KR102157924B1 - 면역 세포들 및 병리 세포들 둘 다에 존재하는 항원을 타겟팅하기 위하여 조작된 면역치료용 세포들 - Google Patents

면역 세포들 및 병리 세포들 둘 다에 존재하는 항원을 타겟팅하기 위하여 조작된 면역치료용 세포들 Download PDF

Info

Publication number
KR102157924B1
KR102157924B1 KR1020167025575A KR20167025575A KR102157924B1 KR 102157924 B1 KR102157924 B1 KR 102157924B1 KR 1020167025575 A KR1020167025575 A KR 1020167025575A KR 20167025575 A KR20167025575 A KR 20167025575A KR 102157924 B1 KR102157924 B1 KR 102157924B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gly
leu
ala
ser
val
Prior art date
Application number
KR1020167025575A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160138404A (ko
Inventor
필립 두샤토
로랑 포와로
Original Assignee
셀렉티스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50114255&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR102157924(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 셀렉티스 filed Critical 셀렉티스
Publication of KR20160138404A publication Critical patent/KR20160138404A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102157924B1 publication Critical patent/KR102157924B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464429—Molecules with a "CD" designation not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464436—Cytokines
    • A61K39/464438—Tumor necrosis factors [TNF], CD70
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

상기 마커들을 코드하는 유전자들이 TALEN, Cas9 또는 아르고노트(argonaute)와 같은 희귀 절단 엔도뉴클레아제에 의하여 상기 면역 세포들에서 불활성화된다는 사실에 의하여, 병리 세포들 및 상기 면역 세포들 둘 다에 공통되는(예: CD38, CS1 또는 CD70) 항원 마커를 타겟팅하는 키메라 항원 수용체들 지니는 것으로 여겨질 수 있는, 면역요법을 위한 유전적으로 조작된 면역 세포들을 발달시키는 방법들.

