WO2022250433A1 - Cd300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체, 이를 발현하는 면역세포 등에 관한 것으로, 본 발명에 따른 CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체는 CD300c 항원 또는 CD300c 수용체를 발현하는 암 세포를 특이적으로 인식하여 암의 성장, 전이 등을 직접적이고 효과적인 방식으로 억제하여 다양한 암의 면역 치료제로서 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

CD300C 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체

본 발명은 CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체, 이를 발현하는 면역세포, 및 이의 용도 등에 관한 것이다.

암은 현대인의 사망원인에서 가장 큰 비중을 차지하고 있는 질환 중 하나로서 여러가지 원인에 의하여 발생된 유전자의 돌연변이로 인하여 정상세포가 변화하여 발생된 질병으로서, 정상적인 세포의 분화, 증식, 성장 형태 등을 따르지 않는 종양 중 악성인 것을 지칭한다. 암이란, "제어되지 않은 세포성장"을 특징으로 하며, 이러한 비정상적인 세포 성장에 의해 종양(tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투되고, 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 한다. 암은 수술, 방사선 및 약물 요법 등으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환이다. 특히, 최근에는 노년 인구의 증가, 환경 악화 등으로 인하여 세계 암 발생률은 매년 5% 이상 증가되고 있는 추세이며, WHO 보고서에 따르면 향후 25년 내 암 발생 인구는 3천 만명으로 증가되고, 이중 2천 만명의 인구는 암으로 사망할 것으로 추정되고 있다.

암의 약물 치료, 즉, 항암제는 일반적으로 세포 독성을 가지고 있는 화합물로서 암세포를 공격해 사멸시키는 방식으로 암을 치료하는데, 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 손상을 주기 때문에 높은 부작용을 나타낸다. 따라서 부작용을 감소시키기 위하여 표적 항암제들이 개발되었다. 그러나 이러한 표적 항암제들의 경우에는 부작용은 낮출 수 있었으나, 높은 확률로 내성이 생긴다는 한계점을 나타내었다. 따라서, 최근에는 체내의 면역체계를 이용하여 독성 및 내성으로 인한 문제점을 감소시키는 면역 항암제에 대한 관심이 급증하고 있는 추세이다. 이러한 면역 항암제의 일례로서 암세포 표면의 PD-L1에 특이적으로 결합하여 T 세포의 PD-1과의 결합을 억제하여 T 세포를 활성화시키고, 암세포를 공격하도록 만드는 면역관문억제제가 개발된 바 있다. 그러나 이러한 면역관문억제제의 경우에도 효과를 나타내는 암의 종류가 다양하지 않기 때문에, 다양한 암에서 동일하게 치료 효과를 나타내는 새로운 항염 면역 치료제의 개발이 절실히 필요한 실정이다.

한편, 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR)는 T 세포에 항원 특이성을 전달하도록 설계된 인공 수용체로서, 이들은 T 세포를 활성화하고 특이적 면역성을 제공하도록 선택된 항원 특이적 구성요소, 막관통 구성요소, 세포 내 구성요소 등으로 구성된다. 최근에는 이러한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 유전자를 도입한 세포를 이용하여 암 면역 요법, 즉, 환자로부터 T 세포를 채취해, 이러한 T 세포에 키메라 항원 수용체를 코딩하는 유전자를 도입하여 증폭하고, 다시 환자에게 이입하는 요법을 통하여 암을 치료하는 방법에 관한 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다.

[선행기술문헌]

[특허문헌]

(특허문헌 1) 한국 공개 특허 10-2016-0016725

본 발명은 상술한 문제점을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 암 예방 또는 치료를 위한 CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공하는 것을 일 목적으로 한다.

본 발명은 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

본 발명은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 키메라 항원 수용체 또는 이를 포함하는 면역세포를 이용하는 항암 요법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 키메라 항원 수용체 또는 이를 포함하는 면역 세포를 이용하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 키메라 항원 수용체 또는 이를 포함하는 면역 세포의 암 예방 또는 치료를 위한 용도를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 키메라 항원 수용체 또는 이를 포함하는 면역 세포의 암 예방 또는 치료를 위한 약제 제조용 용도를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.

본 발명의 일 태양에 따르면, CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체가 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포가 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 벡터가 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체 또는 이를 포함하는 면역세포를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체 또는 이를 포함하는 면역세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체 또는 이를 포함하는 면역세포를 이용하는 항암 요법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체 또는 이를 포함하는 면역세포의 암 예방 또는 치료용 용도가 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체 또는 이를 포함하는 면역세포의 암 예방 또는 치료를 위한 약제 제조용 용도가 제공된다.

본 발명에 따른 CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체는 CD300c 항원 또는 CD300c 수용체를 발현하는 암 세포를 특이적으로 인식하여 암의 성장, 전이, 발달 등을 직접적이고 효과적인 방식으로 억제할 수 있고, CD300c 항원 또는 CD300c 항원 수용체를 표면에 발현하는 다양한 암의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1a 내지 도 1y는 본 발명에 따른 25종의 항-CD300c 단클론 항체 각각의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 서열(핵산 및 아미노산 서열)을 나타낸다. 각각의 도면에서, CDR 부위(CDR1, CDR2 및 CDR3)는 순서대로 표시하였다.

도 2는 본 발명의 항-CD300c 단클론 항체 및/또는 CD300c siRNA의 항암 효과를 나타내는 기작을 간략하게 나타낸 개략도이다.

도 3은 본 발명의 항-CD300c 단클론 항체가 각각 단핵구, T 세포, 암 세포에 작용하는 기작을 간략하게 나타낸 개략도이다.

도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체의 비환원 조건에서의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도면이다.

도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체의 환원 조건에서의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도면이다.

도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 정상세포, 면역세포, 및 암세포주에서 CD300c의 발현을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.

도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체의 CD300c 항원에 대한 결합력을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체의 T 세포 활성화를 통한 항암 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 9 및 도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체가 M1 마크로파지로의 분화에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 11 및 도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 M1 마크로파지로의 분화에 대한 항-CD300c 단클론 항체의 농도 의존적 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 13은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체가 M1 마크로파지로의 분화에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 14는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체가 인간 단핵구 세포의 M1 마크로파지로의 분화를 촉진시키는지 재확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 15 내지 도 18은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체와 기존 면역 항암제의 M1 마크로파지 분화능을 ELISA를 이용하여 비교한 결과를 나타낸 도면이다.

도 19는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체와 면역 항암제의 M0 마크로파지에서 M1 마크로파지로의 분화능을 ELISA를 이용하여 비교한 결과를 나타낸 도면이다.

도 20은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체와 면역 항암제의 M1 마크로파지로의 분화능을 ELISA를 이용하여 비교한 결과를 나타낸 도면이다.

도 21 내지 도 23은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체의 M2 마크로파지에서 M1 마크로파지로의 재분화능을 ELISA를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 24는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체의 M1 마크로파지로의 분화능 및 재분화능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 25 내지 도 27은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체와 면역 항암제의 병용 처리 시 M1 마크로파지 분화의 신호인 MAPK(도 25), NF-kB(도 26), 및 IkB(도 27)의 신호 전달을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 28은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체의 0% FBS의 조건에서의 암세포 성장 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 29는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체의 0.1% FBS의 조건에서의 암세포 성장 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 30은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체와 면역 항암제의 암세포(폐암) 성장 억제 효과를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.

도 31은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체와 면역 항암제의 암세포(유방암) 성장 억제 효과를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.

도 32는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체의 농도별 암세포 성장 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 33은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체와 면역 항암제의 병용 처리 시 세포자멸 신호의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 34 및 도 35는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체와 면역 항암제의 병용 처리 시 암 세포 성장 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 36은 본 발명의 일 구현예에 따른 결합 ELISA의 결과를 나타낸 도면이다.

도 37은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체가 마우스 마크로파지에서 M1 마크로파지로의 분화능을 촉진시킬 수 있는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 38은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체가 마우스 암세포주에서 항암 효과를 나타내는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 39는 본 발명의 일 구현예에 사용된 실험 방법을 개략적으로 나타낸 나타낸 도면이다.

도 40은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-PD-1 항체 및 항-CD300c 단클론 항체를 단독 또는 병용으로 대장암 세포주 이식 마우스에 투여한 경우 관찰되는 생체내 암 성장 억제 효과를 나타낸 도면이다.

도 41은 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체가 마우스 종양 모델에서 CD8+ T 세포 면역을 촉진하는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 42는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-CD300c 단클론 항체가 마우스 모델에서 암 조직 내의 M1 마크로파지를 증가시키는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 43은 본 발명의 일 구현예에 따른 CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 제작을 위한 유전자 배열을 간략하게 나타낸 도면이다.

도 44는 본 발명의 일 구현예에 따른 CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 제작을 위한 벡터 맵을 나타낸 도면이다.

도 45는 본 발명의 일 구현예에 따른 CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체가 발현되는 Jurkat 세포주를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 46은 본 발명의 일 구현예에 따른 CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체가 발현된 Jurkat 세포주의 항암 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않으면서 일 구현예에서 다른 구현예로 변경되거나 구현예들이 조합되어 구현될 수 있다. 본 명세서에 사용된 기술 및 학술 용어들은, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석할 목적으로 하기 정의들이 적용될 것이고, 단수로 사용된 용어는 적절한 경우에는 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.

정의

본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 당해 기술 분야에서 통상의 기술자에게 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다.

용어 "(항원-) 결합 도메인"은 항원에 결합하는 단백질의 일부분을 지칭한다. 항원-결합 도메인은 합성 폴리펩티드, 효소적으로 얻을 수 있는 폴리펩티드, 또는 유전자 조작된 폴리펩티드일 수 있으며, 항원에 결합하는 면역글로불린(예를 들어, 항체) 또는 그의 일부(예를 들어, 항원 결합 단편)이다.

용어 "항체"는 광의적으로 사용되며, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 임의의 아이소타입의 모노클로날 항체(전장(full length) 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 항체 융합체(예를 들어, 항체와 (폴리)펩티드의 융합체 또는 항체와 화합물의 융합체) 및 항체 단편(항원 결합 단편 포함)을 포함한다. 본 명세서에서, 접두사 "항-"은 항원과 관련된 경우, 해당 항체가 해당 항원과 반응성임을 의미한다. 특정 항원과 반응성인 항체는 파지 또는 유사한 벡터에서 재조합 항체 라이브러리의 선별과 같은 합성 및/또는 재조합 방법에 의해, 또는 항원 또는 항원-코딩 핵산을 사용한 동물의 면역화에 의해 생성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대표적인 IgG 항체는 이황화 결합에 의해 결합되는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 구성된다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 중쇄 가변 영역(HVR) 및 경쇄 가변 영역(LVR)은 각각 "상보성 결정 영역"("CDR") 또는 "초가변 영역"으로 칭해지는 3개의 절편을 포함하며, 이는 주로 항원 에피토프와의 결합에 관여한다. 이들은 N-말단으로부터 순차적으로 숫자가 매겨져서 통상 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭된다. CDR 외부의 가변 영역 중에서 보다 잘 보존된 영역은 "골격 영역"("FR")으로 지칭된다. 본 명세서에서 항체는 예를 들어 동물 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다.

용어 “단일 도메인 항체(single domain antibody)"는 CD300c 항원에 대한 특이 항체로서, CDR이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 항체이며, 일반적으로 두 개의 중쇄(heavy chain)와 항원 결합 부위 만을 이용하여 제작된 항체일 수 있으나, 경쇄가 자연적으로 없는 항체, 종래의 4-쇄 항체에서 유래한 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체에서 유래된 것 외의 단일 도메인 스캐폴드를 모두 포함할 수 있다.

용어 “단쇄 가변 단편(single-chain variable fragment; scFv)"이란 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 15개 내외의 아미노산이 연결된 펩타이드 서열로 이루어진 링커(linker)로 연결한 단백질로서, 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역, 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역의 순서 모두 가능하며, 원 항체와 동일 혹은 유사한 항원 특이성을 가진다. 연결부위는 주로 글리신(glycine)과 세린(serine)으로 이루어진 친수성의 유연한 펩타이드 사슬(GS linker)로서 "(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3"의 15개의 아미노산 서열 또는 이와 유사한 서열이 주로 사용된다. 상기 항체(antibody)는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 의미하며, 다클론 항체(polyclonal antibody), 단클론 항체(monoclonal antibody)및 이의 기능적인 단편(fragment)를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함할 수 있다. 이중 단클론항체는 단일 항원성 부위(에피톱, epitope)에 대해서 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타내는 항체로서, 상이한 에피톱들에 대해 특이성을 나타내는 항체들을 포함하는 다클론 항체와 다르게, 단클론 항체는 항원 상의 단일 에피톱에 대해서만 결합 특이성 및 친화도를 나타내기 때문에, 치료제로서의 품질 관리가 용이하다. 특별히, 본 발명의 항-CD300c 단클론 항체는 CD300c를 발현하는 암 세포에 특이적으로 결합하여 그 자체적으로도 항암 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 면역세포를 자극함으로써 암세포 의존성 항암 활성을 최대화시킬 수 있다. 상기 항체는 구성 중 중쇄(heavy chain) 및/또는 경쇄(light chain)의 가변 영역(variable region)을 포함하며, 상기 가변 영역은 1차 구조로서 항체 분자의 항원 결합 부위를 형성하는 부분을 포함하며, 본 발명의 항체는 상기 가변 영역을 포함하는 일부 단편으로 구성될 수 있다

용어 "인간화"(리쉐이핑(reshaping) 또는 CDR 그래프팅(grafting)이라고도 지칭됨)는 이종 공급원(통상적으로 설치류) 유래의 단클론 항체의 면역원성을 저하시키고, 친화도 또는 이펙터 기능(ADCC, 보체 활성화, Clq 결합)을 개선시키기 위한 확립된 기법을 포함한다.

