用いて、機能的多重組み換えTCR複合体を生成するためにT細胞を形質導入する。例えば、i)CD3-dseltaポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインならびにCD19、FAP、CAIX、またはBCMA特異的scFv抗体フラグメントを有する第一のTFP、ならびにii)CD3ガンマポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインならびにCD19、FAP、CAIX、またはBCMA特異的抗体フラグメントを有する第二のTFPを含むT細胞を提供する。該第一のTFP及び第二のTFPは、互いに、及び内因性TCRサブユニットのポリペプチドと相互作用することが可能であり、それによって機能的TCR複合体を形成する。
本明細書で提供されるTFPポリペプチドは、内因性TCRサブユニットのポリペプチドと機能的に会合し、機能的TCR複合体を形成することが可能である。ここで、レンチウイルスベクター内の複数のTFPを用いて、機能的多重組み換えTCR複合体を生成するためにT細胞を形質導入する。例えば、i)CD3-dseltaポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインならびにCD19、FAP、CAIX、またはBCMA特異的scFv抗体フラグメントを有する第一のTFP、ならびにii)CD3ガンマポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインならびにCD19、FAP、CAIX、またはBCMA特異的抗体フラグメントを有する第二のTFPを含むT細胞を提供する。該第一のTFP及び第二のTFPは、互いに、及び内因性TCRサブユニットのポリペプチドと相互作用することが可能であり、それによって機能的TCR複合体を形成する。
これらの多重ヒト化TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX、またはT
FP.BCMA T細胞の使用は、上記実施例2及び3に示す通り、液性及び固形腫瘍で実証される。
FP.BCMA T細胞の使用は、上記実施例2及び3に示す通り、液性及び固形腫瘍で実証される。
実施例6:TFPで形質導入されたT細胞の調製
レンチウイルスの産生
適切な構築物をコードするレンチウイルスを以下のように調製した。5×106個のHEK293FT細胞を、100mmのディッシュに播種し、培養密度70~90%になるまで一夜置いた。示されたDNAプラスミド2.5μg及びレンチウイルスパッケージングミックス(ALSTEM、カタログ番号VP100;付属書B3参照)20μLを0.5mLの血清を含まないDMEMまたはOpti-MEM I培地で希釈し、緩やかに混合した。別のチューブで、NanoFectトランスフェクション試薬(ALSTEM、カタログ番号NF100)30μLを、0.5mLの血清を含まないDMEMまたはOpti-MEM I培地で希釈し、緩やかに混合した。これらNanoFect/DMEM及びDNA/DMEM溶液をその後混合し、10~15秒間ボルテックスし、その後、このDMEM-プラスミド-NanoFect混合物を室温で15分間インキュベートした。前段階からの完全トランスフェクション複合体を、細胞のプレートに滴下し、揺動してプレート内のトランスフェクション複合体を均等に分散させた。このプレートをその後加湿された5%CO2インキュベータ内で、37℃で一夜インキュベートした。翌日、上清を10mLの新たな培地で置換し、ViralBoost(500x、ALSTEM、カタログ番号VB100)20μLを追加した。これらのプレートをその後さらに24時間、37℃でインキュベートした。レンチウイルスを含む上清をその後50mLの滅菌蓋つきコニカル遠心チューブに採取し、氷上に置いた。4℃で15分間、3000rpmでの遠心分離後、透明な上清を低タンパク質結合性0.45μm滅菌フィルターでろ過し、続いてウイルスを4℃で1.5時間、25,000rpmの超遠心分離(Beckmann、L8-70M)によって単離した。このペレットを取り出し、DMEM培地に再懸濁し、レンチウイルス濃度/力価を、定量的RT-PCRにて、Lenti-X qRT-PCR滴定キット(Clontech;カタログ番号631235)を用いて確立した。任意の残余のプラスミドDNAは、DNaseIで処理することで除去した。このウイルスストック調製物は、すぐに感染に用いたか、または等分し、後の使用のために-80℃で保存した。
レンチウイルスの産生
適切な構築物をコードするレンチウイルスを以下のように調製した。5×106個のHEK293FT細胞を、100mmのディッシュに播種し、培養密度70~90%になるまで一夜置いた。示されたDNAプラスミド2.5μg及びレンチウイルスパッケージングミックス(ALSTEM、カタログ番号VP100;付属書B3参照)20μLを0.5mLの血清を含まないDMEMまたはOpti-MEM I培地で希釈し、緩やかに混合した。別のチューブで、NanoFectトランスフェクション試薬(ALSTEM、カタログ番号NF100)30μLを、0.5mLの血清を含まないDMEMまたはOpti-MEM I培地で希釈し、緩やかに混合した。これらNanoFect/DMEM及びDNA/DMEM溶液をその後混合し、10~15秒間ボルテックスし、その後、このDMEM-プラスミド-NanoFect混合物を室温で15分間インキュベートした。前段階からの完全トランスフェクション複合体を、細胞のプレートに滴下し、揺動してプレート内のトランスフェクション複合体を均等に分散させた。このプレートをその後加湿された5%CO2インキュベータ内で、37℃で一夜インキュベートした。翌日、上清を10mLの新たな培地で置換し、ViralBoost(500x、ALSTEM、カタログ番号VB100)20μLを追加した。これらのプレートをその後さらに24時間、37℃でインキュベートした。レンチウイルスを含む上清をその後50mLの滅菌蓋つきコニカル遠心チューブに採取し、氷上に置いた。4℃で15分間、3000rpmでの遠心分離後、透明な上清を低タンパク質結合性0.45μm滅菌フィルターでろ過し、続いてウイルスを4℃で1.5時間、25,000rpmの超遠心分離(Beckmann、L8-70M)によって単離した。このペレットを取り出し、DMEM培地に再懸濁し、レンチウイルス濃度/力価を、定量的RT-PCRにて、Lenti-X qRT-PCR滴定キット(Clontech;カタログ番号631235)を用いて確立した。任意の残余のプラスミドDNAは、DNaseIで処理することで除去した。このウイルスストック調製物は、すぐに感染に用いたか、または等分し、後の使用のために-80℃で保存した。
同様の実験を、FAP.TFP及びCAIX.TFP構築物で行うことができる。
PBMC単離
末梢血単核球(PBMC)は、全血またはバフィーコートのいずれかから調製した。全血は、10mLのヘパリンバキュテナーに採取し、すぐに処理したか、または4℃で一夜保存した。抗凝固処理した全血約10mLを、50mLのコニカル遠心チューブで、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液と総体積20mLになるまで混合した(PBS、pH7.4、Ca2+/Mg2+を含まない)。この血液/PBS混合物20mLをその後静かに15mLのFicoll-Paque PLUS(GE Healthcare、17-1440-03)の表面に載せ、その後400gで30~40分間、室温にて、ブレーキをかけることなく遠心分離した。
末梢血単核球(PBMC)は、全血またはバフィーコートのいずれかから調製した。全血は、10mLのヘパリンバキュテナーに採取し、すぐに処理したか、または4℃で一夜保存した。抗凝固処理した全血約10mLを、50mLのコニカル遠心チューブで、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液と総体積20mLになるまで混合した(PBS、pH7.4、Ca2+/Mg2+を含まない)。この血液/PBS混合物20mLをその後静かに15mLのFicoll-Paque PLUS(GE Healthcare、17-1440-03)の表面に載せ、その後400gで30~40分間、室温にて、ブレーキをかけることなく遠心分離した。
バフィーコートは、Research Blood Components(マサチューセッツ州ボストン)から購入した。Leucosepチューブ(Greiner bio-one)は、15mLのFicoll-Paque(GE Health Care)を加えて準備し、1000gで1分間遠心分離した。バフィーコートは、PBS(pH7.4、Ca2+もMg2+も含まない)で1:3に希釈した。この希釈バフィーコートをLeucosepチューブに移し、1000gで15分間、ブレーキをかけることなく遠心分離した。希釈血漿/Ficoll界面に見られる末梢血単核球(PBMC)を含む
細胞層を、Ficollの混入を最小限にするように注意深く取り出した。残余のFicoll、血小板、及び血漿タンパク質は、その後、このPBMCを40mLのPBSで3回、室温にて200gで10分間遠心分離することによって洗浄して除去した。これらの細胞をその後血球計で計数した。この洗浄PBMCをCAR-T培地(AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)、5%AB血清及び1.25μg/mLアンホテリシンB(Gemini Bioproducts、カリフォルニア州ウッドランド)、100U/mLペニシリン、ならびに100μ/mLストレプトマイシンを含む)で一度洗浄した。別の方法として、この洗浄PBMCを断熱バイアルに移し、-80℃で24時間凍結し、その後、後の使用のために液体窒素中で保存した。
細胞層を、Ficollの混入を最小限にするように注意深く取り出した。残余のFicoll、血小板、及び血漿タンパク質は、その後、このPBMCを40mLのPBSで3回、室温にて200gで10分間遠心分離することによって洗浄して除去した。これらの細胞をその後血球計で計数した。この洗浄PBMCをCAR-T培地(AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)、5%AB血清及び1.25μg/mLアンホテリシンB(Gemini Bioproducts、カリフォルニア州ウッドランド)、100U/mLペニシリン、ならびに100μ/mLストレプトマイシンを含む)で一度洗浄した。別の方法として、この洗浄PBMCを断熱バイアルに移し、-80℃で24時間凍結し、その後、後の使用のために液体窒素中で保存した。
同様の実験を、FAP.TFP及びCAIX.TFP構築物で行うことができる。
T細胞の活性化
全血またはバフィーコートのいずれかから調製した末梢血単核球(PBMC)を、ウイルスの形質導入に先立って、抗ヒトCD28及びCD3抗体結合磁気ビーズで24時間刺激した。新たに単離したPBMCを、CAR-T培地(AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)、5%AB血清及び1.25μg/mLアンホテリシンB(Gemini Bioproducts)、100U/mLペニシリン、ならびに100μg/mLストレプトマイシンを含む)でhuIL-2なしで一度洗浄し、その後300IU/mLのヒトIL-2(1000xストックから;Invitrogen)を含むCAR-T培地に、最終濃度1×106細胞/mLで再懸濁した。PBMCが前もって凍結されたものであった場合、これらを解凍し、予め温めた(37℃)cDMEM培地(Life Technologies)9mLに1×107細胞/mLで再懸濁し、10%FBS、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシンの存在下、1×106細胞/mLの濃度で、CART培地で一度洗浄し、CAR-T培地に1×106細胞/mLで再懸濁し、上記の通りIL-2を添加した。
全血またはバフィーコートのいずれかから調製した末梢血単核球(PBMC)を、ウイルスの形質導入に先立って、抗ヒトCD28及びCD3抗体結合磁気ビーズで24時間刺激した。新たに単離したPBMCを、CAR-T培地(AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)、5%AB血清及び1.25μg/mLアンホテリシンB(Gemini Bioproducts)、100U/mLペニシリン、ならびに100μg/mLストレプトマイシンを含む)でhuIL-2なしで一度洗浄し、その後300IU/mLのヒトIL-2(1000xストックから;Invitrogen)を含むCAR-T培地に、最終濃度1×106細胞/mLで再懸濁した。PBMCが前もって凍結されたものであった場合、これらを解凍し、予め温めた(37℃)cDMEM培地(Life Technologies)9mLに1×107細胞/mLで再懸濁し、10%FBS、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシンの存在下、1×106細胞/mLの濃度で、CART培地で一度洗浄し、CAR-T培地に1×106細胞/mLで再懸濁し、上記の通りIL-2を添加した。
活性化に先立って、抗ヒトCD28及びCD3抗体結合磁気ビーズ(Invitrogen)を、磁気ラックを使用して1mLの滅菌1x PBS(pH7.4)で3回洗浄してビーズをこの溶液から分離し、その後、300IU/mLのヒトIL-2とともにCAR-T培地に再懸濁し、最終濃度4×107ビーズ/mLにした。PBMC及びビーズをその後、25μL(1×106ビーズ)のビーズを1mLのPBMCに移すことで、ビーズ対細胞比1:1で混合した。所望の数の分割量をその後12ウェルの低付着性または未処理の細胞培養プレートの単一のウェルに分配し、ウイルスの形質導入に先立って37℃、5%CO2にて24時間インキュベートした。
同様の実験を、FAP.TFP及びCAIX.TFP構築物で行うことができる。
T細胞の形質導入/トランスフェクション及び増殖
PBMCの活性化後、細胞を37℃、5%CO2にて24時間インキュベートした。レンチウイルスを氷上で解凍し、5×106のレンチウイルスを、培地1mL当たり2μLのTransplus(Alstem)(最終希釈1:500)とともに1×106細胞の各ウェルに加えた。細胞をさらに24時間インキュベートし、その後ウイルスの添加を繰り返した。別の方法として、レンチウイルスを氷上で解凍し、それぞれのウイルスを5μg/mLのポリブレン(Sigma)の存在下、5または50MOIで加えた。細胞を室温で100分間、100gでスピノキュレートした。細胞をその後、300IU/mLのヒトIL-2の継続的な存在下で6~14日間成長させた(総インキュベート時間は、必要とされる最終的なCAR-T細胞の数による)。細胞濃度は、2~3日ごとに分析し、その際、培地を追加して細胞懸濁液を1×106細胞/mLに維持した。
PBMCの活性化後、細胞を37℃、5%CO2にて24時間インキュベートした。レンチウイルスを氷上で解凍し、5×106のレンチウイルスを、培地1mL当たり2μLのTransplus(Alstem)(最終希釈1:500)とともに1×106細胞の各ウェルに加えた。細胞をさらに24時間インキュベートし、その後ウイルスの添加を繰り返した。別の方法として、レンチウイルスを氷上で解凍し、それぞれのウイルスを5μg/mLのポリブレン(Sigma)の存在下、5または50MOIで加えた。細胞を室温で100分間、100gでスピノキュレートした。細胞をその後、300IU/mLのヒトIL-2の継続的な存在下で6~14日間成長させた(総インキュベート時間は、必要とされる最終的なCAR-T細胞の数による)。細胞濃度は、2~3日ごとに分析し、その際、培地を追加して細胞懸濁液を1×106細胞/mLに維持した。
いくつかの例では、活性化されたPBMCをインビトロで転写された(IVT)mRNAでエレクトロポレートした(図14)。ヒトPBMCをDynaビーズ(ThermoFisher)で1対1の比で3日間、300IU/mlの組み換えヒトIL-2(R&D System)の存在下で刺激した。このビーズはエレクトロポレーションの前に除去した。これらの細胞を洗浄し、OPTI-MEM培地(ThermoFisher)に2.5×107細胞/mLの濃度で再懸濁した。この細胞懸濁液200μL(5×106細胞)をギャップ2mmのElectroporation Cuvettes Plus(商標)(Harvard Apparatus BTX)に移し、氷上で予冷した。10μgのIVT TFP mRNAをこの細胞懸濁液に加えた。このmRNA/細胞混合物をその後、ECM830 Eletro Square Wave Porator(Harvard Apparatus BTX)を用いて200Vで20ミリ秒間エレクトロポレートした。このエレクトロポレーションの直後、細胞を新たな細胞培養培地(AIM V AlbuMAX(BSA)無血清培地+5%ヒトAB血清+300IU/ml IL-2)に移し、37℃でインキュベートした。
同様の実験を、FAP.TFP及びCAIX.TFP構築物で行うことができる。
細胞染色によるTFP発現の検証
レンチウイルスの形質導入またはmRNAのエレクトロポレーションに続いて、抗CD19、抗FAP、抗CAIX、及び抗BCMA CARならびにTFPの発現を、抗マウスFab抗体を用いてフローサイトメトリーにて確認し、マウス抗CD19、抗FAP、抗CAIX、または抗BCMA scFvを検出した。T細胞を3mLの染色用緩衝液(PBS、4%BSA)にて3回洗浄し、ウェル当たり1×106細胞でPBSに再懸濁した。死細胞の排除のため、細胞をLive dead aqua(Invitrogen)で30分間氷上にてインキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、50μLの染色用緩衝液に再懸濁した。Fc受容体をブロックするため、1μLの1:100希釈正常ヤギIgG(LifeTechnologies)を各チューブに加え、氷中で10分間インキュベートした。FACS緩衝液1.0mLを各チューブに加え、よく混合し、細胞を300gで5分間の遠心分離によってペレットにした。scFv TFPの表面発現は、ビオチン標識ポリクローナルヤギ抗マウスF(ab)2抗体(Life Technologies)と、アイソタイプコントロールとして働くビオチン標識正常ポリクローナルヤギIgG抗体(Life Technologies)によって検出した。両抗体を100μLの反応体積中、10μg/mLで加えた。細胞をその後4℃で45分間インキュベートし、1回洗浄し、FACS緩衝液に再懸濁し、100μLの1:1000希釈正常マウスIgGを各チューブに加えることによって、正常マウスIgG(Invitrogen)でブロックした。細胞をその後氷上で10分間インキュベートし、染色用緩衝液で洗浄し、100μLの染色用緩衝液に再懸濁した。これらの細胞をその後、1.0μLのフィコエリトリン(PE)標識ストレプトアビジン(BD Biosciences)の添加によって染色し、APC抗ヒトCD3抗体(クローンUCHT1、BD Biosciences)、PerCP/Cy5.5抗ヒトCD8抗体(クローンSK1、BD Biosciences)、及びパシフィックブルー抗ヒトCD4抗体(クローンRPA-T4、BD Biosciences)を各チューブに加えた。フローサイトメトリーをLSRFortessa(商標)X20(BD Biosciences)を用いて行い、データをFACS divaソフトウェアを用いて取得し、FlowJo(Treestar,Inc.オレゴン州アシュランド)で解析した。形質導入T細胞の20%~40%が抗CD19 CAR、抗CD19 LL TFP、抗CD19 SL TFP、または抗BCMA TFPを発現し、CAR及びTFP構築物の同等のレベルの形質導入ならびに表面発現を示した(図5~7)。