Description

면역 세포들 및 병리 세포들 둘 다에 존재하는 항원을 타겟팅하기 위하여 조작된 면역치료용 세포들{CELLS FOR IMMUNOTHERAPY ENGINEERED FOR TARGETING ANTIGEN PRESENT BOTH ON IMMUNE CELLS AND PATHOLOGICAL CELLS}
본 발명은 병리 세포들(pathological cells) 및 면역 세포들(예: CD38) 둘 다에 흔한 항원 마커를 타겟팅하는 키메라(Chimeric) 항원(Antigen) 수용체들(Receptors)이 부여된, 면역요법을 위한, 유전적으로 조작된, 바람직하게는 비-동종반응성(alloreactive), 면역 세포들을 개발하는 방법들에 대한 것이다.
상기 항원 마커를(against) 향하는 CAR를 발현시키는 단계 및 상기 면역 세포들의 표면 상 상기 항원 마커의 존재에 기여하는 면역 세포들에서 유전자들을 불활성화시키는 단계를 포함한다. 이 불활성화는 보통 RNA-가이드된(guided) 엔도뉴클레아제들(endonucleases) (예: Cas9/CRISPR), 메가뉴클레아제들(meganucleases), 징크-핑거 뉴클레아제들 또는 TAL 뉴클레아제들을 코드하는 이식유전자들을 이용함으로써 수행된다. 조작된 면역 세포들, 바람직하게는 T-세포들은 그것들의 상호간의 파괴, 자가자극(auto-stimulation) 또는 집합(aggregation)을 피하는 반면, 악성의, 감염된 세포들 또는 결함이 있는(defective) 면역 세포들에 대한 그것들의 면역 활성으로 향한다. 본 발명은 암, 감염들 및 자가면역 질환들의 치료를 위하여 면역 세포들을 이용한 표준의 그리고 알맞은(affordable) 입양(adoptive) 면역요법(immunotherapy) 전략들로의 길을 연다.
엑스 비보(ex vivo)에서 발생한 자가조직(autologous) 항원-특이적 면역 세포들의 이동(transfer)을 수반하는 입양 면역요법은 바이러스 감염들 및 암을 치료하는 유망한 전략이다. 입양 면역요법에 사용되는 T 세포들은 예를 들어, 유전 공학을 통한 T-세포들의 방향전환(redirection) 또는 항원-특이적 T-세포들의 확장(expansion)에 의하여 만들어질 수 있다(Park, Rosenberg et al. 2011).
T-세포들 내 신규한 특수성들은 키메라(chimeric) 항원(antigen) 수용체들(receptors) (CARs) 또는 유전자 이식(transgenic) T-세포 수용체들의 유전적 전달을 통하여 성공적으로 만들어져왔다 (Jena, Dotti et al. 2010). CAR들(CARs)은 단일 융합 분자에서 하나 이상의 신호전달(signaling) 도메인들(domains)과 관련된 타겟팅(targeting) 모이어티(moiety)로 구성되는 합성 수용체들이다. 일반적으로 CAR의 결합(binding) 모이어티는 유연성(flexible) 링커(linker)에 의하여 연결(join)되는 단일클론 항체의 가벼운(light) 가변(variable) 단편들을 포함하는, 단일-사슬(single-chain) 항체(antibody) (scFv)의 항원-결합 도메인으로 구성된다. 수용체 또는 리간드 도메인들에 기초한 결합 모이어티들 또한 성공적으로 사용되어 왔다. 일 세대(first generation) CAR들을 위한 신호전달 도메인들은 Fc 수용체 감마(gamma) 체인들 또는 CD3제타(CD3zeta)의 세포질 영역으로부터 유래된다. CAR들(CARs)의 일 세대는 T 세포 세포독성을 성공적으로 방향전환하는 것으로(redirect) 보여져왔으나, 그것들은 인 비보(in vivo)에서 항-종양 및 지속적인(prolonged) 확장(expansion)을 제공하는데 실패했다. CD28, OX-40 (CD134), 및 4-1BB (CD137)을 포함하는 공-자극 분자들로부터의 신호전달 도메인들은 CAR 변형된(modified) T 세포들의 증식을 증가시키고 생존을 향상시키기 위하여 단독으로(이 세대) 또는 조합하여(삼 세대) 첨가되어 왔다. CAR들은 T 세포들이 고형 종양들 및 림프종들을 포함하는 여러가지 악성종양들(malignancies)로부터 종양 세포들의 표면에서 발현되는 항원들에 대항하여 방향전환되는 것을 가능하게 성공적으로 해왔다 (Jena, Dotti et al. 2010).
입양 면역요법을 이용한 환자들의 치료를 위한 현재의 프로토콜은 자가조직(autologous) 세포 이동(transfer)에 기초한다. 이 접근에서, T 림프구들이 환자들로부터 회수되고, 엑스 비보(ex vivo)에서 선택 또는 유전적으로 변형되고, 필요하다면 세포들의 수를 증폭시키기 위하여 인 비트로(in vitro)에서 배양되고, 최종적으로 환자 내로 주입(infuse)된다. 림프구 주입(infusion)에 더하여, 숙주는 T 세포들의 이식(engraftment) 또는, 예를 들어 (방사선 또는 화학요법(chemotherapy)과 함께) 프리-컨디셔닝(pre-conditioning) 및 (IL-2와 같은) 림프구 성장 인자들의 투여인, 면역 반응에서 그것들의 참여를 지원하는 다른 방식들로 처리(manipulated)될 수 있다. 각각의 환자는 환자 자신의 림프구들 (즉, 자가조직 요법)을 이용하여 개별적인 가공된(fabricated) 치료를 받는다. 자가조직 요법들은 실제 적용까지 상당한 기술적 그리고 논리적 장애물들을 직면하는데, 그것들의 세대는 값비싼 전용 시설들 및 전문 인력을 요구하고, 그것들은 환자의 진단 후 짧은 시간 내에 만들어져야 하고, 많은 경우들에, 환자의 전치료(pretreatment)는 저하된 면역 기능을 야기하여, 환자의 림프구들이 저조하게 기능적이고 매우 적은 수로 존재할 수 있다. 이들 장애물들 때문에, 각각의 환자의 자가조직 세포 조제용 물질(preparation)은 실질적으로 새로운 산물이며, 약효 및 안전에서 상당한 변화들을 야기한다.
이상적으로, 동종이계(allogeneic) 치료적 세포들이, 상세하게는 미리-제조될 수 있는 특징이 있고, 환자들에게 즉시 투여가 가능한 표준 요법을 이용하고 싶어 한다. 동종이계(allogeneic)에 의하여, 동일 종에 속하지만 유전적으로 다른 개체로부터 세포들이 수득된다는 것이 의미된다. 그러나 동종이계(allogeneic) 세포들의 사용은 현재 많은 문제점들을 갖는다. 면역적격 숙주들에서, 동종이계(allogeneic) 세포들은 급격히 거부되고, 숙주대이식편(host versus graft) 거부(rejection) (HvG)로 칭해지는 과정, 그리고 이것은 이동된 세포들의 약효를 상당히 제한한다. 면역적격 숙주들에서, 동종이계(allogeneic) 세포들은 이식하는 것이 가능하나, 그것들의 내생의(endogenous) T-세포 수용체들 (TCR) 특이성들은 숙주 조직을 외래의 것으로 인식할 수 있고, 이는 이식편대숙주(graft versus host) 질환(disease) (GvHD)을 야기하는데, 이것은 심각한 조직 손상 및 사망으로 이끌 수 있다.
동종이계(allogeneic) T-세포들을 제공하기 위하여, 본 발명자들은 T-세포들을 유전적으로 조작하는 방법을 일전에 개시하였는데, 여기에서는 다른 효과기(effector) 유전자들, 특히 T-세포 수용체들을 코드하는 것들,이 상표 TALENTM으로 더 잘 알려진, 특이적 TAL-뉴클레아제들를 이용함으로써 불활성화되었다 (Cellectis, 8, rue de la Croix Jarry, 75013 PARIS). 이 방법은 동종이계(allogeneic) T-세포들의 대량 생산을 가능하게 하는 플랫폼의 부분으로서 RNA 형질주입(transfection)을 이용하여 일차(primary) 세포들에서 높은 효율인 것을 입증하여 왔다 (WO 2013/176915).
사이클릭(cyclic) ADP 라이보스(ribose) 하이드롤라제(hydrolase)로도 알려져 있는, CD38 (분화 38(differentiation 38)의 클러스터(cluster))은 많은 면역 세포들 (백혈구들), 특히, CD4+, CD8+, B 림프구들 및 자연 살해 세포들을 포함하는 T-세포들의 표면에서 발견되는 당단백질이다. CD38은 또한 세포 부착, 신호전달(signal transduction) 및 칼슘 신호전달(signaling)에서 작용한다. 이 단백질에 대한 구조적 정보는 참고문헌 P28907 하 UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 인간들에서, CD38 단백질은 크로모좀 4에 위치하는 CD38 유전자에 의하여 코드된다. CD38은 NAD+로부터 ADP-리보스(ribose)로 사이클릭 ADP-리보스(ribose)의 가수분해 및 합성을 촉매화하는 다작용성(multifunctional) 세포 외 효소(ectoenzyme)이다. 이들 반응은 세포내(intracellular) Ca2+의 조절을 위해 필수적인 것으로 여겨진다. 또한, CD38 작용의 손실은 손상된 면역 반응들 및 물질대사(metabolic) 방해들(disturbances)과 관련되었다 (Malavasi F., et al. (2008). "Evolution and function of the ADP ribosyl cyclase/CD38 gene 패밀리 in physiology and pathology". Physiol. Rev. 88(3): 841-86).
다른 한 편으로는, CD38 단백질은 HIV 감염, 백혈병들, 골수종들, 고형 종양들, 타입 II 진성 당뇨병(diabetes mellitus) 및 골 대사(bone metabolism)과, 몇몇 다른 유전적으로 결정되는 조건들의 마커이다. 특히, 그것은 백혈병(leukemia)에서 예후 마커로서 사용되어 왔다 (Ibrahim, S. et al. (2001) CD38 발현 as an important prognostic factor in B-세포 chronic lymphocytic leukemia. Blood 98:181-186).
CD70 및 CS1과 같은 표 1에 지시된 많은 다른 종양 항원 마커들과, CD38을 발현시키는 세포들이 CAR들에 대한 매력적인 타겟들로 간주될 수 있는데도 불구하고, 이러한 항원 마커들이 또한 대부분의 T-세포들의 표면에서 발현된다는 사실은 면역요법을 수행하기 위한 이들 마커들의 선택을 상당히 방해해 왔다.
본 발명자들은 여기에서 예를 들어 백혈병(leukemia), CD70 및 CS1를 야기하는 악성 CD38 양성 B-세포들과 같이, T-세포들의 표면에서 또한 존재하는 특이적 항원 마커들을 발현시키는 병리(pathological) 세포들을 수반하는 면역요법을 위한 전략들을 제공한다.
도 1: CD38을 위하여 방해되고 항원 마커 CD38을 지닌(bearing) 악성(malignant) 세포을 타겟팅하는 (단일-체인 CAR로 대표되는) 키메라 항원 수용체를 갖는 것으로 여겨지는, 본 발명에 따른 조작된 T-세포의 도식 표현.
도 2: 멀티-서브유닛 키메라 항원 수용체의 도식 표현.
도 3: 순환하는 이중(bi)-특이적 항체 및 멀티-서브유닛 CAR를 갖는다고 여겨지는 T-세포들를 결합하는 본 발명에 따른 치료적 전략의 도식 표현. 이 특정 측면에서, 멀티-서브유닛 CAR의 세포외 체인 상 존재하는 수용체는 이중(bi)-특이적 항체에 의하여 인식되는 에피토프를 포함한다. 한편으로는 이중(bi)-특이적 항체는 상기 에피토프에 결합하고 다른 한편으로는 항원 마커는 병리(pathological) 세포에 대한 T-세포의 결합을 용이하게 하는 것으로 의도된다.
도 4: 순환하는(circulating) 단일클론 항체 및 멀티-서브유닛 CAR를 갖는 것으로 여겨지는 T-세포들을 결합하는 본 발명에 따른 치료적 전략의 도식 표현. 이 특정 측면에서, 예를 들어, Fc 수용체의, 멀티-서브유닛 CAR의 세포외 체인 상 존재하는 수용체는, 항원 마커에 대향하여 향해진 단일클론 항체에 결합하는 것으로 의도된다. 단일클론 항체는 병리 세포들에 결합하는 T-세포들의 기회를 증가시킨다.
도 5: 하나의 순환하는 이중(bi)-특이적 항체 및 두 개의 세포외 세포 도메인들을 포함하는 멀티-서브유닛 CAR를 갖는 것으로 여겨지는 T-세포들을 결합하는, 본 발명에 따른 치료적 전략의 도식 표현. 이 특정 측면에서, 세포외 세포 도메인들은 별개의 서브-유닛들(sub-units)에 위치된다. 이들 도메인들은 각각 항원을 타겟팅하는 수용체을 그리고 이중-특이적 항체에 의하여 인식되는 에피토프를 포함한다. 수용체는 첫 번째 항원 마커에 대항하여 향해지고, 반면 이중-특이적 항체는 두 번째 항원 마커 및 에피토프에 결합하는 것으로 의도된다. 이 개시는 선택적으로 첫 번째 및 두 번째 항원 마커들 둘다를 그것들의 표면에 지니는 병리 세포들을 타겟으로 하는 것을 목표로 한다.
도 6: 개시는 도 5와 유사하다, 그러나 자극 및 공동자극 도메인들 (각각 4-1BB 및 CD3제타 단백질 도메인들)은 병리(pathological) 세포로의 키메라 항원 수용체의 결합으로부터 야기되는 T-세포의 활성화의 강도를 조절하기 위하여 교환되어 왔다.
도 7: 도 5와 유사하다, 그러나 자극 및 공동자극 도메인들 (각각 4-1BB 및 CD3제타 단백질 도메인들)이 교환되어 왔고 하나의 CD3제타 도메인이 병리(pathological) 세포로의 키메라 항원 수용체의 결합으로부터 야기되는 T-세포의 활성화의 강도를 증가시키기 위하여 첨가되었다.
도 8: 하나의 순환하는 단일클론 항체 및 두 개의 세포외 세포 도메인들을 포함하는 멀티-서브유닛 CAR을 갖는 것으로 여겨지는 T-세포들을 결합하는, 본 발명에 따른 치료적 전략의 도식 표현. 이 특정 측면에서, 세포외 세포 도메인들은 별개의 서브-유닛들에 위치된다.이들 도메인들은 각각 항원 마커를 타겟팅하는 항원 결합 도메인 및 두 번째 항원 마커에 대항하여 향해지는 단일클론 항체에 결합하는 것으로 의도되는 Fc 수용체를 포함한다. 이 개시는 첫 번째 및 두 번째 항원 마커들 둘다를 그것들의 표면에서 지니는 병리 세포들을 선택적으로 타겟으로 하는 것을 목표로 한다.
도 9: 활성화된 T 세포들에 의한 CD38 발현. A. CD3/CD28 코팅된 비드들 + IL2로 활성화 6일 후 T 세포들에 의한 CD38 발현. B. 활성화 17일 동안 T 세포들에 의한 CD38 발현의 종적(Longitudinal) 분석.
도 10: CD38 유전자 상 넉아웃(Knock-out) (KO): A. T 세포에서 Cd38을 넉아웃시키도록 설계된 3개의 다른 TALEN (T2, T4 및 T5)의 CD38 엑손 1 서열 상 위치. B. TALEN CD38ex1_T2로 형질주입(transfection) 후 T 세포들에서의 CD38의 발현. C. CD38 KO T 세포들의 정제를 위하여 통제하기 위한 CD38 염색.
도 11: CD38 CAR : A. 설계된 CAR들의 3개 버젼들의 대표. B. 타겟 세포주들에 의한 CD38 발현 레벨.
도 12: CAR CS1+ 및 KO CS1 T-세포들의 조작을 위한 타이밍(timing) 실험 및 그것들의 그 다음의 테스트:
도 13: CS1 유전자의 KO를 위하여 사용된 TAL 반복들로 T01, T02 및 T03의 구조체들;
도 14: CS1 (SLAMF7) 유전자내 TAL들 T01, T02 및 T03을 위한 타겟 위치. T01 및 T02는 엑손 1을 타겟으로 하고 (도 14A), 반면 T03은 엑손 2를 타겟으로 한다(도 14B).
도 15A: TALEn 또는 비(not) TALEn 형질주입된(transfected) CAR+와 결합된 또는 형질도입(transduce)되지 않은 세포들에서 타겟 세포 생존능의 퍼센트 측정: CAR+ T-세포들과 공동배양되었을 때 CS1(+) 세포들의 감소된 세포 생존능, 반면 CS1(-) 세포 생존능 상에는 영향이 관찰되지 않았다.
도 15B: 유동세포 분석법 데이터를 이용하여 계산된 특이적 세포 용해(lysis) (CS1+)의 퍼센트 측정. T-세포들이 CAR 형질도입(transduction) 전 CS1 유전자를 타겟팅하는 TALEn으로 형질주입될 때 특이적 세포 용해(lysis)는 2 배 더 높은 것이 보여진다.
도 16: 세포독성(cytoxic) 실험으로부터의 FACS 분석 결과들로, 이것들은 가짜로(mock) 형질주입된(transfected) 세포들에서 형질도입(transduction) 효율들이 CS1 유전자를 타겟팅하는 TALEn 으로 형질주입된(transfected) 세포들에서보다 더 높다는 것을 보여준다(NTD: 형질도입되지 않음(not transduced)).
도 17: 다른 샘플들이 형질도입(transduction) D11 후 CD3/CD28 비드들로 재활성화될 때, 형질도입(transduction) 효율들 및 각각의 샘플에서 CD8/CS1 발현 레벨들을 보여주는, FACS 분석의 결과들. 재활성화 직후(upon) CS1 레벨들의 증가가 가짜로(mock) 형질주입된(transfected) 세포들에서 관찰되는 반면, 낮은 양의 세포들이 TALEn 형질주입된(transfected) 군집들(populations)에서 CS1을 발현시킬 수 있다.
표 1: T-세포들 전기천공법(electroporation)에 사용되는 다른 사이토펄스 프로그램들.
표 2: T-세포들에서 Cas9를 이용한 가이드 RNA를 위한 적절한 타겟 서열들.
표 3: 면역 체크포인트 단백질들을 코드하는 유전자들의 리스트
표 4: T-세포들의 표면 상 발현되는 것이 발견된 분화(differentiation)의 클러스터(Cluster) (CD) 항원 마커들, 반면 종양의 다른 타입들의 특징이다.
표 5 내지 13: 여러가지 타입들의 암으로부터의 고형 종양 세포들에서 과발현(over-expressed)되는 반면, T-세포들에서 발현된 주된 표면 항원 마커들. 목록화된 항원 마커들은 실시예 1에 설명된 대로 확인되었다.
표 5: 대장 종양 세포들;
표 6: 유방 종양 세포들;
표 7: 소화관(digestive track) 종양 세포들;
표 8: 신장 종양 세포들;
표 9: 간 종양 세포들;
표 10: 폐 종양 세포들;
표 11: 난소 종양 세포들;
표 12: 췌장(pancreas) 세포들;
표 13: 전립선(prostate) 세포들;
표 14: 여러 타입들의 암 (ALL, AML, CML, MDS, CLL, CTRL)으로부터의 액상 종양 세포들에서 과발현되는 반면, T-세포들에서 발현되는 주된 표면 항원 마커들. 목록화된 항원 마커들은 실시예 1에 설명된 대로 확인되었다.
표 15: CD38 항원의 불활성화를 위한 TALEN들 및 시험된 CD38 타겟의 서열들;
표 16: 두 개의 다른 CD38 타겟들 및 그것의 불활성화를 위한 해당되는 TALEN들의 서열들;
표 17: VH 및 VL 체인들을 위한 특이적 CDR들의 그리고 scFv 항-CD38 항체들 다라투무맙(daratumumab) 및 MOR202의 VH 및 VL 체인들의 서열들.
표 18: 사용된 개개의 요소들의 그리고 scFv 다라투무맙(daratumumab)-기반의 항-CD38 CAR들의 3개의 다른 구조체들의 폴리펩타이드 서열;
표 19: scFv 항-CS1 항체들의 VH 및 VL 체인들의 서열들;
표 20: 도 11A에서 V1, V2 및 V3 버젼들에 기초한 항-CS1 CAR들의 폴리펩타이드 서열;
표 21: CS1 타겟 및 그것의 불활성화를 위한 TALEN들의 서열들;
표 22: CD70 타겟 및 그것의 불활성화를 위한 TALEN들의 서열들;
표 23: scFv 항-CD70 Ab4, Ab8 및 1F6 항체들의 VH 및 VL 체인들의 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 서열들;
표 24: 도 11A의 V1, V2 및 V3 버젼들에 기초한 항-CD70 CAR들의 폴리펩타이드 서열.
발명의 개요
본 발명은 병리 세포들을 타겟으로 하도록 의도된 T-세포들을 조작하는 방법들을 개시하지만, 상기 병리 세포들은 T-세포들의 표면에서 또한 존재하는 하나 또는 몇몇의 항원 마커들을 발현시킨다. 이러한 항원 마커들의 예들은 표 1에서 발견된다. 이러한 항원 마커의 예는 CD38이다. 다른 예들은 CD70 및 CS1이다. 항원 마커에 의하여 그것의 면역-반응성 단편의 전체 단백질이 의미된다.
본 발명에 따라, T-세포들은 세포 표면 상 이러한 항원 마커의 제시에 수반되거나 또는 이러한 항원 마커들을 코드하는 유전자들의 발현을 불활성화시키기 위하여 조작된다.
이 불활성화는 바람직하게는 게놈 변형에 의하여, 더욱 특히, T-세포의 표면에서 상기 항원 마커의 제시 또는 생산에 직접적으로 또는 간접적으로 관여되는 유전적 자리(locus)를 타겟으로 할 수 있는 특이적 희귀(rare)- 절단(cutting) 엔도뉴클레아제(endonuclease)의 T-세포에서의 발현을 통하여 수행된다. 메가뉴클레아제들(Meganucleases), TAL-뉴클레아제들, 징크(zing)-핑거(finger) 뉴클레아제들(nucleases) (ZFN), 또는 Cas9/CRISPR 또는 아르고노트(Argonaute)와 같은 RNA/DNA 가이드된(guided) 엔도뉴클레아제들와 같은, 다른 타입들의 희귀-절단 엔도뉴클레아제들이 사용될 수 있다.
선호되는 예에 따라, T-세포들은 상기 타겟되는 항원 마커를 갖고 있는 상기 세포들의 특이적 결합을 가능하게 하는 적어도 하나의 키메라(chimeric) 항원 수용체들 (CAR)을 갖는다고 생각된다.
또다른 예에 따라, T-세포들은 특히, 예를 들어, T-세포 수용체들 (TCR) 또는 HLA 복합체(complex)를 코드하는, 것들과 같은, 자가-인식에 관여되는 유전자들을 결실시킴으로써 그것들을 동종이계(allogeneic)로 만들도록 더 조작될 수 있다.
본 발명은 상기 T-세포들을 조작하는데 유용한 단백질들, 폴리펩타이드들 또는 벡터들 중 임의의 것과 더불어, 상세한 설명, 예들 및 도면들에서 제시된 유전적 변형들을 포함하는 분리된 세포들 또는 세포주들을 포함한다.
본 발명의 결과로서, 조작된 T-세포들은 암, 감염들 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료 방법들에서, 치료적 제품들로서, 이상적으로는 "기성품인(off the shelf)" 제품으로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 선호되는 면역 세포들은, 치료적 제품들, 바람직하게는 동종이계(allogeneic)인 제품들로서 그것들의 사용을 위하여,
● [표 1의 항원 마커를 타겟팅하는 CAR] + [표 1의 항원 마커] -
하기 것들과 같음:
● [CAR CD38]+[CD38]-, 바람직하게는 또한 [TCR] 음성;
● [CAR CD70]+[CD70]- , 바람직하게는 또한 [TCR] 음성;
● [CAR CS1]+[CS1]- , 바람직하게는 또한 [TCR] 음성;
표현형들을 야기하는 것들이다.
발명의 상세한 설명
여기에서 특이적으로 정의되지 않으면, 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 유전자 치료, 생화학, 유전학, 및 분자생물학의 영역에서 당업자에 의하여 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
여기에서 기재된 것들과 유사하거나 또는 등가인 모든 방법들 및 물질들은, 여기에 기재된 적절한 방법들 및 물질들과 함께 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 여기에 언급된 모든 공개들, 특허 출원들, 특허들, 및 다른 참고문헌들은 그 전체가 참고로서 포함된다. 상충되는 경우, 정의들을 포함하는 본 명세서가 이길 것이다. 나아가 물질들, 방법들 및 예들은 설명적인 것일 뿐이며, 다르게 특정되지 않는 한, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 실시는, 다르게 표시되지 않는 한, 통상의 지식 내인, 세포생물학, 세포 배양, 분자생물학, 유전자이식(transgenic) 생물학(biology), 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 현재 기술들을 포함할 것이다. 이러한 기술들은 문헌에서 완전히 설명된다. 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); and Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986) 참조.
일반적인 측면에서, 본 발명은 암, 감염들 및 자가면역 질환들과 같은 병리 세포들의 발달과 연결된 질환들을 치료하는 새로운 입양 면역요법 전략들을 위한 방법들에 대한 것이다.
본 발명의 주요 목적으로서 T-세포들과 마찬가지로 특이적 항원 마커들을 갖는 병리 세포들을 타겟으로 하는 가능성이다. 병리(pathological) 세포에 의하여, 건강 악화를 야기하는 것으로 여겨지는, 환자 내 존재하는 임의의 타입들의 세포들이 의미된다.
일반적으로, 병리 세포들은 환자의 차도를 얻기 위하여 감소되거나 또는 제거될 필요가 있는 악성 또는 감염된 세포들이다.
첫 번째 예에서, 본 발명의 방법들은 하기 단계들을 포함하는 면역요법을 위한, 적절한 면역 세포들, 바람직하게는 T-세포들을 제조하는(preparing) 방법에 대한 것이다:
(a) 항원 마커의 발현 또는 제시에 관여되는 면역 세포에서 유전자를 유전적으로 불활성화 또는 돌연변이 일으키는 단계로, 상기 항원 마커는 상기 T-세포 및 병리 세포의 표면 둘 다에 존재하는 것으로 알려진 단계;
(b) 상기 면역 세포 내로 상기 병리(pathological) 세포의 표면에 존재하는 상기 항원 마커에 대항하여 향해지는 키메라 항원 수용체를 코드하는 이식유전자를 발현시키는 단계.
본 발명에 따른 면역 세포들은 병리 세포들 및 면역 세포들에 의하여 보통 발현되는, 또는 상기 T 세포들의 표면에 존재하는 것으로 알려진 항원 마커로 향해지는 키메라 항원 수용체를 갖는다고 여겨진다. "존재하는 것으로 알려진" 표면은, 그 항원 마커가 인 비보, 특히 혈액에서, 자연 조건 하, 성장되지만, 그것들이 인 비트로에서 배양될 때는 반드시 그런 것은 아닌, 면역 세포들의 표면에서 발견되는 것으로 보고된다는 것을 의미한다. 아무튼, 본 발명의 방법은 면역 세포의 표면 상 항원 마커의 부재를 야기하고, 이로써 키메라 항원 수용체가 조작된 T-세포 표면과 반응하는 것을 방지한다. 이 측면에서, 본 발명은 그것들의 표면에 상기 마커 항원를 제시하는 세포들을 배제함으로써 그 결과인 T-세포들을 정제하는 추가의 단계를 포함할 수 있다.
표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명은 종양 세포들 뿐 아니라 T-세포들에 의하여도 발현되는 것으로 보고된 중요한 수의 항원 마커 후보들에 대한 것이다. CD38과 같은, 이들 중 일부는 얼마 동안 백혈병 병리 세포들에 관한, 그러나 치료요법으로는 아닌, 진단 방법들에서 특이적 마커들로서 사용되어 왔다. 정말로, 이들 마커들이 꽤 특이적 마커들로서 업계에서 확인되었음에도 불구하고, 그것들은 면역요법을 위한 타겟들로서 이용될 수 없었는데, 이는 이들 마커들에 대항하여 향해진 항체들이 환자들의 T-세포들에 의하여 방해되거나 또는 파괴되었기 때문이다. 본 발명자들은 CS1 및 CD70가 또한 T-세포들의 표면에 존재하며, 이러한 T 세포들에서 CS1 및 CD70을 타겟팅하는 CAR들을 발현시키는 것은 그것들의 소모를 이끈다는 것을 밝혔다(예 2 참조).
본 발명의 선호되는 예에 따라, 상기 방법의 단계 a)의 유전자 돌연변이 또는 불활성화는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 이용하여 수행된다.
유전자를 불활성화시킴으로써, 관심있는 유전자가 기능적 단백질 형태로 발현되지 않는 것이 의도된다. 특정 예들에서, 방법의 유전적 변형은 희귀-절단 엔도뉴클레아제의, 조작하려는 제공된 세포들에서, 발현에 의존하여, 동일한 것이 하나의 타겟된 유전자에서 절단(cleavage)을 촉매화하여 이로써 상기 타겟된 유전자를 불활성화시킨다. 엔도뉴클레아제에 의하여 야기되는 핵산 가닥 파손들(breaks)은 보통 상동 재조합 또는 비상동(non-homologous) 말단(end) 결합(joining) (NHEJ)의 뚜렷한 메커니즘을 통하여 수선된다. 그러나, NHEJ는 절단(cleavage)의 위치에서 DNA 서열을 바꾸는 것을 자주 야기하는 불완전한 수선 공정이다. 메커니즘들은 소위 미세상동(microhomology)-매개 말단 결합을 통하여(Betts, Brenchley et al. 2003; Ma, Kim et al. 2003) 또는 직접적인 재-연결(ligation)을 통한 2 개의 DNA 말단들의 남은 것들(remains)의 재결합(rejoining)(Critchlow and Jackson 1998)을 포함한다. 비상동 말단 결합 (NHEJ)을 통한 수선은 가끔 작은 삽입들 또는 결실들을 야기하고 특이적 유전자 넉아웃들(knockouts)의 창출에 사용될 수 있다. 상기 변형은 적어도 하나의 뉴클레오타이드에서 치환, 결실 또는 첨가일 수 있다. 절단-유도된 돌연변이생성 이벤트, 즉, NHEJ 이벤트에 연이은 돌연변이생성 이벤트가 발생한 세포들은 업계에 잘 알려진 방법에 의하여 확인 및/또는 선택될 수 있다.
용어 "희귀-절단 엔도뉴클레아제"는 DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 DNA 분자 내 핵산들 사이의 결합들(bonds)의 가수분해(절단(cleavage))을 촉매화할 수 있는 야생형 또는 변종(variant) 효소를 가리킨다. 특히, 상기 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제, 더욱 바람직하게는, 매우 특이적이며, 길이가 10 부터 45 염기쌍들 (bp)까지 걸친, 보통 길이가 10 부터 35 염기쌍들까지 걸친, 더욱 보통은 12 부터 20 염기쌍들까지 걸친 핵산 타겟 자리들을 인식하는, 희귀-절단 엔도뉴클레아제일 수 있다. 본 발명에 따른 엔도뉴클레아제는 "타겟 서열"로 더 지시되는 특이적 폴리뉴클레오타이드 서열들을 인식하고, 이들 타겟 서열들 내에서 또는 거기에 인접한 서열들 내로 핵산을 절단하는데, 이는 상기 엔도뉴클레아제의 분자 구조에 의존한다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 특이적 폴리뉴클레오타이드들 서열들에서 단일- 또는 이중-가닥 손상을 인식하고 만들어낼 수 있다.
특정 예에서, 본 발명에 따른 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas9/CRISPR 복합체와 같은, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제이다. RNA 가이드된 엔도뉴클레아제들은 엔도뉴클레아제가 RNA 분자와 어울리는 게놈 조작 도구의 새로운 세대로 여겨진다. 이 시스템에서, RNA 분자 뉴클레오타이드 서열은 타겟 특이성을 결정하고 엔도뉴클레아제를 활성화시킨다 (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013).
Cas 9
Csn1 (COG3513)으로도 명명된 Cas9는 crRNA 생물발생(biogenesis) 및 침입(invading) DNA의 파괴 둘 다에 참여하는 큰 단백질이다. Cas9 는 S. 서모필레스(thermophiles), 리스테리아(Listeria) 인노쿠아(innocua)(Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012) 및 S. 피오게네스(Pyogenes) (Deltcheva, Chylinski et al. 2011)와 같은 다른 박테리아 종들에서 기재되어 왔다. 큰 Cas9 단백질 (> 1200 아미노산들)은 두 개의 예상된 뉴클레아제 도메인들, 즉, 단백질 중앙에 위치한 HNH (McrA-like) 뉴클레아제 도메인 및 분열된(splitted) RuvC-유사(like) 뉴클레아제 도메인 (RNase H fold) (Makarova, Grishin et al. (2006)을 포함한다.
"Cas9"에 의하여 타겟 핵산 서열을 가공하는 것이 가능한 Cas9의 상동체(homologue) 또는 조작된 엔도뉴클레아제가 의미된다. 특정 예에서, Cas9는 이중-가닥 손상 또는 단일-가닥 손상에 해당할 수 있는 핵산 타겟 서열 내 절단(cleavage)을 유도할 수 있다. Cas9 변종(variant)은 단백질 조작 또는 무작위 돌연변이유발에 의하여 수득되고, 자연에서는 자연적으로 존재하지 않는 Cas9 엔도뉴클레아제일 수 있다. 본 발명에 따른 Cas9 변종들(variants)은 예를 들어, S. 피요게네스(pyogenes) Cas9 엔도뉴클레아제 (COG3513)의 아미노산 서열 내 적어도 하나의 잔기의 돌연변이들, 즉, 결실들, 삽입들 또는 치환들에 의하여 수득될 수 있다. 본 발명의 틀 측면에서, 이러한 Cas9 변종들(variants)은 기능적으로 남는데, 즉, 그것들은 타겟 핵산 서열의 가공 능력을 유지한다. Cas9 변종(variant) 또한 S. 피요게네스(pyogenes) Cas9의 아미노산 서열 내 적어도 하나의 잔기의 결실들 from, 또는 삽입들 또는 치환들을 포함할 수 있는 S. 피요게네스(pyogenes) Cas9의 상동체일 수 있다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 또한, 최종 구조체가 원하는 활성, 특히 가이드 RNA 또는 핵산 타겟 서열에 결합하는 능력을 갖는다면, 최종 구조체에 도달하도록 만들어질 수 있다.
RuvC/RNaseH 모티프는 RNA 및 DNA 둘 다에 작용하는 핵산분해(nucleolytic) 기능들의 넓은 스펙트럼들을 보여주는 단백질들을 포함한다 (RNaseH, RuvC, DNA transposases and retroviral integrases and PIWI domain of Argonaut proteins). 본 발명에서, Cas9 단백질의 RuvC 촉매적(catalytic) 도메인은 서열 모티프(motif): D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A에 의하여 특징될 수 있는데, 이 때 X는 자연적인 20 아미노산들 중 임의의 하나를 나타내고, [I/L]은 이소류신(isoleucine) 또는 류신(leucine)을 나타낸다. 다른 용어들로, 본 발명은 적어도 D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A 서열을 포함하는 Cas9 변종(variant)에 대한 것이고, 이 때 X는 자연적인 20 아미노산들 중 임의의 하나를 나타내고 [I/L]은 이소류신 또는 류신을 나타낸다.
HNH 모티프는 콜리신들(colicins), 제한 효소들 및 호밍(homing) 엔도뉴클레아제들을 포함하는 이중-가닥 DNA에 작용하는 많은 뉴클레아제들의 특징이다. 도메인 HNH (SMART ID: SM00507, SCOP 명명법:HNH 패밀리)는 여러가지 DNA 결합 단백질들과 관련되어 여러가지 결합 및 절단 기능들을 수행한다. 알려진 기능을 갖는 것들은 박테리아 독성, 그룹들 I 및 II 인트론들 및 인테인들(inteins)에서의 호밍 기능들, 재조합, 발전적으로(developmentally) 통제되는 DNA 재배열(rearrangement), 파아지(phage) 포장 및 제한 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 다양한 세포 공정들에 포함된다(Dalgaard, Klar et al. 1997). 이들 단백질들은 바이러스들, 고세균(archaebacteria), 진정세균(eubacteria) 및 진핵생물들에서 발견된다. 흥미롭게도, LAGLI-DADG 및 GIY-YIG 모티프들과 같이, HNH 모티프는 인테인들, 그룹 I 및 그룹 II 인트론들 같은 자기-증식(elf-propagating) 요소들의 엔도뉴클레아제 도메인들과 자주 관련된다. HNH 도메인은 얼마간 떨어져서 보존된 His (아미노-말단(terminal)) 및 His/Asp/Glu (카르복시-말단) 잔기들이 측면에 배치된 보존된 Asp/His 잔기의 존재에 의하여 특징될 수 있다. 이들 단백질들의 상당수는 또한 중앙 Asp/His 잔기의 한 측 상에 CX2C 모티프를 가질 수 있다. 구조적으로, HNH 모티프는 α 헬릭스에 의하여 각 측 상에 측면에 위치된 비틀린(twisted) β-가닥들의 중앙 헤어핀으로 나타난다(Kleanthous, Kuhlmann et al. 1999). Cas9의 큰 HNH 도메인은 서열번호 5로 나타내어진다. 본 발명에서, HNH 모티프는 서열 모티프: Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S 에 의하여 특징될 수 있는데, 이 때 X는 자연적인 20 아미노산들 중 임의의 하나를 나타낸다. 본 발명은 적어도 Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S 서열을 포함하는 Cas9 변종(variant)에 대한 것인데, 이 때 X는 자연적인 20 아미노산들 중 임의의 하나를 나타낸다.
이 발명은 타겟인 복합(multiplex) 유전자 변형들을 쉽게 하고 Cas9 세포들로의 가이드 RNA의 도입에 의하여 유도(inducible) 뉴클레아제 시스템을 만드는데 특히 관심있을 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 본 발명자들은 Cas9 단백질이 가이드 RNA와 함께 또는 분리되어 타겟 핵산 서열을 가공할 수 있는 HNH 도메인들 및 두 개의 분리된 분열(split) Cas9 RuvC 로 나뉠 수 있다는 것을 밝혔다.
또한 다른 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제들 또는 Cas 상동체들로부터의 RuvC 및 HNH 도메인들은 뉴클레아제 효율 또는 특이성을 개선하기 위하여 조립될 수 있다. 다른 종들로부터의 도메인들은 두 개의 단백질들로 분열되거나 또는 서로 융합하여 변종(variant) Cas 단백질을 형성할 수 있다. Cas9 분열(split) 시스템은 게놈 타겟팅의 유도 방법에 특히 적합하고 세포 내 Cas9 과발현의 잠재적 독성 효과를 피하는 것으로 여겨진다. 정말로, 바람직하게는 상기 분열(split) 도메인을 코드하는 이식유전자로 상기 세포를 안정적으로 형질전환(transforming)시킴으로써, 첫 번째 분열(split) Cas9 도메인은 세포 내로 도입될 수 있다. 그 다음에, Cas9의 상보적인 분열(split) 부분은 세포 내로 도입되어, 두 개의 분열(split) 부분들이 세포 내로 재조립되어 원하는 시간에 기능적 Cas9 단백질을 재구성할 수 있다.
야생형 Cas9와 비교하여 분열(split) Cas9의 크기의 감소는 예를 들어, 세포 투과(penetrating) 펩타이드들을 이용하는 것에 의한, 세포 내로의 전달(delivery) 및 벡터화를 쉽게 한다. 다른 Cas 단백질들로부터의 재-배열된 도메인들은 예를 들어, S. 피요게네스(pyogenes) Cas9와 약간 다른 PAM 모티프들을 타겟팅함으로써, 특이성 및 뉴클레아제 활성을 조절하는 것을 가능하게 한다.
분열(Split) Cas9 시스템
RuvC 및 HNH 도메인들의 예전의 특징화는 본 발명자들이 Cas9 단백질를 분열(split) Cas9 단백질로 만들도록 하였다. 놀랍게도 본 발명자들은 이들 두 개의 분열(split) Cas9가 분리하여 또는 함께 핵산 타겟을 가공할 수 있다는 것을 보여주었다. 이 관찰은 분열(split) Cas9 단백질을 이용하여 새로운 Cas9 시스템을 발달시키는 것을 가능하게 한다. 각각의 분열(split) Cas9 도메인들은 제조되고 분리되어 이용될 수 있다. 이와 같이, 이 분열(split) 시스템은 T-세포들에서 RNA guided 엔도뉴클레아제의 벡터화 및 전달에 몇몇 이점들을 보이며, 이는 더 짧고 그리고/또는 불활성인 단백질을 전달하는 것을 가능하게 하고, 원하는 시간에 T-세포들에서 게놈 조작을 유도하는데 특히 적합하고, 이로써 통합적인 Cas9 뉴클레아제의 잠재적 독성을 제한한다.
"분열(split Cas9)"에 의하여 RuvC 또는 HNH 도메인을 포함하나, 이들 도메인들 둘다를 포함하는 것은 아닌, Cas9 단백질 또는 Cas9 변종의 감소된 또는 길이를 줄인(truncated), 형태로 여기에서 의미된다. 이러한 "분열(Split) Cas9"는 예를 들어, RuvC 도메인을 제공하는 하나의 분열(Split) Cas9 및 HNH 도메인을 제공하는 또다른 것과 같은, 상보적인 방식으로, 또는 가이드 RNA와 독립적으로 사용될 수 있다. 다른 분열(split) RNA 가이드된 엔도뉴클레아제들는 RuvC 및/또는 NHN 도메인들을 갖고 함께 사용될 수 있다.
각각의 Cas9 분열(split) 도메인은 동일하거나 또는 다른 Cas9 상동체들로부터 유래될 수 있다. Cas9의 많은 상동체들이 게놈 데이터베이스에서 확인되어 왔다.
상기 Cas9 분열(split) 도메인들 (RuvC 및 HNH 도메인들)은 동시에 또는 연속적으로 세포 내로 도입될 수 있어 상기 분열(split) Cas9 도메인(들)이 세포에서 타겟 핵산 서열을 가공한다. 상기 Cas9 분열(split) 도메인들 및 가이드 RNA는 다른 데서 기재한 바와 같이, 세포 투과 펩타이드들 또는 다른 형질주입(transfection) 방법들을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 컴팩트(compact) Cas9로 불리는 하나의 분열(split) Cas9 도메인만이 상기 세포 내로 도입된다. 정말로, 놀랍게도 본 발명자들은 전술한 RuvC 모티프를 포함하는 분열(split) Cas9 도메인이 HNH 모티프를 포함하는 분열(split) 도메인의 타겟 핵산 서열을 독립적으로 절단하는 것이 가능하다는 것을 보였다. 이런 식으로 그들은 가이드 RNA가 타겟 핵산 서열에 결합하기 위하여 HNH 도메인의 존재를 필요로 하지 않으며, RuvC 분열(split) 도메인에 의하여 결합되기에 충분히 안정적이라는 것을 밝힐 수 있었다. 선호되는 예에서, 상기 분열(split) Cas9 도메인 단독은 상기 타겟 핵산 서열에 자국을 내는 것(nicking)이 가능하다.
각각의 분열(split) 도메인은 N-말단(terminal) 및/또는 C-말단(terminal) 말단(end)에서 적어도 하나의 활성 도메인에 융합될 수 있고, 상기 활성 도메인은 : 뉴클레아제 (예를 들어 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제), 폴리메라제, 키나아제, 포스파타제, 메틸라제, 디메틸라제, 아세틸라제, 디사세틸라제(desacetylase), 토포이소메라제(topoisomerase), 인테그라제, 트란스포사제( transposase), 리가아제(ligase), 헬리카제, 리콤비나제(recombinase), 전사활성인자(예를 들어 VP64, VP16), 전사억제제 (예를 들어; KRAB), DNA 말단 가공 효소 (예를 들어 Trex2, Tdt), 리포터 분자 (예를 들어 형광 단백질들, lacZ, 루시페라제)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
HNH 도메인은 타겟 이중 가닥 DNA의 하나의 가닥을 자국을 내는 것(nicking)의 원인이고, RuvC-유사 RNaseH 폴드(fold) 도메인은 이중가닥 핵산 타겟의 (PAM 모티프를 포함하는) 다른 가닥에 자국을 내는 것(nicking)에 관련된다 (Jinek, Chylinski et al. 2012). 그러나 야생형 Cas9에서, 이들 두 개의 도메인들은 PAM의 바로 가까이에서 동일한 타겟 서열(프로토(proto)-스페이서(spacer)) 내 침투(invasive) DNA의 뭉툭한(blunt) 절단(cleavage)을 야기한다 (Jinek, Chylinski et al. 2012). Cas 9는 니카아제(nickase)일 수 있고, 다른 타겟 서열들 내에서 틈(nick) 이벤트를 유도한다.
제한되지 않는 예로서, Cas9 또는 분열(split) Cas9는 HNH 또는 RuvC-유사 도메인의 촉매적 잔기들 내 돌연변이(들)을 포함하여, 다른 타겟 서열들 내 틈내기(nick) 이벤트를 유도할 수 있다. 제한되지 않는 예로서, Cas9 단백질의 촉매적 잔기들은 Cas 패밀리(Family) 멤버들의 상동체들에 CLUSTALW 방법을 이용하여 아미노산들 D10, D31, H840, H868, N882 및 N891 또는 정렬된(aligned) 위치들에 해당하는 것들이다. 이들 잔기들 중 임의의 것은 임의의 다른 아미노산들에 의하여, 바람직하게는 알라닌(alanine) 잔기에 의하여 대체될 수 있다. 촉매적 잔기들 내 돌연변이는 cas9의 촉매적 도메인 중 적어도 하나의 불활성화를 유도하는 아미노산들의 결실 또는 첨가, 또는 또다른 아미노산들에 의한 치환을 의미한다.(참고.) 특정 예에서, Cas9 또는 분열(split) Cas9는 상기 돌연변이들 중 하나 또는 몇몇을 포함할 수 있다. 또다른 특정 예에서, 분열(split) Cas9는 두 개의 RuvC 및 HNH 촉매적 도메인들 중 하나만을 포함한다. 본 발명에서 다른 종들로부터의 Cas9, Cas9 상동체들, 조작된 Cas9 및 그것의 기능적 변종이 사용될 수 있다. 본 발명은 관심있는 유전적 서열 내 핵산 절단(cleavage)을 수행하기 위하여 임의의 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 또는 분열(split) RNA 가이드된 엔도뉴클레아제들 변종들(variants)의 사용을 예상한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 Cas9 변종들(variants)은 S. 피요게네스(Pyogenes) (COG3513)와 적어도 70 %, 바람직하게는 적어도 80 %, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 그리고 더욱 더 바람직하게는 95 % 동일성(identity)을 공유하는 아미노산 서열을 갖는다.
메가뉴클레아제들
희귀-절단 엔도뉴클레아제는 또한 호밍(homing) 엔도뉴클레아제일 수 있으며, 또한 메가뉴클레아제(meganuclease)의 이름으로도 알려져 있다. 이러한 호밍 엔도뉴클레아제들은 업계에 잘 알려져 있다 (Stoddard 2005). 호밍 엔도뉴클레아제들은 매우 특이적이며, 12부터 45 염기쌍들 (bp)까지의 길이로 걸쳐진, 보통 14 부터 40 bp까지의 길이로 걸쳐진 DNA 타겟 위치들을 인식한다. 본 발명에 따른 호밍 엔도뉴클레아제는 예를 들어 LAGLIDADG 엔도뉴클레아제에, HNH 엔도뉴클레아제에, 또는 GIY-YIG 엔도뉴클레아제에 해당할 수 있다. 본 발명에 따른 선호되는 호밍 엔도뉴클레아제는 I-CreI 변종일 수 있다. "변종(variant)" 엔도뉴클레아제, 즉, 무작위 돌연변이 발생에 의하여 또는 유전적 가공에 의하여 수득되는 그리고 자연에서 자연적으로 존재하지 않는 엔도뉴클레아제는 야생형 엔도뉴클레아제들에 의하여 인식되는 것과 다른 DNA 서열들에 결합할 수 있다(국제출원 WO2006/097854 참조).
상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 모듈식 DNA 결합 뉴클레아제일 수 있다. 모듈식 DNA 결합 뉴클레아제에 의하여 핵산 타겟 서열을 특정하는(specifying) 단백질 또는 적어도 하나의 DNA 결합 도메인 및 엔도뉴클레아제의 적어도 하나의 촉매적 도메인를 포함하는 임의의 융합 단백질들이 의미된다. DNA 결합 도메인은 보통 이중- 또는 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드들을 인식하는 적어도 하나의 모티프를 포함하는 독립적으로 폴드된(folded) 폴리펩타이드 또는 단백질 도메인에 의하여 형성된 RNA 또는 DNA-결합 도메인이다. 이러한 많은 폴리펩타이드들은 특이적 핵산 서열들에 결합하는 능력을 갖는 것으로 당업계에서 기재되어 왔다. 이러한 결합 도메인들은, 제한되지 않는 예들로서, 헬릭스-턴 헬릭스 도메인들, 류신 지퍼 도메인들, 날개달린(winged) 헬릭스 도메인들, 헬릭스-루프-헬릭스 도메인들, HMG-박스 도메인들, 면역글로불린(Immunoglobin) 도메인들, B3 도메인 또는 조작된 징크 핑거 도메인을 자주 포함한다.
징크 - 핑거 뉴클레아제들
인 비트로에서 DNA를 절단하기 위하여 처음 개발된, "징크 핑거 뉴클레아제들(Zinc Finger Nucleases)" (ZFNs)은 3 또는 그보다 많은 C2H2 징크 핑거 모티프들을 포함하는 DNA 인식 도메인 및, FokI, 타입 IIS 제한 효소의 절단(cleavage) 도메인 사이의 융합이다. 정확한 방향(orientation) 및 간격(spacing)에서 두 개의 개별적인 ZFN들의 DNA 내 특정 위치에서의 헤테로다이머화(heterodimerization)는 DNA에서 이중가닥(double-strand) 손상(break) (DSB)으로 이끈다. 이러한 키메라 엔도뉴클레아제들의 이용은 Urnov et al.에 의하여 검토된 대로 당업계에서 널리 보고되어 왔다. (Genome editing with engineered zinc finger nucleases (2010) Nature reviews Genetics 11:636-646).
표준 ZFN들은 절단(cleavage) 도메인을 각각의 징크 핑거 도메인의 C-말단에 융합시킨다. 두 개의 절단(cleavage) 도메인들을 다이머화하고 DNA를 절단하는 것을 가능하게 하기 위하여, 두 개의 개별적인 ZFN들이 어느 정도의 거리로 떨어진 그것들의 C-말단들과 DNA의 반대 가닥들에 결합한다. 징크 핑거 도메인 및 절단(cleavage) 도메인 사이의 가장 흔히 사용되는 링커 서열들은 각각의 결합 자리의 5' 가장자리(edge)가 5 내지 7 bp에 의하여 분리되기를 요구한다.
새로운 징크-핑거 어레이들을 만들어내는 가장 간단한 방법은 알려진 특이성을 갖는 더 작은 징크-핑거 "모듈들(modules)"을 결합시키는 것이다. 가장 일반적인 모듈식 조립 공정은 9개 염기쌍 타겟 자리를 인식할 수 있는 3-핑거 어레이를 만들기 위하여 3개의 염기쌍 DNA 서열을 각각 인식할 수 있는 3개의 분리된 징크 핑거들을 결합시키는 단계를 포함한다. 많은 선택 방법들이 원하는 서열들을 타겟팅할 수 있는 징크-핑거 어레이들을 만드는데 사용되어 왔다. 초기의 선택 노력들은 부분적으로 무작위인 징크-핑거 어레이들의 큰 풀(pool)로부터 정해진 DNA 타겟에 결합한 단백질들을 선택하기 위하여 파아지 디스플레이를 이용하였다. 더 최근의 노력들은 효모 일-잡종(hybrid) 시스템들, 박테리아 일-잡종 및 이-잡종 시스템들, 및 포유류 세포들을 이용하였다.
TAL -뉴클레아제들
"TALE-뉴클레아제(nuclease)" 또는 "MBBBD-뉴클레아제"는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 도메인과, 모듈식(Modular) 염기(Base)-당(per)-염기(Base) 결합(Binding) 도메인(domain) (MBBBD) 또는 전사(Transcription) 활성인자(Activator) 유사(Like) 효과기(Effector) 단백질들 (TALE)로부터 보통 유래하는 DNA 결합 도메인의 융합으로부터 야기되는 조작된 단백질들을 가리킨다. 이러한 촉매적 도메인은 보통 예를 들어 I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-I과 같은 효소들에서 생산된다. TALE-뉴클레아제는 선택된 촉매적 도메인 (WO2012138927)에 따라 모노머 또는 다이머 형태로 형성될 수 있다. 이러한 조작된 TALE-뉴클레아제들은 상표명 TALENTM 하 상업적으로 이용가능하다 (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France).
본 발명의 선호되는 예에 따라, DNA 결합 도메인은 전사(Transcription) 활성인자(Activator) 유사(like) 효과기(Effector) (TALE)로부터 유래하며, 이때 서열 특이성은 제한되지 않는 예들로서, 잔토모난스(Xanthomonas) 또는 랄스토니아(Ralstonia) 박테리아 단백질들 AvrBs3, PthXo1, AvrHah1, PthA, Tal1c 로부터 유래하는 일련의 33-35 아미노산들 반복들(repeats)에 의하여 만들어진다.
이들 반복들은 본질적으로 염기쌍과 상호작용하는 것을 특정하는 2개 아미노산들 자리들이 다르다 (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009). DNA 타겟 내 각각의 염기쌍은 반복의 두 개의 변종(variant) 아미노산들로부터 야기되는 특이성을 갖고 단일 반복에 의하여 접촉된다 (소위 반복(repeat) 가변(variable) 디펩타이드(dipeptide), RVD). TALE 결합 도메인들은 핵(nuclear) 위치화(localization) 신호들(signals) (NLS)을 포함하는 C-말단 도메인 및 타겟된 서열의 첫 번째 타이민(thymine) 염기(base) (T0)의 요구의 원인이 되는 N-말단 자리이동(translocation) 도메인을 더 포함할 수 있다. TALE 핵산 결합 도메인은 보통 TALE 인식 자리의 각각의 뉴클레오타이드들 염기에 특이적인 RVD를 포함하는 각각의 반복, TALE 반복 서열들을 다수 포함하는 조작된 코어 TALE 스캐폴드(scaffold)에 해당한다. 본 발명에서, 상기 코어 스캐폴드의 각각의 TALE 반복 서열은 30 내지 42 아미노산들, 더욱 바람직하게는 33 또는 34 아미노산들로 만들어지며, 이때 12 및 13 위치들에 위치하는 두 개의 중요한 아미노산들 (소위 반복 가변 디펩타이드, RVD)이 상기 TALE 결합 자리 서열의 하나의 뉴클레오타이드의 인식을 매개한다; 등가의 두 개의 중요한 아미노산들은 특히, 33 또는 34 아미노산들 길이보다 더 높은 TALE 반복 서열에서, 12 및 13 외 위치들에 위치될 수 있다. 바람직하게는, 다른 뉴클레오타이드들의 인식과 관련된 RVD들은 C의 인식을 위한 HD, T의 인식을 위한 NG, A의 인식을 위한 NI, G 또는 A의 인식을 위한 NN이다. 또다른 예에서, 중요한 아미노산들 12 및 13은 뉴클레오타이드들 A, T, C 및 G에 대한 그것들의 특이성을 조절하기 위하여, 그리고 특히 이 특이성을 향상시키기 위하여, 다른 아미노산 잔기들에 대하여 돌연변이될 수 있다. TALE 핵산 결합 도메인은 보통 8 및 30 TALE 반복 서열들 사이를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 상기 코어 스캐폴드는 8 및 20 TALE 반복 서열들 사이를; 다시 더욱 바람직하게는 15 TALE 반복 서열들을 포함한다. 그것은 또한 상기 세트의 TALE 반복 서열들의 C-말단에 위치된 20 아미노산들으로 만들어진 추가적인 단일 길이를 줄인(truncated) TALE 반복 서열을 포함할 수 있다.
다른 조작된 DNA 결합 도메인들은 WO 2014/018601에 기재된 대로 소위 모듈식 염기-당-염기 특이적 핵산 결합 도메인들을 형성하기 위하여 대체의 서열들로서 이용될 수 있다. 상기 MBBBD는, 예를 들어, 새로 확인된 단백질들, 즉, 내생공생생물(endosymbiont) 진균 부르콜데리아(Burkholderia) 리조시니카(Rhizoxinica)의 최근 시퀀싱된 게놈으로부터 EAV36_BURRH, E5AW43_BURRH, E5AW45_BURRH 및 E5AW46_BURRH 단백질들,로부터 조작될 수 있다 (Lackner, Moebius et al. 2011). 이들 핵산 결합 폴리펩타이드들은 염기 특이적인 약 31 내지 33 아미노산들의 모듈들을 포함한다. 이들 모듈들은 잔토모나스(Xanthomonas) TALE 공통(common) 반복들과 40 % 미만(less)의 동일성(identity)을 보이며, 더 많은 폴리펩타이드들 서열 변동성을 제시한다. 부르콜데리아(Burkholderia) 및 잔토모나스(Xanthomonas)로부터의 상기 단백질들로부터의 다른 도메인들 (모듈들, N 및 C-말단들)은 특이적 핵산 서열들에 결합 특성들을 갖는 새로운 단백질들 또는 스캐폴드들을 조작하는데 유용하며, 결합되어 키메라 TALE-MBBBD 단백질들을 형성할 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 특이적 TALE-뉴클레아제들을 이용함으로써 CD38, CS1 및 CD70와 같은 항원 마커들을 코드하는 유전자들의 발현을 불활성화시키기 위하여 조작된 T-세포들을 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 실현을 위하여 특히 적합한 것은, 각각 CD38, CS1 및 CD70 유전자들을 위한, 서열번호: 2-3;5-6;8-9, 서열번호: 64-65;67-68;70-71 및 서열번호: 73-74;76-77;79-80의 하나들과 같은 TALE-뉴클레아제들이다. 이들 특이적 TALE-뉴클레아제들, 그것들의 서열 타겟 및 사용되는 프로토콜은 하기 예들 1-3에서 더욱 철저히 제시된다.
전달 방법들
본 발명자들은 세포들 내 또는 키메라 항원 수용체들을 비롯해, 엔도뉴클레아제들을 발현시키는 폴리뉴클레오타이드들, 그것들의 가능한 공(co)-효과기들(effectors) (예를 들어 Cas9 또는 아르고노트(Argonaute)와 관련된 가이드 RNA 또는 DNA) 상기 세포들의 세포내(subcellular) 구획들(compartments) 전달을 가능하게 하는 임의의 알려진 수단들을 고려하였다. 이들 수단들은 제한되지 않는 예들로서 바이러스 형질도입(transduction), 전기천공법(electroporation) 및 또한 리포좀 전달 수단들, 폴리머 담체들, 화학적 담체들, 리포플렉스들(lipoplexes), 폴리플렉스들(polyplexes), 덴드라이머들(dendrimers), 나노입자들, 에멀젼, 자연적 엔도사이토시스(endocytosis) 또는 식균(phagocytose) 경로를 포함한다.
본 발명의 선호되는 예로서, 본 발명의 엔도뉴클레아제들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들은, 예를 들어 전기천공법에 의하여, 외래 DNA의 염색체 통합(integration)을 피하기 위하여 그리고 일시적 발현을 얻기 위하여 mRNA 형태로 형질주입(transfect)된다. 본 발명자들은 표 1에 보여지는 T-세포 내 mRNA 전기천공법을 위한 다른 최적의 조건들을 결정하였다. 본 발명자는 사이토펄스(cytoPulse) 기술을 이용하였는데, 이는 펄스된(pulsed) 전기장들의 이용에 의하여, 세포들 내로 물질의 전달을 위하여 살아있는 세포들을 일시적으로 투과성으로 만드는 것(permeabilize)을 가능하게 한다. 펄스들 사이의 간격(interval)에 더하여, 펄스 기간(duration), 강도(intensity)는 최소의 치사율(mortality)로 높은 형질주입(transfection) 효율을 위한 최고의 조건들에 도달하기 위하여 변형될 수 있다. 기본적으로, 첫 번째 높은 전기장 펄스들은 포어(pore) 형성을 가능하게 하는 반면, 그 다음의 더 낮은 전기장 펄스들은 세포 내로 폴리뉴클레오타이드를 옮기는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명자는 T 세포들에서 mRNA의 >95% 형질주입(transfection) 효율의 달성을 이끌었던 단계들 및 T 세포들 내 다른 종류의 단백질들을 일시적으로 발현시키기 위하여 전기천공법(electroporation) 프로토콜의 사용을 기재한다. 특히, 본 발명은:
(a) 단계 (a) 및 (b)의 전기적 펄스들 사이의 0.2 내지 10 ms 의 펄스 간격, 0.1 ms의 펄스 너비(width) 및 센티미터 당 2250 부터 3000 V까지의 전압 범위로 하나의 전기적 펄스;
(b) 단계 (c)의 전기적 펄스 및 단계 (b)의 전기적 펄스 사이의 100 ms의 펄스 간격 및 100 ms의 펄스 너비로 2250 부터 3000 V까지의 전압 범위로 하나의 전기적 펄스; 및
(c) 4 전기적 펄스들의 각각들 사이의 2 ms의 펄스 간격 및 0.2 ms의 펄스 너비로 325 V의 전압으로 4 전기적 펄스들
로 구성되는, 상기 T 세포를 RNA에 접촉시키는 단계 및 애자일(agile) 펄스 서열을 T 세포에 적용하는 단계를 포함하는 T 세포의 형질전환 방법에 대한 것이다.
특정 예에서, 상기 T 세포를 RNA와 접촉시키는 단계 및
(a) 단계 (a) 및 (b)의 전기적 펄스들 사이의 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 ms의 펄스 간격, 0.1 ms의 펄스 너비 및 센티미터 당 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 또는 3000V 전압으로 하나의 전기적 펄스;
(b) 단계 (c)의 첫 번째 전기적 펄스 및 단계 (b)의 전기적 펄스 사이의 100 ms의 펄스 간격 및 100 ms의 펄스 너비로 2250, of 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 또는 3000V의 전압 범위로 하나의 전기적 펄스; 및
(c) 4 전기적 펄스들 각각 사이의 2 ms의 펄스 간격 및 0.2 ms의 펄스 너비를 갖고 325 V의 전압을 갖는 4 전기적 펄스들
로 구성되는 애자일(agile) 펄스 서열을 T 세포에 적용하는 단계를 포함하는 T 세포를 형질전환시키는(transforming) 방법.
상기 기재된 값 범위 내 포함되는 임의의 값들은 본 출원에 개시된다. 전기천공 매질(medium)은 업계에 알려진 임의의 적절한 매질(medium)일 수 있다. 바람직하게는 전기천공 매질(medium)은 0.01 to 1.0 밀리지멘스(milliSiemens)에 걸치는 범위의 전도성을 갖는다.
Figure 112016089675477-pct00001
표 1: PBMC 유래된 T-세포에서 전기천공을 위하여 요구되는 최소 전압을 결정하는데 사용되는 다른 사이토펄스 프로그램들.
바이러스 형질도입
본 발명에 따라, 레트로바이러스(retroviral) 벡터들 및 더욱 바람직하게는 렌티바이러스(lentiviral) 벡터들의 사용은 특히 T-세포들 내로 키메라 항원 수용체들을 발현시키는데 적합하다. 바이러스 형질도입(transduction) 방법들은 업계에 잘 알려져 있다 (Walther et al. (2000) Viral Vectors for Gene Transfer. Drugs. 60(2):249-271). 통합하는(integrative) 바이러스 벡터들은 T-세포들 게놈 내 폴리뉴클레오타이드들의 안정적인 통합 및 더 오랜 기간 동안 키메라 항원 수용체들을 발현시키는 것을 가능하게 한다.
비 동종반응성 T세포들
본 발명의 방법이 예를 들어, CAR를 발현시키는 다른 유전적 서열들과 함께 특이적 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 발현시키는 유전적 서열들을 포함하는, 혈액 순환에서 T-세포들을 타겟팅하는 바이러스 벡터들을 이용함으로써, 유전자 치료의 부분으로서 인 비보에서 수행될 수 있는데도 불구하고, 본 발명의 방법은 환자들 또는 기증자들(donors)로부터 수득가능한 배양된 T-세포들 상에 엑스 비보에서 수행되도록 더 일반적으로 의도된다. 엑스(ex-vivo) 비보에서 조작된 T-세포들은 자가조직 치료의 부분으로서 그것들이 유래한 환자 내로 재-주입(implant)되거나 또는 동종이계(allogeneic) 치료의 부분으로서 사용될 수 있다. 후자의 경우에, 세포들을 더 조작하여 그것들을 비-동종반응성(alloreactive)으로 만들어 그것들의 적합한 이식을 확실히 하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 방법은 기증자로부터의 T-세포들을 입수하고 MHC 인식에 관여되는 그것들의 유전자들을 불활성화시키는 단계 및 또는 예를 들어 WO 2013/176915에 기재된 것과 같은, 면역억제제들의 타겟들이 되는 단계의 추가적인 단계들을 포함할 수 있다.
T 세포 수용체들 (TCR)은 항원의 제시에 대응하여 T 세포들의 활성화에 참여하는 세포 표면 수용체들이다. TCR은 보통 조립하여 헤테로다이머를 형성하는 두 개의 체인들, 알파 및 베타로부터 반들어지고, 세포 표면 상에 존재하는 T-세포 수용체 복합체를 형성하기 위하여 CD3-형질도입(transducing) 서브유닛들과 관련된다. TCR의 각각의 알파 및 베타 체인은 면역글로불린(immunoglobulin)-유사 N-말단 가변(variable) (V) 및 불변(constant) (C) 영역, 소수성 막관통(transmembrane) 도메인, 및 짧은 세포질 영역으로 구성된다. 면역글로불린 분자들에 관하여 말하자면, 알파 및 베타 체인들의 가변 영역은 V(D)J 재조합에 의하여 만들어지며, T 세포들의 군집 내 항원 특이성들의 매우 큰 다양성을 만든다. 그러나, 온전한 항원을 인식하는 면역글로불린들과 대조적으로, T 세포들은 MHC 분자와 공동으로 가공된 펩타이드 단편들에 의하여 활성화되고, MHC 제한으로도 알려진, T 세포들에 의한 항원 인식으로 여분의(extra) 차원(dimension)을 도입한다. T 세포 수용체를 통한 기증자 및 수혜자(recipient) 사이의 MHC 차이들의 인식은 T 세포 증식 및 GVHD의 잠재적 발전을 이끈다. TCR의 정상적인 표면 발현이 복합체의 일곱 개의 모든 요소들의 조립 및 조직화된 합성에 의존한다는 것이 보여져왔다 (Ashwell and Klusner 1990). TCR알파(alpha) 또는 TCR베타(beta)의 불활성화는 동종항원(alloantigen) 및 이와 같이 GVHD의 인식을 방지하는 T 세포들의 표면으로부터 TCR의 제거를 야기한다.
이와 같이, 여전히 본 발명에 따라, T-세포들의 이식은 TCR 요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시키는 것에 의하여 개선될 수 있다. TCR은 TCR 알파 유전자 및/또는 TCR 베타 유전자(들)을 불활성화시킴으로써 세포들에서 기능적이지 않게 만들어진다.
Cas9/CRISPR 시스템에 대하여, 본 발명자들은 절단(cleavage) 효율을 유지하는 반면, 살아있는 세포들에서 독성의 큰 감소를 가능하게 하는, TCR을 코드하는 3 엑손들 내 적절한 타겟 서열들을 결정하였다. 선호되는 타겟 서열들은 표 2에 언급된다 (TCR negative 세포들의 더 낮은 비율에 대하여 +, 중간 비율에 대하여 ++, 더 높은 비율에 대하여 +++).
Figure 112016089675477-pct00002
Figure 112016089675477-pct00003
표 2: T-세포들에서 Cas9를 이용한 가이드 RNA에 대한 적절한 타겟 서열들.
MHC 항원들은 또한 이식(transplantation) 반응들에서 중요한 역할을 하는 단백질들이다. 거부는 주입된 조직들의 표면 상에서 조직적합성 항원들과 반응하는 T 세포들에 의하여 매개되고, 이들 항원들의 가장 큰 군은 주요(major) 조직적합성(histocompatibility) 항원들 (MHC)이다. 이들 단백질들은 모든 고등 척추동물들의 표면에서 발현되고, 인간 세포들에서 HLA 항원들 (인간(human) 백혈구(leukocyte) 항원들(antigens))로 불린다. TCR과 같이, MHC 단백질들은 T 세포 자극에 필수적인 역할을 한다. (자주 수지상 세포들) 세포들을 제시하는 항원은 MHC 상 세포 표면 상 외래 단백질들의 분해 산물인 펩타이드들을 보여준다. 공(co)-자극 신호의 존재 하, T 세포는 활성화되고, 또한 동일한 펩타이드/MHC 복합체를 보이는 타겟 세포에 작용할 것이다. 예를 들어, 자극된 T 헬퍼 세포는 그것의 MHC와 함께 항원을 보여주는 대식세포(macrophage)를 타겟으로 할 것이고 또는 세포독성 T 세포 (CTL)은 외래 바이러스 펩타이드들을 보이는 바이러스 감염된 세포에 작용할 것이다.
이런 식으로, 덜 동종반응성인(alloreactive) T-세포들을 제공하기 위하여, 본 발명의 방법은 하나의 HLA 유전자을 불활성화 또는 돌연변이일으키는 단계를 더 포함할 수 있다.
인간들에서 클래스 I HLA 유전자 클러스터는 세 개의 주요 자리들 B, C 및 A과 더불어 몇몇의 주요하지 않은(minor) 자리들을 포함한다. 클래스 II HLA 클러스터는 또한 주요 자리들, DP, DQ 및 DR을 포함하고, 클래스 I 및 클래스 II 유전자 클러스터들은 다형성으로, 군집 내 클래스 I 및 II 유전자들 둘다의 몇몇 다른 대립형질들이 있다. HLA 기능에도 또한 역할을 하는 몇몇 악세서리 단백질들이 또한 있다. Tapl 및 Tap2 서브유닛들은 클래스 I HLA 복합체들 상에 펩타이드 항원들을 로딩하는데 필수적인 TAP 수송체(transporter) 복합체의 부분들이며, LMP2 및 LMP7 프로테오좀(proteosome) 서브유닛들은 HLA 상에 보이기 위하여 펩타이드들 내로 항원들의 단백질가수분해(proteolytic) 분해(degradation)에 역할을 한다. LMP7의 환원(reduction)은 아마도 안정의 부족을 통하여, 세포 표면에서 MHC 클래스 I 의 양을 감소시키는 것으로 보여져 왔다 (Fehling et al. (1999) Science 265:1234-1237). TAP 및 LMP에 추가하여, 그 산물이 TAP 복합체 및 HLA 클래스 I 체인 사이에 다리를 형성하고, 펩타이드 로딩을 향상시키는 타파신(tapasin) 유전자이 있다. 타파신에서의 환원(reduction)은 손상된 면역 반응들, MHC 클래스 I의 감소된 세포 표면 발현 및 손상된 MHC 클래스 I 조립을 갖는 세포들을 야기한다 (Grandea et al. (2000) Immunity 13:213-222 and Garbi et al. (2000) Nat. Immunol. 1:234-238). 상기 유전자들 중 임의의 것은, 예를 들어 WO 2012/012667에 개시된 대로, 본 발명의 부분으로서 불활성화될 수 있다.
약물저항성 T-세포들의 조작 방법:
동종이계(allogeneic) T-세포들의 선택적 이식 및 암 치료를 개선하기 위하여, 약물 내성이 면역억제 제제들 또는 화학요법의 독성 부작용들로부터 그것들을 보호하기 위하여 조작된 T-세포들에 부여될 수 있다. 정말로, 본 발명자들은 대부분의 환자들이 T-세포 면역요법을 받기 전, 치료(care)의 표준으로서, 면역 감소(depleting) 제제들 및 화학요법으로 처치되는 것을 관찰하였다. 또한 그들은 화학요법 또는 면역억제 치료들 하 환자들을 인 비보에서 조작된 T-세포들의 선택적 확장을 수득함으로써 또는 치료 전 엑스 비보로 세포들의 확장을 위한 배양 배지에서 화학요법 약물들을 첨가함으로써, 조작된 T-세포들의 선택을 돕기 위하여 이들 치료들의 이점을 취할 수 있다는 것을 발견하였다.
또한 약물 내성 유전자를 발현시키는 T-세포들이 생존하고 약물 민감성 세포들에 비례하여(relative) 증식할 것이기 때문에, T-세포들의 약물 내성은 또한 인 또는 엑스 비보에서 그것들의 풍부함(enrichment)을 허용한다. 특히, 본 발명은:
(a) T-세포를 제공하는 단계;
(b) 적어도 하나의 약물을 선택하는 단계;
(c) 상기 T-세포에 약물 내성을 부여하도록 T-세포를 변형시키는 단계;
(d) 상기 약물의 존재 하 상기 조작된 T-세포를 확장시키는 단계
를 포함하는 면역요법에 내성인 동종이계(allogeneic)이며 약물 내성 T-세포들을 조작하는 방법에 대한 것이고, 그리고 선택적으로
전술의 단계들은 전술한 바와 같은 방법들의 단계들과 결합할 수 있다.
하이포잔틴(hypoxanthine)-구아닌(guanine) 포스포리보실(phosphoribosyl) 트랜스페라제(transferase) (HPRT) 유전자 (Genbank: M26434.1)와 같은, (약물 민감화(sensitizing) 유전자(들)) 약물에 대한 세포의 민감도의 원인이 되는 하나 또는 그보다 많은 유전자(들)을 불활성화시킴으로써 약물 내성은 T-세포에 부여될 수 있다. 특히 HPRT은 현재 암, 특히 백혈병들, 환자들을 치료하는데 사용되며 HPRT에 의하여 세포독성 티오구아닌(thioguanine) 뉴클레오타이드로 변환되는 6-티오구아닌(thioguanine) (6TG), 세포분열억제(cytostatic) 대사산물(metabolite)에 저항성을 부여하도록 조작된 T-세포들에서 불활성화될 수 있다 (Hacke, Treger et al. 2013). T-세포의 표면에서 정상적으로 발현되는 CD3의 불활성화는 테플리주맙(teplizumab)과 같은 항-CD3 항체들에 저항성을 부여할 수 있다면 또다른 예.
약물 내성은 또한 약물 내성 유전자를 발현시킴으로써 T-세포에 부여될 수 있다. 상기 약물 내성 유전자는 화학치료제 (예를 들어 메토트렉사트(methotrexate))와 같은, 제제에 "내성"을 코드하는 핵산 서열을 가리킨다. 다시 말해서, 세포 내 약물 내성 유전자의 발현은 약물 내성 유전자 없이 해당하는 세포의 증식보다 더 크게 제제의 존재 하 세포들의 증식을 허용한다. 본 발명의 약물 내성 유전자는 항-대사물질, 메토트렉사트(methotrexate), 빈블라스틴(vinblastine), 시스플라틴(cisplatin), 알킬화제들(alkylating agents), 안트라사이클린들( anthracyclines), 세포독성 항생제들(antibiotics), 항-이뮤노필린들(immunophilins), 그것들의 유사체들(analogs) 또는 파생물들(derivatives) 등에 저항성을 코드한다.