용어 "단클론 항체"는 "모노클로날 항체"와 상호교환적으로 사용되고, 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 얻어진 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 이루는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이 및/또는 번역 후 변형(예컨대 이성질화, 아미드화)을 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 고도로 특이적이며, 하나의 항원성 부위에 대해 유도된다. 단클론 항체는 실질적으로 균일한 집단으로부터 수득된 것으로서 항체의 특성을 나타내고 임의의 특정한 방법에 의해 항체의 생산을 요구하는 것으로서 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 기술, 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법 등의 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.

용어 "항원 결합 단편"은 항원에 대한 특이적 결합능을 갖는 항체의 일부 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 문맥상 "항체"가 특별히 "항원 결합 단편"을 제외하는 것으로 이해되는 경우를 제외하고는 "항체"와 "항원 결합 단편"은 상호 교환적으로 사용될 수 있고, "항체"는 "항원 결합 단편"을 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 항원 결합 단편의 예에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 크로스-Fab 단편, 선형 항체, 단일사슬 항체 분자(예를 들어, scFv), 항체 단편과 단일 도메인 항체로 형성된 다중특이성 항체가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.

용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"는 세포외 표적-결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포 표면 수용체로서 정의된다. 본 발명의 키메라 항원 수용체는 림프구, 예컨대 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포와 주로 사용하도록 의도된다.

용어 "항암제"는 세포의 각종 대사경로에 작용하여 암 세포에 대하여 세포독성(cytotoxic) 또는 세포증식억제(cytostatic) 효과를 나타내는 기존의 암 치료에 사용되는 공지의 약제를 총칭하는 것으로, 화학 항암제, 표적 항암제, 및 면역 항암제를 포함한다.

용어 "면역 항암제"는 면역세포를 활성화시켜서 암 세포를 사멸시키는 약제를 지칭한다.

용어 "대상체"는 "환자"와 상호교환적으로 사용되고, 암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 포유동물, 예를 들어, 영장류(예: 인간), 반려 동물(예: 개, 고양이 등), 가축 동물(예: 소, 돼지, 말, 양, 염소 등) 및 실험실 동물(예: 랫트, 마우스, 기니피그 등)일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 대상체는 인간이다.

용어 "치료"는 일반적으로 목적하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미한다. 이러한 효과는 질병 및/또는 이러한 질병으로 인한 유해 효과를 부분적으로 또는 완전히 치유하는 점에서 치료적 효과를 가진다. 바람직한 치료적 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 "치료"는 이미 나타난 질환 또는 장애의 의료적 개입을 의미할 수 있다.

용어 "예방"은 예방적 치료, 즉 질병을 치료하기 보다는 예방하기 위한 목적의 조치 또는 절차에 관한 것이다. "예방"은 질병 또는 이의 증상을 부분적으로 또는 완전히 예방한다는 관점에서 목적하는 예방적인 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득함을 의미한다.

용어 "투여"는 대상체에 예방적 또는 치료적 목적(예컨대, 암의 예방 또는 치료)을 달성하기 위한 물질(예컨대, 항-CD300c 항체 및 그의 항원 결합 단편 또는 다른 항암제)을 제공하는 것을 의미한다.

용어 "생물학적 시료"는 대상체로부터 얻어지는 다양한 샘플 유형을 포괄하며, 진단 또는 모니터링 분석법에 이용될 수 있다. 생물학적 시료는 혈액 및 기타 생물학적 기원의 액체 시료, 생체 검사 시료, 조직 배양물, 또는 이로부터 유래된 세포 및 이의 자손과 같은 고체 조직 시료를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 따라서, 생물학적 시료는 임상적 시료, 배양물 중의 세포, 세포 상층액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체 및 조직 시료, 특히 종양 시료를 포괄한다.

키메라 항원 수용체

본 발명의 일 태양에 따르면, CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체가 제공된다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 T-세포 신호전달 도메인에 연결된 항체(예컨대 scFv)의 항원-결합 도메인을 함유하는 인공적으로 작제된 하이브리드 단백질 또는 폴리펩티드이다. 키메라 항원 수용체는 단클론 항체의 항원-결합 능력을 이용하여 비-MHC-제한된 방식으로 선택된 표적에 대한 T-세포 특이성 및 반응성을 유도할 수 있다. 상기 키메라 항원 수용체는 (세포 외) 항원-결합 도메인, 막 관통 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키메라 항원 수용체는 GS 링커를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키메라 항원 수용체는 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 키메라 항원 수용체는 (세포 외) 항원-결합 도메인, GS 링커, 막 관통 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 키메라 항원 수용체는 (세포 외) 항원-결합 도메인, 신호 펩타이드, GS 링커, 막 관통 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 키메라 항원 수용체는 상기 열거된 구성요소 외에도 당업계에 일반적으로 알려져 있는 임의의 키메라 항원 수용체의 구성 요소를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 결합 도메인은 CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 항체, 단일 도메인 항체, 단쇄 가변 분절, 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

구체적으로 상기 결합 도메인은 CD300c 항원일 수 있다. 상기 CD300c 항원은 수용체에 결합하기 위하여, CD300c 항원 서열 전체를 포함할 수도 있고, CD300c 항원 서열 중 세포외 도메인(extracellular domain; ECD)을 포함할 수도 있다. 상기 CD300c 항원의 세포외 도메인 서열은 서열번호 402로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함할 수 있으며, 또한 상기 서열번호 402와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 결합 도메인은 항-CD300c 항체(바람직하게는 항-CD300c 단클론 항체) 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있지만, CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 한 어떠한 물질이라도 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 결합 도메인이 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 경우, 그러한 결합 도메인은 당업계에 알려진 임의의 항체 생성 기술에 의해 제조될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 결합 도메인은,

(i) 서열번호 7, 서열번호 19, 서열번호 31, 서열번호 43, 서열번호 55, 서열번호 67, 서열번호 79, 서열번호 91, 서열번호 103, 서열번호 115, 서열번호 127, 서열번호 139, 서열번호 151, 서열번호 163, 서열번호 175, 서열번호 187, 서열번호 199, 서열번호 211, 서열번호 223, 서열번호 235, 서열번호 247, 서열번호 259, 서열번호 271, 서열번호 283 및 서열번호 295로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR1;

서열번호 8, 서열번호 20, 서열번호 32, 서열번호 44, 서열번호 56, 서열번호 68, 서열번호 80, 서열번호 92, 서열번호 104, 서열번호 116, 서열번호 128, 서열번호 140, 서열번호 152, 서열번호 164, 서열번호 176, 서열번호 188, 서열번호 200, 서열번호 212, 서열번호 224, 서열번호 236, 서열번호 248, 서열번호 260, 서열번호 272, 서열번호 284 및 서열번호 296으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR2; 및

서열번호 9, 서열번호 21, 서열번호 33, 서열번호 45, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 81, 서열번호 93, 서열번호 105, 서열번호 117, 서열번호 129, 서열번호 141, 서열번호 153, 서열번호 165, 서열번호 177, 서열번호 189, 서열번호 201, 서열번호 213, 서열번호 225, 서열번호 237, 서열번호 249, 서열번호 261, 서열번호 273, 서열번호 285 및 서열번호 297로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(ii) 서열번호 10, 서열번호 22, 서열번호 34, 서열번호 46, 서열번호 58, 서열번호 70, 서열번호 82, 서열번호 94, 서열번호 106, 서열번호 118, 서열번호 130, 서열번호 142, 서열번호 154, 서열번호 166, 서열번호 178, 서열번호 190, 서열번호 202, 서열번호 214, 서열번호 226, 서열번호 238, 서열번호 250, 서열번호 262, 서열번호 274, 서열번호 286 및 서열번호 298로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR1;

서열번호 11, 서열번호 23, 서열번호 35, 서열번호 47, 서열번호 59, 서열번호 71, 서열번호 83, 서열번호 95, 서열번호 107, 서열번호 119, 서열번호 131, 서열번호 143, 서열번호 155, 서열번호 167, 서열번호 179, 서열번호 191, 서열번호 203, 서열번호 215, 서열번호 227, 서열번호 239, 서열번호 251, 서열번호 263, 서열번호 275, 서열번호 287 및 서열번호 299로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR2; 및

서열번호 12, 서열번호 24, 서열번호 36, 서열번호 48, 서열번호 60, 서열번호 72, 서열번호 84, 서열번호 96, 서열번호 108, 서열번호 120, 서열번호 132, 서열번호 144, 서열번호 156, 서열번호 168, 서열번호 180, 서열번호 192, 서열번호 204, 서열번호 216, 서열번호 228, 서열번호 240, 서열번호 252, 서열번호 264, 서열번호 276, 서열번호 288 및 서열번호 300으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은,

(i) 서열번호 7, 서열번호 67, 서열번호 79, 서열번호 115 또는 서열번호 211의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR1;

서열번호 8, 서열번호 68, 서열번호 80, 서열번호 116 또는 서열번호 212의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR2; 및

서열번호 9, 서열번호 69, 서열번호 81, 서열번호 117 또는 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR3을 포함하고,

상기 경쇄 가변 영역은,

(ii) 서열번호 10, 서열번호 70, 서열번호 82, 서열번호 118 또는 서열번호 214의의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR1;

서열번호 11, 서열번호 71, 서열번호 83, 서열번호 119 또는 서열번호 215의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR2; 및

서열번호 12, 서열번호 72, 서열번호 84, 서열번호 120 또는 서열번호 216의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR3을 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 303, 서열번호 323, 서열번호 327, 서열번호 339 또는 서열번호 371의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 304, 서열번호 324, 서열번호 328, 서열번호 340 또는 서열번호 372의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 303로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 304으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 323로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 324로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 327로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 328로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 339로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 340로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 371로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 372로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 키메라 항원 수용체의 결합 도메인은 아래 식 (1) 내지 (3)으로 각각 표현되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 아래 식 (4) 내지 (6)으로 각각 표현되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다(각 아미노산 서열은 N→C 방향임):

FTFSX1YX2MX3WVR (1) (서열번호 403)

상기 식에서,

X1= R, S 또는 D

X2= A, G 또는 H

X3= T, H 또는 S

X1X2SX3X4GGX5TYYAX6 (2) (서열번호 404)

상기 식에서,

X1= S, A 또는 T

X2= M 또는 I

X3= G 또는 S

X4= T 또는 S

X5= T, S 또는 Y

X6= D 또는 E

YCAX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11W (3) (서열번호 405)

상기 식에서,

X1= R, V 또는 S

X2= G 또는 S

X3= A, G, S, Y 또는 I

X4= Y, A, Q, G 또는 R

X5= G 또는 L

X6= F, R, I, M 또는 P

X7= D, G, F 또는 L

X8= H, F, D 또는 V

X9= F, I, Y 또는 존재하지 않음

X10= D 또는 존재하지 않음

X11= Y 또는 존재하지 않음

CX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13W (4) (서열번호 406)

상기 식에서,

X1= R, S 또는 T

X2= A, G 또는 R

X3= S 또는 N

X4= Q, S 또는 N

X5= S, I 또는 G

X6= I, N 또는 G

X7= G, I, T 또는 S

X8= N, G, R, A 또는 K

X9= Y, S, R 또는 G

X10= N 또는 존재하지 않음

X11= Y 또는 존재하지 않음

X12= L 또는 V

X13= N, Y, H 또는 Q

X1X2X3X4X5X6X7GX8X9 (5) (서열번호 407)

상기 식에서,

X1= D, E, S 또는 R

X2= A, D, K 또는 N

X3= S 또는 N

X4= N, K 또는 Q

X5= L 또는 R

X6= E 또는 P

X7= T 또는 S

X8= I 또는 V

X9= P 또는 R

YCX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11F (6) (서열번호 408)

상기 식에서,

X1= Q, S 또는 A

X2= Q, S 또는 A

X3= S, Y 또는 W

X4= S, T, D 또는 A

X5= A, S, D 또는 G

X6= I, S, N 또는 T

X7= P, S, L, N 또는 K

X8= Y, T, S, N 또는 G

X9= V, G, L 또는 존재하지 않음

X10 = P 또는 존재하지 않음

X11= T, I 또는 V.

특정 구현예에서, 상기 결합 도메인은 단쇄 가변 분절(scFv)일 수 있고, 서열번호 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438 및 440으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 도메인은 서열번호 412, 414, 416, 418 또는 440을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

상기 결합 도메인은 상기 기재된 임의의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기의 결실, 및/또는 그러한 아미노산 서열 내로의 잔기의 삽입 및/또는 그러한 아미노산 서열 내에서의 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구성물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환을 포함하는 다양한 변경의 임의의 조합이 수행될 수 있지만, 최종 구성물은 원하는 특성, 예를 들어, 항원-결합 특성을 보유해야 한다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심있는 부위는 중쇄 가변 영역(HVR) 및 골격 영역(FR)을 포함한다. 보존적 치환은 표 1에 "바람직한 치환"이라는 항목 아래에 제공되어 있으며, 이하에 아미노산 측쇄 부류 (1) 내지 (6)과 관련하여 추가로 기술되어 있다. 아미노산 치환은 관심있는 분자 및 원하는 활성, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 혹은 CDC에 대해 스크리닝된 생성물에 도입될 수 있다.

원래 잔기	예시적 치환	바람직한 치환
Ala(A)	Val;Leu; Ile	Val
Arg(R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn(N)	Gln; His; Asp; Lys; Arg	Gln
Asp(D)	Glu; Asn	Glu
Cys(C)	Ser; Ala	Ser
Gln(Q)	Asn; Glu	Asn
Glu(E)	Asp; Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
His(H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile(I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine	Leu
Leu(L)	Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys(K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met(M)	Leu; Phe; Ile	Ile
Phe(F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Val; Ser	Ser
Trp(W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val(V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신(Norleucine)	Leu

아미노산들은 통상적인 측쇄 성질에 따라 다음과 같이 그룹화될 수 있다:(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 이러한 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반한다.