レンチウイルスの形質導入またはmRNAのエレクトロポレーションに続いて、抗CD19、抗FAP、抗CAIX、及び抗BCMA CARならびにTFPの発現を、抗マウスFab抗体を用いてフローサイトメトリーにて確認し、マウス抗CD19、抗FAP、抗CAIX、または抗BCMA scFvを検出した。T細胞を3mLの染色用緩衝液(PBS、4%BSA)にて3回洗浄し、ウェル当たり1×106細胞でPBSに再懸濁した。死細胞の排除のため、細胞をLive dead aqua(Invitrogen)で30分間氷上にてインキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、50μLの染色用緩衝液に再懸濁した。Fc受容体をブロックするため、1μLの1:100希釈正常ヤギIgG(LifeTechnologies)を各チューブに加え、氷中で10分間インキュベートした。FACS緩衝液1.0mLを各チューブに加え、よく混合し、細胞を300gで5分間の遠心分離によってペレットにした。scFv TFPの表面発現は、ビオチン標識ポリクローナルヤギ抗マウスF(ab)2抗体(Life Technologies)と、アイソタイプコントロールとして働くビオチン標識正常ポリクローナルヤギIgG抗体(Life Technologies)によって検出した。両抗体を100μLの反応体積中、10μg/mLで加えた。細胞をその後4℃で45分間インキュベートし、1回洗浄し、FACS緩衝液に再懸濁し、100μLの1:1000希釈正常マウスIgGを各チューブに加えることによって、正常マウスIgG(Invitrogen)でブロックした。細胞をその後氷上で10分間インキュベートし、染色用緩衝液で洗浄し、100μLの染色用緩衝液に再懸濁した。これらの細胞をその後、1.0μLのフィコエリトリン(PE)標識ストレプトアビジン(BD Biosciences)の添加によって染色し、APC抗ヒトCD3抗体(クローンUCHT1、BD Biosciences)、PerCP/Cy5.5抗ヒトCD8抗体(クローンSK1、BD Biosciences)、及びパシフィックブルー抗ヒトCD4抗体(クローンRPA-T4、BD Biosciences)を各チューブに加えた。フローサイトメトリーをLSRFortessa(商標)X20(BD Biosciences)を用いて行い、データをFACS divaソフトウェアを用いて取得し、FlowJo(Treestar,Inc.オレゴン州アシュランド)で解析した。形質導入T細胞の20%~40%が抗CD19 CAR、抗CD19 LL TFP、抗CD19 SL TFP、または抗BCMA TFPを発現し、CAR及びTFP構築物の同等のレベルの形質導入ならびに表面発現を示した(図5~7)。
同様の実験を、FAP.TFP及びCAIX.TFP構築物で行うことができる。
実施例7:フローサイトメトリーによる細胞傷害性アッセイ
それぞれCD19、FAP、CAIX、またはBCMA標的に対して陽性または陰性のいずれかである標的細胞を蛍光染料であるカルボキシフルオレセイン二酢酸サクシニミジルエステル(CFSE)で標識した。これらの標的細胞を、未形質導入であるか、対照のCAR-T構築物で形質導入、またはTFPで形質導入されたエフェクターT細胞と混合した。示されたインキュベーション時間の後、死対生CFSE標識標的細胞及び陰性対照の標的細胞の割合を各エフェクター/標的細胞培養に対してフローサイトメトリーで決定した。各T細胞+標的細胞培養における標的細胞の生存率を、標的細胞のみを含むウェルに対して計算した。
それぞれCD19、FAP、CAIX、またはBCMA標的に対して陽性または陰性のいずれかである標的細胞を蛍光染料であるカルボキシフルオレセイン二酢酸サクシニミジルエステル(CFSE)で標識した。これらの標的細胞を、未形質導入であるか、対照のCAR-T構築物で形質導入、またはTFPで形質導入されたエフェクターT細胞と混合した。示されたインキュベーション時間の後、死対生CFSE標識標的細胞及び陰性対照の標的細胞の割合を各エフェクター/標的細胞培養に対してフローサイトメトリーで決定した。各T細胞+標的細胞培養における標的細胞の生存率を、標的細胞のみを含むウェルに対して計算した。
エフェクターT細胞の細胞傷害活性は、エフェクター及び標的細胞の共インキュベーション後のエフェクターT細胞を含まないまたは含む標的細胞における生存標的細胞の数を、フローサイトメトリーを用いて比較することによって測定した。CD19 TFPまたはCAR-T細胞での実験において、標的細胞はCD19陽性Raji Burkittリンパ腫細胞(ATCC,CCL-86)であり、陰性対照として用いた細胞はCD19陰性K562細胞(ATCC,CCL-243)であった。BCMA TFP T細胞での実験では、標的細胞はBCMA陽性RPMI-8226形質細胞腫/骨髄腫細胞(ATCC,CCL-155)であり、陰性対照として用いた細胞は、BCMA陰性Raji Burkittリンパ腫細胞(ATCC,CCL-86)であった。
標的細胞は、一度洗浄し、PBSに1×106細胞/mLで再懸濁した。蛍光染料のカルボキシフルオレセイン二酢酸サクシニミジルエステル(CFSE)(ThermoFisher)を濃度0.03μMでこの細胞懸濁液に加え、これらの細胞を室温で20分間インキュベートした。反応体積の5倍の体積で完全細胞培養培地(RPMI-1640+10%HI-FBS)をこの細胞懸濁液に加えることによって、この標識化反応を止め、室温でさらに2分間、これらの細胞をインキュベートした。これらの細胞を遠心分離によってペレットにし、細胞傷害性培地(フェノールレッドを含まないRPMI1640(Invitrogen)プラス5%AB血清(Gemini Bioproducts)に2×105細胞/mLで再懸濁した。CFSE標識標的細胞懸濁液(10,000細胞に相当)50マイクロリットルを96ウェルのU底プレート(Corning)の各ウェルに加えた。
BCMA TFP構築物で形質導入されたエフェクターT細胞を、陰性対照としての未形質導入T細胞と一緒に洗浄し、細胞傷害性培地に2×106細胞/mLまたは1×106細胞/mLで懸濁した。エフェクターT細胞懸濁液50μL(100,000または50,000細胞に相当)を、播種した標的細胞に加え、総体積100μL中、それぞれエフェクター対標的比10対1または5対1にした。これらの培養物をその後混合し、沈降させ、37℃、5%CO2にて4時間インキュベートした。このインキュベートの直後、7AAD(7-アミノアクチノマイシンD)(BioLegend)をメーカーの推奨通りにこの培養細胞に加え、BD Fortessa X-20(BD Biosciences)でフローサイトメトリーを行った。フローサイトメトリーデータの解析は、FlowJoソフトウェア(TreeStar,Inc.)を用いて行った。
RPMI-8226標的細胞の生存率は、エフェクターT細胞及び標的細胞を含む試料中の生存RPMI-8226標的細胞数(CFSE+7-AAD-)を、標的細胞のみを含む試料中の生存RPMI-8226標的細胞数(CFSE+7-AAD-)で除することによって計算した。エフェクター細胞の細胞傷害性は、RPMI-8226の殺傷率=100%-RPMI-8226細胞の生存率として計算した。
上記の通り、抗CD19-28ζ CAR構築物で形質導入されたT細胞は、未形質導入であるか、または非CD19特異的CAR対照で形質導入したT細胞と比較した場合に、CD19発現Raji B細胞に対して細胞傷害性を示した(図8)。しかしながら、抗CD19-CD3εで形質導入されたT細胞は、調べたすべてのエフェクター:標的比において、抗CD19 CAR対照よりもRaji標的に対して効果的な細胞傷害性を誘導した。抗CD19-CD3γ TFPもまた、5~10:1のエフェクター:標的比において、抗CD19 CARで観察されるよりも高かった強い細胞傷害性を媒介した(図8)。多少の細胞傷害性が抗CD19-TCRα及び抗CD19-TCRβ TFPで観察された。同様の結果が、代替ヒンジ領域で構築された抗CD19 TFPで得られた。今度もまた、CD19発現Raji標的細胞に対する細胞傷害性は、抗CD19-CD3εまたは抗CD19-CD3γ TFPで形質導入されたT細胞で、抗CD19-CARで形質導入されたT細胞よりも高かった。
CD-19に特異的なTFPをコードするmRNAでエレクトロポレートされたT細胞もまた、CD19発現Raji細胞に対する強い細胞傷害性を示した。対照や抗CD19
TRuC構築物のいずれでもCD19陰性K562細胞の有意な殺傷が見られなかった一方、RajiのCD19に特異的な殺傷が、抗CD19-CD3ε SLまたは抗CD19-CD3γ SL TRuCのいずれかで形質導入されたT細胞によって観察された(図14)。
TRuC構築物のいずれでもCD19陰性K562細胞の有意な殺傷が見られなかった一方、RajiのCD19に特異的な殺傷が、抗CD19-CD3ε SLまたは抗CD19-CD3γ SL TRuCのいずれかで形質導入されたT細胞によって観察された(図14)。
B細胞成熟抗原(BCMA)に特異的なTFPで形質導入されたT細胞も同様に、BCMA発現RPMI8226細胞に対する強い細胞傷害性を示した。抗BCMA-CD3εまたは抗BCMA-CD3γ TFPで形質導入されたT細胞は、BCMA発現RPMI8226標的細胞に対する細胞傷害性を効果的に媒介した。エフェクター対標的細胞比10:1では、標的細胞のほとんど100%が殺傷された(図9)。
同様の実験を、FAP.TFP及びCAIX.TFP構築物で行うことができる。
実施例8:リアルタイム細胞傷害性アッセイによる細胞傷害性
抗CD19及び抗BCMA TFPはまた、リアルタイム細胞傷害性アッセイ(RTCA)形式でも抗CD19 CARより優れた細胞傷害性を示した。RTCAアッセイは、特殊な96ウェルプレートの各ウェルで、リアルタイムで接着性の標的細胞単層の電気インピーダンスを測定し、最終的な読み出しを細胞指数と呼ばれる値として示す。細胞指数の変化は、同時にインキュベートされたT細胞エフェクターによる標的細胞の殺傷の結果として、標的細胞単層の破壊を示す。従って、エフェクターT細胞の細胞傷害性は、標的細胞及びエフェクターT細胞の両方を含むウェルの細胞指数と標的細胞のみを含むウェルのそれとを比較した変化として評価することができる。
抗CD19及び抗BCMA TFPはまた、リアルタイム細胞傷害性アッセイ(RTCA)形式でも抗CD19 CARより優れた細胞傷害性を示した。RTCAアッセイは、特殊な96ウェルプレートの各ウェルで、リアルタイムで接着性の標的細胞単層の電気インピーダンスを測定し、最終的な読み出しを細胞指数と呼ばれる値として示す。細胞指数の変化は、同時にインキュベートされたT細胞エフェクターによる標的細胞の殺傷の結果として、標的細胞単層の破壊を示す。従って、エフェクターT細胞の細胞傷害性は、標的細胞及びエフェクターT細胞の両方を含むウェルの細胞指数と標的細胞のみを含むウェルのそれとを比較した変化として評価することができる。
RTCAに対する標的細胞は、HeLa細胞でCD19を発現する(CD19-HeLa)またはBCMAを発現する(BCMA-HeLa)ものと、陰性対照として、親の、未形質導入HeLa細胞である。完全長ヒトCD19またはBCMAをコードするDNAは、GeneArt(ThermoFisher)によって合成し、EF1aプロモーターの制御下で、選択マーカーとしてネオマイシンを担持するデュアルプロモーターのレンチウイルスベクターpCDH514B(System Bioscience)の複数のクローニング部位に挿入した。CD19またはBCMAをコードするベクターのいずれかを担持するレンチウイルスをその後パッケージした。HeLa細胞をCD19またはBCMAレンチウイルスのいずれかで24時間形質導入し、その後G418(1mg/mL)で選択した。この形質導入されたCD19-HelaまたはBCMA-HeLaによるCD19またはBCMAの発現は、抗ヒトCD19またはBCMA抗体(BioLegend、クローン番号19A2;Miltenyi、クローン番号REA315)でのFAC
S分析によって確認した。
S分析によって確認した。
接着性標的細胞は、DMEM、10%FBS、1%抗生物質-抗真菌剤(Life Technologies)で培養した。RTCAの調製のため、RPMI培地50μLをEプレート(ACEA Biosciences,Inc,カタログ番号:JL-10-156010-1A)の適切なウェルに加えた。このプレートをRTCA MP機器(ACEA Biosciences,Inc.)内に配置し、適切なプレートのレイアウト及びアッセイスケジュールを、メーカーの取扱説明書に記載の通り、RTCA2.0ソフトウェアに入力した。ベースラインの測定は、100回の測定に対して15分毎に行った。体積100μL中1×104個の標的細胞をその後各アッセイウェルに加え、これらの細胞を15分間沈殿させた。このプレートを読み取り機に戻し、読み取りを再開した。
翌日、エフェクターT細胞を洗浄し、細胞傷害性培地(フェノールレッドを含まないRPMI1640(Invitrogen)プラス5%AB血清(Gemini Bioproducts;100-318))に再懸濁した。このプレートをその後機器から取り出し、細胞傷害性培地(フェノールレッドを含まないRPMI1640+5%AB血清)に懸濁したエフェクターT細胞を100,000細胞または50,000細胞で各ウェルに加え、エフェクター対標的比をそれぞれ10対1または5対1にした。このプレートをその後機器に戻した。測定を100測定について2分ごとに行い、その後1000測定について15分ごとに行った。
RTCAアッセイにおいて、CD19で形質導入されたHeLaの殺傷は、エフェクター細胞の添加後、HeLa単独または対照のCAR構築物で形質導入されたT細胞と共インキュベートされたHeLaと比較して、細胞指数の時間依存性の減少によって示されるように、抗CD19-28ζ CARで形質導入されたT細胞で形質導入されたT細胞によって観察された(図11)。しかしながら、抗CD19-CD3εまたは抗BCMA-CD3γ TFP発現T細胞による標的細胞の殺傷は、抗CD19 CARで観察されるよりも深く、迅速であった。例えば、抗CD19-CD3ε TFPで形質導入されたT細胞の添加の4時間以内に、CD19発現標的細胞の殺傷は基本的に完了した。他のCD3及びTCR構築物を含み複数のTFP構築物で形質導入されたT細胞にはほとんどまたは全く殺傷が観察されなかった。同様の結果が、代替ヒンジ領域で構築された抗CD19
TFPで得られた。CD19で形質導入されたHeLa標的細胞に対する細胞傷害性は、この場合もやはり抗CD19-CD3εまたは抗CD19-CD3γ TFPで形質導入されたT細胞で、抗CD19-CARで形質導入されたT細胞よりも大きかった。
TFPで得られた。CD19で形質導入されたHeLa標的細胞に対する細胞傷害性は、この場合もやはり抗CD19-CD3εまたは抗CD19-CD3γ TFPで形質導入されたT細胞で、抗CD19-CARで形質導入されたT細胞よりも大きかった。
抗BCMA TFPで形質導入されたT細胞もまた、BCMA発現RPMI8226細胞に対して強い細胞傷害性を示した。図9に示す通り、抗BCMA-CD3εまたは抗BCMA-CD3γ TFPで形質導入されたT細胞は、BCMA発現RPMI8226標的細胞に対する細胞傷害性を効果的に媒介した。エフェクター対標的比10:1で、ほとんど100%の標的細胞が殺傷された(図12)。
TFPで形質導入されたT細胞の細胞傷害活性は、形質導入に使用されたウイルス量(MOI)に対して用量依存的であった。CD19-HeLaの殺傷の増加は、抗CD19-CD3ε TFPレンチウイルスのMOIの増加とともに観察され、TFPの形質導入と細胞傷害活性の関係がさらに強まった(図13)。
同様の実験を、FAP.TFP及びCAIX.TFP構築物で行うことができる。
実施例9:ELISAによるIL-2及びIFN-γ分泌
同族抗原を有する細胞の認識と関連するエフェクターT細胞活性化及び増殖の別の尺度
は、インターロイキン-2(IL-2)及びインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)等のエフェクターサイトカインの産生である。
同族抗原を有する細胞の認識と関連するエフェクターT細胞活性化及び増殖の別の尺度
は、インターロイキン-2(IL-2)及びインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)等のエフェクターサイトカインの産生である。
ヒトIL-2に対するELISAアッセイ(カタログ番号EH2IL2、Thermo
Scientific)及びIFN-γに対するELISAアッセイ カタログ番号KHC4012、Invitrogen)をこれら製品の挿入物に記載の通りに行った。簡潔には、50μLの再構成された標準または試料を二連で96ウェルプレートの各ウェルに加え、続いてビオチン化抗体試薬50μLを加えた。試料は、プレートを数回静かにタップすることによって混合した。その後標準も試料も含まないウェルのすべてに標準希釈剤を50μL加え、このプレートを慎重に接着プレートカバーで密封し、その後室温(20~25℃)で3時間インキュベートした。このプレートカバーをその後外し、プレートの中を空にし、各ウェルに洗浄用緩衝液を満たした。この洗浄手順を合計3回繰り返し、このプレートを紙タオルや他の吸収材料にあてた。調製ストレプトアビジン-HRP溶液100μLを各ウェルに加え、新しいプレートカバーを取り付けた後、室温で30分間インキュベートした。このプレートカバーを再び外し、このプレートの内容物を廃棄し、TMB基質溶液100μLを各ウェルに加えた。室温の暗所で30分間反応させ、その後停止液100μLを各ウェルに加えた。このプレートを評価する。反応停止の30分以内に、450nm及び550nmに設定されたELISAプレートリーダーで吸光度を測定した。450nmの値から550nmの値を引き、未知の試料のIL-2量をIL-2標準曲線から得られる値と比較して計算した。
Scientific)及びIFN-γに対するELISAアッセイ カタログ番号KHC4012、Invitrogen)をこれら製品の挿入物に記載の通りに行った。簡潔には、50μLの再構成された標準または試料を二連で96ウェルプレートの各ウェルに加え、続いてビオチン化抗体試薬50μLを加えた。試料は、プレートを数回静かにタップすることによって混合した。その後標準も試料も含まないウェルのすべてに標準希釈剤を50μL加え、このプレートを慎重に接着プレートカバーで密封し、その後室温(20~25℃)で3時間インキュベートした。このプレートカバーをその後外し、プレートの中を空にし、各ウェルに洗浄用緩衝液を満たした。この洗浄手順を合計3回繰り返し、このプレートを紙タオルや他の吸収材料にあてた。調製ストレプトアビジン-HRP溶液100μLを各ウェルに加え、新しいプレートカバーを取り付けた後、室温で30分間インキュベートした。このプレートカバーを再び外し、このプレートの内容物を廃棄し、TMB基質溶液100μLを各ウェルに加えた。室温の暗所で30分間反応させ、その後停止液100μLを各ウェルに加えた。このプレートを評価する。反応停止の30分以内に、450nm及び550nmに設定されたELISAプレートリーダーで吸光度を測定した。450nmの値から550nmの値を引き、未知の試料のIL-2量をIL-2標準曲線から得られる値と比較して計算した。
別の方法として、2プレックスアッセイをヒトサイトカイン磁気緩衝液試薬キット(Invitrogen、LHB0001M)をヒトIL-2磁気ビーズキット(Invitrogen、LHC0021M)及びヒトIFN-γ磁気ビーズキット(Invitrogen、LHC4031M)とともに用いて行った。簡潔には、25μLのヒトIL-2及びIFN-γ抗体ビーズを96ウェルプレートの各ウェルに加え、以下のガイドラインを用いて洗浄した:1x洗浄液200μLの2回洗浄、プレートを磁気96ウェルプレートセパレータ(Invitrogen、A14179)に接触させて置き、ビーズを1分間沈殿させ、液体をデカントする。その後、インキュベーション緩衝液50μLをプレートの各ウェルに、二連で再構成標準100μLまたは三連で試料(細胞傷害性アッセイからの上清)50μL及びアッセイ用希釈剤50μLを加え、合計体積を150μLにした。試料を暗所にて、軌道半径3mmのオービタルシェーカーを用いて、室温で2時間、600rpmで混合した。同じ洗浄ガイドラインに従ってこのプレートを洗浄し、100μLのヒトIL-2及びIFN-γビオチン化検出抗体を各ウェルに加えた。試料を暗所にて、軌道半径3mmのオービタルシェーカーを用いて、室温で1時間、600rpmで混合した。同じ洗浄ガイドラインに従ってこのプレートを洗浄し、ストレプトアビジン-R-フィコエリトリン100μLを各ウェルに加えた。試料を暗所にて、軌道半径3mmのオービタルシェーカーを用いて、室温で30分間、600rpmで混合した。同じ洗浄ガイドラインを用いてこのプレートを3回洗浄し、液体をデカント後、試料を1x洗浄液150μLに再懸濁した。これらの試料を、軌道半径3mmのオービタルシェーカーを用いて、600rpmで3分間混合し、4℃で一夜保存した。その後、同じ洗浄ガイドラインに従ってこのプレートを洗浄し、これらの試料を1x洗浄液150μLに再懸濁した。