디하이드로폴레이트(dihydrofolate) 환원효소(reductase) (DHFR), 이노신(inosine) 모노포스페이트(monophosphate) 디하이드로게나제(dehydrogenase) 2 (IMPDH2), 칼시뉴린(calcineurin) 또는 메틸구아닌(methylguanine) 트랜스페라제(transferase) (MGMT)와 같은 몇몇 유전자들의 대립형질들이 세포에 약물 내성 을 부여하는 것으로 확인되어 왔다. 상기 약물 내성 유전자는 상동 재조합에 의하여 세포의 게놈 내로 상기 약물 내성 유전자를 통합시킴으로써 또는 세포 내로 상기 유전자를 코드하는 이식유전자를 도입함으로써 세포에서 발현될 수 있다. 몇몇 다른 약물 내성 유전자들이 타겟인 세포들에 약물 내성을 부여하는데 잠재적으로 사용될 수 있는 것으로 확인되어 왔다 (Takebe, Zhao et al. 2001; Sugimoto, Tsukahara et al. 2003; Zielske, Reese et al. 2003; Nivens, Felder et al. 2004; Bardenheuer, Lehmberg et al. 2005; Kushman, Kabler et al. 2007).
DHFR는 세포 내 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate)의 양을 조절하는데 관여되는 효소이고 DNA 합성에 필수적이다. 메토트렉사트(methotrexate) (MTX)와 같은 엽산(folate) 유사체들은 DHFR을 억제하고 이런 식으로 임상에서 항-종양(neoplastic) 제제로서 사용된다. 치료에서 사용되는 항-엽산들에 의한 억제에 증가하는 저항성을 갖는 DHFR의 다른 돌연변이 형태들이 기재되어 왔다. 특정 예에서, 본 발명에 따른 약물 내성 유전자는 메토트렉사트와 같은, 항-엽산 치료에 저항성을 부여하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 인간 야생형 DHFR (GenBank: AAH71996.1)의 돌연변이 형태를 코드하는 핵산 서열일 수 있다. 특정 예에서, DHFR의 돌연변이 형태는 G15, L22, F31 또는 F34 위치에서, 바람직하게는 L22 또는 F31 위치에서 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산을 포함한다 ((Schweitzer, Dicker et al. 1990); 국제출원 WO 94/24277; US 특허 US 6,642,043).
여기에서 사용된 대로, "항엽산 제제" 또는 "엽산 유사체들"은 어떤 레벨에서 엽산 대사 경로를 방해하도록 향해지는 분자를 가리킨다. 항엽산 제제들의 예들은, 예를 들어, 메토트렉사트 (MTX); 아미놉테린(aminopterin); 트리메트렉사트(trimetrexate) (뉴트렉신(Neutrexin)™); 에다트렉사트(edatrexate); N10-프로파길(propargyl)-5,8-디데아자폴릭산(dideazafolic acid) (CB3717); ZD1694 (투모덱스(Tumodex)), 5,8-디데아자이소폴릭 산(dideazaisofolic acid) (IAHQ); 5,10-디데아자테트라하이드로폴릭산( dideazatetrahydrofolic acid) (DDATHF); 5-디아자폴릭산(deazafolic acid); PT523 (N 알파-(4-아미노-4-디옥십테로일(deoxypteroyl))-N 델타-헤미프탈로일(hemiphthaloyl)-L-오르니틴(ornithine)); 10-에틸-10-디아자아미놉테린(deazaaminopterin) (DDATHF, 로마트렉솔(lomatrexol)); 피리트렉심(piritrexim); 10-EDAM; ZD1694; GW1843; 피미트렉사트(Pemetrexate) 및 PDX (10-프로파길(propargyl)-10-디아자아미놉테린(deazaaminopterin))을 포함한다.
약물 내성 유전자의 또다른 예는 또한 구아노신(guanosine) 뉴클레오타이드들의 데노보(de novo) 합성에서 속도 제한 효소인, 이오니신(ionisine)-5'-모노포스페이트(monophosphate) 디하이드로게나제(dehydrogenase) II (IMPDH2)의 돌연변이 또는 변형된 형태일 수 있다. IMPDH2의 돌연변이 또는 변형된 형태는 IMPDH 억제제 저항성 유전자이다. IMPDH 억제제들은 마이코페놀산(mycophenolic acid) (MPA) 또는 그것의 프로드러그 마이코페놀레이트(mycophenolate) 모페틸(mofetil) (MMF)일 수 있다. 돌연변이 IMPDH2는 IMPDH 억제제에 상당히 증가된 저항성을 이끄는 야생형 인간 IMPDH2의 MAP 결합 위치에 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 돌연변이들을 포함할 수 있다 (NP_000875.2). 돌연변이들은 바람직하게는 T333 및/또는 S351 위치들에 있다 (Yam, Jensen et al. 2006; Sangiolo, Lesnikova et al. 2007; Jonnalagadda, Brown et al. 2013). 특정 예에서, 333 위치에서 트레오닌(threonine) 잔기는 이소류신 잔기로 대체되고, 351 위치에서 세린(serine) 잔기는 티로신(tyrosine) 잔기로 대체된다.
또다른 약물 내성 유전자는 칼시뉴린(calcineurin)의 돌연변이 형태이다. 칼시뉴린 (PP2B)은 T-세포 활성화에 중심이 되며 많은 생물학적 공정들에 관여되는, 도처에 존재하는 식으로(ubiquitously) 발현된 세린/트레오닌 단백질 포스파타제이다. 칼시뉴린은 촉매적 서브유닛 (CnA; 세 개의 아형들(isoforms)) 및 조절 서브유닛 (CnB; 두 개의 아형들(isoforms))을 포함하는 헤테로다이머(heterodimer)이다. T-세포 수용체의 참여(engagement) 후, 칼시뉴린은 전사 인자 NFAT를 탈인산화하는데(dephosphorylate), 이것은 그것을 IL2와 같은 활성 주요 타겟 유전자 및 핵으로 이동시키는 것을 가능하게 한다. CyPA와 복합체 내 사이클로포린(cyclosporine) A (CsA) 또는 FKBP12와 복합체 내 FK506은 칼시뉴린의 활성 자리로의 NFAT 접근을 막는데, 이는 그것의 탈인산화(dephosphorylation)을 방지하여 이로써 T-세포 활성화를 억제한다 (Brewin, Mancao et al. 2009). 본 발명의 약물 내성 유전자는 FK506 및/또는 CsA와 같은 칼시뉴린 억제제에 저항성인 칼시뉴린의 돌연변이 형태를 코드하는 핵산 서열일 수 있다. 특정 예에서, 상기 돌연변이 형태는 V314, Y341, M347, T351, W352, L354, K360 : 위치들에서 야생형 칼시뉴린 헤테로다이머 a의 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산, 바람직하게는 T351 및 L354 또는 V314 및 Y341 위치들에서 이중 돌연변이들을 포함할 수 있다. 여기에서 기재된 아미노산 위치들의 대응(correspondence)은 야생형 인간 칼시뉴린 헤테로다이머의 형태의 아미노산들의 위치들의 면에서 흔히 발현된다 (GenBank: ACX34092.1).
또다른 특정 예에서, 상기 돌연변이 형태는 V120, N123, L124 또는 K125 : 위치들에서 야생형 칼시뉴린 헤테로다이머 b의 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산, 바람직하게는 L124 및 K125 위치들에서 이중 돌연변이들을 포함할 수 있다. 여기에서 기재된 아미노산 위치들이 대응은 야생형 인간 칼시뉴린 헤테로다이머 b 폴리펩타이드의 형태의 아미노산들의 위치들의 면에서 흔히 발현된다 (GenBank: ACX34095.1).
또다른 약물 내성 유전자는 인간 알킬 구아닌 트랜스페라제 (hAGT)를 코드하는 0(6)-메틸구아닌(methylguanine) 메틸트랜스페라제(methyltransferase) (MGMT)이다. AGT는 나이트로소우레아스(nitrosoureas) 및 테모졸로마이드(temozolomide) (TMZ)와 같은, 알킬화제들의 세포독성 효과들에 저항성을 부여하는 DNA 수선 단백질이다. 6-벤질구아닌(benzylguanine) (6-BG)은 니트로소우레아(nitrosourea) 독성을 강하게 하는 AGT의 억제제이고, 이 제제의 세포독성 효과들을 강력하게 하기 위하여 TMZ와 함께 투여된다. AGT의 변종들(variants)을 코드하는 MGMT의 몇몇 돌연변이 형태들은 6-BG에 의하여 불활성화에 매우 저항성이나, DNA 손상을 수선하는 그것들의 능력을 유지한다 (Maze, Kurpad et al. 1999). 특정 예에서, AGT 돌연변이 형태는 야생형 AGT 위치 P140의 돌연변이된 아미노산을 포함할 수 있다 (UniProtKB: P16455).
또다른 약물 내성 유전자는 다약물(multidrug) 내성(resistance) 단백질 1 (MDR1) 유전자일 수 있다. 이 유전자는, 세포막을 가로질러 대사 부산물들의 수송에 관여하는 P-당단백질(glycoprotein) (P-GP)로 알려진, 막 당단백질을 코드한다. P-Gp 단백질은 몇몇 구조적으로 관련없는 화학요법 제제들을 향해 넓은 특이성을 보인다. 이런 식으로, 약물 내성(resistance)은 MDR-1을 코드하는 핵산 서열의 발현에 의하여 세포들에 부여될 수 있다 (NP_000918).
약물 내성 유전자는 또한 ble 유전자 또는 mcrA 유전자와 같은, 세포독성 항생제일 수 있다. 면역 세포에서 ble 유전자 또는 mcrA의 이소성(ectopic) 발현은 화학치료 제제, 각각 블레오마이신(bleomycine) 또는 미토마이신(mitomycin) C에 노출될 때 선택적인 이점을 준다.
T-세포들은 면역억제제들에 저항성으로 만들어질 수 있다. 면역억제제는 작용의 몇몇 메커니즘들 중 하나에 의하여 면역 기능을 억제하는 제제이다. 다시 말해서, 면역억제제는 면역 반응의 규모 및/또는 집요함(voracity)을 약화시키는 능력에 의하여 보여지는 화합물에 의하여 작용되는 역할이다. 제한되지 않는 예로서, 면역억제제는 칼시뉴린 억제제, 라파마이신(rapamycin)의 타겟, 인터루킨-2 α-체인 차단제, 이노신 모노포스페이트(monophosphate) 디하이드로게나제(dehydrogenase)의 억제제, 디하이드로엽산(dihydrofolic acid) 환원효소의 억제제, 코르티코스테로이드(corticosteroid) 또는 면역억제 항대사물질(antimetabolite)일 수 있다. 고전적인 세포독성 면역억제제들은 DNA 합성을 억제함으로써 작용한다. 다른 것들은 T-세포들의 활성화 또는 헬퍼 세포들의 활성화를 억제함으로써 작용할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 T 세포들에서 면역억제제의 타겟을 불활성화시킴으로써 면역요법을 위하여 T 세포들에 대한 면역억제 내성을 부여하는 것을 가능하게 한다. 제한되지 않는 예들로서, 면역억제제의 타겟들은 CD52, 글루코코르티코이드 수용체 (GR), a FKBP 패밀리 유전자 멤버 및 사이클로필린(cyclophilin) 패밀리 유전자 멤버와 같은: 면역억제제를 위한 수용체일 수 있다.
면역적격(immunocompetent) 숙주들에서, 동종이계(allogeneic) 세포들은 숙주 면역 시스템에 의하여 정상적으로 급히 거부된다. 비-방사능조사된 혈액 산물들 내 존재하는 동종이계(allogeneic) 백혈구들이 5 내지 6 일 이하(no more than) 동안 계속될 것이라는 것이 입증되어 왔다. 이런 식으로, 동종이계(allogeneic) 세포들의 거부를 예방하기 위하여, 숙주의 면역 시스템는 효과적으로 억제되어야 한다. 글루코코르티코이드스레토이드들(glucocorticoidsteroid)은 면역 억제를 위하여 치료적으로 널리 사용된다. 스테로이드 호르몬들의 이 클래스는 T 세포들의 시토졸(cytosol)에 존재하는 글루코코르티코이드 수용체 (GR)에 결합하여, 면역 공정에 관여되는 다수의 유전자들의 발현을 조절하는 특이적 DNA 모티프들의 결합 및 핵으로의 자리이동을 야기한다. 글루코코르티코이드 스테로이드들로의 T 세포들의 치료는 사이토카인 생산의 감소된 수준들을 야기하여 T 세포 활성화에 간섭 및 T 세포 무반응(anergy)을 이끈다. CAMPATH1-H로도 알려진, 알렘투주맙(Alemtuzumab)은 CD52을 타겟팅하는 인간화된 단일클론 항체, 12 아미노산 글리코실포스파티딜(glycosylphosphatidyl)-이노시톨(inositol)-(GPI) 연결된 당단백질이다 (Waldmann and Hale, 2005). CD52는 과립백혈구들(granulocytes) 및 골수 전구체들에 없는 반면, 단핵백혈구들에서 더 낮은 수준들 및 T 및 B 림프구들에서 높은 수준들로 발현된다. CD52에 대항하여 향해지는 인간화된 단일클론 항체, 알렘투주맙(Alemtuzumab)으로 치료는 순환하는 림프구들 및 단핵백혈구들의 급속한 소모를 유도하는 것이 보여져 왔다. 그것은 이식(transplantation)을 위한 컨디셔닝 식이 요법의 부분으로서 특정 경우들 및 T 세포 림프종들의 치료에서 자주 사용된다. 그러나 입양 면역요법의 경우에 면역억제제들의 사용은 도입된 치료적 T 세포들에 또한 해로운 효과를 가질 것이다. 그러므로, 이들 조건들에서 입양 면역요법 접근을 효과적으로 사용하기 위하여, 도입된 세포들은 면역억제 치료에 내성이어야 할 것이다.
상기 단계들의 선호되는 예로서, 면역억제 치료에 특이적인 단계 (b)의 상기 유전자는 CD52이고, 단계 (d)의 면역억제 치료는 CD52 항원을 타겟팅하는 인간화된 항체를 포함한다. 또다른 예로서, 면역억제 치료에 특이적인 단계 (b)의 상기 유전자는 글루코코르티코이드 수용체 (GR)이고, 단계 d)의 면역억제 치료는 덱사메타손( dexamethasone)과 같은 코르티코스테로이드(corticosteroid)를 포함한다. 또다른 예로서, 면역억제 치료에 특이적인, 단계 (b)의 상기 target 유전자는 FKBP 패밀리 유전자 멤버 또는 그것의 변종(variant)이고 단계 (d)의 면역억제 치료는 푸지마이신(fujimycin) 또는 타크로리무스(Tacrolimus)로도 알려진 FK506를 포함한다. 또다른 예로서, 상기 FKBP 패밀리 유전자 멤버는 FKBP12 또는 그것의 변종이다. 또다른 예로서, 면역억제 치료에 특이적인 단계 (b)의 상기 유전자는 사이클로필린 패밀리 유전자 멤버 또는 그 변종이고, 단계 (d)의 면역억제 치료는 사이클로스포린(cyclosporine)을 포함한다.
본 발명의 특정 예에서, 방법의 유전적 변형 단계는 CD52 및 GR, CD52 및 TCR 알파, CDR52 및 TCR 베타, GR 및 TCR 알파, GR 및 TCR 베타, TCR 알파 및 TCR 베타로 구성되는 군으로부터 선택되는 두 유전자들의 불활성화에 의존한다. 또다른 예에서, 방법의 유전적 변형 단계는 둘보다 많은 유전자들의 불활성화에 의존한다. 유전적 변형은 바람직하게는 다른 유전자들을 타겟팅하는 적어도 두 RNA 가이드들을 이용하여 엑스 비보에서 작동된다.
유전자를 불활성화시킴으로써 관심있는 유전자가 기능적 단백질 형태로 발현되지 않는 것이 의도된다.
면역요법을 위하여 매우 활성인 T 세포들의 조작
본 발명에 따라 T-세포들은 염증성 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들, 조절 T-림프구들 또는 헬퍼 T-림프구들로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 CD4+ T-림프구들 및 CD8+ T-림프구들로 구성되는 구능로부터 유래될 수 있다. 그것들은 혈액으로부터 추출되거나 또는 줄기 세포들로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포들은 성체 줄기 세포들, 배아 줄기 세포들, 더욱 특히 비-인간 줄기 세포들, 제대혈 줄기 세포들, 간(progenitor) 세포들, 골수 줄기 세포들, 유도된 만능(pluripotent) 줄기 세포들, 전능성(totipotent) 줄기 세포들 또는 조혈(hematopoietic) 줄기 세포들일 수 있다. 대표적인 인간 세포들은 CD34+ 세포들이다. 본 발명의 세포들의 유전적 변형 및 확장 전에, 세포들의 소스(source)는 여러가지 제한되지 않는 방법들을 통하여 대상으로부터 수득될 수 있다. T-세포들은 말초 혈액 단핵 세포들, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선(thymus) 조직, 감염 자리로부터의 조직, 복수들(ascites), 흉막 삼출(pleural effusion), 비장 조직 및 종양들을 포함하는 제한되지 않는 다수의 소스들로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 예들에서, 당업자에게 알려지고 이용가능한 임의의 수의 T 세포주들이 사용될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 건강한 기증자로부터 암으로 진단된 환자로부터, 또는 감염으로 진단된 환자로부터 유래될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 다른 표현형 특성들을 제시하는 세포들의 혼합된 군집의 부분이다. 전술한 방법에 따라 형질전환된(transformed) T-세포로부터 수득된 세포주가 본 발명의 범위에 또한 포함된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명에 따른 T-세포들은 그것들의 활성 및/또는 활성화를 향상시키기 위하여, 특히 "면역-체크포인트들"로 가리켜지는 종합적인 T-세포 조절에 관여되는 단백질들의 발현을 조절함으로써, 더 조작, 바람직하게는 유전적으로 조작될 수 있다.
면역 체크 포인트들
용어 "면역(immune) 체크포인트들(checkpoints)"이 T 세포들에 의하여 발현되는 일군의 분자들을 의마한다는 것이 당업자에 의하여 이해될 것이다. 이들 분자들은 면역 반응을 억제 또는 하향(down)-조절(modulate)하기 위하여 "브레이크들(brakes)"로 효과적으로 작용한다. 면역 체크포인트 분자들은 면역 세포들을 직접적으로 억제하는, 프로그램드(programmed) 데쓰(Death) 1 (PD-1, PDCD1 또는 CD279로도 알려짐, 등록 번호: NM_005018), 세포독성(Cytotoxic) T-림프구(Lymphocyte) 항원(Antigen) 4 (CTLA-4, CD152로도 알려짐, GenBank 등록(accession) 번호 AF414120.1), LAG3 (CD223로도 알려짐, 등록 번호: NM_002286.5), Tim3 (HAVCR2로도 알려짐, GenBank 등록 번호: JX049979.1), BTLA (CD272로도 알려짐, 등록 번호: NM_181780.3), BY55 (CD160로도 알려짐, GenBank 등록 번호: CR541888.1), TIGIT (lVSTM3로도 알려짐, 등록 번호: NM_173799), LAIR1 (CD305로도 알려짐, GenBank 등록 번호: CR542051.1, {Meyaard, 1997 #122}), SIGLEC10 (GeneBank 등록 번호: AY358337.1), 2B4 (CD244로도 알려짐, 등록 번호: NM_001166664.1), PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, CD96, CRTAM, SIGLEC7 {Nicoll, 1999 #123}, SIGLEC9 {Zhang, 2000 #124;Ikehara, 2004 #125}, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF {Quigley, 2010 #121}, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, CTLA-4는 어떤 CD4 및 CD8 T 세포들 상 발현되는 세포-표면 단백질이다; 항원 제시 세포들 상에 그것의 리간드들 (B7-1 및 B7-2)에 의하여 이용(engage)될 때, T-세포 활성화 및 효과기(effector) 기능이 억제된다. 이런 식으로 본 발명은 면역 체크포인트에 관여되는 적어도 하나의 단백질을, 특히 PD1 및/또는 CTLA-4 또는 표 3에 나타내어진 임의의 면역-체크포인트 단백질들을, 불활성화시킴으로써 T-세포들을 유전적으로 변형시키는 단계를 포함하는, 특히 면역요법을 위하여 T-세포들을 조작하는 방법에 대한 것이다.
Figure 112016089675477-pct00004
Figure 112016089675477-pct00005
표 3: 면역 체크포인트 단백질들을 코드하는 유전자들의 리스트.
병리 세포들에 대항하여 키메라 항원 수용체들을 발현시키는 조작된 T-세포들
본 발명에 따라 T-세포들 내로 도입된 키메라 항원 수용체들은 단일-체인 또는 멀티-체인 CAR들과 같은 다른 디자인을 취할 수 있다. 이들 다른 디자인들은 타겟된 병리 세포들을 향하여 개선된 특이성 및 결합 효율을 위한 여러가지 전략들을 가능하게 한다. 이들 전략들 중 일부는 본 출원의 도면들에 분명히 보여져 있다. 단일-체인 CAR들은 업계에서 가장 고전적인 버젼이다. 멀티-체인 CAR 건축들은 본 출원인에 의하여 개발되어 졌으며, 특이성 및 강도의 면에서 T-세포들의 활성을 조절하는 것을 가능하게 한다. 복수의 서브유닛들은 추가적인 공동자극(co-stimulation) 도메인들을 보호하거나 또는 수용체들의 다른 타입들을 비롯해, 멀리서 이러한 도메인들을 유지(keep)할 수 있는 반면, 고전적인 단일 체인 건축은 가끔 다특이적(multispecific) 상호작용들에 덜 관대하고 훨씬 민감한 것으로 간주될 수 있다.
단일-사슬 CAR
엑스 비보에서 만들어진 자가조직(autologous) 항원-특이적 T 세포들의 이동을 수반하는 입양 면역요법은 바이러스 감염들 및 암을 치료하기 위한 유망한 전략이다. 입양 면역요법에 사용되는 T 세포들은 유전적 조작을 통한 T 세포들의 방향수정 또는 항원-특이적 T 세포들의 확장에 의하여 만들어질 수 있다 (Park, Rosenberg et al. 2011). 바이러스 항원 특이적 T 세포들의 이동은 이식(transplant) 관련 바이러스 감염들 및 희귀 바이러스-관련 악성종양들의 치료에 사용되는 잘 확립된 절차이다. 유사하게 종양 특이적 T 세포들의 분리 및 이동은 흑색종을 치료하는데 성공적인 것으로 보여져 왔다.
T 세포들에서의 신규한 특이성들은 이식유전자를 가진(transgenic) T 세포 수용체들 또는 키메라 항원 수용체들 (CARs)의 유전적 이동을 통하여 성공적으로 만들어져 왔다 (Jena, Dotti et al. 2010). CAR들은 단일 융합 분자에서 하나 또는 그보다 많은 신호전달 도메인들과 관련된 타겟팅 모이어티(moiety)로 구성된 합성 수용체들이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티는 유연성(flexible) 링커에 의하여 연결된 단일클론 항체의 가벼운 그리고 가변성 단편들을 포함하는, 단일-체인 항체 (scFv)의 항원-결합 도메인으로 구성된다. 리간드 도메인들 또는 수용체에 기초한 결합 모이어티들은 또한 성공적으로 사용되어 왔다. 첫 세대 CAR들에 대한 신호전달 도메인들은 CD3제타 또는 the Fc 수용체 감마 체인들의 세포질(cytoplasmic) 영역으로부터 유래된다. 첫 세대 CAR들은 T 세포 세포독성의 방향을 성공적으로 전환하는 것으로 보여져 왔다. 그러나 그것들은 인 비보에서 항-종양 활성 및 장기적 확장을 제공하는 것에는 실패하였다. CD28, OX-40 (CD134), 및 4-1BB (CD137)을 포함하는 공동자극 분자들로부터의 신호전달 도메인들이 CAR 변형된 T 세포들의 증가 증식 및 생존을 향상시키기 위하여 결합하여 (삼 세대) 또는 단독으로(이 세대) 첨가되어 왔다. CAR들은 T 세포들이 림프종들 및 고형 종양들을 포함하는 여러가지 악성종양들로부터 종양 세포들의 표면에서 발현되는 항원들에 대항하여 방향전환하는 것을 성공적으로 가능하게 해왔다 (Jena, Dotti et al. 2010).
CD38와 같은, T-세포들 및 병리 세포들에 공통된, 항원 마커를 타겟팅하는 CAR에 추가하여, T-세포들 특이성을 향상시키기 위하여 T-세포들에 의하여 필연적으로 발현되지 않는 다른 항원 마커들을 향하여 향해진 CAR들을 더 발현시키는 것이 예상된다.
다(multi)-특이적 세포들을 창조하기 위하여 T-세포들에 의하여 더 발현될 수 있는 키메라 항원 수용체의 예들은 TNFRSF17 (UNIPROT Q02223), SLAMF7 (UNIPROT Q9NQ25), GPRC5D (UNIPROT Q9NZD1), FKBP11 (UNIPROT Q9NYL4), KAMP3, ITGA8 (UNIPROT P53708), 및 FCRL5 (UNIPROT Q68SN8)와 같은, 다발성(multiple) 골수종(myeloma) 또는 림프구성(lymphoblastic) 백혈병(leukemia) 항원 마커들에 대항하여 향해진 항원 수용체들이다.
추가의 예들로서, 타겟의 항원은 분화(differentiation) 분자들의 임의의 클러스터 (예를 들어 CD16, CD64, CD78, CD96,CLL1, CD116, CD117, CD71, CD45, CD71, CD123 and CD138), ErbB2 (HER2/neu)와 같은 종양-관련 표면 항원, 암태아성(carcinoembryonic) 항원 (CEA), 상피(epithelial) 세포(cell) 부착(adhesion) 분자 (EpCAM), 표피(epidermal) 성장 인자 수용체 (EGFR), EGFR 변종(variant) III (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, 디시알로강그리오사이드(disialoganglioside) GD2, 관(ductal)-상피(epithelial) 뮤신(mucine), gp36, TAG-72, 글리코핑고리피드들(glycosphingolipids), 신경교종(glioma)-관련 항원, β-인간 융모성(chorionic) 고나도트로핀(gonadotropin), alphafetoprotein (AFP), 렉틴(lectin)-반응성(reactive) AFP, 사이로글로불린(thyroglobulin), RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로메라제(telomerase) 역전사효소(reverse transcriptase), RU1, RU2 (AS), 장(intestinal) 카르복실(carboxyl) 에스테라제(esterase), 뮤트(mut) hsp70-2, M-CSF, 프로스타제(prostase), 프로스타제(prostase) 특이적 항원 (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1a, p53, 프로스타인(prostein), PSMA, 살아남은(surviving) 그리고 텔로메라제(telomerase), 전립선(prostate)-암종(carcinoma) 종양(tumor) 항원(antigen)-1 (PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구(neutrophil) 엘라스타제(elastase), 에프린(ephrin) B2, CD22, 인슐린(insulin) 성장 인자들 (IGF1)-I, IGF-II, IGFI 수용체, 메소텔린(mesothelin), 종양-특이적 펩타이드 에피토프(epitope)를 제시하는 주요(major) 조직적합성 복합체 (MHC) 분자, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, 종양 기질(stromal) 항원들, 파이브로넥틴(fibronectin)의 여분(extra) 도메인 A (EDA) 및 여분(extra) 도메인 B (EDB) 및 섬유아세포(fibroblast) 관련(associated) 단백질 (fap) 및 테나신(tenascin)-C (TnC A1)의 A1 도메인; (HIV gp120과 같은) HIV-특이적 항원과 같은 바이러스-특이적 표면 항원 또는 CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD133, CD138, CTLA-4, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), GM-CSF, 사이토카인 수용체들, endoglin, a major 조직적합성 복합체 (MHC) 분자, BCMA (CD269, TNFRSF 17)와 같은 가계(lineage)-특이적 또는 조직 특이적 항원; EBV-특이적 항원, CMV-특이적 항원, HPV-특이적 항원, 라사(Lasse) 바이러스(Virus)-특이적 항원, 인플루엔자 바이러스-특이적 항원을 비롯해 이들 표면 마커들의 임의의 유도체(derivate) 또는 변종(variant)으로부터일 수 있다. 항원들은 꼭 표면 마커 항원들은 아니지만, 또한 세포들의 표면에서 HLA 클래스 I에 의하여 제시되는 내생의 작은 항원들일 수 있다.
예들로서, 본 발명은 상기 CAR들을 발현시키는 세포들에서 각각 CD38, CS1 및/또는 CD70을 코드하는 유전자들의 불활성화와 함께, 예들에서 기재된 대로 CD38, CS1 및/또는 CD70과 같은 세포 표면 마커을 특이적으로 타겟으로 하는 단일-체인 CAR들을 포함한다.
특이적 예로서, scFv 항-CD38의 VH 및 VL 체인들은 각각 서열번호:10 및 12 및 서열번호: 11 및 13과 적어도 80%, 바람직하게는 90% 그리고 더욱 바람직하게는 95%의 동일성(identity)을 공유한다.
특이적 예로서, 그것의 상기 항체 또는 에피토프-결합 단편이 적어도 하나의 무거운 체인 및 적어도 하나의 가벼운 체인을 포함하고, 이때 상기 무거운(heavy_ 체인이 서열번호들: 14-17로 나타내어지는 아미노산 서열들을 갖는 세 개의 순차적 상보성(complementarity)-상보성-결정 영역들을 포함하고, 그리고 이때 상기 가벼운(light) 체인이 서열번호들: 21-23로 나타내어지는 아미노산 서열들을 갖는 세 개의 순차적 상보성-결정 영역들을 포함하는 것으로 특징되는, CD38 항원 상 항체 또는 에피토프-결합.
또다른 특이적 예로서, 그것의 상기 항체 또는 에피토프-결합 단편이 적어도 하나의 무거운 체인 및 적어도 하나의 가벼운 체인을 포함하고, 이때 상기 무거운 체인은 서열번호들: 18-20로 나타내어지는 아미노산 서열들을 갖는 세 개의 순차적 상보성-결정 영역들을 포함하고, 그리고 이때 상기 가벼운 체인 서열번호들: 24-26로 나타내어지는 아미노산 서열들을 갖는 세 개의 순차적 상보성-결정 영역들을 갖는 것으로 특징되는 CD38 항원 상 항체 또는 에피토프-결합.
또다른 특이적 예로서, scFv 항-CS1의 VH 및 VL 체인들은 각각 서열번호:38-40-42-44-46 및 서열번호: 39-41-42-45-46과 적어도 80%, 바람직하게는 90% 및 더욱 바람직하게는 95%의 동일성(identity)을 공유한다.
더 또다른 특이적 예로서, scFv 항-CD70의 VH 및 VL 체인들은 각각 서열번호:81-82; 85-86; 89-91 및 서열번호: 83-84; 87-88; 91-92와 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 레벨에서 적어도 80%, 바람직하게는 90% 그리고 더욱 바람직하게는 95% of 동일성(identity)을 공유한다.
한 예에서, 본 발명은 서열번호: 35-37와 적어도 80%, 바람직하게는 90% 및 더욱 바람직하게는 95% of 동일성(identity)을 공유하는 단일 CAR 항-CD38를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 또다른 예에서, 본 발명은 서열번호: 48-62와 적어도 80%, 바람직하게는 90% 그리고 더욱 바람직하게는 95% of 동일성(identity)을 공유하는 단일 CAR 항-CS1을 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하였다.
더 또다른 예에서, 본 발명은 서열번호: 93-101과 적어도 80%, 바람직하게는 90% 그리고 더욱 바람직하게는 95% of 동일성(identity)를 공유하는 단일 CAR 항-CD70를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명은 더욱 특히 본 발명에 기재된 것들과 조금 동일성(identity)을 제시하는 CAR를 갖고 있다고 여겨지고 상기 CAR에 의하여 타겟되는 세포 마커를 코드하는 유전자에서 희귀-절단 엔도뉴클레아제 유도된 돌연변이들을 지닐(bear) 것(즉, CAR는 상기 불활성화된 유전자의 산물과 친화성(affinity)을 보인다)인 면역 세포들에 대한 것이다. 동일성(identity)에 의하여 GCG 서열 분석 패키지의 부분으로서 이용가능한 FASTA, 또는 BLAST와 같은 소프트웨어에 의하여 결정되는, 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90% 그리고 더욱 더 바람직하게는 95% 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 동일성(identity)이 의미된다 (University of Wisconsin, Madison, Wis.). BLASTP "동일성들(Identities)"은 동일한(identical) 높은 수치를 매겨진(scoring) 서열 쌍들에서 총 잔기의 수 및 부분(fraction)을 보여준다. 여기에 공개된 아미노산 서열들에 대하여 이들 정도의 동일성(identity) 또는 유사성(similarity) 또는 임의의 중간 정도의 유사성(similarity)의 동일성(identity) 을 갖는 아미노산 서열들이 이 공개에 의하여 포함되고 고려된다. 동일한 것이 BLASTN을 이용하는 폴리뉴클레오타이드 서열들에 대하여 적용된다.
멀티-서브유닛 CAR
T-세포들에 도입된 선행기술로부터의 키메라 항원 수용체들은 신호전달 도메인들의 연속적인 덧붙임(appending)을 필요로 하게 만드는 단일 체인 폴리펩타이드들로 형성되어 왔다. 그러나, 그것들의 자연적인 막근접영역(juxtamembrane) 위치로부터 신호전달 도메인들을 움직임으로써 그것들의 기능을 방해할 수 있다. 이 문제점을 극복하기 위하여, 본 출원인은 최근에 모든 관련 신호전달 도메인들의 정상적인 막근접영역을 가능하게 하기 위하여 FcεRI로부터 유래된 멀티-체인 CAR를 디자인하였다. 이 새로운 건축에서, FcεRI 알파 체인의 높은 친화성(affinity) IgE 결합 도메인은 세포 타겟들에 대항하여 T-세포 특이성를 방향 전환하기 위하여 scFv와 같은 세포 외(extracellular) 리간드-결합 도메인에 의하여 대체되고, FcεRI 베타 체인의 N 및/또는 C-말단들 꼬리들이 정상 막근접영역(juxtamembrane) 위치들에서 공동(co)자극 t니호들을 대체하기 위하여 사용된다.
따라서, 본 발명에 따른 조작된 T-세포에 의하여 발현된 CAR는 본 발명의 조작된 T-세포들의 확장 및 생산에 특히 적당한 멀티-체인 키메라 항원 수용체 (CAR)일 수 있다. 이러한 멀티-체인 CAR들은 적어도 두 개의 하기 성분들을 포함한다:
a) 세포외(extracellular) 리간드-결합 도메인 및 FcεRI 알파 체인의 막관통(transmembrembrane) 도메인을 포함하는 하나의 폴리펩타이드,
b) FcεRI 베타 체인의 막관통 도메인 및 N- 및 C- 말단 세포질 꼬리의 부분을 포함하는 하나의 폴리펩타이드 및/또는
c) 다른 폴리펩타이드들을 자연발생적으로(spontaneously) 함께 다합체화하여 다이머, 트리머 또는 테트라머 CAR를 형성하는, FcεRI 감마 체인의 막관통 도메인 및 세포질내(intracytoplasmic) 꼬리의 부분 각각을 포함하는 적어도 두 개의 폴리펩타이드들.
이러한 건축들에 따라, 리간드들 결합 도메인들 및 신호전달 도메인들이 분리된 폴리펩타이드들에 관련이 있다. 다른 폴리펩타이드들은 밀접하게 가깝게 막 내로 고정되어 서로 상호작용을 가능하게 한다. 이러한 건축에서 신호전달 및 공동(co)-자극 도메인들은 (즉, 그것의 안쪽 면 상의 세포막에 인접한) 막근접영역(juxtamembrane) 위치들에 있을 수 있으며, 이는 공동(co)-자극 도메인들의 기능적 기능을 가능하게 하는 것으로 여겨진다. 멀티-서브유닛 건축은 또한 T-세포 활성화에 더 많은 통제와 함께 CAR들을 디자인하는데 더 많은 유연성 및 가능성들을 제공한다. 예를 들어, 다(multi)-특이적 CAR 건축을 얻기 위하여 다른 특이성을 갖는 몇몇의 세포외 항원 인식 도메인을 유도하는 것이 가능하다. 멀티-체인 CAR 내로 다른 서브유닛들 사이에 상대적인 비율을 통제하는 것이 또한 가능하다. 건축의 이 타입은 PCT/US2013/058005 (WO2014/039523)에서 출원인에 의하여 최근에 기재되었다.
예를 들어, 공동(co)-자극 도메인들 및 신호전달들이 그것에 융합되는 IgE (FcεRI)에 대한 높은 친화성 수용체의 다른 알파, 베타 및 감마 체인들을 이용하여(Metzger, Alcaraz et al. 1986), 단일 멀티-체인 CAR의 부분으로서 다른 체인들의 조립이 가능하게 만들어진다. 감마 체인은 하나의 면역수용체(immunoreceptor) 티로신-기반의 활성화 모티프 (ITAM) (Cambier 1995)을 포함하는 막관통 영역 및 세포질 꼬리를 포함한다.
멀티-체인 CAR는 타겟 내 다른 요소들에 동시에 결합하기 위하여 몇몇의 세포외 리간드-결합 도메인을 포함할 수 있으며, 이로써 기능 및 면역 세포 활성화를 증가시킨다. 한 예에서, 세포외 리간드-결합 도메인들은 동일한 막관통 폴리펩타이드 상에 나란히(in tandem) 위치될 수 있으며, 선택적으로 링커에 의하여 분리될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 다른 세포외 리간드-결합 도메인들은 멀티-체인 CAR을 구성하는(composing) 다른 막관통 폴리펩타이드들 상에 위치될 수 있다. 또다른 예에서, 본 발명은 각각 하나의 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는 멀티-체인 CAR들의 집단(population)에 대한 것이다. 특히, 본 발명은 면역 세포를 제공하는 단계 및 상기 세포의 표면에서 각각 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는 멀티-체인 CAR의 집단을 발현시키는 단계를 포함하는 면역 세포들의 좆가 방법에 대한 것이다. 또다른 특정 예에서, 본 발명은 면역 세포를 제공하는 단계 및 각각 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는 멀티-체인 CAR의 집단을 구성하는(composing) 폴리펩타이드들을 코드하는 상기 세포 폴리뉴클레오타이드들 내로 도입하는 단계를 포함하는 면역 세포를 조작하는 방법에 대한 것이다. 특정 예에서, 면역 세포의 조작 방법은 세포 표면에서 적어도 다른 세포외 리간드 결합 도메인들에 융합된 FcεRI 알파 체인들의 몇몇 부분 및 신호(signal)-전달(transducing) 도메인에 융합된 FcεRI 베타 및/또는 감마 체인의 부분을 발현시키는 단계를 포함한다. 더 많은 특정 예에서, 상기 방법은 다른 세포외 리간드 biniding 도메인들에 융합된 몇몇 FcεRI 알파 체인들 및 신호-전달(transducing) 도메인에 융합된 FcεRI 베타 및/또는 감마 체인의 부분을 코드하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 멀티-체인 CAR들의 집단에 의하여, 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 각각 포함하는 적어도 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 이보다 많은 멀티-체인 CAR들이 의미된다. 본 발명에 따른 다른 세포외 리간드 결합 도메인들은 바람직하게는 동시에 타겟에서 다른 요소들에 결합할 수 있으며, 이로써 기능 및 면역 세포 활성화를 증가시킨다.
본 발명은 또한 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 각각 포함하는 멀티-체인 CAR들의 집단(population)을 포함하는 분리된 면역 세포에 대한 것이다.
본 발명의 멀티-체인 CAR의 신호 전달(transducing) 도메인 또는 세포내(intracellular) 신호전달 도메인은 면역 반응 및 면역 세포의 활성화를 야기하는 타겟에의 세포외 리간드 결합 도메인의 결합 후 세포내(intracellular) 신호전달의 원인이 된다. 다시 말해서, 신호 전달(transducing) 도메인은 그 안에서 멀티-체인 CAR가 발현되는 면역 세포의 정상적인 효과기(effector) 작용들 중 적어도 하나의 활성화의 원인이 된다. 예를 들어, T 세포의 효과기(effector) 기능은 사이토카인들의 분비를 포함하는 헬퍼 활성 또는 세포융해(cytolytic) 활성일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "신호(signal) 전달(transducing) 도메인"은 효과기(effector) 신호 기능 신호를 전달하고 전문화된 기능을 수행하기 위하여 세포로 향하는 단백질의 부분을 가리킨다.
단일 또는 멀티-체인 CAR에서의 사용을 위한 신호 전달(transducing) 도메인의 선호되는 예들은 이들 서열들의 임의의 유도체 또는 변종(variant) 및 동일한 기능적 능력으로서 임의의 합성 서열을 비롯해, 항원 수용체 이용(engagement) 후 신호전달(signal transduction)을 시작하는 것과 협력하여(in concert) 작용하는 공동(co)-수용체들 및 T 세포 수용체 또는 Fc 수용체의 세포질 서열들일 수 있다. 신호 전달(transduction) 도메인은 세포질 신호전달 서열의 두 개의 구별되는 클래스들을 포함하며, 그것들은 항원-의존성 일차(primary) 활성화를 시작하고, 그리고 이차(secondary) 또는 공동(co)-자극 신호를 제공하는 식으로 항원-독립적 방식으로 작용한다. 일차 세포질 신호전달 서열은 ITAM들의 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프들로 알려진 신호전달 모티프들을 포함할 수 있다. ITAM들은 syk/zap70 클래스 티로신 키나제들을 위한 결합 부위들로서 작용하는 여러가지 수용체들의 세포질내(intracytoplasmic) 꼬리에서 발견되는 잘 정의된 신호전달 모티프들이다. 본 발명에서 사용된 ITAM의 예들은 제한되지 않는 예들로서 TCR제타(zeta), FcR감마(gamma), FcR베타(beta), FcR엡실론(epsilon), CD3감마(gamma), CD3델타(delta), CD3엡실론(epsilon), CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함할 수 있다. 선호되는 예에서, 멀티-체인 CAR의 신호전달(signaling) 전달(transducing) 도메인은 FcεRI 베타 또는 감마 체인들의 세포질내(intracytoplasmic) 도메인 또는 CD3제타 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
특정 예에서, 본 발명의 멀티-체인 CAR의 신호전달(signal transduction) 도메인은 공동(co)-자극 신호 분자를 포함한다. 공동(co)-자극 분자는 효율적ㅇ니 면역 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 그것들의 리간드들 외 세포 표면 분자이다.
리간드 결합-도메인들은 일전에 사용된 임의의 항원 수용체일 수 있고, 문헌 내 언급된 단일- 체인 CAR와 관련하여, 특히 단일클론 항체들로부터의 scFv을 가리킬 수 있다. WO 2014/4011988에 기재된 대로 이중특이적(bispecific) 또는 다중(multi)-특이적 CAR들이 참조로서 포함된다.
단일-체인 CAR들과 관련하여 전에 기재된 대로 유사하게, 본 발명은 CD38, CS1 또는 CD70과 같은 세포 표면 마커를 특히 타겟으로 하는 멀티-체인 CAR들을 갖는 것으로 여겨지는 면역 세포들을 포함한다. 본 발명의 선호되는 예에 따라, 상기 기재된 CAR들이 면역 세포들에서 발현되는 반면, 상기 표면 마커(들)을 코드하는 내생 유전자들의 불활성화는 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 발현에 의하여 유도된다.
T 세포들의 확장 및 활성화
본 발명에 따른 방법은 T-세포들을 활성화 및/또는 확장시키는 추가의 단계를 보통 포함한다. 이것은 예를 들어, U.S. 특허들 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 U.S. 특허출원 공개번호 20060121005에 기재된 대로 방법들을 이용하여 T 세포들의 유전적 변형 전 또는 후에 될 수 있다. 이들 방법들에 따라, 본 발명의 T 세포들은 T 세포들의 표면 상 공동(co)-자극 분자을 자극하는 리간드 및 신호 관련된 CD3 TCR 복합체를 자극하는 제제가 거기에 부착된 것을 갖는 표면과의 접촉에 의하여 확장(expand)될 수 있다.
특히, T 세포 집단들은 항-CD3 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의하여, 또는 칼슘 이노포어와 함께 단백질 키나아제 C 활성제(activator)(예컨대, 브리오스타틴(bryostatin))와의 접촉에 의하여와 같이 인 비트로에서 자극될 수 있다. T 세포들의 표면 상 부수적인(accessory) 분자의 공동자극을 위하여, 부수적인(accessory) 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포들의 집단(population)은 T 세포들의 증식을 자극하는데 적합한 조건들 하, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포들 또는 CD8+ T 세포들의 증식을 자극하기 위하여, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 제제들이 용액 내에 또는 표면에 커플링될 수 있다. 당업자가 쉽게 인식할 수 있기 때문에, 입자들의 세포들에 대한 비율은 타겟 세포에 상대적인 입자 크기에 의존할 수 있다. 본 발명의 추가의 예들에서, T 세포들과 같은 세포들이 제제-코팅된 비드들과 결합될 수 있고, 비드들 및 세포들이 그 뒤에 분리될 수 있고, 그 다음에 세포들이 배양된다. 대체의 예에서, 배양 전, 제제-코팅된 비드들 및 세포들이 분리되지 않으나, 함께 배양된다. 세포 표면 단백질들이 항-CD3 및 항-CD28이 부착(attach)되는 상자성(paramagnetic) 비드들(3x28 비드들)이 T 세포들에 접촉하는 것을 가능하게 함으로써 라이게이션(ligate)될 수 있다. 한 예에서, 세포들 (예를 들어, 4 내지 10 T 세포들) 및 비드들 (예를 들어, 1:1의 비율에서 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드들)이 버퍼, 바람직하게는 PBS (칼슘 및 마그네슘과 같은 이가 양이온들 없이)에서 결합된다. 다시, 당업자들은 임의의 세포 농도가 사용될 수 있다는 것을 쉽게 인식할 수 있다. 혼합물은 몇 시간 동안(약 3 시간) 내지 약 14일 또는 그 사이의 임의의 매시간의 정수 값으로 배양될 수 있다. 또다른 예에서, 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건들은 혈청 (예컨대, 소(fetal) 태아(bovine) 또는 인간 혈청), 인터루킨(interleukin)-2 (IL-2), 인슐린, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGFp, 및 TNF- 또는 당업자에게 알려진 세포들 성장을 위한 임의의 다른 첨가제들을 포함하는, 증식 및 생존능에 필요한 인자들을 포함할 수 있는 적합한 배지들 (예컨대, 최소(Minimal) 필수(Essential) 배지들(Media) 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo 5, (Lonza))을 포함한다. 세포들의 성장을 위한 다른 첨가제들은, 계면활성제, 플라스마네이트(plasmanate) 및 2-머캅토에탄올(mercaptoethanoi) 및 N-아세틸-싯흐테인과 같은 환원제들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배지들은 RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, 및 X-Vivo 20, Optimizer, 첨가된 아미노산들과 함께, 소듐(sodium) 피루베이트(pyruvate), 및 비타민들, 무-혈청 또는 적합한 양의 혈청 (또는 혈장)으로 보충된, 또는 호르몬들의 정해진 세트, 및/또는 T 세포들의 확장 및 성장에 충분한 양의 사이토카인(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신과 같은 항생제들이 대상에 주입되는(infused) 세포들의 배양물들이 아닌, 실험적 배양물 내에만 포함된다. 타겟 세포들은 예를 들어, 적합한 온도 (예컨대, 37 ℃) 및 대기(예컨대, 5% C02 플러스 공기)인, 성장을 지지하는데 필요한 조건들 하 유지된다. 다양한 자극 시간들에 노출되어 온 T-세포들은 다른 특성들을 보일 수 있다.
또다른 특정 예에서, 상기 세포들은 조직 또는 세포들과 공(co)-배양시킴으로써 확장될 수 있다. 상기 세포들은 예를 들어 대상 내로 상기 세포를 투여한 후 대상의 혈액 내인, 인 비보에서 확장될 수 있다.
치료적 적용들
상기 기재된 다른 방법들에 의하여 수득가능한 T-세포들은 그것을 필요로 하는 환자에서 다른 것들, 암, 감염들 또는 면역 질환들 중에서, 치료를 위한 의약으로서 사용되도록 의도된다.
상기 치료는 개선, 치유 또는 예방일 수 있다. 그것은 동종이계(allogenic) 면역요법 치료의 부분 또는 자가조직 면역요법의 부분일 수 있다. 자가조직(autologous)에 의하여, 환자들을 치료하기 위하여 사용되는 세포들, 세포주 또는 세포들의 집단(population)이 상기 환자 또는 인간(Human) 백혈구(Leucocyte) 항원(Antigen) (HLA) 양립성(compatible) 기증자로부터 유래한다는 것이 의미된다. 동종이계(allogeneic)에 의하여 환자들을 치료하기 위하여 사용되는 세포들 또는 세포들의 집단이 상기 환자로부터 유래되지 않고 기증자로부터라는 것이 의미된다.
앞의 방법들 중 하나에 따라 조작된 T-세포들은 모아지고(pooled), 동결되고(frozen) 그리고 하나 또는 몇몇의 환자들에게 투여될 수 있다. 그것들이 비-동종반응성(alloreactive)일 때, 그것들은 "기성품(off the shelf)" 치료적 제품으로서 이용가능한데, 이는 그것들이 그것을 필요로 하는 환자들에게 일반적으로 주입될 수 있다는 것을 의미한다.
상기 치료들은 주로 암, 바이러스 감염, 자가면역 질병들(disorders) 또는 이식편대숙주 질환(Graft versus Host Disease) (GvHD)로 진단받은 환자들에 의도된다. 암들은 바람직하게는 백혈병들 및 림프종들로, 이것들은 액상(liquid) 종양(tumor)들을 갖지만, 또한 고형 종양들에도 관련될 수 있다. 본 발명의 CAR들로 치료되는 암들의 타입들은 암종(carcinoma), 모세포종(blastoma), 및 육종(sarcoma), 및 특정 백혈병(leukemia) 또는 림프(lymphoid) 악성종양들, 양성(benign) 및 악성(malignant) 종양들, 및 악성종양들(malignancies) 예를 들어, 육종들(sarcomas), 암종(carcinomas), 및 흑색종들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 성인 종양들/암들 및 소아 종양들/암들이 또한 포함된다.
본 발명은 다른 타입들의 암을 치료하기 위하여 본 발명의 조작된-세포들로 타겟될 수 있는 항원 마커들의 예들과 표들 4 내지 14에 제공된다.
본 발명의 면역요법에 사용되는 선호되는 항원 마커들은 더욱 특히 CD38, CD319 (CS1) 및 CD70이다.
본 발명의 T-세포들은, 환자 자신의 면역 세포들, 특히 T-세포들에 향하여 향해지는 특이적 CAR들을 갖출 때, 류머티즘성(rheumatoid) 다발성 관절염(polyarthritis), 전신(systemic) 홍반성 루프스(lupus erythematosus), 쇼그렌(Sjogren's) 증후군(syndrome), 피부경화증(scleroderma), 섬유근육통(fibromyalgia), 근염(myositis), 강추성(ankylosing) 척추염(spondylitis), 타입 I의 인슐린 의존성 당뇨병, 하이모토(Hashimoto's) 갑상선염(thyroiditis), 애디슨(Addison's) 병(disease), 크론(Crohn's) 병(disease), 복강(Celiac's) 병(disease), 근위축측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis) (ALS) 및 다발성(multiple) 경화증(sclerosis) (MS)와 같은 자가면역 질환을 치료하기 위한 가장 중요한 단계인, 상기 세포들의 조절 또는 억제를 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 환자 자신의 T-세포들에 대항하여 앞서 기재된 대로 조작된 T-세포들을 향하게 함으로써 면역 질환을 치료하는 방법을 포함한다.
상기 치료들은 항체들 치료, 화학요법, 사이토카인들 치료, 수지상(dendritic) 세포 치료, 유전자 치료, 호르몬 치료, 레이저(laser) 광(light) 치료 및 방사선(radiation) 치료의 군으로부터 선택되는 하나 또는 그보다 많은 치료들과 결합하여 일어날 수 있다.
앞서 기재된 대로 조작된 T-세포들은, 그것들이 치료의 표준들로서 사용되는 화학요법 약물들 및 면역억제제들, 특히 메토트렉사트 및 플루다라빈(fludarabine) 및 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide)의 결합,에 저항성으로 만들어질 때, 암의 다양한 형태들을 치료하는데 특히 적합하다. 정말로, 본 발명은 바람직하게는 세포들 또는 세포들의 집단에 의존한다. 이 측면에서, 화학요법 및/또는 면역억제 치료는 인 비보에서 조작된 T-세포들의 확장 및 선택을 도와야 한다.
본 발명의 특정 예들에서, 세포들은 항바이러스 치료, 시도포비어(cidofovir) 및 인터루킨-2, MS 환자들을 위한 시타라빈(Cytarabine) (또한 ARA-C로도 알려짐) 또는 나탈리지맙(nataliziimab) 치료 또는 건선(psoriasis) 환자들을 위한 에팔리지맙(efaliztimab) 치료 또는 PML 환자들을 위한 다른 치료들과 같은 제제들로의 치료를 포함하나 이에 제한되지 않는, 많은 적절한 치료 양상들과 함께 (예컨대, 전, 동시에 또는 그 후) 환자에게 투여된다. 추가의 예에서, 본 발명의 T 세포들은 사이클로스포린(cyclosporin), 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉사트, 마이코페놀레이트(mycophenolate), 및 FK506과 같은 면역억제제들, 방사선, 화학요법, 또는 CAMPATH, 항-CD3 항체들 또는 other 항체 치료들과 같은 다른 면역제거(immunoablative) 제제들, 사이톡신(cytoxin), 플루다리빈(fludaribine), 사이클로스포린(cyclosporin), FK506, 라파마이신(rapamycin), 마이코플리에놀릭산(mycoplienolic acid), 스테로이드들, FR901228, 사이토카인들, 및 방사선조사(irradiation)와 결합하여 사용될 수 있다. 이들 약물들은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린 (사이클로스포린(cyclosporine) 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장 인자 유도된 신호전달 (라파마이신(rapamycin))에 중요한 p70S6 키나아제를 억제한다 (Liu et al., Cell 66:807-815, 1 1; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93). 추가의 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 OKT3 또는 CAMPATH과 같은 항체들 또는 플루다라빈(fludarabine), 외부(external)-빔(beam) 방사선(radiation) 치료(therapy) (XRT), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)와 같은 화학요법 제제들을 이용하여 T 세포 제거(ablative) 치료 골수 이식(transplantation)과 함께 (예컨대, 그 전, 동시에 또는 그 후) 환자에게 투여된다. 또다른 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 CD20과 반응하는 제제들, 예를 들어, 리툭산(Rituxan)과 같은 B-세포 제거(ablative) 치료 후 투여된다. 예를 들어, 한 예에서, 대상들은 고용량 화학요법에 뒤이은 말초 혈액 줄기 세포 이식(transplantation)으로 표준 치료를 겪을 수 있다. 특정 예들에서, 이식(transplant) 후, 대상들은 본 발명의 확장된 면역 세포들의 주입(infusion)을 받는다. 추가적 예에서, 확장된 세포들은 수술 전 또는 후에 투여된다. 여기에 기재된 방법들 중 임의의 하나에 의하여 수득된 상기 변형된 세포들은 숙주대이식편(Host versus Graft) (HvG) 거부(rejection) 및 이식편대숙주 질환 (GvHD)에 대항하여 그것을 필요로 하는 환자들을 치료하기 위하여 본 발명의 특정 측면에서 사용될 수 있다; 그러므로 본 발명의 범위 내에 불활성화된 TCR 알파 및/또는 TCR 베타 유전자들를 포함하는, 효과적인 양의 변형된 세포들을 상기 환자에게 투여함으로써 상기 환자를 치료하는 단계를 포함하는 숙주대이식편(Host versus Graft) (HvG) 거부 및 이식편대숙주 질환 (GvHD)에 대항하여 그것을 필요로 하는 환자들을 치료하는 방법이다.
한 예에 따라, 본 발명의 상기 T 세포들은 환자에의 투여하자마자(upon) 탄탄한(robust) 인 비보 T 세포 확장(expansion)을 겪을 수 있고, 연장된 시간 동안, 바람직하게는 한 주 동안, 더욱 바람직하게는 2 주 동안, 더욱 더 바람직하게는 적어도 한 달 동안 체액들에서 지속될 수 있다. 본 발명에 따른 T-세포들이 이들 기간들 동안 지속될 것으로 예상되는데도 불구하고, 환자들의 신체 내로 그것들의 수명은 1 년, 바람직하게는 6 달, 더욱 바람직하게는 2 달, 그리고 더욱 더 바람직하게는 1달을 초과하지 않도록 의도된다.
본 발명에 따른 세포들 또는 population of 세포들의 집단의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 투입(transfusion), 피하 주입(implantation) 또는 이식(transplantation)을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 여기에 기재된 조성물들은 피하로, 피내로(intradermaliy), 종양내로(intratumorally), 노드내로(intranodally), 골수내로(intramedullary), 근육내로(intramuscularly), 정맥내(intravenous) 또는 림프내(intralymphatic) 주사, 또는 복강내로(intraperitoneally) 환자에게 투여될 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 바람직하게는 정맥내 주사에 의하여 투여된다.
세포들 또는 세포들의 집단의 투여는 kg 체중 당 104-109 세포들, 바람직하게는 그 범위 내 모든 정수값들의 세포 수들을 포함하는 바람직하게는 105 내지 106 세포들/kg 체중의 투여로 구성될 수 있다. 세포들 또는 세포들의 집단은 하나 또는 그보다 많은 투여량들(doses)로 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 효과적인 양의 세포들은 단일 투여량으로서 투여된다. 또다른 예에서, 상기 효과적인 양의 세포들은 기간 시간 동안 한 투여량(dose)보다 많이 투여된다. 투여 타이밍은 담당 의사의 판단 내이며, 환자의 임상적 조건에 의존한다. 세포들 또는 세포들의 집단은 혈액은행 또는 기증자와 같은 임의의 소스로부터 수득될 수 있다. 개개의 필요성들이 다른 반면, 당업계에서 특정 질병 또는 조건들을 위한 정해진 세포 타입의 효과적인 양의 최적 범위의 결정. 효과적인 양은 치료적 또는 예방적 이득을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 정량(dosage)은 수혜자의 연령, 건강 및 무게, 동시에 하는 치료의 종류, 만약 있다면, 치료의 빈도 및 원하는 효과의 유형(nature)에 의존할 것이다.
또다른 예에서, 그 세포들을 포함하는 상기 효과적인 양의 세포들 또는 조성물이 비경구로 투여된다. 상기 투여는 정맥내 투여일 수 있다. 상기 투여는 종양 내로 주사에 의하여 직접 될 수 있다.
암의 다른 타입들에 포함되는 고형 종양들에서 과발현되는 반면 T-세포들의 표면에서 발현되는 표면 항원 마커의 확인 (표들 5 내지 13)
우리는 세포내(subcellular) 위치화(localization)를 함유하는 BioGPS (Human Primary Tumors (U95)) 유니프로트(uniprot) 데이터로부터 또한 다운로드될 수 있는 정상 조직들 (Human U133A/GNF1H Gene Atlas) 암 마이크로어레이 데이터의 패널(panel)로부터의 BioGPS 마이크로어레이 데이터를 사용하였다.
우리는 정상 조직들로부터 오는 값들의 분포를 그렸고 그리고 상대적인 발현을 위한 5의 역치 값을 결정하였다.
우리는 마이크로어레이들로 분석된 유전자들 모두 훑어보았으며(browsed) 막에서 그것들의 위치화(localization)를 체크하였다 (막단백질로 언급되지 않은 단백질은 버렸다). CD8+ T-세포들의 발현은 BioGPS 데이터베이스로부터 체크되었다. 유전자들은 해당하는 발현이 가장 높았던, 암의 타입에 따라 목록화되었다 (표들 5 내지 13).
다른 액상 혈액 종양들에서 과발현된 반면 T-세포들의 표면 상에서 발현된 표면 항원 마커의 확인(표 14)
그 연구를 위하여, RNA-서열(seq) 데이터가 이용가능하지 않았고, 이런 식으로 우리는 11 개의 연구실들이 수반된 MILE 컨소시엄 (Microarray Innovations in Leukemia)으로부터 큰 연구로부터 수득된 마이크로어레이 데이터를 이용하였다 (http://www.ngrl.org.uk/wessex/downloads/tm08/TM08-S4-1_KenMills.pdf - Haferlach et al. 2010, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20406941). 이 원(raw) 데이터는 ALL (급성(acute) 림프구성 백혈병(leukemia)), AML (급성(acute) 골수성(myelogenous) 백혈병(leukemia)), CLL (만성(chronic) 림프구성 백혈병(leukemia)) 및 CML (만성(chronic) 골수성(myelogenous) 백혈병(leukemia)) 및 MDS (골수형성이상(myelodysplastic) 증후군(syndrome))에 대한 결과들을 포함한다. 우리는 또한 늘 그렇듯이 세포내(subcellular) 위치화를 위한 유니프로트(uniprot) 데이터를 이용하였다.
우리는 먼저 모든 연구된 조직들 상 모든 유전자들로부터 값들의 전체적인 분포를 먼저 그렸다. 그리고 나서, 발현에 필요한 레벨의 아이디어를 갖기 위하여, 우리는 그것을 위하여 치료적 항체들이 이용가능하고 일부 액상 종양들에서 발현되는 유전자들의 리스트를 취하였다 (CD52, CD 20, CD33, CD19, CD25, CD44, CD47, CD96, CD116, CD117, CD135, TIM-3). 각각의 유전자를 위하여, 우리는 그것이 발현되는 종양에서 수득되는 값을 보았다. 그리고나서, 우리는 그것을 위하여 유전자가 세포막 단백질을 주는 것으로 보이는 각 유전자 쌍 및 종양의 평균을 계산하였다 (단백질에서 적어도 하나의 막관통 도메인의 기재 + 세포막 위치화(localization). 우리는 모든 조직들에서 발현이 이 역치인 0.15 미만(below)이었던 유전자들을 버렸다. 우리는 T-세포들에서의 상대적인 발현이 0.2 초과(above)였던 그 유전자들을 목록화하고 표 14에 순위를 매겼다. 그런 식으로, 표 4는 특히 ALL, AML, CLL, CML 및 MDS를 치료하기 위하여, 발명 당 액상 종양 세포들을 타겟팅하기 위하여, 추정되는 항원 마커 후보들을 제공한다.
면역치료를 위한 본 발명에 따른 T-세포들을 조작하기 위한 단계들의 예
본 발명의 더 나은 이해를 위하여, 단계들의 예들 하 백혈병(leukemia) CD38 양성 세포들에 대항하여 향해진 T-세포들을 생산하는 것이 제공된다:
1. 세포 배양물로부터 또는 혈액은행으로부터 또는 하나의 개별 환자로부터의 혈액 샘플로부터 T-세포들을 제공하고, 그리고 항-CD3/C28 활성제(activator) 비드들 (Dynabeads®)을 이용하여 상기 T 세포들을 활성화시키는 단계. 비드들은 T 세포들의 활성화 및 확장에 요구되는 일차 및 공동(co)-자극 신호들 둘다를 제공한다.
2. CD3제타 활성화 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인, 막관통 도메인 및 항-CD38 항체의 가변(variable) 체인을 코드하는 서열에 융합된 CD28로부터의 힌지(hinge)의 융합으로 구성되는 키메라(Chimeric) 항원 수용체를 코드하는 이식유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터로 상기 세포들을 형질도입(transducing)하는 단계. 형질전환된(transformed) T-세포의 안전(security) 개선을 위하여, 리툭시맵(rituximab)에 민감한 자살 유전자가 T2A 분열(splitting) 서열들에 의하여 분리되는 렌티바이러스 벡터 내로 WO 2013/153391에 기재된 대로 더 도입될 수 있다.
3. (선택적으로) 비 동종반응성(alloreactive) 및/또는 내성(resistant) T 세포들을 조작하는 단계:
a) 타생(allogenic)의 TCR에 의하여 외래의 것(foreign)으로 숙주 조직의 인식을 방지하고 세포 표면으로부터 TCR을 제거하여 그런 식으로 WO 2013/176915에 제시된 프로토콜을 따름으로써 GvHD를 피하기 위하여 상기 세포들에서 TCR 알파를 불활성화시키는 것이 가능하다.
b) 이식된(transplanted) T 세포들에 영향을 미치지 않고 이식편(graft) 거부를 방지하기 위하여 상기 세포들을 면역억제 또는 화학요법 치료에 내성으로 만들기 위하여 면역억제제 또는 화학요법 약물을 위한 타겟을 코드하는 하나의 유전자를 불활성화시키는 것이 또한 가능하다. 이 예에서, 면역억제제들의 타겟은 CD52이고 WO 2013/176915에 기재된 대로 면역억제제는 인간화된 단일클론 항-CD52 항체 (예: 알렘투주맙(Alemtuzumab))이다.
4. 특이적 TAL-엔도뉴클레아제(endonuclease) (TALENTM - Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, France)를 코드하는 mRNA로 T-세포들을 전기천공시킴(electoporating)으로써 유전자 불활성화가 수행된다. 불활성화된 T 세포들은 자성 비드들을 이용하여 분류된다. 예를 들어, 타겟된 유전자 (예를 들어 CD38, CD70 및 CD70)를 아직 발현시키는 T 세포들은 고형 표면 상 고정(fixation)에 의하여 제거될 수 있고, 그리고 불활성화된 세포들은 칼럼을 통하여 패스됨으로써 스트레스에 노출되지 않는다. 이온화한 방법은 적절히 조작된 T-세포들의 농도를 증가시킨다.
5. CD3 복합체의 자극을 통한 환자에의 투여 후 인 비보로 또는 환자에게 투여하기 전에 조작된 T-세포들의 인 비트로에서의 확장. 투여 단계 전, 환자들은 CAMPATH1-H, 인간화된 단일클론 항-CD52 항체와 같은 면역억제 치료를 받을 수 있다.
6. 타겟 항원에 근접하도록 조작된 세포들을 가져가기 위하여 환자에 투여 후 인 비보에서 또는 환자에 투여 전 엑스 비보에서 이중특이적 항체들에 선택적으로 노출된 상기 세포들.
항-CD38 단일 체인 키메라 항원 수용체 (CAR CD38)을 위하여 코드하는 단일 시스트론(monocistronic) mRNA로 전기천공된 조작된 T-세포들의 기능 분석
특히, 키메라 항원 수용체 (CAR CD38)와 제공될 때, 게놈조작이 항-종양 활성을 보이는 조작된 T-세포들의 능력에 영향을 미치지 않았다는 것을 입증하기 위하여, 조작된 T-세포들이 그것들의 표면에 CD38을 발현시킨 Daudi 세포들로 4 시간 동안 배양되었다. T 림프구들에 의한 세포독성 그래뉼(granule) 방출의 마커, CD107a의 세포 표면 상향조절(upregulation)이 유동세포분석법(flow cytometry) 분석(analysis)에 의하여 측정되었다 (Betts, Brenchley et al. 2003).
전기천공법(electroporation) 24시간 후, 세포들은 살아있는 세포들 상 CAR의 세포 표면 발현을 평가하는데 특이적인 PE-콘쥬게이트된(conjugated) 염소(goat) 항 마우스 IgG F(ab')2 단편 및 고정가능한(fixable) 생존능(viability) 염료(dye)로 염색되었다. CD38을 위하여 유전적으로 방해된 살아있는 T-세포들의 압도적인 수가 그것들의 표면에 CAR을 발현시킨다. T 세포들은 6 시간 동안 Daudi (CD38+) 세포들과 함께 배야오디었고, 그것들의 표면에서 탈과립(degranulation) 마커 CD107a의 발현을 감지하기 위하여 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다 (Betts, Brenchley et al. 2003).
결과들은 CD38가 PMA /이노마이신(ionomycin) (양성 대조군) 또는 CD38+ Daudi 세포들에 대응하여 탈과립시키는(degranulate) 동일한 능력이 유지된 T-세포들을 방해했다는 것을 보여주었다. CD107 상향조절(upregulation)은 CD38+의 존재에 의존한다. 이들 데이터는 본 T-세포들의 게놈 조작이 통제된 항-종양 반응을 올리는(mount) T 세포들의 능력에 나쁜 영향을 주지 않는다는 것을 제안한다.
Figure 112016089675477-pct00006
Figure 112016089675477-pct00007
Figure 112016089675477-pct00008
Figure 112016089675477-pct00009
Figure 112016089675477-pct00010
Figure 112016089675477-pct00011
Figure 112016089675477-pct00012
Figure 112016089675477-pct00013
Figure 112016089675477-pct00014
Figure 112016089675477-pct00015
Figure 112016089675477-pct00016
Figure 112016089675477-pct00017
Figure 112016089675477-pct00018
표 4: T-세포들의 표면에서 발현되는 것이 발견된 분화(differentiation)의 클러스터(Cluster) (CD) 항원 마커들.
Figure 112016089675477-pct00019
Figure 112016089675477-pct00020
Figure 112016089675477-pct00021
표 5: T-세포들 및 결장(colon) 종양 세포들 둘다의 표면에서 발현된 항원 마커들
Figure 112016089675477-pct00022
Figure 112016089675477-pct00023
Figure 112016089675477-pct00024
Figure 112016089675477-pct00025
Figure 112016089675477-pct00026
Figure 112016089675477-pct00027
Figure 112016089675477-pct00028
Figure 112016089675477-pct00029
Figure 112016089675477-pct00030
Figure 112016089675477-pct00031
Figure 112016089675477-pct00032
Figure 112016089675477-pct00033
Figure 112016089675477-pct00034
표 6: T-세포들 및 유방 종양 세포들 둘다의 표면에서 발현된 항원 마커들
Figure 112016089675477-pct00035
Figure 112016089675477-pct00036
Figure 112016089675477-pct00037
Figure 112016089675477-pct00038
표 7: T-세포들 및 소화기(digestive) 종양 세포들 둘다의 표면에서 발현된 항원 마커들
Figure 112016089675477-pct00039
Figure 112016089675477-pct00040
Figure 112016089675477-pct00041
Figure 112016089675477-pct00042
표 8: T-세포들 및 신장 종양 세포들 둘다의 표면에서 발현된 항원 마커들
Figure 112016089675477-pct00043
표 9: T-세포들 및 간 종양 세포들 둘다의 표면에서 발현된 항원 마커들
Figure 112016089675477-pct00044