본 명세서에서 용어 "아미노산 서열 변이체"는 모 항체 결합 분자(예를 들어, 인간화 혹은 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기에 아미노산 치환이 존재하는 실질적인 변이체를 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체는 모 항체 결합 분자에 비해 특정한 생물학적 특성의 변형, 예컨대 개선(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)을 갖고/갖거나 모 항원 결합 분자의 특정한 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 이는, 예를 들어, 당업계에 공지된 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기법을 이용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게 말하면, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항원 결합 분자가 파지 상에 디스플레이되어 특정 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)이 스크리닝된다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 그러한 변경이 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다.

또한, CD300c 항원 또는 그의 수용체에 대해 개선된 친화도를 갖는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 변이체가 제공된다. 그러한 변이체는 CDR 돌연변이(문헌[Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995]), 사슬 셔플링(chain shuffling)(문헌[Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992]), E.coli의 돌연변이유발(mutator) 균주의 사용(문헌[Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996]), DNA 셔플링(문헌[Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997]), 파지 디스플레이(phage display)(문헌[Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996]) 및 유성(sexual) PCR(문헌[Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998])을 비롯한 다수의 친화도 성숙 프로토콜에 의해 얻어질 수 있다. 문헌[Verhoeyen et al., Science, 239, 1534-1536, 1988]에는 이러한 친화도 성숙 방법들이 논의되어 있다.

상기 항-CD300c 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 종간 교차 반응성을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 항-CD300c 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 및 마우스 CD300c 항원 둘 모두에 대한 교차 반응성일 수 있다. 이러한 교차 반응성은 실험예 6.3 및 실험예 6.4에서 확인된다.

특정 구현예에서, 상기 신호 펩타이드는 CD8α 신호 펩타이드이거나 이를 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 GS 링커는 글라이신 및 세린으로 구성된 5개 내지 15개의 펩티드일 수 있다. 구체적으로 GS 링커는 서열번호 422의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 세포막 관통 도메인은 CD8 힌지(hinge of cluster of differentiation 8) 및/또는 CD28 세포막 관통 도메인(CD28 transmembrane domain)이거나 이를 포함할 수 있다. 상기 CD8 힌지는 서열번호 424의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 상기 CD28 세포막 관통 도메인은 서열번호 426의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD28 세포내 도메인(CD28 intracellular domain) 및/또는 CD3ζ 세포내 도메인(CD3ζ intracellular domain)이거나 이를 포함할 수 있다. 상기 CD28 세포내 도메인은 서열번호 428의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 상기 CD3ζ 세포내 도메인은 서열번호 430의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

폴리뉴클레오티드, 벡터 및 면역세포

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(예컨대 발현 벡터), 및 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 세포가 제공된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 키메라 항원 수용체를 구성하거나 이에 포함되는 아미노산 서열을 코딩하는 임의의 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열에 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상 동일성을 갖는 핵산 서열을 또한 포함할 수 있다.

상기 "벡터"는 그에 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 일 유형은 "플라스미드"로, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 벡터이며, 여기서 바이러스 유래된 DNA 또는 RNA 서열이 바이러스 내로의 패키징을 위해 벡터에 존재한다. 특정 벡터는 이것이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다(예를 들어, 세균 복제 원점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)가 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있으며, 그에 따라 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이것이 작동적으로 연결된(operatively-linked) 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 그러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 재조합 DNA 기법에서 유용한 통상적인 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 하는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.

본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포는 상기 벡터로 면역세포를 형질전환시켜 제조될 수 있다. 예컨대, 원하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 면역세포 내로 도입시킴으로써 생성될 수 있다.

일 구현예에서, 면역세포는 단핵구, 대식세포, T 세포, 자연살해세포(Natural killer cell; NK cell) 및 수지상세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 면역세포에는 암의 예방 또는 치료 용도로 사용되고 있는 면역세포라면 어떠한 면역세포라도 포함될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 면역세포는 T 세포일 수 있다. 본 발명의 목적상, T 세포는 임의의 T 세포일 수 있으며, 예컨대, 배양된 T 세포, 예를 들어 1차 T 세포, 또는 배양된 T 세포주, 예를 들어 Jurkat, SupT1 등으로부터의 T 세포, 또는 포유동물로부터 얻어진 T 세포일 수 있다. 포유동물로부터 얻어지는 경우, T 세포는 골수, 혈액, 림프절, 흉선, 또는 다른 조직 또는 체액을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다수의 공급원으로부터 얻어질 수 있다. T 세포는 또한 풍부화(enrich)되거나 정제될 수 있다. T 세포는 인간 T 세포일 수 있다. T 세포는 인간으로부터 단리된 T 세포일 수 있다. T 세포는 임의의 유형의 T 세포일 수 있으며, CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), CD4+ 헬퍼 T 세포, 예를 들어 Th1 및 Th2 세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 말초 혈액 백혈구(PBL), 종양 침윤 림프구(TIL), 기억 T 세포, 미감작 T 세포 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는 임의의 발달 단계의 것일 수 있다. T 세포는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포일 수 있다.

암의 예방 또는 치료 방법

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명의 면역세포를 이용하여 대상체에서 암을 예방 또는 치료하거나, 암의 적어도 하나의 증상 또는 징후의 중증도를 개선 또는 감소시키거나, 전이를 억제하거나, 암의 성장을 억제하는 방법이 제공된다. 본 명세서에서 "암을 예방 또는 치료"한다는 것은 암의 증식, 생존, 전이, 재발 또는 항암제 내성을 억제하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 본 발명의 면역세포를 암의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 면역세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 암 예방 또는 치료 용도가 제공된다.

본 명세서에서 용어 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 생리적 상태를 지칭한다. 본 발명에서 예방 또는 치료의 대상이 되는 암에는 그 발생 부위에 따라 대장암, 소장암, 직장암, 결장암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 혀암, 인두암, 후두암, 식도암, 자궁경부암, 자궁암, 나팔관암, 난소암, 뇌암, 두경부암, 폐암, 임파선암, 담낭암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 전립선암, 피부암(또는 흑색종), 유방암, 위암, 골암, 혈액암 등이 포함될 수 있으나, 암 세포의 표면에 CD300c 단백질을 발현하는 한 모든 암이 포함될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 암은 대장암, 직장암, 결장암, 갑상선암, 구강암, 인두암, 후두암, 자궁경부암, 뇌암, 폐암, 난소암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 혀암, 유방암, 자궁암, 위암, 골암 및 혈액암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서 상기 암은 고형암일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 항암제(예를 들어, 면역 항암제)를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. (i) 본 발명에 따른 면역세포가 (ii) 하나 이상의 면역 항암제와 병용되는 경우, (i) 및 (ii)는 동시에 투여되거나 순차적으로 투여될 수 있다.

"순차적으로 투여"된다는 것은 하나의 성분이 투여되고, 투여 직후 또는 투여 후 일정 간격을 두고 다른 성분이 투여됨을 의미하며, 이때 성분들은 어떠한 순서로도 투여될 수 있다. 즉, 면역세포가 투여된 직후 또는 투여 후 일정 간격을 두고 하나 이상의 면역 항암제가 투여될 수 있거나, 그 반대도 마찬가지로 적용된다. 또한, 하나 이상의 면역 항암제 중 어느 하나가 먼저 투여되고, 이어서 면역세포가 투여되고, 이어서 하나 이상의 면역 항암제 중 다른 하나가 투여될 수 있다.

면역 항암제는 인체의 면역세포를 활성화시켜서 암 세포를 사멸시키는 새로운 기전을 가지므로, 특정 유전자 변이가 없어도 대부분의 암에 폭넓게 사용될 수 있다는 장점을 갖는다. 또한, 면역 항암제는 환자 자신의 면역체계의 강화를 통해 암을 치료한다는 점에서 부작용이 적고 환자의 삶의 질을 높이고 생존기간도 대폭 연장되는 효과를 가져온다. 이러한 면역 항암제는 면역 관문 억제제를 포함하고, 공지의 방법에 의해 제조된 것이거나 시판되는 제품일 수 있다. 면역 항암제의 예에는 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA-4, 항-CD47, 항-KIR, 항-LAG3, 항-CD137, 항-OX40, 항-CD276, 항-CD27, 항-GITR, 항-TIM3, 항-41BB, 항-CD226, 항-CD40, 항-CD70, 항-ICOS, 항-CD40L, 항-BTLA, 항-TCR 및 항-TIGIT 항체가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 면역 항암제의 예에는 더발루맙(임핀지(Imfinzi)), 아테졸리주맙(테센트릭(Tecentriq)), 아벨루맙(바벤시오(Bavencio)), 펨브롤리주맙(키트루다(Keytruda)), 니볼루맙(옵디보(Opdivo)), αCD47, 세미플리맙(리브타요(Libtayo)), 마그롤리맙(Hu5F9-G4), 및 이필리무맙(여보이(Yervoy))이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

일 구현예에서, 면역 항암제는 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA-4, 항-CD47, 항-KIR, 항-LAG3, 항-CD137, 항-OX40, 항-CD276, 항-CD27, 항-GITR, 항-TIM3, 항-41BB, 항-CD226, 항-CD40, 항-CD70, 항-ICOS, 항-CD40L, 항-BTLA, 항-TCR 및 항-TIGIT 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 일례로, 면역 항암제는 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA-4, 및 항-CD47 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 면역 항암제는 더발루맙(임핀지(Imfinzi)), 아테졸리주맙(테센트릭(Tecentriq)), 펨브롤리주맙(키트루다(Keytruda)), 니볼루맙(옵디보(Opdivo)), αCD47, 및 이필리무맙(여보이(Yervoy))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 면역세포 및 선택적으로 하나 이상의 추가 항암제 각각은 국소 또는 전신 치료가 요망되는지 여부 및 치료될 영역에 따라 여러 방식으로 투여될 수 있다. 이러한 성분들을 대상체에 투여하는 방법은 투여 목적, 발병 부위, 대상체의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입, 국소 또는 국부 투여(예컨대 병변내 투여)일 수 있다. 예컨대 비경구 투여는 정맥내, 피하, 복강내, 폐내, 동맥내, 근육내, 직장, 질내, 관절내, 전립선내, 비내, 안구내, 방광내, 척추강내 투여 또는 심실내 투여(예를 들어 뇌실내 투여)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 병용되는 경우, 면역세포와 추가 항암제는 동일한 경로로 투여될 수 있거나 서로 상이한 경로로 투여될 수 있다.

상기 방법에서, 본 발명에 따른 면역세포의 수는 개체(환자)의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 개체 내의 종양 세포 수의 약 1배 내지 약 10배로 포함될 수 있다. 또한, 하나 이상의 추가 항암제의 유효량은 개체(환자)의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 kg당 약 0.01 mg 내지 약 100 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 50 mg이 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여될 수 있다. 그러나, 투여 경로 및 기간, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로, 본 발명의 범위는 이에 한정되지 않는다.

약학 조성물

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 면역세포를 유효 성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명에 따른 면역세포의 암 예방 또는 치료용 약제 제조용 용도가 제공된다.

상기 면역세포는 조성물에 예방적 또는 치료적 유효량으로 포함될 수 있다. 상기 약학 조성물은 암의 증식, 생존, 전이, 재발 또는 항암제 내성을 억제하기 위해 대상체에 투여될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 하나 이상의 항암제(예를 들어, 면역 항암제)를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 면역세포 및 선택적으로 상기 추가 면역 항암제는 동일한 조성물에 포함되거나 각각 별개의 조성물에 포함될 수 있다. 별개 조성물에 포함되는 경우, 상기 면역세포 및 상기 추가 면역 항암제는 각각 제제화될 수 있고, 각각 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물을 제조하기 위해, 상기 면역세포 및 선택적으로 추가 면역 항암제는 제약상 허용되는 담체 및/또는 부형제와 혼합될 수 있다. 약학 조성물은 동결건조 제제 또는 수성 용액의 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)]을 참조한다.

허용되는 담체 및/또는 부형제(안정화제 포함)는 사용되는 용량 및 농도에서 대상체에게 무독성이고, 버퍼(예를 들어 포스페이트, 시트레이트 또는 다른 유기산); 항산화제(예를 들어 아스코르브산 또는 메티오닌); 방부제(예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헤사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 이하의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질(예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린); 친수성 중합체(예를 들어 폴리비닐피롤리돈); 아미노산(예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신); 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제(예를 들어 EDTA); 당(예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨); 염 형성 반대 이온(예를 들어 나트륨); 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및(또는) 비이온계 계면활성제(예를 들어 TWEEN(등록상표), PLURONICS(등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG))을 포함할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 그 투여 경로에 따라 당업계에 공지된 적합한 형태로 제제화될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "예방적 또는 치료적 유효량" 또는 "유효량"은 대상체의 암을 예방 또는 치료하는 데 유효한 조성물의 유효 성분의 양으로서, 의학적 처치에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 암을 예방 또는 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 이때, 상기한 요소들을 모두 고려하여 최소한의 부작용 또는 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물 내의 유효 성분 각각의 유효량에 대해서는 상기 암의 예방 또는 치료 방법 섹션에 기재된 설명을 참조한다.