このプレートをMAGPIXシステム(Luminex)及びxPONENTソフトウェアを用いて読み取った。このデータの解析は、標準曲線とサイトカイン濃度を与えるMILLIPLEX Analystソフトウェアを用いて行った。
図15は、未形質導入または対照のCARで形質導入されたT細胞に対して、抗CD19 TFPで形質導入されたT細胞が、内因的にCD19を発現するRaji細胞またはCD19で形質導入されたHeLa細胞のどちらかと共培養された場合に高レベルのIL
-2及びIFN-γの両方を産生することを示している。対照的に、CD19陰性K562細胞または未形質導入HeLa細胞との共培養では、TFPで形質導入されたT細胞からほとんどサイトカインが分泌されなかった。先の細胞傷害性のデータと一致して、代替ヒンジ領域で構築された抗CD19 TFPは、CD19を有する標的細胞との共培養で同様の結果をもたらした(図16)。
-2及びIFN-γの両方を産生することを示している。対照的に、CD19陰性K562細胞または未形質導入HeLa細胞との共培養では、TFPで形質導入されたT細胞からほとんどサイトカインが分泌されなかった。先の細胞傷害性のデータと一致して、代替ヒンジ領域で構築された抗CD19 TFPは、CD19を有する標的細胞との共培養で同様の結果をもたらした(図16)。
先の細胞傷害性のデータと一致して、抗CD19-CD3ε及び抗CD19-CD3γは、TFP構築物の中で最大レベルのIL-2及びIFN-γを生じた(図15及び16)。しかしながら、抗CD19-CD3ε及び抗CD19-CD3γ TFPで形質導入されたT細胞によるサイトカイン産生は、これらTFPがより高レベルの標的細胞の殺傷を示している(図8及び11)にもかかわらず、抗CD19-28ζ CARを発現するT細胞のそれと同程度であった。TFPはCARより効果的に標的細胞を殺傷するが、同程度またはより低いレベルの炎症性サイトカインを放出し得るという可能性は、高レベルのこれらサイトカインが、養子CAR-T療法に対する用量制限毒性と関連していることから、CARと比べてTFPの潜在的な利点を表している。
抗BCMA-CD3εまたは抗BCMA-CD3γ TFPで形質導入されたT細胞もまた、BCMAを発現しない対照のHeLa細胞ではなく、BCMA-HeLaとの共培養でIL-2及びIFN-γを産生した(図17)。
同様の実験を、FAP.TFP及びCAIX.TFP構築物で行うことができる。
実施例10:フローサイトメトリーによるCD107aの曝露
T細胞活性化のさらなるアッセイは、休止細胞における細胞質細胞溶解性顆粒の膜に位置するリソソーム膜タンパク質(LAMP-1)であるCD107aの表面発現である。エフェクターT細胞の脱顆粒、すなわち、細胞溶解活性の必要条件は、活性化誘導の顆粒エキソサイトーシス後、CD107aの細胞表面への動員をもたらす。従って、CD107aの曝露は、細胞傷害性と密接に相関するサイトカイン産生に加えて、T細胞活性化のさらなる尺度を与える。
T細胞活性化のさらなるアッセイは、休止細胞における細胞質細胞溶解性顆粒の膜に位置するリソソーム膜タンパク質(LAMP-1)であるCD107aの表面発現である。エフェクターT細胞の脱顆粒、すなわち、細胞溶解活性の必要条件は、活性化誘導の顆粒エキソサイトーシス後、CD107aの細胞表面への動員をもたらす。従って、CD107aの曝露は、細胞傷害性と密接に相関するサイトカイン産生に加えて、T細胞活性化のさらなる尺度を与える。
標的及びエフェクター細胞は別々に洗浄し、細胞傷害性培地(RPMI+5%ヒトAB血清+1%抗生物質抗真菌剤)に再懸濁した。このアッセイは、U底96ウェルプレート(Corning)にて、最終体積100μL中、0.5μL/ウェルのPE/Cy7標識抗ヒトCD107a(LAMP-1)抗体(クローンH4A3、BD Biosciences)の存在下、2×105個のエフェクター細胞と2×105個の標的細胞を混合することによって行った。これらの培養物をその後37℃、5%CO2にて1時間インキュベートした。このインキュベーションの直後、1:10希釈の分泌阻害剤モネンシン(1000x溶液、BD GolgiStop(商標))10μLを、細胞を乱さないように慎重に各ウェルに加えた。このプレートをその後37℃、5%CO2にてさらに2.5時間インキュベートした。このインキュベーションに続いて、これらの細胞をAPC抗ヒトCD3抗体(クローンUCHT1、BD Biosciences)、PerCP/Cy5.5抗ヒトCD8抗体(クローンSK1、BD Biosciences)、及びパシフィックブルー抗ヒトCD4抗体(クローンRPA-T4、BD Biosciences)で染色し、その後37℃、5%CO2にて30分間インキュベートした。これらの細胞をその後FACS緩衝液で2回洗浄し、(分析に先立ってFACS緩衝液100μL及びIC固定緩衝液100ulに再懸濁した。
T細胞表面でのCD107aの曝露は、フローサイトメトリーによって検出した。フローサイトメトリーは、LSRFortessa(商標)X20(BD Biosciences)で行い、フローサイトメトリーデータの解析は、FlowJoソフトウェア(T
reestar,Inc.オレゴン州アシュランド)を用いて行った。CD107+veであるCD3ゲート内のCD8+エフェクター細胞の割合を、各エフェクター/標的細胞培養について測定した。
reestar,Inc.オレゴン州アシュランド)を用いて行った。CD107+veであるCD3ゲート内のCD8+エフェクター細胞の割合を、各エフェクター/標的細胞培養について測定した。
先の細胞傷害性及びサイトカインのデータと一致して、RajiまたはNalm-6細胞等のCD-19発現標的細胞と抗CD19-28ζ CARで形質導入されたエフェクターT細胞の共培養は、CD19-ve標的細胞とともにインキュベートしたエフェクターと比較して、表面CD107a発現の3~5倍の増加を誘導した(図18)。同じ条件下で比較すると、抗CD19-CD3ε LLまたは抗CD19-CD3γ LL TFP発現エフェクターは、CD107a発現の5~7倍の誘導を呈した。代替ヒンジ領域で構築された抗CD19 TFPはCD19を有する標的細胞との共培養で同様の結果をもたらした。
未形質導入のT細胞と比較して、抗BCMA-CD3εまたは抗BCMA-CD3γ TFPで形質導入された細胞も同様に、BCMA+ve RPMI8226細胞との共培養でCD107aの表面発現の増加を呈した(図19)。これらの結果は、TFPで形質導入されたエフェクターT細胞が、それらの同族抗原を発現する標的細胞への曝露で活性化し、脱顆粒することを示している。
同様の実験を、FAP.TFP及びCAIX.TFP構築物で行うことができる。
実施例11:マウスでのインビボ効力研究
抗CD19 TFPで形質導入されたエフェクターT細胞のインビボでの抗腫瘍反応を達成する能力を評価するために、抗CD19-28ζ CAR、抗CD19-CD3ε LL TFP、または抗CD19-CD3γ LL TFPのいずれかで形質導入されたエフェクターT細胞を、前もってCD19+RajiまたはNalm-6ヒト白血病細胞株を接種したNOD/SCID/IL-2Rγ-/-(NSG-JAX)マウスに養子移入した。
抗CD19 TFPで形質導入されたエフェクターT細胞のインビボでの抗腫瘍反応を達成する能力を評価するために、抗CD19-28ζ CAR、抗CD19-CD3ε LL TFP、または抗CD19-CD3γ LL TFPのいずれかで形質導入されたエフェクターT細胞を、前もってCD19+RajiまたはNalm-6ヒト白血病細胞株を接種したNOD/SCID/IL-2Rγ-/-(NSG-JAX)マウスに養子移入した。
本研究の開始前に少なくとも6週齢の雌のNOD/SCID/IL-2Rγ-/-(NSG-JAX)マウスをJackson Laboratory(ストック番号005557)から入手し、実験的使用の前に3日間、順化させた。接種用のRaji及びNalm-6ヒト白血病細胞株は、対数期の培養に維持し、その後採取し、トリパンブルーで計数して生細胞数を測定した。腫瘍投与の当日、これらの細胞を300gで5分間遠心分離し、予め温めた滅菌PBSに、1×106細胞/100μL(Nalm-6)または5×105細胞/100μL(Raji)のいずれかで再懸濁した。未形質導入または抗CD19-28ζ CAR、抗CD19-CD3ε LL TFP、または抗CD3γ LL
TFP構築物で形質導入された養子移入用のT細胞を調製した。本研究の0日目、実験群あたり10匹の動物に5×105個のRajiまたは1×106個のNalm-6細胞のいずれかを静脈内投与した。三日後、滅菌PBS100μL中の示されたエフェクターT細胞集団5×106個を各動物に対して静脈内に移入した。これら動物における詳細な臨床観察を安楽死させるまで毎日記録した。死亡または安楽死まで、すべての動物に対して毎週体重測定を行った。被験物質及び対照物質の養子移入の35日後にすべての動物を安楽死させた。本研究中、瀕死と思われたすべての動物は、獣医師と協議の上、本研究の責任者の判断で安楽死させた。
TFP構築物で形質導入された養子移入用のT細胞を調製した。本研究の0日目、実験群あたり10匹の動物に5×105個のRajiまたは1×106個のNalm-6細胞のいずれかを静脈内投与した。三日後、滅菌PBS100μL中の示されたエフェクターT細胞集団5×106個を各動物に対して静脈内に移入した。これら動物における詳細な臨床観察を安楽死させるまで毎日記録した。死亡または安楽死まで、すべての動物に対して毎週体重測定を行った。被験物質及び対照物質の養子移入の35日後にすべての動物を安楽死させた。本研究中、瀕死と思われたすべての動物は、獣医師と協議の上、本研究の責任者の判断で安楽死させた。
未形質導入T細胞と比較して、抗CD19-28ζ CAR、抗CD19-CD3ε LL TFP、または抗CD19-CD3γ LL TFPのいずれかで形質導入されたT細胞の養子移入は、Raji(図20A)及びNalm6(図20B)の両方の担腫瘍マウスの生存を延長させ、抗CD19 CAR及びTFPで形質導入されたT細胞の両方
がこれらマウスモデルにおける対応する生存の延長で、標的細胞の殺傷を媒介することが可能であることを示した。集合的に、これらのデータは、TFPが、インビトロ及びインビボで、第一世代のCARより優れた抗原特異的な殺傷を示すキメラ受容体を作り出すための代替的なプラットフォームを表すということを示している。
がこれらマウスモデルにおける対応する生存の延長で、標的細胞の殺傷を媒介することが可能であることを示した。集合的に、これらのデータは、TFPが、インビトロ及びインビボで、第一世代のCARより優れた抗原特異的な殺傷を示すキメラ受容体を作り出すための代替的なプラットフォームを表すということを示している。
同様の実験を、FAP.TFP及びCAIX.TFP構築物で行うことができる。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、当業者には、かかる実施形態が例としてのみ提供されることが明らかであろう。多くの変形、変更、及び置換は、本発明から逸脱することなく当業者には直ちに想起されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明の実践において採用される場合があることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を決定すること、ならびにこれら特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの同等物がその適用を受けていることが意図される。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、当業者には、かかる実施形態が例としてのみ提供されることが明らかであろう。多くの変形、変更、及び置換は、本発明から逸脱することなく当業者には直ちに想起されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明の実践において採用される場合があることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を決定すること、ならびにこれら特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの同等物がその適用を受けていることが意図される。
本願は以下の発明を包含する。
[項目1] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3εの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b) 抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。
[項目2] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3γの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b) 抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。
[項目3] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3δの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b) 抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。
[項目4] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCRαの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b) 抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。
[項目5] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCRβの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b) 抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。
[項目6] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、TCRサブユニット及び、抗CD19結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む単離された組み換え核酸分子。
[項目7] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、TCRサブユニット及び、抗B細胞成熟抗原(BCMA)結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む単離された組み換え核酸分子。
[項目8] 前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結される、項目6または7に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目9] 前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する、項目6~8のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目10] 前記コードされた抗原結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、項目1~9のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目11] 前記コードされたリンカー配列が、(G 4 S) n を含み、n=1~4である、項目10に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目12] 前記TCRサブユニットが、TCRの細胞外ドメインを含む、項目1~11のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目13] 前記TCRサブユニットが、TCRの膜貫通ドメインを含む、項目1~12のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目14] 前記TCRサブユニットが、TCRの細胞内ドメインを含む、項目1~13のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目15] 前記TCRサブユニットが、(i)TCRの細胞外ドメイン、(ii)TCRの膜貫通ドメイン、及び(iii)TCRの細胞内ドメインを含むとともに、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つが同じTCRサブユニット由来である、項目1~14のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目16] 前記TCRサブユニットが、CD3ε、CD3γ、もしくはCD3δの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または少なくとも1つの修飾を有するアミノ酸配列を含むTCRの細胞内ドメインを含む、項目1~15のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目17] 前記TCRサブユニットが、4-1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ζの機能的シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または少なくとも1つの修飾を有するアミノ酸配列を含む細胞内ドメインを含む、項目1~16のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目18] 前記ヒトまたはヒト化抗体ドメインが、抗体フラグメントを含む、項目1~17のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目19] 前記ヒトまたはヒト化抗体ドメインが、scFvまたはV H ドメインを含む、項目1~18のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目20] (i)それぞれ配列番号25、配列番号27、及び配列番号29に70~100%の配列同一性がある、抗CD19軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)それぞれ配列番号31、配列番号33、及び配列番号35に70~100%の配列同一性がある、抗CD19重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3をコードする、項目1~19のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目21] 軽鎖可変領域をコードし、前記軽鎖可変領域が、配列番号49の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号49の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む、項目1~20のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目22] 