Figure 112016089675477-pct00045
Figure 112016089675477-pct00046
Figure 112016089675477-pct00047
Figure 112016089675477-pct00048
Figure 112016089675477-pct00049
표 10: T-세포들 및 폐 종양 세포들 둘다의 표면에서 발현된 항원 마커들
Figure 112016089675477-pct00050
Figure 112016089675477-pct00051
Figure 112016089675477-pct00052
표 11: T-세포들 및 난소(ovary) 종양 세포들 둘다의 표면에서 발현된 항원 마커들
Figure 112016089675477-pct00053
Figure 112016089675477-pct00054
표 12: T-세포들 및 췌장 종양 세포들 둘다의 표면에서 발현된 항원 마커들
Figure 112016089675477-pct00055
Figure 112016089675477-pct00056
Figure 112016089675477-pct00057
표 13: T-세포들 및 전립선 종양 세포들 둘다의 표면에서 발현된 항원 마커들
Figure 112016089675477-pct00058
Figure 112016089675477-pct00059
Figure 112016089675477-pct00060
Figure 112016089675477-pct00061
Figure 112016089675477-pct00062
Figure 112016089675477-pct00063
Figure 112016089675477-pct00064
Figure 112016089675477-pct00065
Figure 112016089675477-pct00066
Figure 112016089675477-pct00067
Figure 112016089675477-pct00068
Figure 112016089675477-pct00069
Figure 112016089675477-pct00070
Figure 112016089675477-pct00071
Figure 112016089675477-pct00072
Figure 112016089675477-pct00073
Figure 112016089675477-pct00074
Figure 112016089675477-pct00075
Figure 112016089675477-pct00076
Figure 112016089675477-pct00077
Figure 112016089675477-pct00078
Figure 112016089675477-pct00079
Figure 112016089675477-pct00080
Figure 112016089675477-pct00081
Figure 112016089675477-pct00082
Figure 112016089675477-pct00083
표 14: 액상 종양 세포들 (ALL, AML, CML, MDS, CLL, CTRL)에서 과발현되고 T-세포들의 표면에서 발현된 항원 마커들
실시예 1 - 항 -CD38 CAR의 CD38 유전자 & 발현 상 넉아웃 (KNOCK OUT) (KO)
CD38 타겟-사이클릭 ADP 리보스(ribose) 하이드롤라제(hydrolase)의 제시
CD38은 환자들의 대다수에서 높은 수준의 CD38을 발현시키는 다발성 골수종 (MM) 세포들을 포함하는, 많은 면역 세포들의 표면에서 발견되는 당단백질이다. 많은 연구들이 CDC 및 ADCC에 의하여 항-CD38 mAb들을 이용한 CD38+ MM 세포주들 및 환자들로부터 CD38+ MM 세포들의 효율적인 죽이기를 보여주었기 때문에 CD38은 MM을 위한 입증된 타겟이다 (Ellis, J. H. K. et al, Journal of Immunology, 1995, 155 (2), 925-937). 다라투무맙(daratumumab)은 다발성 골수종 및 다른 혈액학상 종양들의 죽이기를 유도하는 치료적 인간 CD38 단일클론 항체이다 (De Weers, M. et al, J Immunol 2011 186:1840-1848). 몇몇 연구들에서, CD38가 또한 활성화된 T 세포들에 의하여 높게 발현된다는 것이 보여져 왔다 (Sandoval-Montes CJ et a:, 2005, Leukoc Biol. 77(4):513-21).
T-세포들에 의한 CD38의 발현
CD3/CD28 비드들 및 IL-2 자극 후 T 세포들에 의한 CD38 발현이 17일 동안 매 3-4 일 FACS에 의하여 분석되었다. 90%보다 많은 T 세포들이 활성화 후 6 일 및 17 일 사이에 발현된다는 것이 관찰되었다 (도 10B).
이런 식으로 항-CD38 CAR+ T 세포들에 의한 활성화된 T 세포들의 죽이기를 피하기 위하여 T 세포들에서 CD38 표면 발현이 방지되어야 한다. 이것은 ALE-뉴클레아제들을 이용한 CD38 유전자의 불활성화에 의하여 달성될 수 있다. TALEN은 TAL 뉴클레아제들의 주문제작된(customized) 포맷(format)을 지정하는 출원인(Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 PARIS)에 의하여 소유되는 상표이다.
CD38 넉아웃 (knock-out) (KO)을 위한 전략
CD38 유전자 내 13-pb 스페이서에 의하여 분리된 두 개의 17-pb 길이 서열들을 타겟팅하는 헤테로다이머 TALE-뉴클레아제가 설계되고 생산되었다. 각각의 반(half) 타겟은 도 10A 및 하기 표 15에 목록화된 반(half) TALE-뉴클레아제들의 반복들에 의하여 인식된다.
CD38ex1_T2 타겟을 위한 왼쪽 TALEN의 반복들 서열은 NN-NI-NN-NN-NG-NN-NN-NN-NG-NG-NN-NN-HD-NN-NI-NG였고, 오른쪽 TALEN을 위한 것은 NN-NG-HD-HD-HD-HD-NN-HD-NI-NN-NG-NN-HD-HD-HD-NG였다.
Figure 112016089675477-pct00084
Figure 112016089675477-pct00085
표 15: CD38 항원의 불활성화를 위한 TALEN들 및 시험된 CD38 타겟의 서열들
각각의 TALE-뉴클레아제 구조체(construct)는 T7 프로모터의 통제 하 포유류 발현 벡터에서 제한 효소 소화(digestion)를 이용하여 서브클론(subcloned)되었다. CD38을 절단하는 TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA가 T7 프로모터로부터 다운스트림 코딩(coding) 서열을 나르는 플라스미드들로부터 합성되었다.
재조합 IL-2 및 항 CD3/CD28 코팅된 비드들과 72 시간 동안 활성화된 정제된 T 세포들이 반(half) CD38ex1_T2 TALE-뉴클레아제들 둘다를 코드하는 2 mRNAs 각각 (각각 10μg)으로 전기천공법(electroporation) (Cytopulse)에 의하여 형질주입(transfect)되었다. 조사하기 위하여 CD38 음성 T 세포들의 퍼센트가 TALEN mRNA 형질주입(transfection) 후 3, 6, 10 및 13 일에 유동세포 분석법에 의하여 평가되었다. 형질주입(transfect)된 T 세포들의 15%가 CD38 결핍(deficient)이었으며 (도 10 C), 이 결핍은 형질주입(transfection) 후 13일 동안 안정적이었다는 것이 관찰되었다.
게다가 CD38 유전자을 타겟팅하는 두 개의 대체의 TALE-뉴클레아제들이 설계되었다. 각각의 반(half) 타겟은 도 10A 및 하기 표 16에 목록화된 반(half) TALE-뉴클레아제들의 반복들에 의하여 인식된다. CD38ex1_T4 타겟을 위한 왼쪽 TALEN의 반복 서열은 NG-NN-HD-NN-NI-NN-NG-NG-HD-NI-NN-HD-HD-HD-NN-NN-NG이었고, 오른쪽 TALEN을 위한 것은 NG-NN-HD-NG-NN-HD-HD-NN-NN-HD-NG-HD-NG-HD-NG-NI이었다. CD38ex1_T5 타겟을 위한 왼쪽 TALEN의 반복 서열은 NG-NN-NI-NG-HD-HD-NG-HD-NN-NG-HD-NN-NG-NN-NN-NG였고, 오른쪽 TALEN을 위한 것은 HD-NN-NI-NN-NN-NG-NN-NN-HD-NN-HD-HD-NI-NN-HD-NI이었다.
Figure 112016089675477-pct00086
Figure 112016089675477-pct00087
Figure 112016089675477-pct00088
표 16: 두 개의 다른 CD38 타겟들의 서열들 및 그것들의 불활성화를 위한 해당하는 TALEN들
CAR 항-CD38의 발현을 위한 전략
CAR들 항-CD38의 조성물 및 구조체(Structure)
표 17에 scFv 항-CD38의 VH 및 VL 체인이 제시된다. US 8,263,746B 특허에 기재된 대로 서열번호: 12-13는 MOR202 (또는 MOR03087)에 해당하고, 서열번호:10-11은 인간화된 항-CD38 항체 다라투무맙( daratumumab) (Genmab)에 해당한다.
서열번호:14-20 및 서열번호:21-26는, WO 2008/047242 출원에 기재된 대로 각각 VH 체인 (HCDR) 및 VL 체인 (LCDR)에 대한 CDR 서열에 해당한다.
Figure 112016089675477-pct00089
Figure 112016089675477-pct00090
표 17: VH 및 VL 체인들을 위한 특이적 CDR의, 그리고 scFv 항-CD38 항체들 다라투무밥(daratumumab), MOR202의 VH 및 VL 체인들의 서열들
다라투무밥(daratumumbab)을 위하여, scFv 3개의 다른 CAR들 구조체들(constructs) (GMB005-V1&V2&V3)이 하기 표 18에 개시된 그것들의 서열 및 도 11A에 제시된 바와 같이 설계되어 왔다. 세 개의 구조체들(constructs)은 모두 신호 펩타이드 (CD8α), GS 링커 (scFv VH 및 VL 체인들 사이), 막관통 도메인 (TM), 4-1BB 공동자극(costimulatory) 도메인, 및 CD3ζ 활성화 도메인 (하기 표 18에 개시된 서열들)의 면에서 동일한 요소들(components)를 공유한다. 그것들의 차이들은 힌지(hinge)의 선택으로부터 온다(표 18):
V1 : FcRIIa 힌지(hinge)
- V2 : CD8a 힌지(hinge)
- V3 : IgG1 힌지(hinge)
Figure 112016089675477-pct00091
Figure 112016089675477-pct00092
표 18: 사용된 개개의 요소들의 그리고 scFv 다라투무맙(daratumumab)-기반의 항-CD38 CAR들의 3 개의 다른 구조들의 폴리펩타이드 서열
스크리닝
CD38 TALEN들은 활성화 4일 후 형질주입(transfect)될 것이다. 3일 후 CD38 결핍(deficient) 세포들은 음성(negative) 선택(selection)에 의하여 분류되고, 항-CD38 CAR mRNA들로 3일 후 형질주입될 것이다. 생성된 CAR 분자들은 그 다음에 CAR mRNA 일시적 형질주입(transfection) 직후 타겟 세포주들 발현 CD38을 향하여 탈과립(degranulation) 활성 및 발현을 위하여 스크리닝될 것이다. 다른 발현 레벨들의 CD38 (도 11B)를 발현시키는 타겟 세포주들이 활성 테스트를 위하여 사용될 것이다:
- 항-CD38 마이크로비드들을 이용하여 자기(magnetic) 분리(separation)에 의하여 수득되는- U266 CD38+ 및 U266 CD38
- 중간 레벨의 CD38을 발현시키는 다발성 골수종 세포주, L363
- 높은 레벨의 CD38을 발현시키는 버킷(Burkitt) 림프종으로부터 유래의 세포주, 다우디(Daudi)
- 만성 골수성(myelogenous) 백혈병(leukemia)으로부터 유래의 세포주 CD38 음성 세포주, K562.
이 첫 번째 스크리닝 후 다수의 선택된 후보들이 탈과립(degranulation), IFNγ 방출 및 선택된 타겟 세포주들을 향한 특이적 세포독성 활성을 유도하는 그것들의 능력에 대하여 테스트될 두 번째 스크리닝 단계가 이어질 것이다. 후보 선택은 그 다음에 좁혀질 것이고, CAR 활성 및 렌티바이러스(lentivirus) 벡터 생산을 위하여 선택된 몇몇 후보들은 CAR들을 안정적으로 발현시키는 CD38 KO T-세포들에서 평가될 것이다.
실시예 2 CS1 KO의 맥락에서 항 - CS1 CAR의 활성
CS1 타겟의 제시
다발성(Multiple) 골수종(myeloma) (MM)은 2012년 미국에서 확인된 MM으로부터의 10,710 명 사망 및 추정되는 21,700 케이스들과 함께 골수 내 형질(plasma) 세포들(cells) (PCs)의 잘못된(aberrant) 클론(clonal) 증식(expansion)에 의하여 특징되는 B-세포 악성 종양(malignancy)이다 (Siegel R, et al. Cancer J Clin 2012 62:10-29). 2013년에, 22,350 명의 개인들이 미국에서 MM으로 새로 진단될 것이고, 10,710명이 그것으로 죽을 것이고, 이는 모든 혈액(hematologic) 악성종양들로부터의 20%의 사망들을 설명하는 것이라는 것이 추정될 것이다. 전체적으로 개선된 생존을 갖는 면역조절 약물들 및 프로테아좀(proteasome) 억제제들의 사용에도 불구하고 (Palumbo A, et al. Leukemia 2009 23:449-456), MM은 신규한 치료적 접근들이 긴급하게 필요한 불치의(incurable) 악성종양(malignancy)으로 남아 있다(Podar K, et al. Leukemia 2009 23:10-24).
세포 표면 당단백질 CS1 (SLAMF7, CD319 또는 CRACC로도 문헌에서 알려져 있는 - NCBI 참고 서열: NP_067004.3)은 골수종(myeloma) 세포들의 표면에서 도처에 존재하는 식으로(ubiquitously) 높게 발현된다 (Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14:2775-84). CS1는 자연살해 (NK) 세포들, T 세포들의 몇몇 서브셋트들(subsets), 및 정상 B 세포들을 포함하는 면역 효과기(effector) 세포들의 대다수에서 매우 낮은 수준들로 발현되고, 골수(myeloid) 세포들 상에서 거의 감지될 수 없다 (Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14:2775-84). 특히, CS1는 MM을 포함하는, 혈액(hematologic) 악성종양들을 치료하기 위하여 줄기 세포 이식(transplantation)에 사용될 수 있는, 인간 조혈 줄기 세포들에서 무시해도 될 정도로 발현된다 (Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14:2775-84). MM에서 CS1의 기능들이 불완전하게 이해된 채로 남아 있고, CS1이 골수종(myeloma) 세포 부착(adhesion), 클론원성(clonogenic) 성장, 및 종양형성(tumorigenicity)에서 역할을 할 수 있다는 것이 입증되어 왔다 (Benson DM Jr, et al. J Clin Oncol 2012 30:2013-5; Tai YT, et al. Blood 2009 113:4309-18).
CAR 항-CS1의 구조
동일한 구조들 V1, V2 및 V3가 (표 18에서 보인 서열들 및 도 11A에 묘사된 바와 같이) 힌지(hinge), 막관통 도메인, 공동활성화(co-activation) 및 형질도입(transduction) 도메인들의 면에서, 몇몇 요소들과, 항-CD38 항원 타겟 단일-체인 CAR을 위한 실시예 1과 같이 설계된다.
표 19에 scFv 항-CS1의 VH 및 VL 체인들이 제시된다. 서열번호:38-40-42-44-46 및 서열번호:39-41-43-45-47은 쥐(murine) scFv Luc63, Luc90, Luc34, LucX1 및 LucX2 의 VH 체인 및 VL 체인에 각각 해당된다.
표 20에 상기 scFv와 항-CS1 CAR들이 제시된다; 도 11A의 버젼들 V1, V2 및 V3에 기초하여 이들 CAR들, 이때 각각 짧은 FcERγ 힌지(hinge), 중간(medium) 힌지(hinge) CD8α 힌지 및 긴(long) IgG1 힌지가 사용된다. 밑줄친 부분들은 링커에 의하여 결합되는 scFv VH 및 VL 체인들에 해당한다.
Figure 112016089675477-pct00093
표 19: scFv 항-CS1 항체들의 VH 및 VL 체인들의 서열들
Figure 112016089675477-pct00094
Figure 112016089675477-pct00095
Figure 112016089675477-pct00096
Figure 112016089675477-pct00097
Figure 112016089675477-pct00098
표 20: 도 11A의 V1, V2 및 V3 버젼들에 기초한 항-CS1 CAR들의 폴리펩타이드 서열
CAR CS1+ 및 KO CS1 조작을 위한 전략
CS1는 이것을 CAR 발달을 위한 흥미로운 타겟으로 만드는, 다발성(Multiple) 골수증(Myeloma)을 갖는 환자들로부터의 플라스마사이토이드(plasmacytoid) 세포들에서 높은 레벨들로 발현된다. T-세포들은, 특히 CD8 서브셋(subset)은, 낮은 수준의 CS1을 발현시키는데, 이는 T-세포 CAR 발달에 문제점이고, 이는 그것들이 항-CS1 CAR를 발현시킬 때 죽여질 수 있기 때문이다.
이 예에서, 우리는 CS1 유전자가 CAR+ T-세포들에서 방해될 때 CAR 활성이 향상되었는지 여부를 보기 위하여, CS1 (SLAMF7) 유전자을 타겟팅하는 TALEN으로 형질주입(transfect)되었거나, 또는 가짜로(mock) 형질주입(transfect)되는 인간 T-세포들에서 Luc90-v2 CAR (표 20에 보여지는 서열)의 활성을 평가하였다. 실험 과정은 도 12에 보여진다.
T-세포들은 버피(buffy)-코팅(coat)으로부터 정제되었고, CD3/CD28-코팅된 비드들을 이용하여 활성화되었다. 세포들은 T01_오른쪽(right) TAL을 코드하는 mRNA 10 μg 및 T01_왼쪽(left) TAL을 코드하는 mRNA 10 μg으로 활성화 72 시간 후 공동(co)-형질주입(transfect)되었다. TAL들의 서열들은 도 13에 보여진 TAL 반복들(repeats)로 플라스미드 구조체들(constructs) (T01, T02 및 T03) 및 하기 표 21에 보여진다.
도 14는 CS1 (SLAMF7) 유전자 내 TAL들 T01, T02 및 T03을 위한 타겟 위치를 보여준다: T01 및 T02은 엑손 1 (도 14A)을 타겟으로 하는 반면 T03은 엑손 2 (도 14B)을 타겟으로 한다.
Figure 112016089675477-pct00099
표 21: 그것의 불활성화를 위한 CS1 타겟 및 TALEN들의 서열들
TALEn 형질주입(transfection) 3일 후, 세포들은 L90-v2 CAR의 발현을 EF1a 프로모터으로 몰아가는(drive) 재조합 렌티바이러스(lentiviral) 벡터로 형질도입(transduce)되었다. 렌티바이러스 벡터는 CAR 발현이 라이보좀 스킵 펩타이드를 통하여 BFP 발현 (푸른(Blue) 형광(Fluorescent) 단백질(Protein))로 커플링된 방식으로 만들어졌다. L90-v2 CAR는 CS1 타겟을 인식하는 세포외 결합 도메인(scFv L90)에 의하여 이루어지고, hCD8α 단백질로부터 유래된 막관통 영역들 및 힌지(hinge)가 이어진다. 분자의 세포내(intracellular) 부분은 41BB-유래 공동자극(costimulatory) 도메인을 포함하고, CD3γ 신호전달 도메인이 이어진다(개개의 요소들, scFv 및 CAR 서열들 각각을 위한 앞의 표 18-19-20에 개시된 서열들).
형질도입(transduction) 효율은 BFP 발현을 따라, 유동세포 분석법에 의하여 형질도입(transduction) 6일 후 평가되었다. 세포들은 또한 항-CD8 및 항-CS1 항체들로 염색되었다.
결과들
CAR CS1+ 발현
도 16으로부터의 결과들은 형질도입(transduction) 효율들이 CS1 유전자을 타겟팅하는 TALEn으로 형질주입(transfect)되어 온 세포들보다 가짜로(mock) 형질주입(transfect)된 세포들에서 더 높다는 것을 보여준다. 이것은 아마 TALEN-주도의(driven) 유전자 붕괴(disruption)의 결과로서 세포들이 더 이상 CS1을 발현시키지 않을 때 이 군집(population)은 영향을 받지 않는 반면, 비-형질도입된(transduced) CS1-발현시키는 T-세포들의 특이적 세포 죽이기 때문이다.
TALEN 또는 가짜로(mock) 형질주입된(transfected) 세포들 사이에서 이 시점에서 CS1 레벨들에서 중요한 차이들은 관찰되지 않는데(음성 대조군-플라스미드 없이 형질주입(transfection)), T-세포들의 최초 활성화 후 시간이 흐르면서 CS1 레벨들이 감소하기 때문이다. 반면, CD8+ 세포들의 %에서 중요한 감소는 TALEN 형질주입된 CAR+ 세포들에 비교하여 가짜로(mock) 형질주입된(transfected) CAR 발현 세포들에서 관찰되는데, 이는 CD8+ 세포들의 상당부분이 CAR+ T-세포들에 의하여 제거되어왔기 때문이다.
세포독성 활성 평가
세포들의 세포독성 활성이 CS1의 발현이 없는 음성 대조군 세포주 (MOLM13) 또는 CS1을 발현시키는 세포주(L363 세포들)과 동일한 양의 T-세포들을 함께 배양함으로써, CAR 형질도입(transduction) 8일 후 평가되었다. 타겟 세포주들의 생존능은 세포 공동-배양들을 시작한 4 시간 후 유동세포 분석법에 의하여 측정되었다. 도 15A에 보여지는 결과들은 그것들이 CAR+ T-세포들과 공동배양될 때 CS1(+) 세포들의 감소된 세포 생존능을 보여주는데, 반면 CS1(-) 세포 생존능에서의 영향은 관찰되지 않았다. 특이적 세포 용해(lysis)가 유동세포 분석법 데이터를 이용하여 계산되었고, 그것은 CAR 형질도입(transduction) 전 T-세포들이 CS1 유전자를 타겟팅하는 TALEn으로 형질주입된 때보다 2배 더 높았다 (도 15B). 공동배양물 내 존재하는 CAR+ T-세포들의 양이 세포들이 가짜로(mock) 형질주입되었을 때보다 더 높았기 때문에 영향은 더 클 수도 있다는 것이 고려되어야 한다(도 16으로부터 유동세포 분석법 데이터 참조). 실험으로부터의 결과들은 하기와 같다:
- Mock/NTD 샘플을 위하여, BFP+ 세포들의 %는 0.1%이고, CD8+ 세포들의 양은 53.9%이다;
- TALEn/NTD 샘플을 위하여, BFP+ 세포들의 %는 0.2%이고 CD8+ 세포들의 양은 49.5%이다;
- Mock /L90-2 샘플을 위하여, BFP+ 세포들의 %는 94%이고 CD8+ 세포들의 양은 1.8%이다;
- TALEn /L90-2 샘플을 위하여, BFP+ 세포들의 %는 61%이고 CD8+ 세포들의 양은 8.3%이다.
형질도입(transduction) 효율들은 CS1 유전자를 타겟팅하는 TALEn으로 형질주입된 세포들보다 가짜로(mock) 형질주입된 세포들에서 더 높다 (NTD: 형질도입되지 않음(not transduced)).
형질도입(tra nsduction) 후 재활성화
CS1 유전자가 TALEn 형질주입된(transfected) T-세포들에서 방해되었다는 것을 확인하기 위하여, 다른 샘플들이 형질도입(transduction) D11 후 CD3/CD28 비드들로 재활성화되었다. 재활성화 72 시간 후 세포들은 항-CD8 및 항-CS1 항체들로 염색되었고 유동세포 분석법에 의하여 발현이 분석되었다.
도 17은 각각의 샘플에서 CD8/CS1 발현 레벨들 및 형질도입(transduction) 효율들을 보여준다. 더 낮은 패널에서 보이듯이, 재활성화 직후 CS1 레벨들의 증가가 가짜로(mock) 형질주입된 세포들에서 관찰되고, 반면 더 낮은 양의 세포들이 TALEn 형질주입된 군집들(populations)에서 CS1을 발현시킬 수 있다.
실험으로부터의 결과들은 하기와 같다:
- Mock/NTD 샘플을 위하여, BFP+ 세포들의 %는 0.01%이고, CS1은 세포들의 65.2%에서 발현되고, CD8+ 세포들의 양은 80.7%이다;
- TALEn/NTD 샘플을 위하여, BFP+ 세포들의 %는 0.2%이고, CS1은 세포들의 9.7%에서 발현되고, CD8+ 세포들의 양은 78.8%이다;
- Mock /L90-2 샘플을 위하여, BFP+ 세포들의 %는 94%이고, CS1은 세포들의 37.5%에서 발현되고, CD8+ 세포들의 양은 16%이다.
- TALEn /L90-2 샘플을 위하여, BFP 강도는 61%이고, CS1 발현은 8.5%이고 CD8 발현은 68.5%이다.
재활성화 직후 CS1 레벨들의 증가가 가짜로(mock) 형질주입된 세포들에서 관찰되고, 반면 낮은 양의 세포들이 TALEn 형질주입된 군집들(populations)에서 CS1을 발현시킬 수 있다.
완전히, 이들 결과들은 CS1 유전자가 TALEn 형질주입된(transfected) T-세포들에서 방해되고, 이것이 주로 세포독성 CD8+ T-세포들을 보존함으로써, 항-CS1 CAR+ 세포들의 세포독성 활성을 향상시킨다는 것을 가리킨다.
실시예 3: CD70 타겟
CD70 타겟의 제시
CD70은 CD27에 결합하는 사이토카인이며, TNF 패밀리의 부분이다 (Goodwin R.G. et al, 1993, Cell 73:447-456). 이 단백질은 조정(adaptive) T 세포 반응들에서 역할을 갖고, 공동자극된 T-세포들의 증식을 유도하고, 세포용해(cytolytic) T-세포들의 발생을 향상시킨다. 그것의 등록 번호는 P32970 (Uniprot)이다. Schurch, C. et al. (J. Clin. Invest., 2012; doi:10.1172/JCI45977)와 같은 몇몇 연구들은 CD27-CD70 상호작용들의 차단(blocking)이 만성(chronic) 골수성(myelogenous) 백혈병(leukemia) (CML)을 치료하는 것을 도울 수 있었다는 것을 제안한다.
CD70 KO를 위한 전략
CD70 유전자의 KO를 위한 동일한 전략이 실시예 1 및 실시예 2에서와 같이 수행될 것이다. CD70 유전자 내 15pb 스페이서(spacer)에 의하여 분리된 두 개의 49-pb 길이 서열들을 타겟팅하는 헤테로다이머(heterodimeric) TALE-뉴클레아제 및 23pb 스페이서에 의하여 분리된 57-pb 길이 서열을 타겟팅하는 하나의 TALE-뉴클레아제가 설계되고 생산되었다. 각각의 반(half) 타겟은 하기 표 22에 목록화된 반(half) TALE-뉴클레아제들의 반복들에 의하여 인식된다.
Figure 112016089675477-pct00100
표 22: 그것의 불활성화를 위한 TALEN들 및 CD70 타겟의 서열들
항-CD70 CAR의 발현을 위한 전략
CAR 항-CD70을 발현시키기 위한 동일한 전략이 실시예 1 및 실시예 2와 같이 수행될 것이다.
동일한 구조들 V1, V2 및 V3이 신호 펩타이드, VH 및 VL 체인들 사이의 링커, 막관통 도메인, 공동(co)-활성화 및 형질도입(transduction) 도메인들의 면에서 동일한 요소들(components)로 실시예 1-2와 같이 설계된다 (표 18에 보여지는 개개의 요소들을 위한 서열들 및 도 11A에 보인 일반 건축들(architectures)). 힌지만이 3 개 버젼들 V1, V2 및 V3 사이에서 다르고, 이때 각각 짧은 FcERγ 힌지, 중간(medium) 힌지 CD8α 힌지 및 긴 IgG1 힌지가 사용된다.
표 23에 scFv 항-CD70의 VH 및 VL 체인이 제시된다. 서열번호:81-82, 85-86, 89-90 및 서열번호:83-84,87-88,91-92는 Seattle Genetics로부터의 AMGEN 및 1F6으로부터의 scFv Ab4, Ab8의 VH 체인 및 VL 체인에 각각 해당한다.
표 24에 상기 scFv와 항-CD70 CAR들이 제시된다; 도 11A에 따라 버젼들 V1, V2 및 V3에 기반한 이들 CAR들, 이때 짧은 FcEγ 힌지, 중간(medium) 힌지 CD8 및 긴 IgG1 힌지가 각각 사용된다.
Figure 112016089675477-pct00101
Figure 112016089675477-pct00102
Figure 112016089675477-pct00103
Figure 112016089675477-pct00104
표 23: scFv 항-CD70 Ab4, Ab8 및 1F6 항체들을 위한 VH 및 VL 체인들의 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 서열들
Figure 112016089675477-pct00105
Figure 112016089675477-pct00106
Figure 112016089675477-pct00107
표 24: 도 11A에 따른 V1, V2 및 V3 버젼들에 기초한 항-CD70 CAR들의 폴리펩타이드 서열들
참고문헌들
Bardenheuer, W., K. Lehmberg, et al. (2005). "Resistance to cytarabine and gemcitabine and in vitro selection of transduced cells after retroviral expression of cytidine deaminase in human hematopoietic progenitor cells." Leukemia 19(12): 2281-8.
Betts, M. R., J. M. Brenchley, et al. (2003). "Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation." J Immunol Methods 281(1-2): 65-78.
Boch, J., H. Scholze, et al. (2009). "Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors." Science 326(5959): 1509-12.
Brewin, J., C. Mancao, et al. (2009). "Generation of EBV-specific cytotoxic T cells that are resistant to calcineurin inhibitors for the treatment of posttransplantation lymphoproliferative disease." Blood 114(23): 4792-803.
Cambier, J.C. (1995) "Antigen and Fc Receptor Signaling:The Awesome Power of the lmmunoreceptor Tyrosine- I Based Activation Motif (ITAM)" The Journal of Immunology 155 (7) 3281-3285.
Cong, L., F. A. Ran, et al. (2013). "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems." Science 339(6121): 819-23.
Critchlow, S. E. and S. P. Jackson (1998). "DNA end-joining: from yeast to man." Trends Biochem Sci 23(10): 394-8.
Dalgaard, J. Z., A. J. Klar, et al. (1997). "Statistical modeling and analysis of the LAGLIDADG family of site-specific endonucleases and identification of an intein that encodes a site-specific endonuclease of the HNH family." Nucleic Acids Res 25(22): 4626-38.
Deltcheva, E., K. Chylinski, et al. (2011). "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Nature 471(7340): 602-7.
Garneau, J. E., M. E. Dupuis, et al. (2010). "The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA." Nature 468(7320): 67-71.
Gasiunas, G., R. Barrangou, et al. (2012). "Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria." Proc Natl Acad Sci U S A 109(39): E2579-86.
Hacke, K., J. A. Treger, et al. (2013). "Genetic modification of mouse bone marrow by lentiviral vector-mediated delivery of hypoxanthine-Guanine phosphoribosyltransferase short hairpin RNA confers chemoprotection against 6-thioguanine cytotoxicity." Transplant Proc 45(5): 2040-4.
Jena, B., G. Dotti, et al. (2010). "Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor." Blood 116(7): 1035-44.
Jinek, M., K. Chylinski, et al. (2012). "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Science 337(6096): 816-21.
Jonnalagadda, M., C. E. Brown, et al. (2013). "Engineering human T cells for resistance to methotrexate and mycophenolate mofetil as an in vivo cell selection strategy." PLoS One 8(6): e65519.
Kushman, M. E., S. L. Kabler, et al. (2007). "Expression of human glutathione S-transferase P1 confers resistance to benzo[a]pyrene or benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol mutagenesis, macromolecular alkylation and formation of stable N2-Gua-BPDE adducts in stably transfected V79MZ cells co-expressing hCYP1A1." Carcinogenesis 28(1): 207-14.
Lackner, G., N. Moebius, et al. (2011). "Complete genome sequence of Burkholderia rhizoxinica, an Endosymbiont of Rhizopus microsporus." J Bacteriol 193(3): 783-4.
Ma, J. L., E. M. Kim, et al. (2003). "Yeast Mre11 and Rad1 proteins define a Ku-independent mechanism to repair double-strand breaks lacking overlapping end sequences." Mol Cell Biol 23(23): 8820-8.
Mak, A. N., P. Bradley, et al. (2012). "The crystal structure of TAL effector PthXo1 bound to its DNA target." Science 335(6069): 716-9.
Mali, P., L. Yang, et al. (2013). "RNA-guided human genome engineering via Cas9." Science 339(6121): 823-6.
Metzger, H. et al. (1986) "The Receptor with High Affinity for Immunoglobulin E" Annual Review of Immunology. 4: 419-470
Moscou, M. J. and A. J. Bogdanove (2009). "A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors." Science 326(5959): 1501.
Nivens, M. C., T. Felder, et al. (2004). "Engineered resistance to camptothecin and antifolates by retroviral coexpression of tyrosyl DNA phosphodiesterase-I and thymidylate synthase." Cancer Chemother Pharmacol 53(2): 107-15.
Park, T. S., S. A. Rosenberg, et al. (2011). "Treating cancer with genetically engineered T cells." Trends Biotechnol 29(11): 550-7.
Sangiolo, D., M. Lesnikova, et al. (2007). "Lentiviral vector conferring resistance to mycophenolate mofetil and sensitivity to ganciclovir for in vivo T-cell selection." Gene Ther 14(21): 1549-54.
Schweitzer, B. I., A. P. Dicker, et al. (1990). "Dihydrofolate reductase as a therapeutic target." Faseb J 4(8): 2441-52.
Sugimoto, Y., S. Tsukahara, et al. (2003). "Drug-selected co-expression of P-glycoprotein and gp91 in vivo from an MDR1-bicistronic retrovirus vector Ha-MDR-IRES-gp91." J Gene Med 5(5): 366-76.
Takebe, N., S. C. Zhao, et al. (2001). "Generation of dual resistance to 4-hydroperoxycyclophosphamide and methotrexate by retroviral transfer of the human aldehyde dehydrogenase class 1 gene and a mutated dihydrofolate reductase gene." Mol Ther 3(1): 88-96.
Waldmann H. and Hale G. (2005) "CAMPATH: from concept to clinic". Phil. Trans. R. Soc. B 360: 1707-1711.
Yam, P., M. Jensen, et al. (2006). "Ex vivo selection and expansion of cells based on expression of a mutated inosine monophosphate dehydrogenase 2 after HIV vector transduction: effects on lymphocytes, monocytes, and CD34+ stem cells." Mol Ther 14(2): 236-44.
Zielske, S. P., J. S. Reese, et al. (2003). "In vivo selection of MGMT(P140K) lentivirus-transduced human NOD/SCID repopulating cells without pretransplant irradiation conditioning." J Clin Invest 112(10): 1561-70.
<110> CELLECTIS <120> CELLS FOR IMMUNOTHERAPY ENGINEERED FOR TARGETING ANTIGEN PRESENT BOTH ON IMMUNE CELLS AND PATHOLOGICAL CELLS <130> P81400737PCT00 <150> PA201470076 <151> 2014-02-14 <160> 148 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 47 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 tgaggtgggt tggcgactaa ggcgcaccgg tgggcactgc ggggaca 47 <210> 2 <211> 936 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38ex1_T2-L1 TALEN <400> 2 Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Tyr Pro Tyr Asp 1 5 10 15 Val Pro Asp Tyr Ala Ile Asp Ile Ala Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr 20 25 30 Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val 35 40 45 Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His 50 55 60 Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val 65 70 75 80 Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Ala 85 90 95 Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala 100 105 110 Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp 115 120 125 Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Val 130 135 140 Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn 145 150 155 160 Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys 165 170 175 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 180 185 190 His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly 195 200 205 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys 210 215 220 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 225 230 235 240 Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 245 250 255 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 260 265 270 Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 275 280 285 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 290 295 300 Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 305 310 315 320 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 325 330 335 Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 340 345 350 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln 355 360 365 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 370 375 380 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 385 390 395 400 Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala 405 410 415 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 420 425 430 Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys 435 440 445 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 450 455 460 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly 465 470 475 480 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 485 490 495 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 500 505 510 Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 515 520 525 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 530 535 540 Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 545 550 555 560 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala 565 570 575 Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 580 585 590 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 595 600 605 Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 610 615 620 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 625 630 635 640 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 645 650 655 Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 660 665 670 Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala 675 680 685 Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro Ala Leu Ala 690 695 700 Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu Gly Gly Arg 705 710 715 720 Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly Asp Pro Ile Ser Arg 725 730 735 Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg 740 745 750 His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile 755 760 765 Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu 770 775 780 Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser 785 790 795 800 Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr 805 810 815 Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro 820 825 830 Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr 835 840 845 Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser 850 855 860 Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly 865 870 875 880 Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn 885 890 895 Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile 900 905 910 Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn 915 920 925 Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp 930 935 <210> 3 <211> 942 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38ex1_T2-R1 TALEN <400> 3 Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Lys Glu Thr Ala 1 5 10 15 Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Ile Asp Ile Ala Asp 20 25 30 Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro 35 40 45 Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His 50 55 60 Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro 85 90 95 Glu Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly 100 105 110 Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly 115 120 125 Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg 130 135 140 Gly Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu 145 150 155 160 Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 165 170 175 Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 180 185 190 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 195 200 205 Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 210 215 220 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val 225 230 235 240 Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 245 250 255 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 260 265 270 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 275 280 285 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 290 295 300 Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala 305 310 315 320 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 325 330 335 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 340 345 350 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 355 360 365 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly 370 375 380 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 385 390 395 400 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His 405 410 415 Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 420 425 430 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 435 440 445 Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu 450 455 460 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 465 470 475 480 Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 485 490 495 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 500 505 510 Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 515 520 525 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln 530 535 540 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 545 550 555 560 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 565 570 575 Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala 580 585 590 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 595 600 605 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 610 615 620 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 625 630 635 640 His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly 645 650 655 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 660 665 670 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 675 680 685 Gly Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg 690 695 700 Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu 705 710 715 720 Ala Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu 725 730 735 Gly Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu 740 745 750 Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr 755 760 765 Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu 770 775 780 Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly 785 790 795 800 Lys His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val 805 810 815 Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser 820 825 830 Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr 835 840 845 Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp 850 855 860 Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val 865 870 875 880 Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn 885 890 895 His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu 900 905 910 Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val 915 920 925 Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp 930 935 940 <210> 4 <211> 49 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(49) <223> CD38ex1_T4 target <400> 4 Thr Gly Cys Gly Ala Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly 1 5 10 15 Thr Gly Thr Cys Cys Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Ala Cys Cys 20 25 30 Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Cys Thr 35 40 45 Ala <210> 5 <211> 970 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38ex1_T4-L TALEN <400> 5 Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Tyr Pro Tyr Asp 1 5 10 15 Val Pro Asp Tyr Ala Ile Asp Ile Ala Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr 20 25 30 Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val 35 40 45 Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His 50 55 60 Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val 65 70 75 80 Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Ala 85 90 95 Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala 100 105 110 Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp 115 120 125 Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Val 130 135 140 Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn 145 150 155 160 Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys 165 170 175 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 180 185 190 His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly 195 200 205 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys 210 215 220 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His 225 230 235 240 Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 245 250 255 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 260 265 270 Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 275 280 285 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 290 295 300 Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 305 310 315 320 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 325 330 335 Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 340 345 350 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln 355 360 365 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 370 375 380 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 385 390 395 400 Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala 405 410 415 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 420 425 430 Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 435 440 445 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 450 455 460 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly 465 470 475 480 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 485 490 495 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 500 505 510 Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 515 520 525 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 530 535 540 Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 545 550 555 560 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala 565 570 575 Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 580 585 590 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 595 600 605 Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 610 615 620 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 625 630 635 640 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 645 650 655 Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 660 665 670 Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala 675 680 685 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 690 695 700 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg 705 710 715 720 Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro Ala 725 730 735 Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu Gly 740 745 750 Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly Asp Pro Ile 755 760 765 Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu 770 775 780 Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile 785 790 795 800 Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val 805 810 815 Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly 820 825 830 Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile 835 840 845 Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn 850 855 860 Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu Asn 865 870 875 880 Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr 885 890 895 Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe 900 905 910 Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn 915 920 925 Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu 930 935 940 Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe 945 950 955 960 Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp 965 970 <210> 6 <211> 942 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38ex1_T4-R TALEN <400> 6 Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Lys Glu Thr Ala 1 5 10 15 Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Ile Asp Ile Ala Asp 20 25 30 Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro 35 40 45 Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His 50 55 60 Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro 85 90 95 Glu Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly 100 105 110 Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly 115 120 125 Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg 130 135 140 Gly Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu 145 150 155 160 Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 165 170 175 Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 180 185 190 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 195 200 205 Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 210 215 220 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val 225 230 235 240 Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 245 250 255 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 260 265 270 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 275 280 285 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 290 295 300 Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala 305 310 315 320 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 325 330 335 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 340 345 350 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 355 360 365 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly 370 375 380 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 385 390 395 400 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 405 410 415 Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 420 425 430 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 435 440 445 Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu 450 455 460 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 465 470 475 480 Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 485 490 495 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 500 505 510 Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 515 520 525 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln 530 535 540 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 545 550 555 560 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 565 570 575 Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala 580 585 590 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 595 600 605 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 610 615 620 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 625 630 635 640 His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly 645 650 655 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 660 665 670 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 675 680 685 Ile Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg 690 695 700 Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu 705 710 715 720 Ala Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu 725 730 735 Gly Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu 740 745 750 Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr 755 760 765 Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu 770 775 780 Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly 785 790 795 800 Lys His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val 805 810 815 Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser 820 825 830 Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr 835 840 845 Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp 850 855 860 Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val 865 870 875 880 Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn 885 890 895 His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu 900 905 910 Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val 915 920 925 Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp 930 935 940 <210> 7 <211> 49 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(49) <223> CD38ex1_T5 <400> 7 Thr Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Gly Thr Cys Gly Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Cys Thr Cys Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Thr Cys Gly Thr Cys 20 25 30 Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys 35 40 45 Ala <210> 8 <211> 936 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38ex1_T5-L TALEN <400> 8 Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Tyr Pro Tyr Asp 1 5 10 15 Val Pro Asp Tyr Ala Ile Asp Ile Ala Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr 20 25 30 Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val 35 40 45 Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His 50 55 60 Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val 65 70 75 80 Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Ala 85 90 95 Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala 100 105 110 Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp 115 120 125 Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Val 130 135 140 Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn 145 150 155 160 Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys 165 170 175 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 180 185 190 His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly 195 200 205 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys 210 215 220 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 225 230 235 240 Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 245 250 255 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 260 265 270 Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 275 280 285 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 290 295 300 Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 305 310 315 320 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 325 330 335 Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 340 345 350 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln 355 360 365 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 370 375 380 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 385 390 395 400 Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala 405 410 415 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 420 425 430 Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys 435 440 445 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 450 455 460 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly 465 470 475 480 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 485 490 495 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His 500 505 510 Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 515 520 525 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 530 535 540 Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 545 550 555 560 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala 565 570 575 Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 580 585 590 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 595 600 605 Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 610 615 620 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 625 630 635 640 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 645 650 655 Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 660 665 670 Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala 675 680 685 Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro Ala Leu Ala 690 695 700 Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu Gly Gly Arg 705 710 715 720 Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly Asp Pro Ile Ser Arg 725 730 735 Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg 740 745 750 His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile 755 760 765 Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu 770 775 780 Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser 785 790 795 800 Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr 805 810 815 Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro 820 825 830 Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr 835 840 845 Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser 850 855 860 Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly 865 870 875 880 Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn 885 890 895 Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile 900 905 910 Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn 915 920 925 Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp 930 935 <210> 9 <211> 942 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38ex1_T5-R TALEN <400> 9 Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Lys Glu Thr Ala 1 5 10 15 Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Ile Asp Ile Ala Asp 20 25 30 Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro 35 40 45 Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His 50 55 60 Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro 85 90 95 Glu Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly 100 105 110 Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly 115 120 125 Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg 130 135 140 Gly Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu 145 150 155 160 Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 165 170 175 Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 180 185 190 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 195 200 205 Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 210 215 220 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val 225 230 235 240 Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 245 250 255 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 260 265 270 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 275 280 285 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 290 295 300 Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala 305 310 315 320 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 325 330 335 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys 340 345 350 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 355 360 365 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly 370 375 380 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 385 390 395 400 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 405 410 415 Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 420 425 430 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 435 440 445 Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu 450 455 460 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 465 470 475 480 Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 485 490 495 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 500 505 510 Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 515 520 525 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln 530 535 540 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 545 550 555 560 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 565 570 575 Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala 580 585 590 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 595 600 605 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys 610 615 620 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 625 630 635 640 His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly 645 650 655 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 660 665 670 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 675 680 685 Ile Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg 690 695 700 Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu 705 710 715 720 Ala Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu 725 730 735 Gly Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu 740 745 750 Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr 755 760 765 Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu 770 775 780 Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly 785 790 795 800 Lys His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val 805 810 815 Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser 820 825 830 Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr 835 840 845 Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp 850 855 860 Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val 865 870 875 880 Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn 885 890 895 His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu 900 905 910 Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val 915 920 925 Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp 930 935 940 <210> 10 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Daratumumab-VH chain <400> 10 Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 35 40 45 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 11 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Daratumumab-VL chain <400> 11 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 12 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOR202-VH chain <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Asp Pro Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Pro Leu Val Tyr Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOR202-VL chain <400> 13 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg His Tyr Tyr Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Thr Gly Gly Ala Ser Leu 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1-1 - VH chain <400> 14 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1-2 - VH chain <400> 15 Ser Tyr Tyr Met Asn 1 5 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 - VH chain <400> 16 Gly Ile Ser Gly Asp Pro Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 - VH chain <400> 17 Asp Leu Pro Leu Val Tyr Thr Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR4 - VH chain <400> 18 Asp Tyr Trp Met Gln 1 5 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR5 - VH chain <400> 19 Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR6 - VH chain <400> 20 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 - VH chain <400> 21 Ser Gly Asp Asn Leu Arg His Tyr Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 - VH chain <400> 22 Gly Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 - VH chain <400> 23 Gln Thr Tyr Thr Gly Gly Ala Ser Leu 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR4 - VH chain <400> 24 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val Val Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR5 - VH chain <400> 25 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR6 - VH chain <400> 26 Gln Gln His Ser Pro Pro Tyr Thr 1 5 <210> 27 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8&#945;-Signal peptide (SP) <400> 27 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <400> 28 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> FCRII&#945; hinge <400> 29 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 30 <211> 69 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(69) <223> CD8&#945; hinge <400> 30 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 35 40 45 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 50 55 60 Ile Thr Leu Tyr Cys 65 <210> 31 <211> 231 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(231) <223> IgG1 hinge <400> 31 Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 32 <211> 24 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> TM domain <400> 32 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 33 <211> 42 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(42) <223> 4-1 BB co-stimulatory domain <400> 33 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 34 <211> 112 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(112) <223> CD3&#950; activation domain <400> 34 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 35 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GMB005-V1 CAR <400> 35 Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu 1 5 10 15 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 20 25 30 Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala Met Ser Trp Val 35 40 45 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 65 70 75 80 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 85 90 95 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Lys Asp Lys Ile 100 105 110 Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 115 120 125 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr 145 150 155 160 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser 165 170 175 Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 180 185 190 Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile 195 200 205 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 225 230 235 240 Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 245 250 255 Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr 260 265 270 Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu 275 280 285 Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu 290 295 300 Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln 305 310 315 320 Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly 325 330 335 Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 340 345 350 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 355 360 365 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 370 375 380 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 385 390 395 400 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 405 410 415 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 420 425 430 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 435 440 <210> 36 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GMB005-V2 CAR <400> 36 Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu 1 5 10 15 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 20 25 30 Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala Met Ser Trp Val 35 40 45 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 65 70 75 80 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 85 90 95 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Lys Asp Lys Ile 100 105 110 Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 115 120 125 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr 145 150 155 160 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser 165 170 175 Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 180 185 190 Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile 195 200 205 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 225 230 235 240 Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 245 250 255 Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 260 265 270 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 275 280 285 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 290 295 300 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 305 310 315 320 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 325 330 335 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 340 345 350 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 355 360 365 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 370 375 380 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 385 390 395 400 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 405 410 415 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 420 425 430 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 435 440 445 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 450 455 460 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 465 470 <210> 37 <211> 657 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GMB005-V3 CAR <400> 37 Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu 1 5 10 15 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 20 25 30 Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala Met Ser Trp Val 35 40 45 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 65 70 75 80 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 85 90 95 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Lys Asp Lys Ile 100 105 110 Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 115 120 125 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr 145 150 155 160 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser 165 170 175 Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 180 185 190 Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile 195 200 205 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 225 230 235 240 Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 245 250 255 Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 260 265 270 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 275 280 285 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 290 295 300 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 305 310 315 320 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 325 330 335 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 340 345 350 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 355 360 365 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 370 375 380 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 385 390 395 400 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 405 410 415 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 420 425 430 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 435 440 445 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 450 455 460 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 465 470 475 480 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 485 490 495 Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 500 505 510 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 515 520 525 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 530 535 540 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 545 550 555 560 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 565 570 575 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 580 585 590 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 595 600 605 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 610 615 620 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 625 630 635 640 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 645 650 655 Ala <210> 38 <211> 119 <212> PRT <213> mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(119) <223> Luc63-VH chain <400> 38 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 107 <212> PRT <213> mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(107) <223> Luc63-VL chain <400> 39 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 40 <211> 120 <212> PRT <213> mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(40) <223> Luc90-VH chain <400> 40 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(107) <223> Luc90-VL chain <400> 41 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Ser Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Thr Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 42 <211> 121 <212> PRT <213> mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(121) <223> Luc34-VH chain <400> 42 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Lys Val Tyr Tyr Gly Ser Asn Pro Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(107) <223> Luc34-VL chain <400> 43 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 44 <211> 120 <212> PRT <213> mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(120) <223> LucX1-VH chain <400> 44 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 45 <211> 107 <212> PRT <213> mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(107) <223> LucX1-VL chain <400> 45 Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Met Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 46 <211> 120 <212> PRT <213> mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(120) <223> LucX2-VH chain <400> 46 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 47 <211> 108 <212> PRT <213> mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(108) <223> LucX2-VL chain <400> 47 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 48 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc63-V1 CAR <400> 48 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Asp Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn 65 70 75 80 Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp 115 120 125 Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr 145 150 155 160 Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile 165 170 175 Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Ala Val Ala Trp Tyr Gln 180 185 190 Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 195 200 205 Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr 210 215 220 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp 225 230 235 240 Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 245 250 255 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe 260 265 270 Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 275 280 285 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 290 295 300 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 305 310 315 320 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 325 330 335 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 340 345 350 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 355 360 365 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 370 375 380 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 385 390 395 400 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 405 410 415 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 420 425 430 <210> 49 <211> 485 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc63-V2 CAR <400> 49 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Asp Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn 65 70 75 80 Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp 115 120 125 Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr 145 150 155 160 Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile 165 170 175 Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Ala Val Ala Trp Tyr Gln 180 185 190 Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 195 200 205 Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr 210 215 220 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp 225 230 235 240 Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 245 250 255 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 260 265 270 Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 275 280 285 Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe 290 295 300 Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val 305 310 315 320 Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys 325 330 335 Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu 355 360 365 Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro 370 375 380 Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly 385 390 395 400 Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro 405 410 415 Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr 420 425 430 Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly 435 440 445 Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln 450 455 460 Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln 465 470 475 480 Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 50 <211> 647 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc63-V3 CAR <400> 50 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Asp Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn 65 70 75 80 Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp 115 120 125 Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr 145 150 155 160 Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile 165 170 175 Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Ala Val Ala Trp Tyr Gln 180 185 190 Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 195 200 205 Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr 210 215 220 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp 225 230 235 240 Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 245 250 255 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr 260 265 270 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 275 280 285 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu 290 295 300 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 305 310 315 320 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 325 330 335 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 340 345 350 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 355 360 365 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 370 375 380 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 385 390 395 400 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 405 410 415 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 420 425 430 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 435 440 445 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 450 455 460 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 465 470 475 480 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Arg Gly 485 490 495 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 500 505 510 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 515 520 525 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 530 535 540 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 545 550 555 560 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 565 570 575 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 580 585 590 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 595 600 605 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 610 615 620 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 625 630 635 640 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 645 <210> 51 <211> 433 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc90-V1 CAR <400> 51 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu 20 25 30 Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ser Phe Thr Thr Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg 65 70 75 80 Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Arg Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Gln Lys Ser Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser 165 170 175 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Thr Gly Val Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 195 200 205 Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala 245 250 255 Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser 260 265 270 Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 275 280 285 Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu 290 295 300 Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 305 310 315 320 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 325 330 335 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 340 345 350 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 355 360 365 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 370 375 380 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 385 390 395 400 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 405 410 415 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 420 425 430 Arg <210> 52 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc90-V2 CAR <400> 52 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu 20 25 30 Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ser Phe Thr Thr Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg 65 70 75 80 Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Arg Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Gln Lys Ser Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser 165 170 175 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Thr Gly Val Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 195 200 205 Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala 245 250 255 Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 53 <211> 648 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc90-V3 CAR <400> 53 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu 20 25 30 Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ser Phe Thr Thr Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg 65 70 75 80 Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Arg Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Gln Lys Ser Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser 165 170 175 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Thr Gly Val Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 195 200 205 Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala 245 250 255 Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His 260 265 270 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 275 280 285 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro 290 295 300 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 305 310 315 320 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 325 330 335 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 340 345 350 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 355 360 365 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 370 375 380 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 385 390 395 400 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 405 410 415 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 420 425 430 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 435 440 445 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 450 455 460 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 465 470 475 480 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Arg 485 490 495 Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro 500 505 510 Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu 515 520 525 Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 530 535 540 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 545 550 555 560 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 565 570 575 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu 580 585 590 Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser 595 600 605 Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly 610 615 620 Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu 625 630 635 640 His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 645 <210> 54 <211> 434 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc34-V1 CAR <400> 54 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 20 25 30 Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg 65 70 75 80 Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys Val Tyr Tyr Gly Ser Asn Pro 115 120 125 Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 145 150 155 160 Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly Gly Arg Val 165 170 175 Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp Leu Ala Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala 195 200 205 Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser 260 265 270 Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 275 280 285 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu 290 295 300 Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys 305 310 315 320 Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 325 330 335 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 340 345 350 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 355 360 365 Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 370 375 380 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 385 390 395 400 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 405 410 415 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 420 425 430 Pro Arg <210> 55 <211> 487 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc34-V2 CAR <400> 55 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 20 25 30 Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg 65 70 75 80 Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys Val Tyr Tyr Gly Ser Asn Pro 115 120 125 Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 145 150 155 160 Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly Gly Arg Val 165 170 175 Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp Leu Ala Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala 195 200 205 Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 260 265 270 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 275 280 285 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 290 295 300 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly 325 330 335 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 340 345 350 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 355 360 365 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 370 375 380 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 385 390 395 400 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 405 410 415 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 420 425 430 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 435 440 445 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 450 455 460 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 465 470 475 480 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 56 <211> 649 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc34-V3 CAR <400> 56 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 20 25 30 Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg 65 70 75 80 Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys Val Tyr Tyr Gly Ser Asn Pro 115 120 125 Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 145 150 155 160 Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly Gly Arg Val 165 170 175 Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp Leu Ala Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala 195 200 205 Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr 260 265 270 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 275 280 285 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr 290 295 300 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 305 310 315 320 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 325 330 335 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 340 345 350 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 355 360 365 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 370 375 380 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 385 390 395 400 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 405 410 415 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 420 425 430 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 435 440 445 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 450 455 460 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 465 470 475 480 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys 485 490 495 Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg 500 505 510 Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro 515 520 525 Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 530 535 540 Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu 545 550 555 560 Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg 565 570 575 Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln 580 585 590 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 595 600 605 Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 610 615 620 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 625 630 635 640 Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 645 <210> 57 <211> 433 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LucX1-V1 CAR <400> 57 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 20 25 30 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys 65 70 75 80 Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Gly Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr Thr Val 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly Glu Lys Val Thr 165 170 175 Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Glu Gly Asn 195 200 205 Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Tyr Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Met Leu Ser Glu Asp Val Ala 225 230 235 240 Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser 260 265 270 Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 275 280 285 Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu 290 295 300 Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 305 310 315 320 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 325 330 335 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 340 345 350 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 355 360 365 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 370 375 380 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 385 390 395 400 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 405 410 415 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 