다른 일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 암의 증식, 생존, 전이, 재발 또는 항암제 내성을 억제할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예

I. 항-CD300c 단클론 항체의 제조

실시예 1. 항-CD300c 단클론 항체의 제조

실시예 1.1. 항-CD300c 단클론 항체 라이브러리 제작

항-CD300c 단클론 항체를 선별하기 위하여, 람다 파지 라이브러리, 카파 파지 라이브러리, VH3VL1 파지 라이브러리, 및 OPALTL 파지 라이브러리를 이용하여 바이오패닝(biopanning)을 실시하였다. 구체적으로, 면역 시험관(immunotube)에 5 μg/mL 농도의 CD300c 항원을 첨가하고, 1시간 동안 반응시켜 시험관 표면에 항원을 흡착시켰다. 그 후, 3%의 스킴 밀크(skim milk)를 첨가하여 비특이적 반응을 억제시킨 후, 다시 3%의 스킴 밀크에 분산되어 있는 10¹² PFU의 항체 파지 라이브러리를 각각의 면역 시험관에 첨가하여 항원과 결합시켰다. 이어서, TBST(tris buffered saline-Tween20) 용액을 이용하여 3회 세척하여, 비특이적으로 결합되어 있는 파지를 제거한 후, CD300c 항원 특이적으로 결합되어 있는 단쇄 가변 분절(single-chain variable fragment; scFv) 파지 항체를 100 mM의 트리에틸아민 용액을 이용하여 용출시켰다. 용출된 파지는 1.0 M의 Tris-HCl 완충용액(pH 7.8)을 이용하여 중화시킨 후에, 대장균 ER2537에 처리하여 37℃에서 1 시간 동안 감염시키고, 감염시킨 대장균은 카르베니실린이 포함되어 있는 LB 한천 배지에 도포하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이어서, 형성된 대장균 콜로니를 3 mL의 SB(super broth)-카르베니실린 배양액을 이용하여 현탁시키고, 일부는 15% 글리세롤을 첨가하여 -80℃에서 사용 전까지 보관하였으며, 나머지는 SB-카르베니실린-2% 포도당 용액에 재접종하여 37℃에서 배양하였다. 획득된 배양액을 원심분리하여 파지 입자가 포함되어 있는 상층액을 이용하여 다시 바이오패닝을 3회 반복함으로써 항원 특이적인 항체를 확보 및 농축하였다.

바이오패닝을 3회 반복한 후에 항체 유전자를 포함하고 있는 대장균을 카르베니실린을 포함하는 LB 한천 배지에 도포하여 37℃에서 16 시간 동안 배양하고, 형성된 대장균 콜로니를 다시 SB-카르베니실린-2% 포도당 용액에 재접종하여 37℃에서 흡광도(OD600nm)가 0.5가 될 때까지 배양한 후에, IPTG를 첨가하고 30℃에서 16시간 동안 추가 배양하였다. 이후, 원형질막 추출(periplasmic extraction)을 실시하였으며, 상기 결과를 통하여 CD300c 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 라이브러리 풀(library pool)을 일차적으로 확보하였다.

실시예 1.2. 항-CD300c 단클론 항체 선별

CD300c 항원에 높은 결합력을 가지고 특이적으로 결합하는 항-CD300c 단클론 항체를 선별하기 위하여, 실시예 1.1과 동일한 방법으로 확보된 라이브러리 풀을 이용하여 ELISA를 실시하였다. 보다 자세하게는, 코팅 완충용액(coating buffer; 0.1 M의 sodium carbonate, pH 9.0)에 CD300c 항원과 CD300a 항원을 각각 웰 당 5 μg/mL의 농도가 되도록 ELISA 플레이트에 분주한 후 실온에서 3 시간 동안 반응시켜 항원을 플레이트에 결합시켰다. 그 후, PBST(phosphate buffered saline-Tween20)를 이용하여 3회 세척하여 결합되지 않은 항원을 깨끗이 제거해준 후에, 각각의 웰에 2% BSA(bovine serum albumin)이 첨가되어 있는 PBST를 350 μL 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 반응시키고, PBST를 이용하여 다시 세척하였다. 이어서, 실시예 1.1과 동일한 방법으로 확보된 scFv를 포함하고 있는 periplasmic extract를 25 μg씩 첨가하고, 1 시간 동안 실온에서 반응시켜 항원과 결합시켰다. 1 시간 후에 PBST를 이용하여 3회 세척하여 결합되지 않은 scFv를 제거해준 후에, 4 μg/mL의 검출용 항체를 첨가하고 다시 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이후, PBST를 이용하여 결합되지 않은 검출용 항체를 제거해준 후에 HRP가 결합되어 있는 항-토끼 IgG를 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 반응시키고, 다시 PBST를 이용하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 이어서, TMB 용액을 첨가하고 10 분 동안 반응시켜 발색시킨 후에, 2 N의 황산 용액을 첨가하여 발색 반응을 종료시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하여, CD300c 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하였다.

실시예 1.3. 항-CD300c 단클론 항체 서열 확인

실시예 1.2와 동일한 방법을 이용하여 선별된 항-CD300c 단클론 항체의 염기 서열을 확인하였다. 보다 자세하게는, 선별된 항체 클론들을 플라스미드 미니프렙 키트(plasmid miniprep kit)를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출한 후에, DNA 시퀀싱을 실시하여 CDR(complementarity-determining regions) 서열을 분석하였다. 그 결과, 서로 다른 아미노산 서열을 가지고 있는 25종의 항-CD300c 단클론 항체를 확보하였다. 이러한 25종의 항-CD300c 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 하기 표 2 및 3에 나타내었다.

항체 명칭	기원(파지 라이브러리)	중쇄 가변 영역(핵산)	경쇄 가변 영역(핵산)	중쇄 가변 영역(아미노산)	경쇄 가변 영역(아미노산)
CK1	카파	도 1aa(서열번호 301)	도 1ab (서열번호 302)	도 1ac (서열번호 303)	도 1ad (서열번호 304)
CK2	카파	도 1ba(서열번호 305)	도 1bb (서열번호 306)	도 1bc (서열번호 307)	도 1bd (서열번호 308)
CK3	카파	도 1ca(서열번호 309)	도 1cb (서열번호 310)	도 1cc (서열번호 311)	도 1cd (서열번호 312)
CL4	람다	도 1da(서열번호 313)	도 1db (서열번호 314)	도 1dc (서열번호 315)	도 1dd (서열번호 316)
CL5	람다	도 1ea(서열번호 317)	도 1eb (서열번호 318)	도 1ec (서열번호 319)	도 1ed (서열번호 320)
CL6	VH3VL1	도 1fa(서열번호 321)	도 1fb (서열번호 322)	도 1fc (서열번호 323)	도 1fd (서열번호 324)
CL7	VH3VL1	도 1ga(서열번호 325)	도 1gb (서열번호 326)	도 1gc (서열번호 327)	도 1gd (서열번호 328)
CL8	VH3VL1	도 1ha(서열번호 329)	도 1hb (서열번호 330)	도 1hc (서열번호 331)	도 1hd (서열번호 332)
CL9	VH3VL1	도 1ia(서열번호 333)	도 1ib (서열번호 334)	도 1ic (서열번호 335)	도 1id (서열번호 336)
CL10	VH3VL1	도 1ja(서열번호 337)	도 1jb (서열번호 338)	도 1jc (서열번호 339)	도 1jd (서열번호 340)
SK11	카파	도 1ka(서열번호 341)	도 1kb (서열번호 342)	도 1kc (서열번호 343)	도 1kd (서열번호 344)
SK12	카파	도 1la(서열번호 345)	도 1lb (서열번호 346)	도 1lc (서열번호 347)	도 1ld (서열번호 348)
SK13	카파	도 1ma(서열번호 349)	도 1mb (서열번호 350)	도 1mc (서열번호 351)	도 1md (서열번호 352)
SK14	카파	도 1na(서열번호 353)	도 1nb (서열번호 354)	도 1nc (서열번호 355)	도 1nd (서열번호 356)
SK15	카파	도 1oa(서열번호 357)	도 1ob (서열번호 358)	도 1oc (서열번호 359)	도 1od (서열번호 360)
SK16	카파	도 1pa(서열번호 361)	도 1pb (서열번호 362)	도 1pc (서열번호 363)	도 1pd (서열번호 364)
SK17	카파	도 1qa(서열번호 365)	도 1qb (서열번호 366)	도 1qc (서열번호 367)	도 1qd (서열번호 368)

항체 명칭	기원(파지 라이브러리)	중쇄 가변 영역(핵산)	경쇄 가변 영역(핵산)	중쇄 가변 영역(아미노산)	경쇄 가변 영역(아미노산)
SL18	람다	도 1ra(서열번호 369)	도 1rb(서열번호 370)	도 1rc (서열번호 371)	도 1rd (서열번호 372)
CB301_H3L1_A10	VH3VL1	도 1sa(서열번호 373)	도 1sb(서열번호 374)	도 1sc (서열번호 375)	도 1sd (서열번호 376)
CB301_H3L1_A12	VH3VL1	도 1ta(서열번호 377)	도 1tb(서열번호 378)	도 1tc (서열번호 379)	도 1td (서열번호 380)
CB301_H3L1_E6	VH3VL1	도 1ua(서열번호 381)	도 1ub(서열번호 382)	도 1uc (서열번호 383)	도 1ud (서열번호 384)
CB301_H3L1_F4	VH3VL1	도 1va(서열번호 385)	도 1vb(서열번호 386)	도 1vc (서열번호 387)	도 1vd (서열번호 388)
CB301_H3L1_G11	VH3VL1	도 1wa(서열번호 389)	도 1wb(서열번호 390)	도 1wc (서열번호 391)	도 1wd (서열번호 392)
CB301_OPALTL_B5	OPALTL	도 1xa(서열번호 393)	도 1xb(서열번호 394)	도 1xc (서열번호 395)	도 1xd (서열번호 396)
CB301_OPALTL_E6	OPALTL	도 1ya(서열번호 397)	도 1yb(서열번호 398)	도 1yc (서열번호 399)	도 1yd (서열번호 400)

상기 표 2 및 표 3에 언급된 각각의 도면에서, CDR 부위(CDR1, CDR2 및 CDR3)는 밑줄을 그어 순서대로 표시하였다(CDR1이 먼저 표시되고, 이어서 CDR2가 표시되고, 이어서 CDR3이 표시됨). 또한, 각각의 도면에 포함된 CDR 부위는 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 서열번호로 표시하였다:

	항체	중쇄/경쇄	아미노산/DNA	CDR1	CDR2	CDR3
도 1aa	CK1	중쇄	DNA	서열번호 1	서열번호 2	서열번호 3
도 1ab		경쇄	DNA	서열번호 4	서열번호 5	서열번호 6
도 1ac		중쇄	아미노산	서열번호 7	서열번호 8	서열번호 9
도 1ad		경쇄	아미노산	서열번호 10	서열번호 11	서열번호 12
도 1ba	CK2	중쇄	DNA	서열번호 13	서열번호 14	서열번호 15
도 1bb		경쇄	DNA	서열번호 16	서열번호 17	서열번호 18
도 1bc		중쇄	아미노산	서열번호 19	서열번호 20	서열번호 21
도 1bd		경쇄	아미노산	서열번호 22	서열번호 23	서열번호 24
도 1ca	CK3	중쇄	DNA	서열번호 25	서열번호 26	서열번호 27
도 1cb		경쇄	DNA	서열번호 28	서열번호 29	서열번호 30
도 1cc		중쇄	아미노산	서열번호 31	서열번호 32	서열번호 33
도 1cd		경쇄	아미노산	서열번호 34	서열번호 35	서열번호 36
도 1da	CL4	중쇄	DNA	서열번호 37	서열번호 38	서열번호 39
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상기와 같이, CD300c 항원에 높은 결합력을 가지고 특이적으로 결합하는 암의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 25종의 항-CD300c 단클론 항체가 확인되었다.

실시예 1.4. 항-CD300c 단클론 항체의 제작 및 정제

실시예 1.3을 통해 확인한 항-CD300c 단클론 항체의 염기서열을 이용하여 항체를 발현할 수 있는 중쇄와 경쇄를 분리한 발현용 벡터를 제작하였다. 보다 자세하게는, 분석한 CDR 서열을 이용하여 pCIW3.3벡터에 각각 중쇄와 경쇄를 발현할 수 있도록 유전자를 삽입하여 제작하였다. 제작한 중쇄와 경쇄 발현용 벡터를 PEI(polyethylenimine)와 1:1의 질량비로 섞어 293T 세포에 트랜스펙션하여 항체의 발현을 유도한 후 8 일차에 배양액을 원심분리 하여 세포를 제거하고 배양액을 획득하였다. 획득한 배양액은 여과 과정을 거친 후 0.1 M NaH2PO4 및 0.1 M Na2HPO4(pH 7.0)이 혼합되어 있는 용액을 이용하여 재현탁시켰다. 재현탁시킨 용액은 단백질 A 비드(GE healthcare)를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, 최종적으로 용리 완충액(Thermofisher)를 이용하여 용출시켰다.

제작된 항체를 확인하기 위하여, 정제된 항체 5 μg에 각각 환원성 샘플 완충액과 비환원성 샘플 완충액에 첨가하고, pre-made SDS PAGE(Invitrogen)을 이용하여 전기영동을 실시하였고, 이후 쿠마시 블루를 이용하여 단백질을 염색하였다. 비환원 조건의 결과를 도 4에, 환원 조건의 결과를 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이, 순도 높은 항-CD300c 단클론 항체가 제작 및 정제되었음이 확인되었다.

II. 암 세포에서의 CD300c의 발현 및 항-CD300c 단클론 항체의 CD300c 항원 결합

실험예 1. 암 세포주에서 CD300c의 발현 확인

CD300c가 다양한 암 세포에서 발현되고 있는지를 평가하기 위하여, 암 세포주 MKN45(인간 위암 세포주), IM95(인간 위암 세포주), HT-29(인간 대장암 세포주), A549(인간 폐암 세포주), HCT116(인간 대장암 세포주), MDA-MB-231(인간 유방암 세포주), HepG2(인간 간암 세포주) 등의 다양한 세포주를 배양하여 mRNA 및 단백질 수준에서 CD300c의 발현을 평가하였다. 또한, 면역세포인 THP-1(인간 단핵구 세포주)에 대해서도 평가를 수행하였다. 이때, HEK293T(일반 세포주)를 대조군으로 사용하였다.