重鎖可変領域をコードし、前記重鎖可変領域が、配列番号51の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号51の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む、項目1~21のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目23] (i)それぞれ配列番号37、配列番号39、及び配列番号41に70~100%の配列同一性がある、抗BCMA軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)それぞれ配列番号43、配列番号45、及び配列番号47に70~100%の配列同一性がある、抗BCMA重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3をコードする、項目1~19のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目24] 軽鎖可変領域をコードし、前記軽鎖可変領域が、配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む、項目1~19及び23のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目25] 重鎖可変領域をコードし、前記重鎖可変領域が、配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む、項目1~19、23、及び24のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目26] 前記TFPが、TCRα鎖、TCRβ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、CD3δのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCRサブユニットの細胞外ドメインを含む、項目1~25のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目27] コードされたTFPが、TCRα鎖、TCRβ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、CD3δのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、項目1~26のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目28] コードされたTFPが、TCRα鎖、TCRβ鎖、TCRζ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、CD3δのTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、項目1~27のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目29] さらに、共刺激ドメインをコードする配列を含む、項目1~28のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目30] 前記共刺激ドメインが、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4-1BB(CD137)、ならびに少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである、項目29に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目31] 前記少なくとも1つから最大20までの修飾が、細胞のシグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、または前記TFPへのリガンド結合に反応してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む、項目1~30のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目32] mRNAである、項目1~31のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目33] 前記TFPが、TCRサブユニットの免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含み、前記サブユニットが、CD3ζのTCRサブユニット、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、CD3δのTCRサブユニット、TCRζ鎖、Fcε受容体1鎖、Fcε受容体2鎖、Fcγ受容体1鎖、Fcγ受容体2a鎖、Fcγ受容体2b1鎖、Fcγ受容体2b2鎖、Fcγ受容体3a鎖、Fcγ受容体3b鎖、Fcβ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質のITAMまたはその一部を含む、項目1~32のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目34] 前記ITAMが、CD3γ、CD3δ、またはCD3εのITAMを置き換える、項目33に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目35] 前記ITAMが、CD3ζのTCRサブユニット、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、及びCD3δのTCRサブユニットからなる群から選択されるとともに、CD3ζのTCRサブユニット、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、及びCD3δのTCRサブユニットからなる群から選択される異なるITAMを置き換える、項目33に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目36] 前記核酸がヌクレオチド類似体を含む、項目1~35のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目37] 前記ヌクレオチド類似体が、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)、2’-O-アミノプロピル、2’-デオキシ、T-デオキシ-2’-フルオロ、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)、2’-O-ジメチルアミノエチル(2’-O-DMAOE)、2’-O-ジメチルアミノプロピル(2’-O-DMAP)、T-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)修飾、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’-アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び2’-フルオロN3-P5’-ホスホルアミダイトからなる群から選択される、項目36に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目38] さらに、リーダー配列を含む、項目1~37のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目39] 項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド分子。
[項目40] ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む単離された組み換えTFP分子。
[項目41] ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えTFP分子であって、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能な単離された組み換えTFP分子。
[項目42] ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えTFP分子であって、内因性TCR複合体に機能的に統合することが可能な単離された組み換えTFP分子。
[項目43] ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む、項目40に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目44] 前記抗CD19結合ドメインが、scFvまたはV H ドメインである、項目40~43のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目45] 前記抗CD19結合ドメインが、配列番号51のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある重鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、項目40~44のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目46] 前記抗CD19結合ドメインが、配列番号49のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある軽鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、項目40~45のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目47] TCRα鎖、TCRβ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、CD3δのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCRの細胞外ドメインを含む、項目40~46のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目48] 項目40~47のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目49] 前記抗CD19結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、項目40~48のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目50] リンカー領域が、(G 4 S) n を含み、n=1~4である、項目49に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目51] ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、単離された組み換えTFP分子。
[項目52] ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えTFP分子であって、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能な単離された組み換えTFP分子。
[項目53] ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えTFP分子であって、内因性TCR複合体に機能的に統合することが可能な単離された組み換えTFP分子。
[項目54] ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む、項目53に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目55] 前記抗BCMA結合ドメインがscFvまたはV H ドメインである、項目51~54のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目56] 前記抗BCMA結合ドメインが、配列番号55のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある重鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、項目51~55のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目57] 前記抗BCMA結合ドメインが、配列番号53のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある軽鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、項目51~56のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目58] TCRα鎖、TCRβ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、CD3δのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCRの細胞外ドメインを含む、項目51~57のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子
[項目59] 前記抗BCMA結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、項目51~58のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目60] リンカー領域が、(G 4 S) n を含み、n=1~4である、項目59に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目61] さらに、共刺激ドメインをコードする配列を含む、項目40~60のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目62] さらに、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む、項目40~61のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目63] さらにリーダー配列を含む、項目40~62のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目64] 項目40~63のいずれか一項に記載のTFPをコードする配列を含む核酸。
[項目65] DNA及びRNAからなる群から選択される、項目64に記載の核酸。
[項目66] 前記核酸がmRNAである、項目64または65に記載の核酸。
[項目67] ヌクレオチド類似体を含む、項目64~66のいずれか一項に記載の核酸。
[項目68] 前記ヌクレオチド類似体が、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)、2’-O-アミノプロピル、2’-デオキシ、T-デオキシ-2’-フルオロ、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)、2’-O-ジメチルアミノエチル(2’-O-DMAOE)、2’-O-ジメチルアミノプロピル(2’-O-DMAP)、T-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)修飾、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’-アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び2’-フルオロN3-P5’-ホスホルアミダイトからなる群から選択される、項目67に記載の核酸。
[項目69] さらに、プロモーターを含む、項目64~68のいずれか一項に記載の核酸。
[項目70] インビトロで転写された核酸である、項目64~69のいずれか一項に記載の核酸。
[項目71] さらに、ポリ(A)尾部をコードする配列を含む、項目64~70のいずれか一項に記載の核酸。
[項目72] さらに、3’UTR配列を含む、項目64~71のいずれか一項に記載の核酸。
[項目73] 項目40~63のいずれか一項に記載のTFPをコードする核酸分子を含むベクター。
[項目74] DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、項目73に記載のベクター。
[項目75] さらに、プロモーターを含む、項目73または74に記載のベクター。
[項目76] インビトロで転写されたベクターである、項目73~75のいずれか一項に記載のベクター。
[項目77] 前記ベクターの核酸配列がさらにポリ(A)尾部を含む、項目73~76のいずれか
一項に記載のベクター。
[項目78] 前記ベクターの核酸配列がさらに3’UTRを含む、項目73~77のいずれか一項に記載のベクター。
[項目79] 項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子、項目40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、項目64~72のいずれか一項に記載の核酸、項目73~78のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
[項目80] ヒトT細胞である、項目79に記載の細胞。
[項目81] 前記T細胞が、CD8+またはCD4+T細胞である、項目80に記載の細胞。
[項目82] さらに、細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第二のポリペプチドに会合した、抑制分子の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸を含む、項目79~81のいずれか一項に記載の細胞。
[項目83] 前記抑制分子が、PD1の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドならびに共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第二のポリペプチドを含む、項目82に記載の細胞。
[項目84] ヒトCD8+またはCD4+T細胞であって、少なくとも2つのTFP分子を含み、前記TFP分子がヒトまたはヒト化抗CD19もしくは抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記TFP分子が前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の中で、前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞において、及び/または前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の表面で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、ヒトCD8+またはCD4+T細胞。
[項目85] i)ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子;ならびに
ii)少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体を含むタンパク質複合体。
[項目86] 前記TCRが、TCRα鎖、TCRβ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、及びCD3δのTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、項目85に記載のタンパク質複合体。
[項目87] 前記抗CD19結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、項目85または86に記載のタンパク質複合体。
[項目88] リンカー領域が、(G 4 S) n を含み、n=1~4である、項目87に記載のタンパク質複合体