420 425 430 Arg <210> 58 <211> 487 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LucX1-V2 CAR <400> 58 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 20 25 30 Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg 65 70 75 80 Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys Val Tyr Tyr Gly Ser Asn Pro 115 120 125 Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 145 150 155 160 Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly Gly Arg Val 165 170 175 Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp Leu Ala Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala 195 200 205 Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 260 265 270 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 275 280 285 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 290 295 300 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly 325 330 335 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 340 345 350 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 355 360 365 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 370 375 380 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 385 390 395 400 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 405 410 415 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 420 425 430 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 435 440 445 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 450 455 460 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 465 470 475 480 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 59 <211> 648 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LucX1-V3 CAR <400> 59 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 20 25 30 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys 65 70 75 80 Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Gly Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr Thr Val 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly Glu Lys Val Thr 165 170 175 Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Glu Gly Asn 195 200 205 Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Tyr Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Met Leu Ser Glu Asp Val Ala 225 230 235 240 Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His 260 265 270 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 275 280 285 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro 290 295 300 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 305 310 315 320 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 325 330 335 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 340 345 350 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 355 360 365 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 370 375 380 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 385 390 395 400 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 405 410 415 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 420 425 430 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 435 440 445 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 450 455 460 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 465 470 475 480 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Arg 485 490 495 Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro 500 505 510 Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu 515 520 525 Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 530 535 540 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 545 550 555 560 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 565 570 575 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu 580 585 590 Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser 595 600 605 Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly 610 615 620 Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu 625 630 635 640 His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 645 <210> 60 <211> 434 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LucX2-V1 CAR <400> 60 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 20 25 30 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys 65 70 75 80 Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Gly Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser 165 170 175 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 195 200 205 Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Tyr Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser 260 265 270 Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 275 280 285 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu 290 295 300 Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys 305 310 315 320 Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 325 330 335 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 340 345 350 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 355 360 365 Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 370 375 380 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 385 390 395 400 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 405 410 415 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 420 425 430 Pro Arg <210> 61 <211> 487 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LucX2-V2 CAR <400> 61 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 20 25 30 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys 65 70 75 80 Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Gly Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser 165 170 175 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 195 200 205 Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Tyr Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 260 265 270 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 275 280 285 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 290 295 300 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly 325 330 335 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 340 345 350 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 355 360 365 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 370 375 380 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 385 390 395 400 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 405 410 415 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 420 425 430 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 435 440 445 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 450 455 460 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 465 470 475 480 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 62 <211> 649 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LucX2-V3 CAR <400> 62 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 20 25 30 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys 65 70 75 80 Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Gly Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser 165 170 175 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 195 200 205 Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Tyr Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr 260 265 270 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 275 280 285 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr 290 295 300 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 305 310 315 320 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 325 330 335 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 340 345 350 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 355 360 365 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 370 375 380 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 385 390 395 400 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 405 410 415 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 420 425 430 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 435 440 445 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 450 455 460 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 465 470 475 480 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys 485 490 495 Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg 500 505 510 Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro 515 520 525 Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 530 535 540 Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu 545 550 555 560 Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg 565 570 575 Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln 580 585 590 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 595 600 605 Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 610 615 620 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 625 630 635 640 Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 645 <210> 63 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CS1 T01 left TALE <400> 63 tgacttccag agagcaatat ggctggttcc ccaacatgcc tcaccctca 49 <210> 64 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CS1 T01 left TALE <400> 64 tgacttccag agagcaa 17 <210> 65 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CS1 T01 right TALE <400> 65 aacatgcctc accctca 17 <210> 66 <211> 49 <212> DNA <213> homosapiens <400> 66 ttccagagag caatatggct ggttccccaa catgcctcac cctcatcta 49 <210> 67 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CS1 T02 left TALE <400> 67 ttccagagag caatatg 17 <210> 68 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CS1 T02 right TALE <400> 68 tgcctcaccc tcatcta 17 <210> 69 <211> 49 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 69 ttgactctat tgtctggacc ttcaacacaa cccctcttgt caccataca 49 <210> 70 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CS1 T03 left TALE <400> 70 ttgactctat tgtctgg 17 <210> 71 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CS1 T03 right TALE <400> 71 cctcttgtca ccataca 17 <210> 72 <211> 49 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 72 tggtcttttc ttccagtggg acgtagctga gctgcagctg aatcacaca 49 <210> 73 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD70 Target 1-left TALE <400> 73 tggtcttttc ttccagt 17 <210> 74 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD70 Target 1-right TALE <400> 74 tgcagctgaa tcacaca 17 <210> 75 <211> 49 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 75 tggtgatctg cctcgtggtg tgcatccagc gcttcgcaca ggctcagca 49 <210> 76 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD70 Target 2-left TALE <400> 76 tggtgatctg cctcgtg 17 <210> 77 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD70 Target 2-right TALE <400> 77 ttcgcacagg ctcagca 17 <210> 78 <211> 57 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 78 tgcgggctgc tttggtccca ttggtcgcgg gcttggtgat ctgcctcgtg gtgtgca 57 <210> 79 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD70 Target 3-left TALE <400> 79 tgcgggctgc tttggtc 17 <210> 80 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD70 Target 3-right TALE <400> 80 ctgcctcgtg gtgtgca 17 <210> 81 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab4-VH chain <400> 81 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 82 <211> 1358 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab4-VH chain <400> 82 aggtgcagct ggtggagtct gggggaggcg tggtccagcc tgggaggtcc ctgagactct 60 cctgtgcagc gtctggattc accttcagta actatggcat acactgggtc cgccaggctc 120 caggcaaggg gctggagtgg gtggcagtta tatggtatga tggaagtaat aaatactatg 180 cagactccgt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac acgctgtatc 240 tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggctgtgta ttactgtgcg agagatggag 300 gatatagtgg ctacgattcg gggtttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct 360 cctcagctag caccaagggc ccatccgtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct 420 ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg 480 tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt 540 cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc 600 agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg 660 agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg 720 ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga 780 cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca 840 actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt 900 acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg 960 gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca 1020 tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg 1080 aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg 1140 acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc 1200 ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca 1260 ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact 1320 acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 1358 <210> 83 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab4-VL chain <400> 83 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Phe Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ile Gln Thr 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 <210> 84 <211> 1476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab4-VL chain <400> 84 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg aatagtaatg gatacaacta tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ttcctgatct atttgggttc ttatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgagaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgta tacaaactct acaaactcca 300 ttcactttcg gccctgggac caaagtggat atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 720 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 780 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 840 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 900 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 960 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1260 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1380 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1476 <210> 85 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab8-VH chain <400> 85 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Phe Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ile Ala Gly Ala Arg Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 86 <211> 560 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab8-VH chain <400> 86 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtga taaatacttt 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatggg 300 atagcaggag ctcgctacgt ctactttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcagcta gcaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct 560 <210> 87 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab8-VL chain <400> 87 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Thr Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 88 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab8-VL chain <400> 88 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaggtgg ggtcccatca 180 aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacaa tattataatt acccattcac tttcggccct 300 gggaccacag tggatatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 89 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 1F6-VH chain <400> 89 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ala Phe Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 90 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 1F6-VH chain <400> 90 atggcttggg tgtggacctt gctattcctg atggcagctg cccaaagtgc ccaagcacag 60 atccagttgg tgcagtctgg acctgaggtg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120 tgcaaggctt ctgggtatac cttcacaaac tatggaatga actgggtgaa gcaggctcca 180 ggaaagggtt taaagtggat gggctggata aacacctaca ctggagagcc aacatatgct 240 gatgccttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgcctatttg 300 cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgcaag agactacggc 360 gactatggta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 411 <210> 91 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 1F6-VL chain <400> 91 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 92 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 1F6-VL chain <400> 92 atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120 atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttttat gcactggtat 180 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 240 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga ggttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgg 396 <210> 93 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab4-V1 CAR <400> 93 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 20 25 30 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser 115 120 125 Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 145 150 155 160 Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro 165 170 175 Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly 180 185 190 Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln 195 200 205 Phe Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg 210 215 220 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg 225 230 235 240 Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ile Gln Thr Leu Gln 245 250 255 Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Leu 260 265 270 Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr 275 280 285 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 290 295 300 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 305 310 315 320 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 325 330 335 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 340 345 350 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 355 360 365 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 370 375 380 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 385 390 395 400 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 405 410 415 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 420 425 430 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 435 440 445 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 450 455 460 <210> 94 <211> 493 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab4-V2 CAR <400> 94 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 20 25 30 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser 115 120 125 Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 145 150 155 160 Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro 165 170 175 Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly 180 185 190 Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln 195 200 205 Phe Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg 210 215 220 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg 225 230 235 240 Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ile Gln Thr Leu Gln 245 250 255 Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Thr Thr 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln 275 280 285 Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala 290 295 300 Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala 305 310 315 320 Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr 325 330 335 Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln 340 345 350 Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser 355 360 365 Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys 370 375 380 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln 385 390 395 400 Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 405 410 415 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg 420 425 430 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 435 440 445 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 450 455 460 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 465 470 475 480 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 490 <210> 95 <211> 584 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab4-V3 CAR <400> 95 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 20 25 30 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser 115 120 125 Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 145 150 155 160 Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro 165 170 175 Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly 180 185 190 Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln 195 200 205 Phe Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg 210 215 220 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg 225 230 235 240 Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ile Gln Thr Leu Gln 245 250 255 Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Glu Pro 260 265 270 Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro 275 280 285 Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 290 295 300 Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 305 310 315 320 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 325 330 335 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 340 345 350 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 355 360 365 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 370 375 380 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 385 390 395 400 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 405 410 415 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 420 425 430 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 435 440 445 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 450 455 460 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 465 470 475 480 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 485 490 495 Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 500 505 510 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly 515 520 525 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 530 535 540 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 545 550 555 560 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 565 570 575 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln 580 <210> 96 <211> 459 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab8-V1 CAR <400> 96 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 20 25 30 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr 65 70 75 80 Phe Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Ile Ala Gly Ala Arg Tyr Val 115 120 125 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 145 150 155 160 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 165 170 175 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 180 185 190 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala 195 200 205 Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 225 230 235 240 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Phe 245 250 255 Gly Pro Gly Thr Thr Val Asp Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile 260 265 270 Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu 275 280 285 Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr 290 295 300 Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe 305 310 315 320 Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg 325 330 335 Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser 340 345 350 Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 355 360 365 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 370 375 380 Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn 385 390 395 400 Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 405 410 415 Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 420 425 430 His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 435 440 445 Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 450 455 <210> 97 <211> 488 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab8-V2 CAR <400> 97 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 20 25 30 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr 65 70 75 80 Phe Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Ile Ala Gly Ala Arg Tyr Val 115 120 125 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 145 150 155 160 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 165 170 175 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 180 185 190 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala 195 200 205 Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 225 230 235 240 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Phe 245 250 255 Gly Pro Gly Thr Thr Val Asp Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg 260 265 270 Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg 275 280 285 Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly 290 295 300 Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr 305 310 315 320 Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg 325 330 335 Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro 340 345 350 Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu 355 360 365 Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 370 375 380 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 385 390 395 400 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 405 410 415 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu 420 425 430 Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser 435 440 445 Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly 450 455 460 Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu 465 470 475 480 His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 98 <211> 674 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 Ab8-V3 CAR <400> 98 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 20 25 30 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr 65 70 75 80 Phe Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Ile Ala Gly Ala Arg Tyr Val 115 120 125 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 145 150 155 160 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 165 170 175 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 180 185 190 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala 195 200 205 Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 225 230 235 240 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Phe 245 250 255 Gly Pro Gly Thr Thr Val Asp Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys 260 265 270 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 275 280 285 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg 290 295 300 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 305 310 315 320 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 325 330 335 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 340 345 350 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 355 360 365 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 370 375 380 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 385 390 395 400 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 405 410 415 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 420 425 430 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 435 440 445 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 450 455 460 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 465 470 475 480 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 490 495 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 500 505 510 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 515 520 525 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu 530 535 540 Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys 545 550 555 560 Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 565 570 575 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 580 585 590 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 595 600 605 Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 610 615 620 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 625 630 635 640 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 645 650 655 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 660 665 670 Pro Arg <210> 99 <211> 459 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 1F6-V1 CAR <400> 99 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Lys Trp Met Gly Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Ala Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala 85 90 95 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 145 150 155 160 Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys 165 170 175 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala 195 200 205 Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile 260 265 270 Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu 275 280 285 Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr 290 295 300 Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe 305 310 315 320 Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg 325 330 335 Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser 340 345 350 Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 355 360 365 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 370 375 380 Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn 385 390 395 400 Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 405 410 415 Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 420 425 430 His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 435 440 445 Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 450 455 <210> 100 <211> 488 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 1F6-V2 CAR <400> 100 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Lys Trp Met Gly Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Ala Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala 85 90 95 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 145 150 155 160 Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys 165 170 175 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala 195 200 205 Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg 260 265 270 Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg 275 280 285 Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly 290 295 300 Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr 305 310 315 320 Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg 325 330 335 Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro 340 345 350 Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu 355 360 365 Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 370 375 380 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 385 390 395 400 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 405 410 415 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu 420 425 430 Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser 435 440 445 Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly 450 455 460 Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu 465 470 475 480 His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 101 <211> 674 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD70 1F6-V3 CAR <400> 101 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Lys Trp Met Gly Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Ala Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala 85 90 95 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 145 150 155 160 Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys 165 170 175 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala 195 200 205 Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys 260 265 270 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 275 280 285 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg 290 295 300 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 305 310 315 320 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 325 330 335 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 340 345 350 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 355 360 365 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 370 375 380 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 385 390 395 400 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 405 410 415 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 420 425 430 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 435 440 445 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 450 455 460 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 465 470 475 480 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 490 495 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 500 505 510 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 515 520 525 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu 530 535 540 Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys 545 550 555 560 Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 565 570 575 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 580 585 590 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 595 600 605 Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 610 615 620 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 625 630 635 640 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 645 650 655 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 660 665 670 Pro Arg <210> 102 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 gagaatcaaa atcggtgaat agg 23 <210> 103 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 ttcaaaacct gtcagtgatt ggg 23 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 tgtgctagac atgaggtcta tgg 23 <210> 105 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 cgtcatgagc agattaaacc cgg 23 <210> 106 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 tcagggttct ggatatctgt ggg 23 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 gtcagggttc tggatatctg tgg 23 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 ttcggaaccc aatcactgac agg 23 <210> 109 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 taaacccggc cactttcagg agg 23 <210> 110 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 aaagtcagat ttgttgctcc agg 23 <210> 111 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 aacaaatgtg tcacaaagta agg 23 <210> 112 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 112 tggatttaga gtctctcagc tgg 23 <210> 113 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 taggcagaca gacttgtcac tgg 23 <210> 114 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 114 agctggtaca cggcagggtc agg 23 <210> 115 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 gctggtacac ggcagggtca ggg 23 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 tctctcagct ggtacacggc agg 23 <210> 117 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 tttcaaaacc tgtcagtgat tgg 23 <210> 118 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 gattaaaccc ggccactttc agg 23 <210> 119 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 ctcgaccagc ttgacatcac agg 23 <210> 120 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 agagtctctc agctggtaca cgg 23 <210> 121 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 ctctcagctg gtacacggca ggg 23 <210> 122 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 122 aagttcctgt gatgtcaagc tgg 23 <210> 123 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 atcctcctcc tgaaagtggc cgg 23 <210> 124 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 tgctcatgac gctgcggctg tgg 23 <210> 125 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 acaaaactgt gctagacatg agg 23 <210> 126 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 126 atttgtttga gaatcaaaat cgg 23 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 127 catcacagga actttctaaa agg 23 <210> 128 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 128 gtcgagaaaa gctttgaaac agg 23 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 129 ccactttcag gaggaggatt cgg 23 <210> 130 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 130 ctgacaggtt ttgaaagttt agg 23 <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 agctttgaaa caggtaagac agg 23 <210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 tggaataatg ctgttgttga agg 23 <210> 133 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133 agagcaacag tgctgtggcc tgg 23 <210> 134 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 ctgtggtcca gctgaggtga ggg 23 <210> 135 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 135 ctgcggctgt ggtccagctg agg 23 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 136 tgtggtccag ctgaggtgag ggg 23 <210> 137 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 cttcttcccc agcccaggta agg 23 <210> 138 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 138 acacggcagg gtcagggttc tgg 23 <210> 139 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 cttcaagagc aacagtgctg tgg 23 <210> 140 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 140 ctggggaaga aggtgtcttc tgg 23 <210> 141 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141 tcctcctcct gaaagtggcc ggg 23 <210> 142 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 142 ttaatctgct catgacgctg cgg 23 <210> 143 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 acccggccac tttcaggagg agg 23 <210> 144 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 144 ttcttcccca gcccaggtaa ggg 23 <210> 145 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 cttacctggg ctggggaaga agg 23 <210> 146 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 gacaccttct tccccagccc agg 23 <210> 147 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 gctgtggtcc agctgaggtg agg 23 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 148 ccgaatcctc ctcctgaaag tgg 23