한편, 단백질의 발현은 웨스턴 블랏과 형광표지된 세포를 유세포분석(FACS)을 이용하여 확인하였다. 구체적으로, 배양한 각 세포주를 4% 포름알데히드로 고정시킨 후에, 5% 노말(normal) 우혈청 알부민을 이용하여 차단하였다. 이어서, 0.5 μg의 eFluor660 표지된 항-CD300c 항체(Invitrogen)를 이용하여 염색하였다. 그 후, 형광표지된 세포를 유세포분석기(FACS)를 이용하여 확인하였다.

그 결과, 대장암, 폐암, 유방암 등 다양한 암 세포에서 CD300c 항원이 mRNA 및 단백질 수준에서 발현됨을 확인하였다. 또한, 도 6에 도시된 바와 같이, 유세포분석기(FACS)를 이용한 분석 결과, 일반 세포주(HEK293T)와 비교하여 인간 폐암 세포주(A549) 및 인간 단핵구 세포주(THP-1)에서 훨씬 많은 CD300c가 발현됨을 확인하였다.

실험예 2. 항-CD300c 단클론 항체의 항원 결합능(Binding affinity) 확인

실시예 1에서 제작된 항-CD300c 단클론 항체의 항원 결합능을 확인하기 위하여 결합 ELISA를 실시하였다. 보다 자세하게는, 코팅 완충 용액(0.1M의 탄산나트륨, pH 9.0)에 CD300c 항원(11832-H08H, Sino Biological) 또는 CD300a 항원(12449-H08H, Sino Biological)을 각각 웰당 8 μg/mL의 농도가 되도록 ELISA 플레이트에 분주한 후 실온에서 3 시간 동안 반응시켜 항원을 플레이트에 결합시켰다. 이어서, PBST를 이용하여 3회 세척하여 결합되지 않은 항원을 깨끗이 제거해준 후에, 각각의 웰에 5% BSA(bovine serum albumin)RK 첨가되어 있는 PBST를 300 μL 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 반응시키고, PBST를 이용하여 다시 세척하였다. 그 후, 항-CD300c 단클론 항체를 4배 희석하여 넣고 1 시간 동안 실온에서 반응시켜 항원과 결합시켰다. 1 시간 후에 PBST를 이용하여 3회 세척하여 결합되지 않은 항-CD300c 단클론 항체를 제거해준 후에, 4 μg/mL의 검출용 항체(HRP conjugated anti-Fc IgG)를 첨가하고 다시 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 후, PBST를 이용하여 결합되지 않은 검출용 항체를 제거해준 후에 TMB 용액을 첨가하고 10 분 동안 반응시켜 발색 시킨 후에, 2 N의 황산 용액을 첨가하여 발색 반응을 종료시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하여, CD300c 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하였다. 그 결과는 하기 표 5 및 도 7에 나타내었다.

표 5에 나타난 바와 같이, 항-CD300c 단클론 항체의 EC50(The effective concentration of drug that causes 50% of the maxium response)을 측정한 결과, 4개 클론(CK3, CL8, SK15, SK16)을 제외하고 나머지 14개 클론 모두 0.2 μg/mL 이하로서 결합 친화력(Binding affinity)이 높은 것을 확인하였다. 또한, 도 7에 도시된 바와 같이, 결합 ELISA의 결과에 따른 S자형 곡선(sigmoid curve)에서도 본 발명의 항-CD300c 단클론 항체가 강한 결합력으로 CD300c 항원에 결합하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3. CD300c 항원에 대한 항-CD300c 단클론 항체의 결합 특이성 확인

항-CD300c 단클론 항체인 CL7의 CD300c 항원에 대한 특이성을 확인하기 위하여, CL7이 기존에 CD300c 항원과 길항 작용을 하는 것으로 알려져 있을 뿐만 아니라, 그와 단백질 서열이 유사한 CD300a 항원에 대해 교차 반응성을 나타내는지 여부를 추가로 확인하였다. 보다 자세하게는, CD300a 항원(입수처: Sino Biological)을 0.039, 0.63, 및 10 μg/mL의 농도로 처리한 후, 실험예 2와 동일한 방법으로 결합 ELISA를 실시하였다. 그 결과를 도 36에 나타내었다.

도 36에 도시된 바와 같이, 항-CD300c 단클론 항체는 CD300c 이외의 항원에는 결합하지 않아 CD300c 항원에만 높은 결합 특이성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

III. CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조 및 그의 항암 효과 확인

실시예 2. CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 발현 벡터의 제조

CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제조하기 위하여, pLVX-Puro 벡터(Addgene)에, 합성된 단백질이 세포막을 통과하여 정확한 위치로 이동하도록 하는 서열번호 302의 아미노산 서열을 포함하는 CD8α 신호 펩타이드(CD8α signal peptide, DNA 서열은 서열번호 301), CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 각 서열번호 412, 414, 416, 418, 420의 아미노산 서열을 포함하는 CK1, CL6, CL7, CL10, SL18 각각의 단쇄 가변 분절(anti-CD300c single chain variable fragment; aCD300c scFv, DNA 서열은 각각 서열번호 411, 413, 415, 417, 419) 또는 서열번호 402의 아미노산 서열을 포함하는 CD300c ECD(extracellular domain) 항원(DNA 서열은 서열번호 401), 서열번호 422의 아미노산 서열을 포함하는 GS 링커(DNA 서열은 서열번호 421), 그리고 세포막 관통 도메인(transmembrane domain)으로서 서열번호 424의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지(hinge of cluster of differentiation 8, DNA 서열은 서열번호 423), 서열번호 426의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 세포막 관통 도메인(CD28 transmembrane domain, DNA 서열은 서열번호 425), 그리고 대식세포 활성화 신호 전달을 위한 세포질 내 도메인(intracytoplasmic domain)으로서 서열번호 428의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 세포내 도메인(CD28 intracellular domain, DNA 서열은 서열번호 427), 및 서열번호 430의 아미노산 서열을 포함하는 CD3ζ 세포내 도메인(CD3ζ intracellular domain, DNA 서열은 서열번호 429)을 순서대로 삽입하여, CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 발현 벡터(pLVX-Puro/aCD300c scFv 또는 pLVX-Puro/CD300c ECD-CAR)를 제조하였다. 제조한 각 벡터의 유전자 및 단백질 서열 조합은 표 6에 나타내었다. 이와 관련된 유전자의 배열의 모식도는 도 43에 나타내었으며, 제작된 벡터 맵의 예시는 도 44에 나타내었다.

CAR 명	DNA 서열 조합	단백질 서열 조합	서열번호
CK1 CAR	서열번호 409, 411, 421, 423, 425, 427, 429의 조합	서열번호 410, 412, 422, 424, 426, 428, 430의 조합	431 및 432
CL6 CAR	서열번호 409, 413, 421, 423, 425, 427, 429의 조합	서열번호 410, 414, 422, 424, 426, 428, 430의 조합	433 및 434
CL7 CAR	서열번호 409, 307, 421, 423, 425, 427, 429의 조합	서열번호 410, 416, 422, 424, 426, 428, 430의 조합	435 및 436
CL10 CAR	서열번호 409, 309, 421, 423, 425, 427, 429의 조합	서열번호 410, 418, 422, 424, 426, 428, 430의 조합	437 및 438
SL18 CAR	서열번호 409, 311, 421, 423, 425, 427, 429의 조합	서열번호 410, 420, 422, 424, 426, 428, 430의 조합	439 및 440
CD300c ECD CAR	서열번호 409, 401, 421, 423, 425, 427, 429의 조합	서열번호 410, 402, 422, 424, 426, 428, 430의 조합	441 및 442

실시예 3. CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 발현용 재조합 렌티바이러스의 제조

CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 발현용 재조합 렌티바이러스 제조에 필요한 HEK293T 세포주(ATCC)를 다음과 같이 준비하였다. 세포의 배양에 사용한 완전 배지는 신선한 DMEM 배지(Gibco)에 열처리한 FBS(fetal bovine serum)를 10%의 농도가 되도록 첨가하고, 1X의 Penicillin-Streptomycin(Gibco)을 첨가한 후에, 상하로 전도시켜 균일하게 혼합한 후에 37℃로 예열하여 사용하였다. 그리고 HEK293T 세포주는 냉동보관된 세포 stock을 사용 전에 신속히 37℃ 항온 수조로 전이하여, 2 내지 3분 동안 급속 해동한 후에, 30 mL의 완전배지에 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 그리고 세포 포화도가 80% 이상이 되었을 때, 계대 배양하며 유지하였다. 렌티바이러스 트랜스펙션(transfection)을 위해서는, HEK293T 세포주를 1 내지 2 X 10⁶ 세포의 농도로 10 mL의 완전 배지에 접종하고, 16시간 동안 배양한 후에, 렌티바이러스 트랜스펙션을 실시하였다.

CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 발현용 렌티바이러스 트랜스펙션은 Lenti-X^TM Expression System(Takara) 키트를 이용하였다. 실시예 2과 동일한 방법으로 제조된 7 μg의 pLVX-Puro/aCD300C scFv 또는 pLVX-Puro/CD300c ECD-CAR 발현 벡터에 sterile water(Invitrogen)를 첨가하여 600 μL가 되도록 맞춰준 후에 Lenti-X^TM Expression System내의 Lenti-X Packaging Single Shots tube에 넣어 혼합하여 nanoparticle complex solution을 제조하였다. 그리고 상온에서 10분간 반응시킨 nanoparticle complex solution을 미리 준비된 HEK293T 세포에 한 방울씩 첨가한 후에 좌우로 흔들면서 혼합하였다. 그리고 배양기에서 4시간 동안 배양한 후에, 새로운 완전배지를 6 mL을 추가로 첨가한 후에, 48시간 동안 배양하였다. 배양 후에는 상층액을 수거하고 원심분리로 세포 잔여물을 제거한 후에 0.45 μm 필터로 거르고, 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다.

획득된 렌티바이러스 상층액 중 20 μL를 Lenti-X^TM Expression System 내의 GoStix cassette sample well(S)에 첨가하고, Chase 용액 3 방울을 sample well에 떨어뜨린 후에 상온에서 10분 동안 반응시킨 뒤, 밴드의 유무로 5 X 10⁵ IFU/mL 이상의 유효 용량의 재조합 렌티바이러스를 획득하였다는 것을 확인하였다.

그 결과, CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 재조합 렌티바이러스가 제조되었다는 것을 확인하였다. 제조한 렌티바이러스가 CK1, CL6, CL7, CL10, SL18 각각의 단쇄 가변 분절의 아미노산 서열을 각각 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 것을 확인하였다.

실시예 4. CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 Jurkat 세포의 제조

CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 Jurkat 세포를 제조하기 위하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 제조된 재조합 렌티바이러스를 Jurkat 세포주에 트랜스펙션시켰다. 보다 자세하게는, 0.1 내지 10 MOI의 재조합 렌티바이러스를 8 μg/Ml의 polybrene(Merk)이 첨가된 완전배지에 접종하고 상하로 전도시켜 균일하게 혼합하였다. 그리고 혼합물을 6-웰 플레이트에 준비된 Jurkat 세포주에 1 Ml씩 첨가한 후에, 1,800 rmp으로 45 내지 90분 동안 원심분리하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그리고 24시간 후에, 5X10⁵ cells/Ml의 농도로 계대배양하였다.

트랜스펙션된 Jurkat 세포주에서 CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체가 정상적으로 발현되는지 확인하기 위하여, 배양된 Jurkat 세포의 총 단백질을 PRO-PREP용액(iNtRON)을 이용하여 수득하였다. 수득된 단백질의 농도는 microBCA protein assay kit(Thermofisher)을 사용하여 측정한 후에, 동일한 양의 단백질을 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 보다 자세하게는, 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE(Invitrogen)에 전기영동한 후에, 전기영동된 단백질들을 니트로셀룰로스 막(Invitrogen)으로 이동시켰다. 이어서, 단백질이 결합된 니트로셀룰로스 막을 5% skim milk(BD) 용액을 이용하여 블록킹시켜 비특이적 항체 반응을 차단하고, 1차 항체로서 항-CD3 항체 및 항-GAPDH 항체(Cell Signaling Technologies, USA)를 1:1,000의 농도가 되도록 각각 5% skim milk를 이용하여 희석하고, 이를 니트로셀룰로스 막에 처리하고 반응시킨 후에, 결합되지 않은 항체는 제거하였다. 그리고 2차 항체로서 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase; HRP)-접합 2차 항체(Cell Signaling Technologies)를 1:2,000의 농도로 희석하여 처리하였다. ECL solution(Thermofisher)을 처리하여 발색반응을 유도한 후에, Luminescent 이미지 분석장치 iBright1500(Invitrogen)을 사용하여 단백질의 양을 정량하였다. 웨스턴 블롯팅 결과는 도 45에 나타내었다.

도 45에 나타난 바와 같이, 항-CD3 항체가 결합된 CD3ζ 세포내 도메인을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체가 발현되는 Jurkat 세포주가 제조된 것을 확인하였다.

추가적으로, CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체의 발현 정도를 유세포분석기(FACS)를 이용하여 확인하였다. 보다 자세하게는, Jurkat 세포주에 PE-융합 항-IgG 항체(Jackson immunoresearch)를 처리하고 30분 동안 4℃에서 배양하여 반응시킨 후에, 유세포분석기를 이용하여 확인하였다.

유세포분석 결과, CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체가 발현되는 Jurkat 세포주가 제조된 것을 확인하였다.

실험예 4. CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 Jurkat 세포의 항암 효과

CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 Jurkat 세포의 항암 효과를 확인하기 위하여, A549 세포주를 이용하여 암세포 사멸 효과를 확인하였다. 보다 자세하게는, A549 세포주를 96-웰 플레이트에 1 X 10⁵ cells/mL의 농도로 접종하였다. 그리고 실시예 4에 기재된 방법과 동일한 방법으로 제조된 CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 Jurkat 세포를 암세포에 20:1의 농도가 되도록 처리하고 공동 배양하였다. 대조군으로 렌티바이러스로 트랜스펙션되지 않은 Jurkat 세포를 사용하였다. 24시간 동안 공동 배양한 후에, 각 웰로부터 공동배양한 Jurkat 세포주를 제거하고, CCK-8(Dojindo)를 이용하여 1시간 동안 반응시킨 후에, OD_450nm에서 흡광도를 측정하여 암세포 사멸 정도를 확인하였다. 그 결과는 도 46에 나타내었다.

도 46에 나타난 바와 같이, CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 Jurkat 세포주는 A549 세포주에 대하여 항암 효과를 나타내며, 렌티바이러스로 트랜스펙션하지 않은 Jurkat 세포주보다 높은 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포주를 이용하면, 면역세포주를 이용한 암 치료 효과를 증가시켜, 효과적으로 암을 치료할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, CD300c 항원을 표면에 발현하는 암 세포에 대해서만 특이적으로 반응하기 때문에, 부작용을 감소시키는 동시에 치료 효과는 극대화할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

IV. 항-CD300c 단클론 항체의 항암 효과

실험예 5. 항-CD300c 단클론 항체의 투여에 따른 항암 효과 확인

실험예 5.1. T 세포 활성화 효과 확인

실시예 1에서 제조된 항-CD300c 단클론 항체가 T 세포 활성화를 통해 항암 효과를 나타낼 수 있는지 확인하기 위하여, 인간 T 세포에서 항-CD300c 단클론 항체의 처리에 따른 IL-2(Interleukin-2)의 생산량을 확인하였다. IL-2는 T 세포의 성장, 증식 및 분화를 도와주는 면역 인자로서, IL-2의 생성량이 증가하는 것은 T 세포의 분화, 증식, 및 성장이 증가하도록 유도하는 자극이 증가됨으로써 T 세포를 활성화시킨다는 것을 의미한다. 구체적으로, 각각 2 μg/웰의 농도가 되도록 항-CD3 단클론 항체와 항-CD28 단클론 항체를 96-웰 플레이트에 첨가하고 24 시간 동안 고정시킨 후에, 1x10⁵ 세포/웰의 Jurkat T 세포(인간 T 림프구 세포주)와 10 μg/웰의 항-CD300c 단클론 항체를 함께 처리하였다. 이어서, IL-2의 생성량을 ELISA 키트(IL-2 Quantikine kit, R&D systems)를 이용하여 측정한 후에, 항-CD300c 단클론 항체를 처리하지 않은 대조군과 비교하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 도시된 바와 같이, 항-CD3 단클론 항체와 항-CD28 단클론 항체를 처리하여 활성화시킨 Jurkat T 세포에 항-CD300c 단클론 항체를 처리한 경우에 IL-2의 생성량이 증가된 것을 확인하였으며, 상기 결과를 통하여, 항-CD300c 단클론 항체가 T 세포를 활성화시킬 수 있다는 것과, 이를 통하여, 항암 면역 작용을 유발하여 암 조직의 성장을 억제할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5.2. M1 마크로파지로의 분화 촉진 확인 (I): 마크로파지 분화 마커(TNF-α) 생성량 측정

실시예 1에서 선별된 항-CD300c 단클론 항체가 단핵구 세포의 M1 마크로파지로의 분화를 촉진시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 96-웰 플레이트에 1.5x10⁴ 세포/웰로 THP-1(인간 단핵구 세포주)을 분주하고, 10 μg/mL의 항-CD300c 단클론 항체 및/또는 100 ng/mL의 LPS를 처리하였다. 48시간 동안 반응시킨 후에, M1 마크로파지의 분화 마커인 TNF-α(Tumor necrosis factor- α)의 생성량을 ELISA 키트(Human TNF-α Quantikine kit, R&D Systems)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.

도 9에 도시된 바와 같이, LPS를 단독으로 처리한 대조군(Con)과 비교하여 CL4, CL7, CL10, 및 SL18 항-CD300c 단클론 항체가 약 2배 이상 TNF-α의 생성량이 증가된 것을 확인하였다.

또한, 도 10에 도시된 바와 같이, LPS를 단독으로 처리한 대조군(Con)과 비교하여 LPS의 처리 없이 항-CD300c 단클론 항체를 단독으로 처리한 실험군들에서 모두 대조군과 비교하여 TNF-α의 생성량이 증가된 것을 확인하였다.

실험예 5.3. M1 마크로파지로의 분화능의 항체 농도 의존적 증가 확인

항-CD300c 단클론 항체가 M1 마크로파지로의 분화를 유도하는 것이 농도에 따라 증가된다는 것을 확인하기 위하여, 실험예 5.2와 동일한 방법으로 TNF-α의 생성량을 확인하였다. 항-CD300c 단클론 항체를 10, 1, 및 0.1 μg/mL의 농도로 처리하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 도시된 바와 같이, 항-CD300c 단클론 항체(CL7, CL10 또는 SL18)의 처리 농도가 증가할수록 TNF-α의 생성량 또한 증가되는 것을 확인하였다.

보다 세부적인 농도를 확인하기 위하여, 항-CD300c 단클론 항체(CL7)를 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 0.157, 및 0.079 μg/mL의 농도로 처리하고, TNF-α의 생성량을 확인하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 도시된 바와 같이, TNF-α의 생성량은 처리된 항-CD300c 단클론 항체의 농도가 증가함에 따라 증가되는 것을 확인하였다.

실험예 5.4. M1 마크로파지로의 분화능 촉진 확인 (II): 세포 형태 관찰

항-CD300c 단클론 항체를 단핵구 세포에 처리하였을 때 M1 마크로파지로의 분화 양상을 세포 형태로 확인하기 위하여, THP-1에 10 μg/ml의 항-CD300c 단클론 항체를 처리하고, 48시간 동안 배양한 후에 세포의 형태를 현미경 하에서 관찰하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 도시된 바와 같이, 항-CD300c 단클론 항체를 처리한 실험군(CL7)의 경우에 THP-1 세포의 형태가 부유 세포(suspension cell)에서 M1 마크로파지의 형태인 원형의 부착 세포로 변하는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 항-CD300c 단클론 항체의 처리에 의하여 단핵구 세포의 M1 마크로파지로의 분화가 촉진되는 것을 확인하였다.

실험예 5.5. M1 마크로파지로의 분화능 촉진 재확인

CL7 항-CD300c 단클론 항체가 인간 단핵구 세포의 M1 마크로파지로의 분화를 촉진시키는지 재확인하기 위하여, TNF-α, IL-1β(Interleukin-1β), 및 IL-8(Interleukin-8)의 분비량을 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 보다 자세하게는 96-웰 플레이트에 1.5x10⁴ 세포/웰로 THP-1을 분주하고, 10 μg/mL의 항-CD300c 단클론 항체를 처리하였다. 48 시간 동안 반응시킨 후에, M1 마크로파지의 분화 마커인 TNF-α, IL-1β 및 IL-8의 생성량을 ELISA 키트(Human TNF-α Quantikine kit, R&D Systems)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에 도시된 바와 같이, 항-CD300c 단클론 항체를 처리하지 않은 대조군(Con)과 비교하여 항-CD300c 단클론 항체를 처리한 실험군(CL7)에서 세 종류의 M1 마크로파지 분화 마커가 모두 증가된 것을 확인하였다.

실험예 5.6. M2 마크로파지의 M1 마크로파지로의 재분화능 확인

항-CD300c 단클론 항체가 M2 마크로파지를 M1 마크로파지로 재분화시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 96-웰 플레이트에 1.5x10⁴ 세포/웰로 THP-1을 분주하고, 320 nM의 PMA를 처리하고 6 시간 동안 전처리한 후에, 20 ng/mL의 IL-4(Interleukin-4) 및 IL-13(Interleukin-13), 그리고 10 μg/mL의 항-CD300c 단클론 항체를 처리하고 18 시간 동안 반응시켰다. TNF-α, IL-1β 및 IL-8의 생성량을 ELISA 키트로 확인하였다. 그 결과를 도 21 내지 도 23에 나타내었다.

도 21 내지 도 23에 도시된 바와 같이, PMA를 전처리하지 않은 경우에는 IL-4 및 IL-13과 항-CD300c 단클론 항체를 함께 처리한 실험군에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-8의 생성량이 증가되었으며, PMA를 전처리한 경우에도 동일하게 IL-4 및 IL-13과 항-CD300c 단클론 항체를 함께 처리한 실험군에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-8의 생성량이 증가된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 항-CD300c 단클론 항체가 M2 마크로파지를 다시 M1 마크로파지로 효과적으로 재분화시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5.7. M1 마크로파지로의 분화능 및 재분화능 확인

항-CD300c 단클론 항체의 M1 마크로파지로의 분화능 및 재분화능을 확인하기 위하여, 96-웰 플레이트에 1.5x10⁴ 세포/웰로 THP-1을 분주하고, 10 μg/mL의 항-CD300c 단클론 항체를 48 시간 동안 전처리하고, 100 ng/mL의 PMA, 100 ng/mL의 LPS, 그리고 20 ng/mL의 IL-4 및 IL-13을 처리하고 24 시간 동안 반응시켰다. TNF-α의 생성량을 ELISA 키트로 확인하였다. 그 결과를 도 24에 나타내었다.

도 24에 도시된 바와 같이, PMA를 단독으로 처리한 M0 마크로파지 대조군, LPS를 단독으로 처리한 M1 마크로파지 대조군, 그리고 IL-4 및 IL-13을 단독으로 처리한 M2 마크로파지 대조군과 비교하여 항-CD300c 단클론 항체를 전처리한 실험군에서 모두 TNF-α의 생성량이 유의성있게 증가된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 항-CD300c 단클론 항체는 M0 마크로파지의 M1 마크로파지로의 분화능, THP-1의 M1 마크로파지로의 분화능 및 M2 마크로파지의 M1 마크로파지로의 재분화능이 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 항암 효과 관찰에 의한 항-CD300c 단클론 항체의 종간 교차 반응성 확인

실험예 6.1. 인간 암세포 성장 억제 효과의 확인

CD300c를 표적으로 하는 단클론 항체가 암세포의 성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여 A549(인간 폐암 세포주)를 이용하여 세포 증식 분석을 실시하였다. 보다 자세하게는, 96-웰 플레이트에 0% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 조건에서는 2x104 세포를 분주하였고, 0.1% 우태아혈청 조건에서는 6x103 세포를 분주하였다. 이어서, 10 μg/mL의 항-CD300c 단클론 항체를 처리하고 5 일 동안 배양하였다. CCK-8(DOJINDO)을 처리하고 OD450nm에서 흡광도를 측정하여 항-CD300c 단클론 항체의 암 세포 성장 억제 효과를 확인하였다. 그 결과를 도 28 및 도 29에 나타내었다.

도 28에 도시된 바와 같이, 0% FBS 조건에서 SK11 및 SK17을 제외하고는, 모두 암 세포의 증식을 억제하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

도 29에 도시된 바와 같이, 0.1% FBS 조건에서는 실험에 사용한 모든 항-CD300c 단클론 항체가 암 세포의 증식을 억제하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실험예 6.2. 항-CD300c 단클론 항체의 농도별 암 세포 성장 억제 효과 확인

항-CD300c 단클론 항체의 농도에 따른 암 세포 성장 억제 효과를 확인하기 위하여, 96-웰 플레이트에 0% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 조건에서는 2x104 A549 세포를 분주하고, 10 μg/mL의 항-CD300c 단클론 항체를 처리하여 5 일 동안 배양하였다. 이어서, CCK-8(DOJINDO)을 처리하고 3 시간 동안 반응시킨 후에, OD450nm에서 흡광도를 측정하여 항-CD300c 단클론 항체의 암 세포 성장 억제 효과를 확인하였다. 그 결과를 도 32에 나타내었다.

도 32에 도시된 바와 같이, 항-CD300c 단클론 항체의 농도가 증가함 따라 암 세포의 성장이 억제되는 것을 확인하였다.

실험예 6.3. 마우스에서 M1 마크로파지로의 분화능 증가 확인

항-CD300c 단클론 항체가 마우스 마크로파지에서 M1 마크로파지로의 분화를 촉진시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 96-웰 플레이트에 마우스 마크로파지(Raw264.7)를 1x10⁴ 세포/웰의 농도로 분주한 후에, 10 μg/mL의 항-CD300c 단클론 항체를 함께 처리하고 배양하였다. TNF-α의 생성량을 ELISA 키트로 확인하였다. 그 결과를 도 37에 나타내었다.

도 37에 도시된 바와 같이, 항-CD300c 단클론 항체를 처리한 실험군들에서는 TNF-α의 생성량이 증가된 것을 확인하였으며, 상기 결과를 통하여, 항-CD300c 단클론 항체가 인간뿐만 아니라 마우스에서도 동일하게 작용하여 M1 마크로파지로의 분화를 촉진하는 교차 반응성을 가짐을 알 수 있다.

실험예 6.4. 마우스 암세포 성장 억제 효과의 확인

항-CD300c 단클론 항체인 CL7, CL10 및 SL18이 항암 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, CT26(마우스 대장암 세포주)을 96-웰 플레이트에 1x10⁴ 세포/웰의 농도로 분주하고, 10 ug/mL의 단클론 항체를 처리하여 5일 동안 배양한 후, CCK-8 검출을 통해 세포 증식 분석을 실시하였다.

도 38에 도시된 바와 같이, 항-CD300c 단클론 항체는 각각 대조군 대비 66%(CL7), 15%(CL10), 및 38%(SL18)의 암 세포 증식 억제 효과를 발휘하므로 마우스에서 암 치료 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 이로써, 항-CD300c 단클론 항체는 인간뿐만 아니라 마우스에서도 동일하게 작용하여 항암 효과를 나타내는 교차 반응성을 가짐을 알 수 있다.

실험예 7. 항-CD300c 단클론 항체와 기존 면역 항암제 사이의 시험관내 항암 효과 비교

아래 실험예에서 사용된 면역 항암제 각각의 입수처는 다음과 같다: 임핀지(AstraZeneca) 및 키트루다(Merck Sharp & Dohme).

실험예 7.1. 항-CD300c 단클론 항체와 기존 면역 항암제 사이의 M1 마크로파지로의 분화능 비교: 3가지 분화 마커(TNF-α, IL-1β 및 IL-8) 생성량 측정

항-CD300c 단클론 항체와 면역 항암제의 M1 마크로파지 분화능을 비교하기 위하여, 실험예 5.2와 동일한 방법으로 TNF-α의 생성량을 ELISA 키트로 확인하였다. 기존 면역 항암제로는 임핀지(Imfinzi)를 10 μg/mL의 농도로 처리하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 도시된 바와 같이, 임핀지(Imf)를 단독으로 처리한 비교군보다 항-CD300c 단클론 항체가 TNF-α의 생성량을 현저히 증가시키는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 기존에 알려져 있는 면역 항암제보다 항-CD300c 단클론 항체가 M1 마크로파지로의 분화능을 현저히 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

다른 면역 항암제와의 비교를 위하여, 항-PD-L1 면역 항암제인 임핀지, 항-PD-1 면역 항암제인 키트루다(Keytruda), 그리고 아이소타입 대조군(이뮤노글로불린 G) 항체를 각각 10 μg/mL의 농도로 처리하고, TNF-α, IL-1β 및 IL-8의 생성량을 ELISA 키트로 확인하였다. 그 결과를 도 16 내지 도 18에 나타내었다.

도 16 내지 도 18에 도시된 바와 같이, 임핀지, 키트루다, IgG 항체와 비교하여 항-CD300c 단클론 항체가 TNF-α, IL-1β 및 IL-8의 생성량을 현저히 증가시키는 것을 확인하였으며, 상기 결과를 통하여, 항-CD300c 단클론 항체가 기존 면역 항암제와 비교하여 M1 마크로파지로의 분화 촉진을 현저히 증가시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 7.2. 항-CD300c 단클론 항체와 기존 면역 항암제 사이의 M0 마크로파지의 M1 마크로파지로의 분화능 비교

항-CD300c 단클론 항체와 면역 항암제의 M0 마크로파지에서 M1 마크로파지로의 분화능을 비교하기 위하여, 96-웰 플레이트에 1.5x10⁴ 세포/웰로 THP-1을 분주하고, 10 μg/mL의 항-CD300c 단클론 항체, 10 μg/mL의 임핀지, 및/또는 200 nM의 PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate)를 처리하였다. 48 시간 동안 반응시킨 후에, TNF-α의 생성량을 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.

도 19에 도시된 바와 같이, 면역 항암제인 임핀지를 단독으로 처리한 비교군의 경우에는 TNF-α가 생성되지 않았지만, 항-CD300c 단클론 항체를 단독으로 처리한 실험군에서는 TNF-α의 생성량이 증가된 것을 확인하였다. 또한, THP-1 세포에 PMA를 처리하여 M0 마크로파지로 분화시켰을 때에도, 임핀지를 처리한 실험군과 비교하여, 항-CD300c 단클론 항체를 처리한 실험군에서 현저히 높은 TNF-α 생성량을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 항-CD300c 단클론 항체가 기존 면역 항암제와 비교하여 M0 마크로파지의 M1 마크로파지로의 분화를 촉진시키는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 7.3. 항-CD300c 단클론 항체와 기존 면역 항암제 사이의 M1 마크로파지로의 분화능 비교

항-CD300c 단클론 항체와 기존 면역 항암제의 M1 마크로파지로의 분화능을 비교하기 위하여, 실험예 5.2와 동일한 방법으로 TNF-α의 생성량을 확인하였다. 그 결과를 도 20에 나타내었다.

도 20에 도시된 바와 같이, LPS를 처리하여 단핵구 세포를 M1 마크로파지로 분화시켰을 때, 임핀지와 LPS를 함께 처리한 실험군에서는 TNF-α의 생성량이 유의성있는 차이를 나타내지 않았으나, 항-CD300c 단클론 항체와 LPS를 함께 처리한 실험군에서는 항-CD300c 단클론 항체를 단독으로 처리한 실험군과 비교하여 TNF-α의 생성량이 유의성있게 증가된 것을 확인하였다.

실험예 7.4. 항-CD300c 단클론 항체와 기존 면역 항암제 사이의 암세포 성장 억제 효과 비교

항-CD300c 단클론 항체와 기존 면역 항암제와의 암 세포 성장 억제 효과를 비교하기 위하여, A549(인간 폐암 세포주)와 MDA-MB-231 (인간 유방암 세포주)를 이용하여 세포 성장 억제 효과를 확인하였다. 보다 자세하게는, 96-웰 플레이트에 0% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 조건에서는 2x104 세포를 분주하였고, 0.1% 우태아혈청 조건에서는 6x103 세포를 분주하였다. 이어서, 10 μg/mL의 항-CD300c 단클론 항체를 처리하고 5 일 동안 배양한 후에, 광학 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 30 및 31에 나타내었다.

도 30에 도시된 바와 같이, A549 세포주에서는 면역 항암제인 임핀지보다 항-CD300c 단클론 항체가 암 세포의 증식을 더욱 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

도 31에 도시된 바와 같이, MDA-MB-231 세포주에서는 면역 항암제인 임핀지보다 항-CD300c 단클론 항체가 암 세포의 증식을 더욱 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

V. 항-CD300c 단클론 항체와 면역 항암제의 병용

실시예 5. 항-CD300c 단클론 항체(CL7)와 면역 항암제의 병용 투여

실시예 1에서 제조된 항-CD300c 단클론 항체(CL7)를 다른 면역항암제, 예를 들어 항-PD-L1 항체인 임핀지(Imfinzi®)와 옵디보(Opdivo®), 항-PD-1 항체인 키트루다, 항-CD47 항체(αCD47), 항-CTLA-4 항체와 병용하여 그 결과를 관찰하였다.

상기 면역 항암제 각각의 입수처는 다음과 같다: 임핀지(AstraZeneca); 옵디보, 항-CTLA-4 항체(Bristol Myers Squibb Company), 키트루다(Merck Sharp & Dohme), 및 항-CD47 항체(Abcam).

실험예 8. 병용에 의한 마크로파지 활성의 (상승적) 증가 확인

실험예 8.1. M1 마크로파지 분화능의 증가 확인

항-CD300c 단클론 항체인 CL7을 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD47 항체 등의 면역 항암제와 병용으로 처리하였을 때에 단핵구 세포의 M1 마크로파지로의 분화능이 증가한다는 것을 확인하기 위하여, M1 마크로파지 분화의 대표적인 신호인 MAPK(mitogen-activated protein kinase), IkB 및 NF-kB의 신호 전달을 확인하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트에 8.8x10⁵ 세포/웰의 THP-1을 분주하고, 10 μg/mL의 항-CD300c 단클론 항체, 10 μg/mL의 임핀지, 및/또는 10 μg/mL의 키트루다를 처리하였다. 대조군으로는 인산염완충용액(PBS)을 동량 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후에, MAPK 신호의 경우 인산화된 SAPK/JNK, 인산화된 ERK, 인산화된 p38를, NF-kB 신호의 경우 인산화된 NF-kB를, IkB 신호의 경우 인산화된 IkB를 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 25 내지 도 27에 나타내었다.

도 25, 도 26 및 도 27은 각각 MAPK, NF-Kb 및 IkB의 신호 전달을 확인한 결과를 도시한다. 항-CD300c를 단독으로 처리하였을 때와 비교하여, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD47 항체 등의 면역 항암제와 병용으로 처리하였을 때에 인산화된 MAPK, IkB, NF-kB의 양이 증가하는 것으로 확인되었다. 이로부터, 항-CD300c 단클론 항체를 단독으로 처리하였을 때보다 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD47 항체 등의 면역 항암제와 병용으로 처리하였을 때에 M1 마크로파지로 분화하는 세포 신호전달이 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 9. 병용에 의한 암 세포 성장 억제 효과의 (상승적) 증가 확인( In vitro )

실험예 9.1. 세포자멸 신호 확인

항-CD300c 단클론 항체인 CL7을 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD47 항체 등의 면역 항암제와 병용으로 처리하였을 때에 세포자멸 신호가 증가하는지를 확인하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트에 8x10⁵ 세포/웰의 A549를 분주하고, 10 μg/mL의 항-CD300c 단클론 항체, 10 μg/mL의 임핀지, 키트루다, 옵디보, 항-CD47 항체를 단독 또는 병용으로 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후에, 세포자멸 신호 또는 세포 주기 신호를 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 확인한 세포자멸 신호의 마커로는 절단된(cleaved) caspase-9, caspase-3, caspase-2, caspase-8을 확인하였고, 세포 주기 신호의 마커로는 사이클린 D1, CDK2, p27kip1, CDK6, 사이클린 D3, P21 Waf1, Cip1 등을 확인하였다.

도 33에 도시된 바와 같이, 항-CD300c 단클론 항체를 단독으로 처리하였을 때보다 항-PD-1인 임핀지와 병용 처리하였을 때 세포자멸신호가 증가하였고, 항-CD300c 단클론 항체를 항-PD1, 항-PD-L1, 항-CTLA-4, 항-CD47 등의 면역 항암제와 함께 병용으로 처리하였을 때에 cleaved-caspase9, p21의 양이 증가하고, 사이클린 D1은 감소하였다. 이로부터, 항-CD300c 단클론 항체를 단독으로 처리하였을 때보다 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD47 항체 등의 면역 항암제와 병용으로 처리하였을 때에 암 세포의 세포자멸이 더 잘 유도되는 것으로 확인되었다.

실험예 9.2. 암 세포주의 성장 억제 효과 확인

항-CD300c 단클론 항체인 CL7과 면역 항암제의 병용 투여에 의한 암 세포 성장 억제 효과를 확인하기 위하여, A549(인간 폐암 세포주)와 MDA-MB-231(인간 유방암 세포주)를 이용하여 암 세포 성장 억제 효과를 비교하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트에 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)이 없는 조건에서는 2x10⁴ 세포(A549) 또는 3x10⁴ 세포(MDA-MB-231)를 분주하였고, 0.1% 우태아혈청 조건에서는 6x10³ 세포(A549) 또는 1x10⁴ 세포(MDA-MB-231)를 분주하였다. 이어서, 10 μg/mL의 항-CD300c 단클론 항체와 임핀지를 단독으로 처리하거나 병용으로 처리하여 5일 동안 배양하였다. 대조군으로는 인산염완충용액(PBS)을 동량 처리하였다. 이어서, CCK-8(DOJINDO)을 처리하고, OD 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 34(A549)과 도 35(MDA-MB-231)에 나타내었다.

A549 세포주에 처리한 경우, 도 34에 도시된 바와 같이, FBS가 없는 조건에서는 항-CD300c 단클론 항체를 단독으로 처리하였을 때 대조군과 비교하여 세포 성장 억제 효과는 17% 높았고, 임핀지와 병용으로 처리하였을 때에는 34% 높은 것으로 확인되었다.

MDA-MB-231 세포주에 처리한 경우, 도 35에 도시된 바와 같이, 0% FBS 조건에서는 대조군과 비교하여 항-CD300c 단클론 항체의 단독 처리시 19% 높은 암 세포 성장 억제 효과가 관찰되었고, 항-CD300c 단클론 항체와 항-CD47 항체를 병용으로 처리하였을 때에는 45% 높은 억제 효과가 관찰되었으며, 항-CD300c 단클론 항체와 항-CD47 항체, 임핀지를 함께 처리하였을 때에는 51% 높은 억제 효과가 관찰되었다. 0.1% FBS 조건에서는 항-CD300c 단클론 항체의 처리시 19% 높은 암 세포 성장 억제 효과를 보았고, 항-CD47 항체와 병용으로 처리하였을 때에는 22% 높은 억제 효과가 관찰되었고, 항-CD300c 단클론 항체와 항-CD47 항체, 임핀지를 모두 병용으로 처리하였을 때에는 32% 높은 억제 효과가 관찰되었다.

위 결과로부터, 항-CD300c 단클론 항체를 단독으로 처리하였을 때보다 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD47 항체 등의 면역 항암제와 병용으로 처리하였을 때에 암 세포의 성장이 더욱 억제된 것으로 확인되었다.

실험예 10. 병용에 의한 생체내 항암 효과의 (상승적) 증가 확인

실험예 10.1. 생체내 암 성장 억제 효과 확인

항-CD300c 단클론 항체인 CL7의 항암 효과를 생체내 조건에서 확인하기 위하여, 대장암 세포주(CT26) 2x10⁵개를 8주령 BALB/c 마우스에 피하 주사로 이식하여 동종이식 마우스 종양 모델을 제작하였다. 동물의 사육 및 실험은 모두 SPF(specific pathogen free) 시설에서 진행하였다. 대장암 세포주를 이식한 후 12일차(D12)에, 종양 크기가 50 내지 100 mm³인 마우스에 항-CD300c 단클론 항체와 각각 BioXcell에서 구매한 항-PD-1 항체를 단독 또는 병용하여 투여하고, 대조군으로는 인산염완충용액(phosphate buffered saline; PBS)을 동량 주사하였다. 개략적인 실험 방법을 도 39에 나타내었다. 구체적으로, 마우스에 복강내 주사로 각각의 항체를 단독 또는 병용하여 1주일 2회, 2주간 총 4회(D12, D15, D19 및 D22) 주사하였다(CL7: 10 mg/kg; 항-PD-1 항체: 10 mg/kg). 25일간 종양 부피를 측정하였다. 그 결과를 도 40에 나타내었다.

도 40으로부터 알 수 있는 바와 같이, 항-CD300c 단클론 항체를 단독 투여한 실험군에서도 대조군과 비교하여 암의 성장이 억제되지만, 항-CD300c 단클론 항체를 단독으로 처리하였을 때보다 항-PD-1 항체 등의 면역 항암제와 병용으로 처리하였을 때에 암의 성장이 더욱 효과적으로 억제된 것으로 확인되었다.

실험예 10.2. 생체내에서의 M1 마크로파지 증가 효과 확인

항-CD300c 단클론 항체가 마우스 모델에서 암 조직 내의 M1 마크로파지를 증가시키는지 확인하기 위하여, 실험예 10.1과 동일한 방법으로 실험한 25일차 마우스를 안락사시키고, 1% PFA(para-formaldehyde)를 마우스에 혈관내 주입하여 관류시킨 후, 암 조직을 획득하였다. 획득된 암 조직을 1% PFA를 이용하여 고정시키고, 순차적으로 10%, 20%, 30% 수크로즈 용액을 이용하여 탈수하였다. 탈수된 암 조직을 OCT 컴파운드(Optimal cutting temperature compound)에서 냉동시킨 후 냉동조직절편기(Cryotome)를 이용하여 암 조직을 50 μm 두께의 절편으로 만들었다. 20 mg/ml의 콜라게나제 D와 2 mg/ml의 DNaseI 혼합 용액에서 37℃에서 1시간 동안 조직을 인큐베이션시킨 다음, 70 um 세포 스트레이너로 여과하고, 적혈구를 용해시킨 다음 세포를 단일 세포로 만들어주기 위해 나일론 메쉬로 다시 여과하였다. 단일 세포 부유액에서 비특이적 반응을 억제하기 위해 CD16/32(입수처: Invitrogen) 항체로 1시간 반응시키고, 세포 생존도를 확인하고 M1 마크로파지 마커인 iNOS와 M2 마크로파지 마커인 CD206에 대한 항체로 염색하여 FACS로 확인하였다.

그 결과, 도 42에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체를 처리한 실험군에서는 M1 마크로파지가 대조군과 비교하여 일부 증가되었으나, 항-CD300c 단클론 항체를 처리한 실험군에서는 M1 마크로파지가 현저히 증가되며, M2 마크로파지는 거의 관찰되지 않는 것을 확인하였다. 또한, 항-CD300c 단클론 항체와 항-PD-1 항체를 병용 투여한 실험군에서 더욱 M1 마크로파지가 증가한 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, 항-CD300c 단클론 항체를 단독으로 처리하였을 때보다 항-PD-1 힝체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD47 항체 등의 면역 항암제와 병용으로 처리하였을 때에 M1 마크로파지로의 분화를 효과적으로 촉진시킬 수 있음을 확인하였다.

실험예 10.3. 생체내에서의 CD8+ T 세포 면역 촉진 효과 확인

항-CD300c 단클론 항체인 CL7이 마우스 종양 모델에서 CD8+ T 세포 면역을 촉진하는지 확인하기 위하여, 실험예 10.1과 동일한 방법으로 실험한 25일차 마우스를 안락사시킨 후, 1% PFA(para-formaldehyde)를 마우스에 혈관내 주입하여 관류시킨 후, 암 조직을 획득하였다. 획득된 암 조직을 1% PFA를 이용하여 고정시키고, 순차적으로 10%, 20%, 30% 수크로즈 용액으로 탈수하였다. 탈수된 암 조직을 OCT 컴파운드(Optimal cutting temperature compound)에서 냉동시킨 후 냉동조직절편기(Cryotome)를 이용하여 암 조직을 50 μm 두께의 절편으로 만들었다. 이어서, CD8+ 및 iNOS로 염색하였다.

도 41에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체를 처리한 실험군에서는 CD8+ T 세포가 대조군과 비교하여 일부 증가되었으나, 항-CD300c 단클론 항체를 처리한 실험군에서는 CD8+ T 세포가 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 항-CD300c 단클론 항체와 항-PD-1 항체를 병용 투여한 실험군의 경우, CD8+ T 세포가 항-PD-1 단독 처리군보다 더 증가된 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, 항-CD300c 단클론 항체가 기존 면역 항암제와 병용된 경우 CD8+ T 세포의 수를 더욱 효과적으로 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명의 항-CD300c 단클론 항체는 CD300c 항원에 대해 높은 특이성을 가지고 결합할 수 있으며, 마우스 등과 같은 종간 교차반응성을 나타내는 것을 확인하였으므로, 다양한 개체에 사용할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 항-CD300c 단클론 항체는 T 세포를 활성화시키고, M1 마크로파지로의 분화를 촉진시킴으로써 면역 항암제의 작용을 함으로써 암 세포의 증식, 전이 등을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 in vitro 및 in vivo에서 모두 확인하였을 뿐만 아니라, 기존의 면역 항암제와의 병용투여를 통하여 그 치료 효과를 더욱 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였으므로 CD300c 항원을 발현하는 다양한 암의 항암면역치료에 효과적으로 사용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (21)

1. CD300c 항원 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체.
2. 제1항에 있어서,

   상기 키메라 항원 수용체는 막 관통 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 추가로 포함하는

   키메라 항원 수용체.
3. 제1항에 있어서,

   상기 결합 도메인은 항체, 단일 도메인 항체 및 단쇄 가변 분절로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인

   키메라 항원 수용체.
4. 제1항에 있어서,

   상기 결합 도메인은,

   (i) 서열번호 7, 서열번호 19, 서열번호 31, 서열번호 43, 서열번호 55, 서열번호 67, 서열번호 79, 서열번호 91, 서열번호 103, 서열번호 115, 서열번호 127, 서열번호 139, 서열번호 151, 서열번호 163, 서열번호 175, 서열번호 187, 서열번호 199, 서열번호 211, 서열번호 223, 서열번호 235, 서열번호 247, 서열번호 259, 서열번호 271, 서열번호 283 및 서열번호 295로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;

   서열번호 8, 서열번호 20, 서열번호 32, 서열번호 44, 서열번호 56, 서열번호 68, 서열번호 80, 서열번호 92, 서열번호 104, 서열번호 116, 서열번호 128, 서열번호 140, 서열번호 152, 서열번호 164, 서열번호 176, 서열번호 188, 서열번호 200, 서열번호 212, 서열번호 224, 서열번호 236, 서열번호 248, 서열번호 260, 서열번호 272, 서열번호 284 및 서열번호 296으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및

   서열번호 9, 서열번호 21, 서열번호 33, 서열번호 45, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 81, 서열번호 93, 서열번호 105, 서열번호 117, 서열번호 129, 서열번호 141, 서열번호 153, 서열번호 165, 서열번호 177, 서열번호 189, 서열번호 201, 서열번호 213, 서열번호 225, 서열번호 237, 서열번호 249, 서열번호 261, 서열번호 273, 서열번호 285 및 서열번호 297로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

   (ii) 서열번호 10, 서열번호 22, 서열번호 34, 서열번호 46, 서열번호 58, 서열번호 70, 서열번호 82, 서열번호 94, 서열번호 106, 서열번호 118, 서열번호 130, 서열번호 142, 서열번호 154, 서열번호 166, 서열번호 178, 서열번호 190, 서열번호 202, 서열번호 214, 서열번호 226, 서열번호 238, 서열번호 250, 서열번호 262, 서열번호 274, 서열번호 286 및 서열번호 298로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;

   서열번호 11, 서열번호 23, 서열번호 35, 서열번호 47, 서열번호 59, 서열번호 71, 서열번호 83, 서열번호 95, 서열번호 107, 서열번호 119, 서열번호 131, 서열번호 143, 서열번호 155, 서열번호 167, 서열번호 179, 서열번호 191, 서열번호 203, 서열번호 215, 서열번호 227, 서열번호 239, 서열번호 251, 서열번호 263, 서열번호 275, 서열번호 287 및 서열번호 299로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및

   서열번호 12, 서열번호 24, 서열번호 36, 서열번호 48, 서열번호 60, 서열번호 72, 서열번호 84, 서열번호 96, 서열번호 108, 서열번호 120, 서열번호 132, 서열번호 144, 서열번호 156, 서열번호 168, 서열번호 180, 서열번호 192, 서열번호 204, 서열번호 216, 서열번호 228, 서열번호 240, 서열번호 252, 서열번호 264, 서열번호 276, 서열번호 288 및 서열번호 300으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;

   서열번호 402로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는

   키메라 항원 수용체.
5. 제1항에 있어서,

   상기 결합 도메인은 아래 식 (1) 내지 (3)으로 각각 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

   아래 식 (4) 내지 (6)으로 각각 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는

   키메라 항원 수용체:

   FTFSX1YX2MX3WVR (1)

   상기 식에서,

   X1= R, S 또는 D

   X2= A, G 또는 H

   X3= T, H 또는 S

   X1X2SX3X4GGX5TYYAX6 (2)

   상기 식에서,

   X1= S, A 또는 T

   X2= M 또는 I

   X3= G 또는 S

   X4= T 또는 S

   X5= T, S 또는 Y

   X6= D 또는 E

   YCAX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11W (3)

   상기 식에서,

   X1= R, V 또는 S

   X2= G 또는 S

   X3= A, G, S, Y 또는 I

   X4= Y, A, Q, G 또는 R

   X5= G 또는 L

   X6= F, R, I, M 또는 P

   X7= D, G, F 또는 L

   X8= H, F, D 또는 V

   X9= F, I, Y 또는 존재하지 않음

   X10= D 또는 존재하지 않음

   X11= Y 또는 존재하지 않음

   CX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13W (4)

   상기 식에서,

   X1= R,S 또는 T

   X2= A, G 또는 R

   X3= S 또는 N

   X4= Q, S 또는 N

   X5= S, I 또는 G

   X6= I, N 또는 G

   X7= G, I, T 또는 S

   X8= N, G, R, A 또는 K

   X9= Y, S, R 또는 G

   X10= N 또는 존재하지 않음

   X11= Y 또는 존재하지 않음

   X12= L 또는 V

   X13= N, Y, H 또는 Q

   X1X2X3X4X5X6X7GX8X9 (5)

   상기 식에서,

   X1= D, E, S 또는 R

   X2= A, D, K 또는 N

   X3= S 또는 N

   X4= N, K 또는 Q

   X5= L 또는 R

   X6= E 또는 P

   X7= T 또는 S

   X8= I 또는 V

   X9= P 또는 R

   YCX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11F (6)

   상기 식에서,

   X1= Q, S 또는 A

   X2= Q, S 또는 A

   X3= S, Y 또는 W

   X4= S, T, D 또는 A

   X5= A, S, D 또는 G

   X6= I, S, N 또는 T

   X7= P, S, L, N 또는 K

   X8= Y, T, S, N 또는 G

   X9= V, G, L 또는 존재하지 않음

   X10 = P 또는 존재하지 않음

   X11= T, I 또는 V.
6. 제4항에 있어서,

   상기 중쇄 가변 영역은,

   (i) 서열번호 7, 서열번호 67, 서열번호 79, 서열번호 115 또는 서열번호 211의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR1;

   서열번호 8, 서열번호 68, 서열번호 80, 서열번호 116 또는 서열번호 212의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR2; 및

   서열번호 9, 서열번호 69, 서열번호 81, 서열번호 117 또는 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR3을 포함하고,

   상기 경쇄 가변 영역은,

   (ii) 서열번호 10, 서열번호 70, 서열번호 82, 서열번호 118 또는 서열번호 214의의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR1;

   서열번호 11, 서열번호 71, 서열번호 83, 서열번호 119 또는 서열번호 215의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR2; 및

   서열번호 12, 서열번호 72, 서열번호 84, 서열번호 120 또는 서열번호 216의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CDR3을 포함하는

   키메라 항원 수용체.
7. 제1항에 있어서,

   상기 키메라 항원 수용체는 신호 펩타이드(signal peptide), GS 링커, 세포막 관통 도메인(transmembrane domain), 및 세포질 내 도메인(intracytoplasmic domain)을 추가로 포함하는

   키메라 항원 수용체.
8. 제7항에 있어서,

   상기 신호 펩타이드는 CD8α 신호 펩타이드를 포함하는

   키메라 항원 수용체.
9. 제7항에 있어서,

   상기 세포막 관통 도메인은 CD8 힌지(hinge of cluster of differentiation 8) 및 CD28 세포막 관통 도메인(CD28 transmembrane domain)을 포함하는

   키메라 항원 수용체.
10. 제7항에 있어서,

    상기 세포질 내 도메인은 CD28 세포내 도메인(CD28 intracellular domain) 및 CD3ζ 세포내 도메인(CD3ζ intracellular domain)을 포함하는

    키메라 항원 수용체.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
12. 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포.
14. 제13항에 있어서,

    상기 면역세포는 단핵구, 대식세포, T 세포, 자연살해세포(Natural killer cell; NK cell) 및 수지상세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는

    면역세포.
15. 제13항의 면역세포를 유효성분으로 포함하는, CD300c 항원 또는 CD300c 수용체를 발현하는 암을 예방하거나 치료하기 위한 약학 조성물.
16. 제15항에 있어서,

    상기 암은 대장암, 직장암, 결장암, 갑상선암, 구강암, 인두암, 후두암, 자궁경부암, 뇌암, 폐암, 난소암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 혀암, 유방암, 자궁암, 위암, 골암 및 혈액암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는

    약학 조성물.
17. 제15항에 있어서,

    상기 약학 조성물은 다른 항암제를 추가로 포함하는

    약학 조성물.
18. 제15항에 있어서,

    상기 약학 조성물은 암의 증식, 생존, 전이, 재발 또는 항암제 내성을 억제하는

    약학 조성물.
19. 제13항의 면역세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
20. 제13항의 면역세포의 암 예방 또는 치료를 위한 용도.
21. 제13항의 면역세포의 암 예방 또는 치료를 위한 약제 제조용 용도.

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