[項目89] (a)項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子によってコードされるTFP、及び
(b)少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体を含むタンパク質複合体。
[項目90] i)ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子;ならびに
ii)少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体を含むタンパク質複合体。
[項目91] 前記TCRが、TCRα鎖、TCRβ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、及びCD3δのTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、項目90に記載のタンパク質複合体。
[項目92] 前記抗BCMA結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、項目90または91に記載のタンパク質複合体。
[項目93] リンカー領域が、(G 4 S) n を含み、n=1~4である、項目92に記載のタンパク質複合体。
[項目94] 項目85~93のいずれか一項に記載のタンパク質複合体あたり、少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含むヒトCD8+またはCD4+T細胞。
[項目95] 項目1~38のいずれか一項に記載の単離された核酸分子によってコードされる少なくとも2つの異なるTFP分子を含むヒトCD8+またはCD4+T細胞。
[項目96] ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団のT細胞が個々にまたは集合的に少なくとも2つのTFP分子を含み、前記TFP分子がヒトまたはヒト化抗CD19もしくは抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記TFP分子が前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の中で、前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞において、及び/または前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の表面で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団。
[項目97] ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団のT細胞が個々にまたは集合的に、項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子によってコードされる少なくとも2つのTFP分子を含む、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団。
[項目98] T細胞に項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、項目64~72のいずれか一項に記載の核酸、または項目73~78のいずれか一項に記載のベクターで形質導入することを含む細胞の作製方法。
[項目99] インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含む、RNA改変細胞集団の生成方法であって、前記RNAが項目40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子をコードする核酸を含む、方法。
[項目100] 哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、前記哺乳類に対して、有効量の項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子を発現する細胞、項目40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、項目64~72のいずれか一項に記載の核酸、項目73~78のいずれか一項に記載のベクター、または項目79~84及び94~98のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含む、方法。
[項目101] 細胞が自己T細胞である、項目100に記載の方法。
[項目102] 細胞が同種異系T細胞である、項目100に記載の方法。
[項目103] 前記哺乳類がヒトである、項目100~102のいずれか一項に記載の方法。
[項目104] CD19またはBCMAの発現を伴う疾患を有する哺乳類の治療方法であって、前記哺乳類に対して、有効量の項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子を発現する細胞、項目40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、項目64~72のいずれか一項に記載の核酸、項目73~78のいずれか一項に記載のベクター、または項目79~84及び94~98のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含む、方法。
[項目105] CD19またはBCMAの発現を伴う前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、前白血病、CD19の発現を伴う非がん関連の適応症からなる群から選択される、項目104に記載の方法。
[項目106] 前記疾患が、B細胞急性リンパ性白血病(B-ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)、急性リンパ性白血病(ALL);慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞濾胞性リンパ腫、大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、前白血病、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患、及びこれらの組合せからなる群から選択される血液がんである、項目104に記載の方法。
[項目107] TFP分子を発現する前記細胞が、TFP分子を発現する細胞の効果を高める薬剤と組み合わせて投与される、項目104に記載の方法。
[項目108] 前記哺乳類では、抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)または抗BCMA CARを発現するT細胞の有効量を投与された哺乳類と比較して、サイトカインの放出が少ない、項目104~107のいずれか一項に記載の方法。
[項目109] TFP分子を発現する前記細胞が、TFP分子を発現する細胞の投与に伴う1つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される、項目104~108のいずれか一項に記載の方法。
[項目110] TFP分子を発現する前記細胞が、CD19またはBCMAに関連する疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される、項目104~109のいずれか一項に記載の方法。
[項目111] 薬剤用としての、項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子を発現する細胞、項目40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、項目64~72のいずれか一項に記載の核酸、項目73~78のいずれか一項に記載のベクター、項目85~93のいずれか一項に記載のタンパク質複合体、または項目79~84及び94~98のいずれか一項に記載の細胞。
[項目112] CD19またはBCMAの発現を伴う疾患を有する哺乳類の治療方法であって、前記哺乳類に対して、有効量の項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子を発現する細胞、項目40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、項目64~72のいずれか一項に記載の核酸、項目73~78のいずれか一項に記載のベクター、または項目79~84及び94~98のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含み、前記哺乳類では、抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)または抗BCMA CARを発現するT細胞の有効量を投与された哺乳類と比較して、サイトカインの放出が少ない、方法。
本願は以下の発明を包含する。
[項目1] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3εの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b) 抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。
[項目2] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3γの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b) 抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。
[項目3] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3δの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b) 抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。
[項目4] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCRαの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b) 抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。
[項目5] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCRβの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b) 抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。
[項目6] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、TCRサブユニット及び、抗CD19結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む単離された組み換え核酸分子。
[項目7] T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、TCRサブユニット及び、抗B細胞成熟抗原(BCMA)結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む単離された組み換え核酸分子。
[項目8] 前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結される、項目6または7に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目9] 前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する、項目6~8のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目10] 前記コードされた抗原結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、項目1~9のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目11] 前記コードされたリンカー配列が、(G 4 S) n を含み、n=1~4である、項目10に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目12] 前記TCRサブユニットが、TCRの細胞外ドメインを含む、項目1~11のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目13] 前記TCRサブユニットが、TCRの膜貫通ドメインを含む、項目1~12のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目14] 前記TCRサブユニットが、TCRの細胞内ドメインを含む、項目1~13のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目15] 前記TCRサブユニットが、(i)TCRの細胞外ドメイン、(ii)TCRの膜貫通ドメイン、及び(iii)TCRの細胞内ドメインを含むとともに、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つが同じTCRサブユニット由来である、項目1~14のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目16] 前記TCRサブユニットが、CD3ε、CD3γ、もしくはCD3δの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または少なくとも1つの修飾を有するアミノ酸配列を含むTCRの細胞内ドメインを含む、項目1~15のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目17] 前記TCRサブユニットが、4-1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ζの機能的シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または少なくとも1つの修飾を有するアミノ酸配列を含む細胞内ドメインを含む、項目1~16のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目18] 前記ヒトまたはヒト化抗体ドメインが、抗体フラグメントを含む、項目1~17のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目19] 前記ヒトまたはヒト化抗体ドメインが、scFvまたはV H ドメインを含む、項目1~18のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目20] (i)それぞれ配列番号25、配列番号27、及び配列番号29に70~100%の配列同一性がある、抗CD19軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)それぞれ配列番号31、配列番号33、及び配列番号35に70~100%の配列同一性がある、抗CD19重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3をコードする、項目1~19のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目21] 軽鎖可変領域をコードし、前記軽鎖可変領域が、配列番号49の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号49の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む、項目1~20のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目22] 重鎖可変領域をコードし、前記重鎖可変領域が、配列番号51の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号51の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む、項目1~21のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目23] (i)それぞれ配列番号37、配列番号39、及び配列番号41に70~100%の配列同一性がある、抗BCMA軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)それぞれ配列番号43、配列番号45、及び配列番号47に70~100%の配列同一性がある、抗BCMA重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3をコードする、項目1~19のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目24] 軽鎖可変領域をコードし、前記軽鎖可変領域が、配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む、項目1~19及び23のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目25] 重鎖可変領域をコードし、前記重鎖可変領域が、配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む、項目1~19、23、及び24のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目26] 前記TFPが、TCRα鎖、TCRβ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、CD3δのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCRサブユニットの細胞外ドメインを含む、項目1~25のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目27] コードされたTFPが、TCRα鎖、TCRβ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、CD3δのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、項目1~26のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目28] コードされたTFPが、TCRα鎖、TCRβ鎖、TCRζ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、CD3δのTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、項目1~27のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目29] さらに、共刺激ドメインをコードする配列を含む、項目1~28のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目30] 前記共刺激ドメインが、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4-1BB(CD137)、ならびに少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである、項目29に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目31] 