Claims (43)

  1. 하기 단계를 포함하는, 병리(pathological) 세포들에 대항하여 면역치료를 위한 T-세포들을 제조(preparing)하는 엑스 비보(ex vivo) 방법:
    (a) T-세포에서 유전자를 유전적으로 불활성화시키는 단계로, 상기 유전자는 항원 마커를 코드하고, 상기 항원 마커는 상기 T-세포 및 병리 세포의 표면 위(on) 둘 다에 존재하는, 단계;
    (b) 상기 병리 세포의 표면에 존재하는 상기 항원 마커에 대항하여 향해진 키메라 항원 수용체를 코드하는 이식유전자를 상기 T-세포 내로 발현시키는 단계.
  2. 제 1항에 있어서,
    단계 a)는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 이용하여 수행되는 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 엔도뉴클레아제는 형질주입된 mRNA로부터 발현되는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은 T-세포 수용체 (TCR)의 요소를 코드하는 유전자를 불활성화시키는 추가의 단계를 포함하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은 HLA의 요소를 코드하는 유전자를 불활성화시키는 추가의 단계를 포함하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은 β2m을 코드하는 유전자를 불활성화시키는 추가의 단계를 포함하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은 CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 및 GUCY1B3 로부터 선택되는 면역 체크포인트 단백질을 코드하는 유전자를 불활성화시키는 추가의 단계를 포함하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은 CD52, 하이포잔틴(hypoxanthine)-구아닌(guanine) 포스포리보실트랜스페라제(phosphoribosyltransferase) (HPRT), 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 수용체(receptor) (GR), 디하이드로폴레이트(dihydrofolate) 환원효소(reductase) (DHFR), 이노신(inosine) 모노포스페이트(monophosphate) 디하이드로게나제(dehydrogenase) 2 (IMPDH2), 칼시뉴린(calcineurin) 또는 메틸구아닌(methylguanine) 트랜스페라제(transferase) (MGMT)를 코드하는 유전자를 불활성화시키는 추가의 단계를 포함하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    단계 a)에서 상기 T-세포는 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T-림프구 또는 헬퍼 T-림프구로부터 유래되는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 방법에 따라 수득가능한 조작된(engineered) T-세포로, 상기 T-세포 및 병리 세포의 표면 상 둘 다에 존재하는, 항원 마커를 코드하는 유전자가 유전적으로 불활성화되고, 이로써 상기 T-세포의 표면 상 상기 항원 마커의 부존재를 야기하고; 그리고 상기 T-세포가 상기 병리 세포의 표면에 존재하는 상기 항원 마커에 대항하여 향해진 키메라 항원 수용체를 발현시키는, 조작된 T-세포.
  11. 표현형 [CAR CD38]+[CD38]-를 야기하는, 제 10항에 따른 조작된 T-세포.
  12. 표현형 [CAR CD70]+[CD70]-를 야기하는, 제 10항에 따른 조작된 T-세포.
  13. 표현형 [CAR CS1]+[CS1]-를 야기하는, 제 10항에 따른 조작된 T-세포.
  14. T-세포들과 공동으로 특정 항원 마커들을 제시하는 병리 세포들의 존재에 대하여 진단받은 환자를 치료하는데 사용을 위한 제 10항에 따른 조작된 T-세포들의 집단(population).
  15. T-세포들과 공동으로 특정 항원 마커들을 제시하는 병리 세포들의 존재에 대하여 진단받은 환자를 치료하는데 사용을 위한 제 11항에 따른 조작된 T-세포들의 집단(population).
  16. T-세포들과 공동으로 특정 항원 마커들을 제시하는 병리 세포들의 존재에 대하여 진단받은 환자를 치료하는데 사용을 위한 제 12항에 따른 조작된 T-세포들의 집단(population).
  17. T-세포들과 공동으로 특정 항원 마커들을 제시하는 병리 세포들의 존재에 대하여 진단받은 환자를 치료하는데 사용을 위한 제 13항에 따른 조작된 T-세포들의 집단(population).