前記少なくとも1つから最大20までの修飾が、細胞のシグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、または前記TFPへのリガンド結合に反応してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む、項目1~30のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目32] mRNAである、項目1~31のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目33] 前記TFPが、TCRサブユニットの免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含み、前記サブユニットが、CD3ζのTCRサブユニット、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、CD3δのTCRサブユニット、TCRζ鎖、Fcε受容体1鎖、Fcε受容体2鎖、Fcγ受容体1鎖、Fcγ受容体2a鎖、Fcγ受容体2b1鎖、Fcγ受容体2b2鎖、Fcγ受容体3a鎖、Fcγ受容体3b鎖、Fcβ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質のITAMまたはその一部を含む、項目1~32のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目34] 前記ITAMが、CD3γ、CD3δ、またはCD3εのITAMを置き換える、項目33に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目35] 前記ITAMが、CD3ζのTCRサブユニット、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、及びCD3δのTCRサブユニットからなる群から選択されるとともに、CD3ζのTCRサブユニット、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、及びCD3δのTCRサブユニットからなる群から選択される異なるITAMを置き換える、項目33に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目36] 前記核酸がヌクレオチド類似体を含む、項目1~35のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目37] 前記ヌクレオチド類似体が、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)、2’-O-アミノプロピル、2’-デオキシ、T-デオキシ-2’-フルオロ、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)、2’-O-ジメチルアミノエチル(2’-O-DMAOE)、2’-O-ジメチルアミノプロピル(2’-O-DMAP)、T-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)修飾、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’-アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び2’-フルオロN3-P5’-ホスホルアミダイトからなる群から選択される、項目36に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目38] さらに、リーダー配列を含む、項目1~37のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
[項目39] 項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド分子。
[項目40] ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む単離された組み換えTFP分子。
[項目41] ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えTFP分子であって、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能な単離された組み換えTFP分子。
[項目42] ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えTFP分子であって、内因性TCR複合体に機能的に統合することが可能な単離された組み換えTFP分子。
[項目43] ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む、項目40に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目44] 前記抗CD19結合ドメインが、scFvまたはV H ドメインである、項目40~43のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目45] 前記抗CD19結合ドメインが、配列番号51のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある重鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、項目40~44のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目46] 前記抗CD19結合ドメインが、配列番号49のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある軽鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、項目40~45のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目47] TCRα鎖、TCRβ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、CD3δのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCRの細胞外ドメインを含む、項目40~46のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目48] 項目40~47のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目49] 前記抗CD19結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、項目40~48のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目50] リンカー領域が、(G 4 S) n を含み、n=1~4である、項目49に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目51] ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、単離された組み換えTFP分子。
[項目52] ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えTFP分子であって、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能な単離された組み換えTFP分子。
[項目53] ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えTFP分子であって、内因性TCR複合体に機能的に統合することが可能な単離された組み換えTFP分子。
[項目54] ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む、項目53に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目55] 前記抗BCMA結合ドメインがscFvまたはV H ドメインである、項目51~54のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目56] 前記抗BCMA結合ドメインが、配列番号55のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある重鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、項目51~55のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目57] 前記抗BCMA結合ドメインが、配列番号53のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある軽鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、項目51~56のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目58] TCRα鎖、TCRβ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、CD3δのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCRの細胞外ドメインを含む、項目51~57のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子
[項目59] 前記抗BCMA結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、項目51~58のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目60] リンカー領域が、(G 4 S) n を含み、n=1~4である、項目59に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目61] さらに、共刺激ドメインをコードする配列を含む、項目40~60のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目62] さらに、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む、項目40~61のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目63] さらにリーダー配列を含む、項目40~62のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
[項目64] 項目40~63のいずれか一項に記載のTFPをコードする配列を含む核酸。
[項目65] DNA及びRNAからなる群から選択される、項目64に記載の核酸。
[項目66] 前記核酸がmRNAである、項目64または65に記載の核酸。
[項目67] ヌクレオチド類似体を含む、項目64~66のいずれか一項に記載の核酸。
[項目68] 前記ヌクレオチド類似体が、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)、2’-O-アミノプロピル、2’-デオキシ、T-デオキシ-2’-フルオロ、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)、2’-O-ジメチルアミノエチル(2’-O-DMAOE)、2’-O-ジメチルアミノプロピル(2’-O-DMAP)、T-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)修飾、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’-アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び2’-フルオロN3-P5’-ホスホルアミダイトからなる群から選択される、項目67に記載の核酸。
[項目69] さらに、プロモーターを含む、項目64~68のいずれか一項に記載の核酸。
[項目70] インビトロで転写された核酸である、項目64~69のいずれか一項に記載の核酸。
[項目71] さらに、ポリ(A)尾部をコードする配列を含む、項目64~70のいずれか一項に記載の核酸。
[項目72] さらに、3’UTR配列を含む、項目64~71のいずれか一項に記載の核酸。
[項目73] 項目40~63のいずれか一項に記載のTFPをコードする核酸分子を含むベクター。
[項目74] DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、項目73に記載のベクター。
[項目75] さらに、プロモーターを含む、項目73または74に記載のベクター。
[項目76] インビトロで転写されたベクターである、項目73~75のいずれか一項に記載のベクター。
[項目77] 前記ベクターの核酸配列がさらにポリ(A)尾部を含む、項目73~76のいずれか
一項に記載のベクター。
[項目78] 前記ベクターの核酸配列がさらに3’UTRを含む、項目73~77のいずれか一項に記載のベクター。
[項目79] 項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子、項目40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、項目64~72のいずれか一項に記載の核酸、項目73~78のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
[項目80] ヒトT細胞である、項目79に記載の細胞。
[項目81] 前記T細胞が、CD8+またはCD4+T細胞である、項目80に記載の細胞。
[項目82] さらに、細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第二のポリペプチドに会合した、抑制分子の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸を含む、項目79~81のいずれか一項に記載の細胞。
[項目83] 前記抑制分子が、PD1の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドならびに共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第二のポリペプチドを含む、項目82に記載の細胞。
[項目84] ヒトCD8+またはCD4+T細胞であって、少なくとも2つのTFP分子を含み、前記TFP分子がヒトまたはヒト化抗CD19もしくは抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記TFP分子が前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の中で、前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞において、及び/または前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の表面で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、ヒトCD8+またはCD4+T細胞。
[項目85] i)ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子;ならびに
ii)少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体を含むタンパク質複合体。
[項目86] 前記TCRが、TCRα鎖、TCRβ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、及びCD3δのTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、項目85に記載のタンパク質複合体。
[項目87] 前記抗CD19結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、項目85または86に記載のタンパク質複合体。
[項目88] リンカー領域が、(G 4 S) n を含み、n=1~4である、項目87に記載のタンパク質複合体
[項目89] (a)項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子によってコードされるTFP、及び
(b)少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体を含むタンパク質複合体。
[項目90] i)ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子;ならびに
ii)少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体を含むタンパク質複合体。
[項目91] 前記TCRが、TCRα鎖、TCRβ鎖、CD3εのTCRサブユニット、CD3γのTCRサブユニット、及びCD3δのTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、項目90に記載のタンパク質複合体。
[項目92] 前記抗BCMA結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、項目90または91に記載のタンパク質複合体。
[項目93] リンカー領域が、(G 4 S) n を含み、n=1~4である、項目92に記載のタンパク質複合体。
[項目94] 項目85~93のいずれか一項に記載のタンパク質複合体あたり、少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含むヒトCD8+またはCD4+T細胞。
[項目95] 項目1~38のいずれか一項に記載の単離された核酸分子によってコードされる少なくとも2つの異なるTFP分子を含むヒトCD8+またはCD4+T細胞。
[項目96] ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団のT細胞が個々にまたは集合的に少なくとも2つのTFP分子を含み、前記TFP分子がヒトまたはヒト化抗CD19もしくは抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記TFP分子が前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の中で、前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞において、及び/または前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の表面で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団。
[項目97] ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団のT細胞が個々にまたは集合的に、項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子によってコードされる少なくとも2つのTFP分子を含む、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団。
[項目98] T細胞に項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、項目64~72のいずれか一項に記載の核酸、または項目73~78のいずれか一項に記載のベクターで形質導入することを含む細胞の作製方法。
[項目99] インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含む、RNA改変細胞集団の生成方法であって、前記RNAが項目40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子をコードする核酸を含む、方法。
[項目100] 哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、前記哺乳類に対して、有効量の項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子を発現する細胞、項目40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、項目64~72のいずれか一項に記載の核酸、項目73~78のいずれか一項に記載のベクター、または項目79~84及び94~98のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含む、方法。
[項目101] 細胞が自己T細胞である、項目100に記載の方法。
[項目102] 細胞が同種異系T細胞である、項目100に記載の方法。
[項目103] 前記哺乳類がヒトである、項目100~102のいずれか一項に記載の方法。
[項目104] CD19またはBCMAの発現を伴う疾患を有する哺乳類の治療方法であって、前記哺乳類に対して、有効量の項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子を発現する細胞、項目40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、項目64~72のいずれか一項に記載の核酸、項目73~78のいずれか一項に記載のベクター、または項目79~84及び94~98のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含む、方法。
[項目105] CD19またはBCMAの発現を伴う前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、前白血病、CD19の発現を伴う非がん関連の適応症からなる群から選択される、項目104に記載の方法。
[項目106] 前記疾患が、B細胞急性リンパ性白血病(B-ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)、急性リンパ性白血病(ALL);慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞濾胞性リンパ腫、大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、前白血病、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患、及びこれらの組合せからなる群から選択される血液がんである、項目104に記載の方法。
[項目107] TFP分子を発現する前記細胞が、TFP分子を発現する細胞の効果を高める薬剤と組み合わせて投与される、項目104に記載の方法。
[項目108] 前記哺乳類では、抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)または抗BCMA CARを発現するT細胞の有効量を投与された哺乳類と比較して、サイトカインの放出が少ない、項目104~107のいずれか一項に記載の方法。
[項目109] TFP分子を発現する前記細胞が、TFP分子を発現する細胞の投与に伴う1つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される、項目104~108のいずれか一項に記載の方法。
[項目110] TFP分子を発現する前記細胞が、CD19またはBCMAに関連する疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される、項目104~109のいずれか一項に記載の方法。
[項目111] 薬剤用としての、項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子を発現する細胞、項目40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、項目64~72のいずれか一項に記載の核酸、項目73~78のいずれか一項に記載のベクター、項目85~93のいずれか一項に記載のタンパク質複合体、または項目79~84及び94~98のいずれか一項に記載の細胞。
[項目112] CD19またはBCMAの発現を伴う疾患を有する哺乳類の治療方法であって、前記哺乳類に対して、有効量の項目1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子、項目39に記載の単離されたポリペプチド分子を発現する細胞、項目40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、項目64~72のいずれか一項に記載の核酸、項目73~78のいずれか一項に記載のベクター、または項目79~84及び94~98のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含み、前記哺乳類では、抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)または抗BCMA CARを発現するT細胞の有効量を投与された哺乳類と比較して、サイトカインの放出が少ない、方法。
Claims (112)
- T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b)抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3ガンマの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b)抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b)抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCRアルファの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b)抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a) (i)TCRの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCRベータの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むTCRの細胞内ドメインを含むTCRサブユニット;ならびに
(b)抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;
前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する単離された組み換え核酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、TCRサブユニット及び、抗CD19結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む単離された組み換え核
酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、前記TFPが、TCRサブユニット及び、抗B細胞成熟抗原(BCMA)結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む単離された組み換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結される、請求項6または7に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記TFPがT細胞で発現される際にTCRに合体する、請求項6~8のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記コードされた抗原結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、請求項1~9のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記コードされたリンカー配列が、(G4S)nを含み、n=1~4である、請求項10に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、TCRの細胞外ドメインを含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、TCRの膜貫通ドメインを含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、TCRの細胞内ドメインを含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、(i)TCRの細胞外ドメイン、(ii)TCRの膜貫通ドメイン、及び(iii)TCRの細胞内ドメインを含むとともに、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つが同じTCRサブユニット由来である、請求項1~14のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、CD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または少なくとも1つの修飾を有するアミノ酸配列を含むTCRの細胞内ドメインを含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、4-1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または少なくとも1つの修飾を有するアミノ酸配列を含む細胞内ドメインを含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記ヒトまたはヒト化抗体ドメインが、抗体フラグメントを含む、請求項1~17のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記ヒトまたはヒト化抗体ドメインが、scFvまたはVHドメインを含む、請求項1~18のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- (i)それぞれ配列番号25、配列番号27、及び配列番号29に70~100%の配
列同一性がある、抗CD19軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)それぞれ配列番号31、配列番号33、及び配列番号35に70~100%の配列同一性がある、抗CD19重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3をコードする、請求項1~19のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。 - 軽鎖可変領域をコードし、前記軽鎖可変領域が、配列番号49の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号49の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 重鎖可変領域をコードし、前記重鎖可変領域が、配列番号51の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号51の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む、請求項1~21のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- (i)それぞれ配列番号37、配列番号39、及び配列番号41に70~100%の配列同一性がある、抗BCMA軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)それぞれ配列番号43、配列番号45、及び配列番号47に70~100%の配列同一性がある、抗BCMA重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3をコードする、請求項1~19のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 軽鎖可変領域をコードし、前記軽鎖可変領域が、配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む、請求項1~19及び23のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 重鎖可変領域をコードし、前記重鎖可変領域が、配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つから最大30までの修飾を有するアミノ酸配列、または、配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性がある配列を含む、請求項1~19、23、及び24のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記TFPが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCRサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項1~25のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- コードされたTFPが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項1~26のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- コードされたTFPが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22
、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項1~27のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。 - さらに、共刺激ドメインをコードする配列を含む、請求項1~28のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記共刺激ドメインが、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4-1BB(CD137)、ならびに少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである、請求項29に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記少なくとも1つから最大20までの修飾が、細胞のシグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、または前記TFPへのリガンド結合に反応してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む、請求項1~30のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- mRNAである、請求項1~31のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記TFPが、TCRサブユニットの免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含み、前記サブユニットが、CD3ゼータのTCRサブユニット、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、TCRゼータ鎖、Fcイプシロン受容体1鎖、Fcイプシロン受容体2鎖、Fcガンマ受容体1鎖、Fcガンマ受容体2a鎖、Fcガンマ受容体2b1鎖、Fcガンマ受容体2b2鎖、Fcガンマ受容体3a鎖、Fcガンマ受容体3b鎖、Fcベータ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質のITAMまたはその一部を含む、請求項1~32のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記ITAMが、CD3ガンマ、CD3デルタ、またはCD3イプシロンのITAMを置き換える、請求項33に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記ITAMが、CD3ゼータのTCRサブユニット、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、及びCD3デルタのTCRサブユニットからなる群から選択されるとともに、CD3ゼータのTCRサブユニット、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、及びCD3デルタのTCRサブユニットからなる群から選択される異なるITAMを置き換える、請求項33に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記核酸がヌクレオチド類似体を含む、請求項1~35のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 前記ヌクレオチド類似体が、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)、2’-O-アミノプロピル、2’-デオキシ、T-デオキシ-2’-フルオロ、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)、2’-O-ジメチルアミノエチル(
2’-O-DMAOE)、2’-O-ジメチルアミノプロピル(2’-O-DMAP)、T-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)修飾、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’-アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び2’-フルオロN3-P5’-ホスホルアミダイトからなる群から選択される、請求項36に記載の単離された組み換え核酸分子。 - さらに、リーダー配列を含む、請求項1~37のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子。
- 請求項1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド分子。
- ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む単離された組み換えTFP分子。
- ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えTFP分子であって、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能な単離された組み換えTFP分子。
- ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えTFP分子であって、内因性TCR複合体に機能的に統合することが可能な単離された組み換えTFP分子。
- ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む、請求項40に記載の単離された組み換えTFP分子。
- 前記抗CD19結合ドメインが、scFvまたはVHドメインである、請求項40~43のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
- 前記抗CD19結合ドメインが、配列番号51のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある重鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項40~44のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
- 前記抗CD19結合ドメインが、配列番号49のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある軽鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項40~45のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
- TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCRの細胞外ドメインを含む、請求項40~46のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
- 請求項40~47のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
- 前記抗CD19結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、請求項40~48のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
- リンカー領域が、(G4S)nを含み、n=1~4である、請求項49に記載の単離された組み換えTFP分子。
- ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、単離された組み換えTFP分子。
- ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えTFP分子であって、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能な単離された組み換えTFP分子。
- ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えTFP分子であって、内因性TCR複合体に機能的に統合することが可能な単離された組み換えTFP分子。
- ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む、請求項53に記載の単離された組み換えTFP分子。
- 前記抗BCMA結合ドメインがscFvまたはVHドメインである、請求項51~54のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
- 前記抗BCMA結合ドメインが、配列番号55のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある重鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項51~55のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
- 前記抗BCMA結合ドメインが、配列番号53のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性がある軽鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも1つから最大30までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項51~56のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
- TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、CD3デルタのTCRサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも1つから最大20までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCRの細胞外ドメインを含む、請求項51~57のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子
- 前記抗BCMA結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、請求項51~58のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
- リンカー領域が、(G4S)nを含み、n=1~4である、請求項59に記載の単離された組み換えTFP分子。
- さらに、共刺激ドメインをコードする配列を含む、請求項40~60のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
- さらに、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む、請求項40~61のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
- さらにリーダー配列を含む、請求項40~62のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子。
- 請求項40~63のいずれか一項に記載のTFPをコードする配列を含む核酸。
- DNA及びRNAからなる群から選択される、請求項64に記載の核酸。
- 前記核酸がmRNAである、請求項64または65に記載の核酸。
- ヌクレオチド類似体を含む、請求項64~66のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記ヌクレオチド類似体が、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)、2’-O-アミノプロピル、2’-デオキシ、T-デオキシ-2’-フルオロ、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)、2’-O-ジメチルアミノエチル(2’-O-DMAOE)、2’-O-ジメチルアミノプロピル(2’-O-DMAP)、T-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)修飾、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’-アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び2’-フルオロN3-P5’-ホスホルアミダイトからなる群から選択される、請求項67に記載の核酸。
- さらに、プロモーターを含む、請求項64~68のいずれか一項に記載の核酸。
- インビトロで転写された核酸である、請求項64~69のいずれか一項に記載の核酸。
- さらに、ポリ(A)尾部をコードする配列を含む、請求項64~70のいずれか一項に記載の核酸。
- さらに、3’UTR配列を含む、請求項64~71のいずれか一項に記載の核酸。
- 請求項40~63のいずれか一項に記載のTFPをコードする核酸分子を含むベクター。
- DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項73に記載のベクター。
- さらに、プロモーターを含む、請求項73または74に記載のベクター。
- インビトロで転写されたベクターである、請求項73~75のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ベクターの核酸配列がさらにポリ(A)尾部を含む、請求項73~76のいずれか
一項に記載のベクター。 - 前記ベクターの核酸配列がさらに3’UTRを含む、請求項73~77のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、請求項39に記載の単離されたポリペプチド分子、請求項40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、請求項64~72のいずれか一項に記載の核酸、請求項73~78のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
- ヒトT細胞である、請求項79に記載の細胞。
- 前記T細胞が、CD8+またはCD4+T細胞である、請求項80に記載の細胞。
- さらに、細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第二のポリペプチドに会合した、抑制分子の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸を含む、請求項79~81のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記抑制分子が、PD1の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドならびに共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第二のポリペプチドを含む、請求項82に記載の細胞。
- ヒトCD8+またはCD4+T細胞であって、少なくとも2つのTFP分子を含み、前記TFP分子がヒトまたはヒト化抗CD19もしくは抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記TFP分子が前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の中で、前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞において、及び/または前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の表面で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、ヒトCD8+またはCD4+T細胞。
- i)ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子;ならびに
ii)少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体を含むタンパク質複合体。 - 前記TCRが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、及びCD3デルタのTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、請求項85に記載のタンパク質複合体。
- 前記抗CD19結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、請求項85または86に記載のタンパク質複合体。
- リンカー領域が、(G4S)nを含み、n=1~4である、請求項87に記載のタンパク質複合体
- (a)請求項1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子によってコードされるTFP、及び
(b)少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体を含むタンパク質複合体。 - i)ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子;ならびに
ii)少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体を含むタンパク質複合体。 - 前記TCRが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンのTCRサブユニット、CD3ガンマのTCRサブユニット、及びCD3デルタのTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、請求項90に記載のタンパク質複合体。
- 前記抗BCMA結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCRの細胞外ドメインにつながれる、請求項90または91に記載のタンパク質複合体。
- リンカー領域が、(G4S)nを含み、n=1~4である、請求項92に記載のタンパク質複合体。
- 請求項85~93のいずれか一項に記載のタンパク質複合体あたり、少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含むヒトCD8+またはCD4+T細胞。
- 請求項1~38のいずれか一項に記載の単離された核酸分子によってコードされる少なくとも2つの異なるTFP分子を含むヒトCD8+またはCD4+T細胞。
- ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団のT細胞が個々にまたは集合的に少なくとも2つのTFP分子を含み、前記TFP分子がヒトまたはヒト化抗CD19もしくは抗BCMA結合ドメイン、TCRの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記TFP分子が前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の中で、前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞において、及び/または前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の表面で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団。
- ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団のT細胞が個々にまたは集合的に、請求項1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子によってコードされる少なくとも2つのTFP分子を含む、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団。
- T細胞に請求項1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、請求項64~72のいずれか一項に記載の核酸、または請求項73~78のいずれか一項に記載のベクターで形質導入することを含む細胞の作製方法。
- インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含む、RNA改変細胞集団の生成方法であって、前記RNAが請求項40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子をコードする核酸を含む、方法。
- 哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、前記哺乳類に対して、有効量の請求項1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、請求項39に記載の単離されたポリペプチド分子、請求項39に記載の単離されたポリペプチド分子を発現する細胞、請求項40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、請求項64~72のいずれか一項に記載の核酸、請求項73~78のいずれか一項に記載のベクター、
または請求項79~84及び94~98のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含む、方法。 - 細胞が自己T細胞である、請求項100に記載の方法。
- 細胞が同種異系T細胞である、請求項100に記載の方法。
- 前記哺乳類がヒトである、請求項100~102のいずれか一項に記載の方法。
- CD19またはBCMAの発現を伴う疾患を有する哺乳類の治療方法であって、前記哺乳類に対して、有効量の請求項1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、請求項39に記載の単離されたポリペプチド分子、請求項39に記載の単離されたポリペプチド分子を発現する細胞、請求項40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、請求項64~72のいずれか一項に記載の核酸、請求項73~78のいずれか一項に記載のベクター、または請求項79~84及び94~98のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含む、方法。
- CD19またはBCMAの発現を伴う前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、前白血病、CD19の発現を伴う非がん関連の適応症からなる群から選択される、請求項104に記載の方法。
- 前記疾患が、B細胞急性リンパ性白血病(B-ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)、急性リンパ性白血病(ALL);慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞濾胞性リンパ腫、大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、前白血病、CD19またはBCMAの発現を伴う疾患、及びこれらの組合せからなる群から選択される血液がんである、請求項104に記載の方法。
- TFP分子を発現する前記細胞が、TFP分子を発現する細胞の効果を高める薬剤と組み合わせて投与される、請求項104に記載の方法。
- 前記哺乳類では、抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)または抗BCMA CARを発現するT細胞の有効量を投与された哺乳類と比較して、サイトカインの放出が少ない、請求項104~107のいずれか一項に記載の方法。
- TFP分子を発現する前記細胞が、TFP分子を発現する細胞の投与に伴う1つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される、請求項104~108のいずれか一項に記載の方法。
- TFP分子を発現する前記細胞が、CD19またはBCMAに関連する疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される、請求項104~109のいずれか一項に記載の方法。
- 薬剤用としての、請求項1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、請求項39に記載の単離されたポリペプチド分子、請求項39に記載の単離されたポリペプチド分子を発現する細胞、請求項40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、請求項64~72のいずれか一項に記載の核酸、請求項73~78のい
ずれか一項に記載のベクター、請求項85~93のいずれか一項に記載のタンパク質複合体、または請求項79~84及び94~98のいずれか一項に記載の細胞。 - CD19またはBCMAの発現を伴う疾患を有する哺乳類の治療方法であって、前記哺乳類に対して、有効量の請求項1~38のいずれか一項に記載の単離された組み換え核酸分子、請求項39に記載の単離されたポリペプチド分子、請求項39に記載の単離されたポリペプチド分子を発現する細胞、請求項40~63のいずれか一項に記載の単離された組み換えTFP分子、請求項64~72のいずれか一項に記載の核酸、請求項73~78のいずれか一項に記載のベクター、または請求項79~84及び94~98のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含み、前記哺乳類では、抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)または抗BCMA CARを発現するT細胞の有効量を投与された哺乳類と比較して、サイトカインの放出が少ない、方法。
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