  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
KR1020167025575A 2014-02-14 2015-02-13 면역 세포들 및 병리 세포들 둘 다에 존재하는 항원을 타겟팅하기 위하여 조작된 면역치료용 세포들 KR102157924B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201470076 2014-02-14
DKPA201470076 2014-02-14
PCT/EP2015/053162 WO2015121454A1 (en) 2014-02-14 2015-02-13 Cells for immunotherapy engineered for targeting antigen present both on immune cells and pathological cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160138404A KR20160138404A (ko) 2016-12-05
KR102157924B1 true KR102157924B1 (ko) 2020-10-26

Family

ID=50114255

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167025575A KR102157924B1 (ko) 2014-02-14 2015-02-13 면역 세포들 및 병리 세포들 둘 다에 존재하는 항원을 타겟팅하기 위하여 조작된 면역치료용 세포들

Country Status (19)

Country Link
US (3) US10836998B2 (ko)
EP (2) EP3105317B1 (ko)
JP (1) JP6673838B2 (ko)
KR (1) KR102157924B1 (ko)
CN (1) CN106029875A (ko)
AU (1) AU2015216875B2 (ko)
BR (1) BR112016017806B1 (ko)
CA (1) CA2937711C (ko)
DK (1) DK3105317T3 (ko)
ES (1) ES2711498T3 (ko)
HU (1) HUE041497T2 (ko)
IL (1) IL246645B (ko)
MX (1) MX2016010345A (ko)
NO (1) NO20161276A1 (ko)
PL (1) PL3105317T3 (ko)
PT (1) PT3105317T (ko)
RU (1) RU2714258C2 (ko)
TR (1) TR201819571T4 (ko)
WO (1) WO2015121454A1 (ko)

Families Citing this family (142)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
KR102523466B1 (ko) 2013-11-07 2023-04-20 에디타스 메디신, 인코포레이티드 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물
MX2016006177A (es) * 2013-11-22 2016-08-19 Cellectis Método para diseñar células t resistentes a fármacos de quimioterapia para inmunoterapia.
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
US9732154B2 (en) 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
CA2954414A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Juno Therapeutics, Inc. Engineered cells for adoptive cell therapy
KR102594343B1 (ko) * 2014-07-21 2023-10-26 노파르티스 아게 Cd33 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
EP3025719B1 (en) 2014-11-26 2018-09-26 Miltenyi Biotec GmbH Combination immunotherapy of antigen-recognizing receptors and hematopoietic cells for the treatment of diseases
JP7098325B2 (ja) 2014-12-05 2022-07-11 シティ・オブ・ホープ Ｃｓ１標的化キメラ抗原レセプター改変ｔ細胞
US11384350B2 (en) 2014-12-15 2022-07-12 The Regents Of The University Of California Cytotoxic molecules responsive to intracellular ligands for selective T cell mediated killing
KR20170135824A (ko) 2015-01-26 2017-12-08 셀렉티스 출아형 원형질 세포의 수지상 세포 신생물 또는 재발된/난치성 급성 골수성 림프종의 치료를 위한 cd123에 결합하는 키메라 항원 수용체들을 지닌 것으로 여겨지는, t 세포 수용체 넉 아웃 조작된 면역 세포들
EP3062105A1 (en) * 2015-02-26 2016-08-31 Université de Bretagne Occidentale (U.B.O.) Processes for the diagnosis, prognosis and monitoring of the progression of Chronic Lymphoid Leukaemia (CLL) and/or of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) using membrane STIM 1
AU2016225012B2 (en) 2015-02-27 2020-09-03 Kevin Chen Chimeric antigen receptors (CARS) targeting hematologic malignancies, compositions and methods of use thereof
US11186824B2 (en) 2015-03-11 2021-11-30 Cellectis Methods for engineering allogeneic T cell to increase their persistence and/or engraftment into patients
CN114634943A (zh) 2015-05-18 2022-06-17 T细胞受体治疗公司 使用融合蛋白对tcr重编程的组合物和方法
CN115058395A (zh) 2015-06-25 2022-09-16 美商生物细胞基因治疗有限公司 嵌合抗原受体(car)、组合物及其使用方法
US11173179B2 (en) 2015-06-25 2021-11-16 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptor (CAR) targeting multiple antigens, compositions and methods of use thereof
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
IL295616A (en) 2015-07-31 2022-10-01 Us Health Adapted cells and treatment methods
EP3347474B1 (en) * 2015-09-11 2020-11-04 Biosceptre (UK) Limited Chimeric antigen receptors and uses thereof
MX2018003534A (es) 2015-09-25 2019-04-25 Abvitro Llc Proceso de alto rendimiento para identificacion de blanco de receptor de celula t de secuencias de receptor de celula t apareadas de manera natural.
US10799535B2 (en) 2015-10-05 2020-10-13 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases with recognition sequences found in the human T cell receptor alpha constant region gene
EP4108255A1 (en) 2015-10-05 2022-12-28 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified cells comprising a modified human t cell receptor alpha constant region gene
MX2018004546A (es) * 2015-10-16 2019-04-15 Univ Columbia Composiciones y métodos para la inhibicion de antígenos específicos de linaje.
IL258821B (en) 2015-10-23 2022-07-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
PT3827845T (pt) 2015-11-03 2022-07-08 Janssen Biotech Inc Formulações subcutâneas de anticorpos anti-cd38 e suas utilizações
EP3377076A4 (en) 2015-11-19 2019-07-31 Bloodcenter Research Foundation METHOD FOR PRODUCING BI-SPECIFIC T CELLS FOR USE IN ANTICANCER IMMUNOTHERAPY
CN105368859B (zh) * 2015-11-25 2019-10-18 王任直 一种嵌合抗原受体hCD87-CAR及载有hCD87-CAR基因结构的慢病毒及质粒及其应用
AU2017226960B2 (en) * 2016-03-04 2024-03-21 Morphosys Ag Clinical assessment of M-protein response in multiple myeloma
WO2017177175A1 (en) * 2016-04-07 2017-10-12 The George Washington University Methods and compositions targeting retroviral latency
AU2017251116A1 (en) * 2016-04-15 2018-12-06 Zymeworks Inc. Multi-specific antigen-binding constructs targeting immunotherapeutics
WO2017178586A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Cellectis A method of engineering prodrug-specific hypersensitive t-cells for immunotherapy by gene expression
WO2017178585A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Cellectis A method of engineering drug-specific hypersensitive t-cells for immunotherapy by gene inactivation
CA3022611A1 (en) * 2016-05-06 2017-11-09 Juno Therapeutics, Inc. Genetically engineered cells and methods of making the same
US20200208111A1 (en) * 2016-06-09 2020-07-02 Branden S. Moriarity Genome-edited nk cell and methods of making and using
US20200283534A1 (en) 2016-06-24 2020-09-10 iCell Gene Therapeuticics LLC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARs), COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
CA3032498A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
CA3032429A1 (en) * 2016-08-03 2018-02-08 Washington University Gene editing of car-t cells for the treatment of t cell malignancies with chimeric antigen receptors
IL264565B1 (en) 2016-08-03 2024-03-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
WO2018042385A2 (en) 2016-09-02 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods and compositions involving interleukin-6 receptor alpha-binding single chain variable fragments
CN109923110A (zh) 2016-10-05 2019-06-21 小利兰·斯坦福大学托管委员会 苔藓抑素化合物和其制备方法
CA3036745A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for t-cell receptors reprogramming using fusion proteins
AU2017342176A1 (en) * 2016-10-10 2019-05-02 The National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd. Non-cytotoxic modified cells and use thereof
CN106544321B (zh) * 2016-10-13 2019-01-29 北京艺妙神州医疗科技有限公司 通用型car-t细胞及其制备方法和用途
JP2019530464A (ja) 2016-10-14 2019-10-24 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸塩基エディターのａａｖ送達
WO2018080541A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Method for treating autoimmune disease using cd4 t-cells with engineered stabilization of expression of endogennous foxp3 gene
US11312998B2 (en) * 2016-11-07 2022-04-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for selecting therapy for a cancer patient
DK3321280T3 (da) * 2016-11-10 2021-02-22 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Oeffentlichen Rechts Immunmodulatorer til reduktion af immunresistens i et melanom og andre proliferative sygdomme
US20190263906A1 (en) * 2016-11-10 2019-08-29 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Immune modulators for reducing immune-resistance in melanoma and other proliferative diseases
CN110268049A (zh) 2016-11-22 2019-09-20 新加坡国立大学 用于t细胞恶性肿瘤免疫疗法的cd7表达阻滞剂和嵌合抗原受体
US11851491B2 (en) 2016-11-22 2023-12-26 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
JP2020504086A (ja) * 2016-11-23 2020-02-06 アセチロン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＡｃｅｔｙｌｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とｃｄ３８阻害剤とを含む医薬組み合わせ物及びその使用方法
CN110248669B (zh) * 2016-12-09 2023-09-08 昂克医疗有限公司 工程化天然杀伤细胞及其用途
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
EP3568416A4 (en) * 2017-01-13 2020-07-08 Celdara Medical, LLC TIM-1 TARGETED CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS
US10440535B2 (en) 2017-01-25 2019-10-08 The George Washington University System and method for asset-agnostic wireless monitoring and predictive maintenance of deployed assets
MA47613A (fr) * 2017-02-22 2020-01-01 Aleta Biotherapeutics Inc Compositions et procédés de traitement du cancer
BR112019017401A2 (pt) * 2017-02-22 2020-04-14 Aleta Biotherapeutics Inc composições e métodos para transdução tumoral
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
CN110914310A (zh) 2017-03-10 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 胞嘧啶至鸟嘌呤碱基编辑器
WO2018176009A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
EP3592380A1 (en) 2017-03-31 2020-01-15 Cellectis New universal chimeric antigen receptor t cells specific for cd22
JP7235391B2 (ja) * 2017-05-08 2023-03-08 ツールゲン インコーポレイテッド 人工的に操作された免疫細胞
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CA3062506A1 (en) 2017-05-12 2019-05-23 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
CN106978445A (zh) * 2017-06-12 2017-07-25 内蒙古大学 CRISPER‑Cas9系统介导的山羊EDAR基因敲除的方法
EP3641768A4 (en) * 2017-06-21 2021-07-07 iCell Gene Therapeutics LLC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARS); COMPOSITIONS AND METHOD OF USE THEREOF
WO2019005957A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Precision Biosciences, Inc. GENETICALLY MODIFIED T CELLS COMPRISING A MODIFIED INTRON IN THE ALPHA T CELL RECEPTOR GENE
WO2019002633A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Cellectis CELLULAR IMMUNOTHERAPY FOR REPETITIVE ADMINISTRATION
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
CN107312800B (zh) * 2017-08-01 2020-02-07 北京舜雷科技有限公司 能敲低内源性pd-1表达的cik及其制备方法与应用
CN107541526B (zh) * 2017-08-23 2019-12-10 北京瑞健科技有限公司 能敲低内源性ctla4表达的cik及制备方法与应用
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
WO2019079347A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE
US11618787B2 (en) 2017-10-31 2023-04-04 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating high risk multiple myeloma
JP2021501587A (ja) * 2017-11-03 2021-01-21 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｃｄ３８指向性キメラ抗原受容体構築物
GB201719169D0 (en) 2017-11-20 2018-01-03 Univ College Cardiff Consultants Ltd Novel T-cell receptor and ligand
JP7372920B2 (ja) 2017-12-29 2023-11-01 セレクティス Ｃａｒ ｔ細胞の作製を改良するための方法
US20230158070A1 (en) 2018-01-30 2023-05-25 Cellectis Combination comprising allogeneic immune cells deficient for an antigen present on both t-cells and pathological cells and therapeutic antibody against said antigen
US11377500B2 (en) 2018-02-01 2022-07-05 Pfizer Inc. Antibodies specific for CD70 and their uses
KR20200128018A (ko) 2018-02-01 2020-11-11 화이자 인코포레이티드 Cd70을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체
WO2019183572A1 (en) * 2018-03-23 2019-09-26 Refuge Biotechnologies, Inc. Gene regulation via conditional nuclear localization of gene modulating polypeptides
CN111954715A (zh) * 2018-03-29 2020-11-17 菲特治疗公司 工程改造的免疫效应细胞和其用途
BR112020020073A2 (pt) * 2018-04-05 2021-01-05 Juno Therapeutics Inc Células t que expressam um receptor recombinante, polinucleotídeos relacionados e métodos
WO2019200122A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Precision Biosciences, Inc. Optimized engineered nucleases having specificity for the human t cell receptor alpha constant region gene
SG11202007878UA (en) 2018-04-27 2020-09-29 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Expression of foxp3 in edited cd34+ cells
KR20210008502A (ko) * 2018-05-11 2021-01-22 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물
WO2019222423A1 (en) * 2018-05-15 2019-11-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods related to tumor cell killers and vaccines
GB2589246A (en) 2018-05-16 2021-05-26 Synthego Corp Methods and systems for guide RNA design and use
US20210230289A1 (en) * 2018-06-12 2021-07-29 The Regents Of The University Of California Single-chain bispecific chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
CN110623980A (zh) * 2018-06-25 2019-12-31 深圳宾德生物技术有限公司 靶向cd38的嵌合抗原受体t细胞在自身免疫性疾病中的应用
EP3820888A4 (en) * 2018-07-13 2022-04-27 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. CO-RECEPTOR SYSTEMS FOR THE TREATMENT OF INFECTIOUS DISEASES
CN110819589B (zh) * 2018-08-13 2022-10-11 上海科技大学 一种增强免疫效应细胞功能的方法
BR112021003670A2 (pt) 2018-08-28 2021-05-18 Vor Biopharma, Inc. células-tronco hematopoéticas geneticamente modificadas e seus usos
EP3629021A1 (en) * 2018-09-26 2020-04-01 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG Diagnosis of a neuroautoimmune disease
CA3114911A1 (en) * 2018-10-04 2020-04-09 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods of reducing type 2 cytokine-mediated inflammation using neuromedin peptides
EP3873205A4 (en) * 2018-10-31 2022-05-11 Humanigen, Inc. MATERIALS AND METHODS FOR TREATMENT OF CANCER
WO2020102721A1 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 Rapa Therapeutics, Llc Immune monitoring of neuro-inflammatory amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN113412119A (zh) * 2018-11-30 2021-09-17 莱蒂恩技术公司 用于用抗cd38免疫治疗来治疗癌症的组合物和方法
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
WO2020191239A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
US20200316197A1 (en) * 2019-03-28 2020-10-08 Janssen Biotech, Inc. Clinically Proven Subcutaneous Pharmaceutical Compositions Comprising Anti-CD38 Antibodies and Their Uses in Combination with Bortezomib and Dexamethasone
US20200308296A1 (en) * 2019-03-28 2020-10-01 Janssen Biotech, Inc. Clinically Proven Subcutaneous Pharmaceutical Compositions Comprising Anti-CD38 Antibodies and Their Uses in Combination with Pomalidomide and Dexamethasone
US20200308284A1 (en) * 2019-03-28 2020-10-01 Janssen Biotech, Inc. Clinically Proven Subcutaneous Pharmaceutical Compositions Comprising Anti-CD38 Antibodies and Their Uses in Combination with Lenalidomide and Dexamethasone
US20200330593A1 (en) * 2019-03-28 2020-10-22 Janssen Biotech, Inc. Clinically Proven Subcutaneous Pharmaceutical Compositions Comprising Anti-CD38 Antibodies and Their Uses in Combination with Bortezomib, Mephalan and Prednisone
EP4332115A2 (en) 2019-04-03 2024-03-06 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified immune cells comprising a microrna-adapted shrna (shrnamir)
CA3138633A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
EP3972585A4 (en) * 2019-05-21 2023-06-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University BRYOSTATIN COMPOUNDS TO IMPROVE IMMUNOTHERAPY
AU2020291922A1 (en) * 2019-06-14 2022-02-10 2Seventy Bio, Inc. Compositions and methods for treating cancer
JP2022544580A (ja) * 2019-08-16 2022-10-19 エイチ リー モフィット キャンサー センター アンド リサーチ インスティテュート インコーポレイテッド 骨髄性悪性腫瘍を処置するためのキメラ抗原受容体
MX2022003316A (es) * 2019-09-18 2022-07-11 Momenta Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos relacionados con constructos de fc-dominio de unión al antígeno diseñados por ingeniería dirigidos a cd38.
JP2023501506A (ja) * 2019-11-13 2023-01-18 上海医薬集団股▲フン▼有限公司 Ｔ細胞機能を改善するｔｍｅｍ５９タンパク質二量体またはキメラ発現受容体
AU2020382017A1 (en) * 2019-11-13 2022-05-12 Crispr Therapeutics Ag Methods of manufacturing CAR-T cells
WO2022250433A1 (ko) * 2021-05-24 2022-12-01 주식회사 센트릭스바이오 Cd300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체
US20230060351A1 (en) * 2020-01-08 2023-03-02 Board Of Regents, The University Of Texas System A method of engineering natural killer cells to target cd70-positive tumors
CN111196858B (zh) * 2020-02-05 2021-02-09 武汉科技大学 一种治疗血液肿瘤合并hiv感染的双特异性嵌合抗原受体、基因、构建方法及其应用
KR20220160053A (ko) * 2020-03-27 2022-12-05 더 트러스티즈 오브 인디애나 유니버시티 다발성 골수종에서의 면역요법 표적 및 그의 식별 방법
CN115777017A (zh) * 2020-05-06 2023-03-10 亘喜生物科技（上海）有限公司 用于t细胞工程改造的组合物及方法
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
AU2021286655A1 (en) * 2020-06-12 2023-01-05 Nkarta, Inc. Genetically modified natural killer cells for CD70-directed cancer immunotherapy
CN111796101B (zh) * 2020-07-14 2022-08-26 汕头市中心医院 Notch3蛋白表达量检测剂联合cypa蛋白表达量检测剂在预测癌症治疗疗效的用途
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
EP4263600A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
WO2022210487A1 (ja) * 2021-03-29 2022-10-06 タカラバイオ株式会社 抗原に特異的な受容体を発現する免疫細胞の製造方法
KR20240027578A (ko) * 2021-04-05 2024-03-04 알테이아 사이언스 에스.알.엘. 신규한 종양 특이적 항원을 이용한 골수성 장애 및 급성 백혈병의 진단 및 치료
CN113671196B (zh) * 2021-07-29 2023-09-12 中国人民解放军空军军医大学 Lair-1分子与脂联素的相互作用对于t细胞活化作用影响的研究方法
WO2023088440A1 (en) * 2021-11-18 2023-05-25 Correctsequence Therapeutics Regeneration of surface antigen-negative cells
CN114350616A (zh) * 2022-01-24 2022-04-15 深圳市先康达生命科学有限公司 一种免疫细胞及其制备方法和应用
WO2023147293A2 (en) * 2022-01-25 2023-08-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods comprising anti-cd38 chimeric antigen receptors (cars)
WO2023168087A1 (en) * 2022-03-04 2023-09-07 Yale University Methods and compositions for treating and preventing fibrosis
CN114397464B (zh) * 2022-03-24 2022-06-10 天津德祥生物技术有限公司 一种红细胞膜碎片与载体的偶联复合物、其偶联方法和应用
WO2023194501A1 (en) * 2022-04-05 2023-10-12 Altheia Science S.R.L. Treatment of myeloid disorders and acute leukemias targeting novel tumor specific antigens
CN114569709B (zh) * 2022-05-05 2022-07-12 苏州慧疗生物医药科技有限公司 高表达adam-28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法及其应用

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
AU6704794A (en) 1993-04-13 1994-11-08 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Protection of human bone marrow from high dose antifolate therapy using mutated human dihydrofolate reductase dna
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US6010613A (en) 1995-12-08 2000-01-04 Cyto Pulse Sciences, Inc. Method of treating materials with pulsed electrical fields
WO1997033988A1 (en) 1996-03-12 1997-09-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Double mutants of dihydrofolate reductase and methods of using same
KR20030032922A (ko) 2000-02-24 2003-04-26 싸이트 테라피스 인코포레이티드 세포의 동시 자극 및 농축
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
JP4753119B2 (ja) 2003-03-14 2011-08-24 セレクティス ソシエテ アノニム 大量処理の生体外エレクトロポレーション法
CA2555185C (en) 2004-02-06 2020-03-24 Morphosys Ag Anti-cd38 human antibodies and uses therefor
DK1863909T3 (da) 2005-03-15 2010-08-30 Cellectis I-CreI-meganukleasevarianter med modificeret specificitet, fremgangsmåde til fremstilling og anvendelser deraf
CA2615532C (en) * 2005-07-26 2016-06-28 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
US20070036773A1 (en) 2005-08-09 2007-02-15 City Of Hope Generation and application of universal T cells for B-ALL
EP2039766A4 (en) 2006-06-05 2010-06-16 Univ Hiroshima IMMUNOCOMPETENT CELL HAVING ANTI-CD38 ANTIBODY ON ITS SURFACE
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
PL2604695T3 (pl) 2007-12-27 2023-04-11 Universität Zürich Cząstka arenawirusa z defektem replikacji
CN110179989B (zh) 2009-05-13 2022-06-24 基酶有限公司 治疗狼疮的方法和组合物
JP2013520999A (ja) * 2010-03-04 2013-06-10 ベット・セラピューティクス・インコーポレイテッド Ｃｄ５２に対するモノクローナル抗体
US8945868B2 (en) 2010-07-21 2015-02-03 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of a HLA locus
CN103501816A (zh) 2010-10-27 2014-01-08 贝勒医学院 使t细胞重定向针对cd70阳性恶性肿瘤的嵌合cd27受体
BR122021026173B1 (pt) * 2010-12-09 2023-12-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Composição farmacêutica
US9315788B2 (en) 2011-04-05 2016-04-19 Cellectis, S.A. Method for the generation of compact TALE-nucleases and uses thereof
CA3205636A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Beta-2 microglobulin-deficient cells
US10391126B2 (en) 2011-11-18 2019-08-27 Board Of Regents, The University Of Texas System CAR+ T cells genetically modified to eliminate expression of T-cell receptor and/or HLA
GB201206559D0 (en) 2012-04-13 2012-05-30 Ucl Business Plc Polypeptide
EP3279315A3 (en) * 2012-05-25 2018-02-28 Cellectis Use of pre t alpha or functional variant thereof for expanding tcr alpha deficient t cells
ES2786263T3 (es) 2012-07-13 2020-10-09 Univ Pennsylvania Mejora de la actividad de los CAR de linfocitos T mediante la introducción conjunta de un anticuerpo biespecífico
WO2014018601A2 (en) 2012-07-24 2014-01-30 Cellectis New modular base-specific nucleic acid binding domains from burkholderia rhizoxinica proteins
EP2893004B1 (en) 2012-09-04 2018-10-24 Cellectis Multi-chain chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2014191128A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Cellectis Methods for engineering t cells for immunotherapy by using rna-guided cas nuclease system
US10322774B2 (en) * 2015-05-15 2019-06-18 Oru Designs, Llc Collapsible kayak with large cockpit

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Blood. 2012, 119(24):5697-5705.
J Immunother. 2009, 32(7):737-743.
Leukemia. 2011, 26(2):365-367.
Nat Biotechnology, 2010, 29(2):143-148.

Also Published As

Publication number Publication date
DK3105317T3 (en) 2019-01-14
EP3105317B1 (en) 2018-09-19
WO2015121454A1 (en) 2015-08-20
CN106029875A (zh) 2016-10-12
CA2937711A1 (en) 2016-07-22
NO20161276A1 (en) 2016-08-09
KR20160138404A (ko) 2016-12-05
EP3505623A1 (en) 2019-07-03
TR201819571T4 (tr) 2019-01-21
RU2016136702A3 (ko) 2018-08-17
CA2937711C (en) 2020-10-20
RU2016136702A (ru) 2018-03-19
IL246645B (en) 2021-02-28
HUE041497T2 (hu) 2019-05-28
MX2016010345A (es) 2017-01-23
BR112016017806B1 (pt) 2023-05-02
US10836998B2 (en) 2020-11-17
US20200407682A1 (en) 2020-12-31
US11692169B2 (en) 2023-07-04
ES2711498T3 (es) 2019-05-06
EP3105317A1 (en) 2016-12-21
RU2714258C2 (ru) 2020-02-13
JP6673838B2 (ja) 2020-04-01
IL246645A0 (en) 2016-08-31
PL3105317T3 (pl) 2019-02-28
US20180201901A1 (en) 2018-07-19
AU2015216875A1 (en) 2016-07-28
BR112016017806A2 (pt) 2017-10-10
AU2015216875B2 (en) 2021-02-25
PT3105317T (pt) 2019-02-27
JP2017506636A (ja) 2017-03-09
US20230357719A1 (en) 2023-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102157924B1 (ko) 면역 세포들 및 병리 세포들 둘 다에 존재하는 항원을 타겟팅하기 위하여 조작된 면역치료용 세포들
US10709775B2 (en) Cells for immunotherapy engineered for targeting CD38 antigen and for CD38 gene inactivation
JP6991167B2 (ja) 免疫療法のための同種および免疫抑制耐性ｔ細胞を操作するための方法
US10870864B2 (en) Methods for engineering T cells for immunotherapy by using RNA-guided Cas nuclease system
JP7386082B2 (ja) 系統特異的タンパク質の阻害のための組成物および方法
JP6779909B2 (ja) がん免疫治療のための抗ＣＬＬ１特異的単鎖キメラ抗原受容体（ｓｃＣＡＲ）
RU2741120C2 (ru) Лечение рака с использованием химерного антигенного рецептора cll-1
EP2997132B1 (en) Methods for engineering allogeneic and highly active t cell for immunotherapy
JP2020178690A (ja) 多部分シグナル伝達タンパク質およびその使用
KR20200069358A (ko) 키메라 항원 수용체 발현 세포의 제조 방법
KR20200015467A (ko) 범용 항-cd22 키메라 항원 수용체 조작된 면역 세포
KR20180118175A (ko) 다중 키메라 항원 수용체 (car) 분자를 발현하는 세포 및 그에 따른 용도
EP3694546A1 (en) Combination comprising allogeneic immune cells deficient for an antigen present on both t-cells and pathological cells and therapeutic antibody against said antigen
KR20170037626A (ko) 인간화 항-bcma 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
JP2020530277A (ja) 反復投与のための細胞免疫療法
JP2021530503A (ja) 標的特異的融合タンパク質を使用してｔｃｒをリプログラミングするための組成物及び方法
KR20190130608A (ko) 면역종양학을 위한 조성물 및 방법
CN114222815A (zh) Suv39h1缺陷的免疫细胞
KR20220152227A (ko) Ｂｃｍａ-지시된 키메라 항원 수용체 ｔ 세포 조성물 및 이의 방법 및 용도
KR20230052289A (ko) Egfr 양성 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant