CN107541526B - 能敲低内源性ctla4表达的cik及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能敲低内源性CTLA4表达的CIK及其制备方法与应用。本发明提供了制备能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂的方法，包括：A)利用细胞因子体外诱导PBMC分化为CIK；B)向步骤A)所得CIK中转入能敲低内源性CTLA4表达的载体，培养13‑16天后收获细胞，从而制得所述能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂；所述能敲低内源性CTLA4表达的载体上含有多个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因；所述多个为2‑30个。实验结果表明，该载体可以大大降低CIK细胞中内源CTLA4的表达水平，从而显著的提高了CIK细胞的肿瘤杀伤活性。

Description

能敲低内源性CTLA4表达的CIK及制备方法与应用

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，涉及一种能敲低内源性CTLA4表达的CIK及制备方法与应用。

背景技术

CIK(Cytokine-Induced Killer Cells)中文全称为细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人外周血单核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有肿瘤杀伤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，临床上已经有大量的病例证实其肿瘤杀伤活性。

细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)又名CD152，是一种白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体，而CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。基因重组的CTLA-4IgG可在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用。同时，CTLA4与其配体B7分子结合后产生抑制性信号，抑制T细胞激活，使肿瘤细胞免受T淋巴细胞攻击。因此阻断CTLA4的免疫抑制效应可以刺激免疫细胞大量增殖，从而诱导、激活或增强抗肿瘤免疫反应。采用CTLA4的抗体阻断CTLA4与B7的结合，可使T细胞的肿瘤杀伤活性不受抑制，从而提高T细胞杀肿瘤的效果。研究证实，采用CTLA4单抗静脉输注治疗恶性晚期转移性黑色素瘤、恶性间皮瘤、肝癌等肿瘤，收到良好的治疗效果。然而，静脉输注CTLA4抗体所需抗体量大，成本很高；同时血液成分、淋巴组织微环境等成分会影响CTLA4抗体与T细胞表面B7的结合。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核细胞中存在的一种RNA降解机制。当病原感染真核细胞或者采用人为的方法将双链RNA(double strand RNA,dsRNA)导入到真核细胞后，这些双链RNA被RNase III家族的成员Dicer加工成21-23bp的双链干扰RNA(shortinterfering RNA,siRNA)。每个siRNA随后被整合到RNA诱导的干扰复合体中(RISC)，该蛋白复合体可以将siRNA靶向到与其互补的转录本的响应序列，导致转录本的切割、降解或者转录抑制。小RNA(microRNA,miRNA)是一种可以诱导基因沉默的内源性RNA，它大概22bp长，可以通过RNAi通路来诱导基因沉默。不同于短发夹RNA(shRNA)，miRNA经常以簇的形式被一个转录本编码，该转录本可能有几kb长并含有发夹结构，其表达由RNA聚合酶II启动。柄环结构的pri-miRNA由核RNase III Drosha降解成70bp左右的前体miRNA(pre-miRNA)，该前体miRNA由exportin-5从核内转运到胞浆。随后前体miRNA被Dicer处理成22bp左右的成熟miRNA，然后被整合入含有miRNA的RAN诱导的沉默复合体。成熟的miRNA通过对mRNA切割或者翻译抑制来调控基因的表达。靶基因的切割可以通过人为改变靶基因或者miRNA的序列来完全互补。

发明内容

本发明的目的是提供一种能敲低内源性CTLA4表达的CIK及其制备方法与应用。

本发明所提供的制备能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂的方法，具体可包括如下步骤：

(A)利用细胞因子体外诱导PBMC分化为CIK；

(B)向步骤(A)所得CIK中转入能敲低内源性CTLA4表达的载体，培养后收获细胞，从而制得所述能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂；

所述能敲低内源性CTLA4表达的载体上含有多个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因；所述多个为2-30个。

进一步，所述能敲低内源性CTLA4表达的载体为慢病毒载体。

在本发明的一个实施例中，所述能敲低内源性CTLA4表达的载体上含有17个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因；所述17个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因具体分别如下：

(1)miRNA-CTLA4-30：核苷酸序列如序列表中序列1的第2391-2449位或序列2的第3146-3204位所示；

(2)miRNA-CTLA4-56：核苷酸序列如序列表中序列1的第2529-2587位或序列2的第3284-3342位所示；

(3)miRNA-CTLA4-119：核苷酸序列如序列表中序列1的第2667-2725位或序列2的第3422-3480位所示；

(4)miRNA-CTLA4-161：核苷酸序列如序列表中序列1的第2805-2863位或序列2的第3560-3618位所示；

(5)miRNA-CTLA4-314：核苷酸序列如序列表中序列1的第2943-3001位或序列2的第3698-3756位所示；

(6)miRNA-CTLA4-397：核苷酸序列如序列表中序列1的第3081-3039位或序列2的第3836-3894位所示；

(7)miRNA-CTLA4-434：核苷酸序列如序列表中序列1的第3219-3277位或序列2的第3974-4032位所示；

(8)miRNA-CTLA4-445：核苷酸序列如序列表中序列1的第3357-3415位或序列2的第4112-4170位所示；

(9)miRNA-CTLA4-536：核苷酸序列如序列表中序列1的第3495-3553位或序列2的第4250-4308位所示；

(10)miRNA-CTLA4-585：核苷酸序列如序列表中序列1的第3633-3691位或序列2的第4388-4446位所示；

(11)miRNA-CTLA4-968：核苷酸序列如序列表中序列1的第3771-3829位或序列2的第4526-4584位所示；

(12)miRNA-CTLA4-1158：核苷酸序列如序列表中序列1的第3909-3967位或序列2的第4664-4722位所示；

(13)miRNA-CTLA4-1201：核苷酸序列如序列表中序列1的第4047-4105位或序列2的第4802-4860位所示；

(14)miRNA-CTLA4-1690：核苷酸序列如序列表中序列1的第4185-4243位或序列2的第4940-4998位所示；

(15)miRNA-CTLA4-1717：核苷酸序列如序列表中序列1的第4323-4381位或序列2的第5078-5136位所示；

(16)miRNA-CTLA4-1759：核苷酸序列如序列表中序列1的第4461-4519位或序列2的第5216-5274位所示；

(17)miRNA-CTLA4-1770：核苷酸序列如序列表中序列1的第4599-4657位或序列2的第5354-5412位所示。

更加具体的，所述能敲低内源性CTLA4表达的载体的序列为序列表中序列1或序列2所示。

在所述方法的步骤(A)中，所述“利用细胞因子体外诱导PBMC分化为CIK”为利用CD3mAb/CD28mAb磁珠、IFN-γ和IL-2诱导PBMC分化为CIK。所述CD3mAb/CD28mAb磁珠的用量为1-2个磁珠/个PBMC；所述IFN-γ的用量为400-1200IU/ml体系；所述IL-2的用量为250-900IU/ml体系。

在所述方法的步骤(B)中，所述培养的时间为自转入所述能敲低内源性CTLA4表达的载体后培养12天。

在本发明中，所述方法具体可包括如下步骤：

(1)将PBMC用淋巴细胞培养基调整浓度至3×10⁵-9×10⁵/ml，制成PBMC细胞悬液；所述淋巴细胞培养基中含有终浓度为300IU/ml的IL-2，以及终浓度为1000IU/ml的IFN-γ。

(2)将步骤(1)的PBMC细胞悬液转移至含有CD3mAb/CD28mAb磁珠的T-175培养瓶中，总体积50ml，并添加IFN-γ、IL-2。

进一步，所述CD3mAb/CD28mAb磁珠的用量为1-2个磁珠/个PBMC。所述CD3mAb/CD28mAb磁珠为invitrogen公司产品，货号为402.03D。

进一步，添加后，所述IFN-γ的终浓度为1000IU/ml；所述IL-2的终浓度为300IU/ml。

(3)培养第3天，将所述能敲低内源性CTLA4表达的载体(全载体序列如序列表中序列1或序列2所示)电转入细胞；电转之后，添加含有IFN-γ和IL-2的无血清培养基继续培养。

其中，进行电转时，细胞浓度为10⁷-10⁹/ml，所用载体量为1-10μg/100μl细胞。所述含有IFN-γ和IL-2的无血清培养基中IFN-γ的终浓度为1000IU/ml，IL-2的终浓度为300IU/ml。

(4)培养第7天，补加200ml所述淋巴细胞培养基，并加入与细胞数量相同的所述CD3mAb/CD28mAb磁珠。

(5)每隔两天进行细胞计数，并补加相应体积的所述淋巴细胞培养液，使得细胞密度基本不变。

(6)培养第15天，离心收获细胞，即为所述能敲低内源性CTLA4表达的CIK。

利用所述方法制备得到的能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂也属于本发明的保护范围。

所述CIK细胞制剂在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(1)制备治疗肿瘤的产品；

(2)制备用于杀伤肿瘤细胞的产品。

本发明还保护能敲低内源性CTLA4表达的载体。

本发明所提供的能敲低内源性CTLA4表达的载体为含有多个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因的慢病毒载体；所述多个为2-30个。

具体的，所述能敲低内源性CTLA4表达的载体上含有17个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因；所述17个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因具体分别如下：

(1)miRNA-CTLA4-30：核苷酸序列如序列表中序列1的第2391-2449位或序列2的第3146-3204位所示；

(2)miRNA-CTLA4-56：核苷酸序列如序列表中序列1的第2529-2587位或序列2的第3284-3342位所示；

(3)miRNA-CTLA4-119：核苷酸序列如序列表中序列1的第2667-2725位或序列2的第3422-3480位所示；

(4)miRNA-CTLA4-161：核苷酸序列如序列表中序列1的第2805-2863位或序列2的第3560-3618位所示；

(5)miRNA-CTLA4-314：核苷酸序列如序列表中序列1的第2943-3001位或序列2的第3698-3756位所示；

(6)miRNA-CTLA4-397：核苷酸序列如序列表中序列1的第3081-3039位或序列2的第3836-3894位所示；

(7)miRNA-CTLA4-434：核苷酸序列如序列表中序列1的第3219-3277位或序列2的第3974-4032位所示；

(8)miRNA-CTLA4-445：核苷酸序列如序列表中序列1的第3357-3415位或序列2的第4112-4170位所示；

(9)miRNA-CTLA4-536：核苷酸序列如序列表中序列1的第3495-3553位或序列2的第4250-4308位所示；

(10)miRNA-CTLA4-585：核苷酸序列如序列表中序列1的第3633-3691位或序列2的第4388-4446位所示；

(11)miRNA-CTLA4-968：核苷酸序列如序列表中序列1的第3771-3829位或序列2的第4526-4584位所示；

(12)miRNA-CTLA4-1158：核苷酸序列如序列表中序列1的第3909-3967位或序列2的第4664-4722位所示；

(13)miRNA-CTLA4-1201：核苷酸序列如序列表中序列1的第4047-4105位或序列2的第4802-4860位所示；

(14)miRNA-CTLA4-1690：核苷酸序列如序列表中序列1的第4185-4243位或序列2的第4940-4998位所示；

(15)miRNA-CTLA4-1717：核苷酸序列如序列表中序列1的第4323-4381位或序列2的第5078-5136位所示；

(16)miRNA-CTLA4-1759：核苷酸序列如序列表中序列1的第4461-4519位或序列2的第5216-5274位所示；

(17)miRNA-CTLA4-1770：核苷酸序列如序列表中序列1的第4599-4657位或序列2的第5354-5412位所示。

更加具体的，所述能敲低内源性CTLA4表达的载体的序列为序列表中序列1或序列2所示。

所述载体在制备所述CIK细胞制剂中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明采用pCDH-MIR质粒表达人工设计的17个靶向CTLA4的串联miRNA，并将该质粒导入CIK细胞。实验结果表明，该质粒可以大大降低CIK细胞中内源CTLA4的表达水平，从而显著的提高了CIK细胞的肿瘤杀伤活性。

附图说明

图1为pCDH-miRNA-CTLA4及pCDH-miRNA-CTLA4-GFP载体在CIK细胞中对CTLA4的干扰作用。其中，1为CIK，2为CIK-pCDH-miRNA-CTLA4；3为CIK-pCDH-miRNA-CTLA4-GFP。

图2为流式检测pCDH-miRNA-CTLA4载体对CIK细胞中CTLA4的敲低作用。

图3为流式检测pCDH-miRNA-CTLA4-GFP载体对CIK细胞中CTLA4的敲低作用。

图4为流式验证CIK、CIK-pCDH-miRNA-CTLA4、CIK-pCDH-miRNA-CTLA4-GFP三组细胞。

图5为CIK-pCDH-miRNA-CTLA4及CIK-pCDH-miRNA-CTLA4-GFP细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞的制备与鉴定

一、能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞的制备

1、淋巴细胞培养基的配制：含有终浓度为300IU/ml的IL-2、终浓度为1000IU/ml的IFN-γ的无血清培养基。其中，所述无血清培养基为Lonza公司产品，货号为04-418Q；所述IL-2为peprotech公司产品，货号为200-02；所述IFN-γ为peprotech公司产品，货号为300-02。

2、采集健康人外周血(当然如果采用绝大多数肿瘤患者的外周血也可以)，经检测无污染后，等体积生理盐水稀释，利用Ficoll淋巴细胞分离液(所述Ficoll淋巴细胞分离液的密度为1.077g/ml)将稀释的外周血进行单核细胞分离；分离得到的PBMC用淋巴细胞培养基调整浓度至3×10⁵-9×10⁵/ml，制成PBMC细胞悬液。

3、将步骤2的PBMC细胞悬液转移至含有CD3mAb/CD28mAb磁珠的T-175培养瓶中，总体积50ml，CD3mAb/CD28mAb磁珠的用量为1-2个磁珠/个PBMC，并向培养瓶中添加IFN-γ至其终浓度为1000IU/ml，添加IL-2至其终浓度为300IU/ml。其中，所述CD3mAb/CD28mAb磁珠为invitrogen公司产品，货号为402.03D。

4、培养第3天，采用Celetrix公司的电转仪将CTLA4干扰质粒(pCDH-miRNA-CTLA4或者pCDH-miRNA-CTLA4-GFP)电转入细胞，电转操作按照公司推荐的实验步骤进行(进行电转时，细胞浓度为10⁷-10⁹/ml，所用载体量为1-10μg/100μl细胞)。电转之后，添加含有终浓度为1000IU/ml的IFN-γ和终浓度为300IU/ml的IL-2的无血清培养基继续培养。

其中，两个CTLA4干扰质粒，pCDH-miRNA-CTLA4和pCDH-miRNA-CTLA4-GFP均含有17个靶向CTLA4的串联miRNA的编码基因。

pCDH-miRNA-CTLA4载体的全序列如序列表中序列1所示。序列1的第233-414位为5’LTR；第458-583位为HIV-1Ψ；第2004-2007位为CMV promoter；第2391-2449位为miRNA-CTLA4-30；第2529-2587位为miRNA-CTLA4-56；第2667-2725位为miRNA-CTLA4-119；第2805-2863位为miRNA-CTLA4-161；第2943-3001位为miRNA-CTLA4-314；第3081-3039位为miRNA-CTLA4-397；第3219-3277位为miRNA-CTLA4-434；第3357-3415位为miRNA-CTLA4-445；第3495-3553位为miRNA-CTLA4-536；第3633-3691位为miRNA-CTLA4-585；第3771-3829位为miRNA-CTLA4-968；第3909-3967位为miRNA-CTLA4-1158；第4047-4105位为miRNA-CTLA4-1201；第4185-4243位为miRNA-CTLA4-1690；第4323-4381位为miRNA-CTLA4-1717；第4461-4519位为miRNA-CTLA4-1759；第4599-4657位为miRNA-CTLA4-1770；第4790-5377位为WPRE；第5745-5925位为3’LTR；第7492-8352位为AmpR。

pCDH-miRNA-CTLA4-GFP载体的全序列如序列表中序列2所示。序列1的第234-414位为5’LTR；第458-583位为HIV-1Ψ；第2004-2007位为CMV promoter；第2339-3058位为EmGFP；第3146-3204位为miRNA-CTLA4-30；第3284-3342位为miRNA-CTLA4-56；第3422-3480位为miRNA-CTLA4-119；第3560-3618位为miRNA-CTLA4-161；第3698-3756位为miRNA-CTLA4-314；第3836-3894位为miRNA-CTLA4-397；第3974-4032位为miRNA-CTLA4-434；第4112-4170位为miRNA-CTLA4-445；第4250-4308位为miRNA-CTLA4-536；第4388-4446位为miRNA-CTLA4-585；第4526-4584位为miRNA-CTLA4-968；第4664-4722位为miRNA-CTLA4-1158；第4802-4860位为miRNA-CTLA4-1201；第4940-4998位为miRNA-CTLA4-1690；第5078-5136位为miRNA-CTLA4-1717；第5216-5274位为miRNA-CTLA4-1759；第5354-5412位为miRNA-CTLA4-1770；第5545-6132位为WPRE；第6500-6680位为3’LTR；第8247-9107位为AmpR。

5、培养第7天，补加200ml所述淋巴细胞培养基(配方同上)，并加入与细胞数量相同的所述CD3mAb/CD28mAb磁珠。

6、每隔两天进行细胞计数，并补加相应体积的所述淋巴细胞培养基(配方同上)，使得细胞密度基本不变。

7、培养第15天，离心收获CIK细胞。CIK转染了pCDH-miRNA-CTLA4或者pCDH-miRNA-CTLA4-GFP质粒之后，分别记为CIK-pCDH-miRNA-CTLA4和CIK-pCDH-miRNA-CTLA4-GFP。

二、能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞的鉴定

1、验证步骤一最终所得细胞能敲低内源性CTLA4表达

(1)Western blot检测步骤一所获得的CIK细胞内源CTLA4表达。1500rpm离心收集未转染任何质粒的CIK细胞、分别转染pCDH-miRNA-CTLA4和pCDH-miRNA-CTLA4-GFP质粒的CIK细胞(即CIK-pCDH-miRNA-CTLA4和CIK-pCDH-miRNA-CTLA4-GFP)上清，细胞沉淀按照每10⁵个细胞加入100μl RIPA裂解液(配方：50mM Tris，150mM NaCl，1％(v/v)Triton X-100，1％(w/v)sodium deoxycholate，0.1％(w/v)SDS)并吹打均匀，室温裂解15分钟，然后12000g离心5分钟，取上清并加入SDS-PAGE上样缓冲液，然后进行SDS-PAGE电泳及Westernblot分析，所用一抗为小鼠抗CTLA4抗体(Santa Cruz Biotechnology公司，货号SC-73402)，二抗为HRP标记兔抗小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology公司，货号SC-358914)。

结果如图1所示，由图可见：CIK转染了pCDH-miRNA-CTLA4或者pCDH-miRNA-CTLA4-GFP质粒之后，与CIK对照相比，内源性CTLA4蛋白表达水平至少下降了95％以上。

(2)取上述步骤一收获的CIK、CIK-pCDH-miRNA-CTLA4、CIK-pCDH-miRNA-CTLA4-GFP各300μl放入1.5ml EP管中，300g离心5分钟，弃上清，加入500μl含有0.5％多聚甲醛的PBS悬浮细胞并室温保持10分钟。然后300g离心5分钟，弃上清，加入300μl PBS，用移液器吹打并悬浮细胞，然后加入5μl相应的荧光抗体，室温避光孵育20分钟之后，用流式细胞仪进行检测。所用荧光抗体APC-anti-human CTLA4antibody为Biolegend公司产品，货号为329953。

结果如图2和图3所示，由图可见：CIK转染了pCDH-miRNA-CTLA4或者pCDH-miRNA-CTLA4-GFP质粒之后，与CIK对照相比，细胞表面表达的内源性内源性CTLA4蛋白表达水平至少下降到了检测不到的水平。

2、验证步骤一最终所得细胞为CIK细胞

处理细胞步骤同上述1(2)中所述，所用荧光抗体PE-anti-CD8antibody、FITC-anti CD4antibody、APC-anti-CD56antibody及PerCP-anti-CD3antibody为Biolegend公司产品，货号分别为300907、357405、362503、300325。

结果如图4所示，CIK、CIK-pCDH-miRNA-CTLA4、CIK-pCDH-miRNA-CTLA4-GFP三组细胞培养都获得了成功，CD8⁺细胞超过80％，CD4⁺细胞不超过20％，CD56⁺细胞超过50％。三组细胞的分子表型类似，因此只给出了CIK-pCDH-miRNA-CTLA4的结果。

实施例2、实施例1制备的能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果检测

首先将人肿瘤细胞系SKOV3接种到艾森活细胞检测站的细胞培养板上，12小时之后，待细胞贴壁生长，加入一定数量的CIK、CIK-pCDH-miRNA-CTLA4、CIK-pCDH-miRNA-CTLA4-GFP细胞，形成不同的效靶比。继续培养48小时，检测各种CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。

结果如图5所示，由图可见：转染了pCDH-miRNA-CTLA4或pCDH-miRNA-CTLA4-GFP质粒的CIK细胞对肿瘤的杀伤活性显著提高。

<110> 北京瑞健科技有限公司

<120> 能敲低内源性CTLA4表达的CIK及制备方法与应用

<130> GNCLN171608

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8956

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420

cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480

tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540

gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600

aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660

aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720

agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780

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cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080

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<210> 2

<211> 9711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

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acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

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gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc 5880

cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag 5940

ctgacgtcct ttccatggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc 6000

ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg 6060

gctctgcggc ctcttccgcg tctccgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg 6120

ccgcctcccc gcctggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc 6180

cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaacg atgtcaagaa 6240

ttggaacgct gacgtcatca acccgctcca aggaatcgcg ggcccagtgt cactaggcgg 6300

gaacacccag cgcgcgtgcg cctggcagga agatggctgt gagggacagg ggagtggcgc 6360

cctgcaatat ttgcatgtcg ctatgtgttc tgggaaatca ccataaacgt gaaatgtctt 6420

tggatttggg aatcttataa gttctgtatg agaccacttg gatcctctga attcttcgat 6480

tctgcttttt gcttctactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc 6540

tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt 6600

agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc 6660

agtgtggaaa atctctagca gtagtagttc atgtcatctt attattcagt atttataact 6720

tgcaaagaaa tgaatatcag agagtgagag gaacttgttt attgcagctt ataatggtta 6780

caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag 6840

ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggctctagc tatcccgccc 6900

ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc 6960

tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag 7020

aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta gacttttgca gagacggccc aaattcgtaa 7080

tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 7140

cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 7200

attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 7260

tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg 7320

ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 7380

gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 7440

ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 7500

cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 7560

ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 7620

accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 7680

catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 7740

gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 7800

tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 7860

agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 7920

actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 7980

gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 8040

aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 8100

gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 8160

aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 8220

atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 8280

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 8340

atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 8400

ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 8460

cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 8520

agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 8580

cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 8640

tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 8700

agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 8760

gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 8820

gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 8880

ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 8940

tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 9000

tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 9060

gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 9120

caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 9180

atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac 9240

gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc 9300

tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 9360

acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 9420

gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg 9480

agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 9540

aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 9600

tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 9660

ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct g 9711

Claims (7)

1.一种制备能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂的方法，包括如下步骤：

(A)利用细胞因子体外诱导PBMC分化为CIK；

(B)向步骤(A)所得CIK中转入能敲低内源性CTLA4表达的载体，培养后收获细胞，从而制得所述能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂；

所述能敲低内源性CTLA4表达的载体为慢病毒载体；

所述能敲低内源性CTLA4表达的载体上含有17个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因；所述17个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因分别如下：

(1)miRNA-CTLA4-30：核苷酸序列如序列表中序列1的第2391-2449位或序列2的第3146-3204位所示；

(2)miRNA-CTLA4-56：核苷酸序列如序列表中序列1的第2529-2587位或序列2的第3284-3342位所示；

(3)miRNA-CTLA4-119：核苷酸序列如序列表中序列1的第2667-2725位或序列2的第3422-3480位所示；

(4)miRNA-CTLA4-161：核苷酸序列如序列表中序列1的第2805-2863位或序列2的第3560-3618位所示；

(5)miRNA-CTLA4-314：核苷酸序列如序列表中序列1的第2943-3001位或序列2的第3698-3756位所示；

(6)miRNA-CTLA4-397：核苷酸序列如序列表中序列1的第3081-3039位或序列2的第3836-3894位所示；

(7)miRNA-CTLA4-434：核苷酸序列如序列表中序列1的第3219-3277位或序列2的第3974-4032位所示；

(8)miRNA-CTLA4-445：核苷酸序列如序列表中序列1的第3357-3415位或序列2的第4112-4170位所示；

(9)miRNA-CTLA4-536：核苷酸序列如序列表中序列1的第3495-3553位或序列2的第4250-4308位所示；

(10)miRNA-CTLA4-585：核苷酸序列如序列表中序列1的第3633-3691位或序列2的第4388-4446位所示；

(11)miRNA-CTLA4-968：核苷酸序列如序列表中序列1的第3771-3829位或序列2的第4526-4584位所示；

(12)miRNA-CTLA4-1158：核苷酸序列如序列表中序列1的第3909-3967位或序列2的第4664-4722位所示；

(13)miRNA-CTLA4-1201：核苷酸序列如序列表中序列1的第4047-4105位或序列2的第4802-4860位所示；

(14)miRNA-CTLA4-1690：核苷酸序列如序列表中序列1的第4185-4243位或序列2的第4940-4998位所示；

(15)miRNA-CTLA4-1717：核苷酸序列如序列表中序列1的第4323-4381位或序列2的第5078-5136位所示；

(16)miRNA-CTLA4-1759：核苷酸序列如序列表中序列1的第4461-4519位或序列2的第5216-5274位所示；

(17)miRNA-CTLA4-1770：核苷酸序列如序列表中序列1的第4599-4657位或序列2的第5354-5412位所示；

所述能敲低内源性CTLA4表达的载体的序列为序列表中序列1或序列2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述细胞因子为CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ和IL-2。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(B)中，所述培养的时间为自转入所述能敲低内源性CTLA4表达的载体后培养12天。

4.利用权利要求1-3中任一所述方法制备得到的能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂。

5.权利要求4所述CIK细胞制剂在如下任一中的应用：

(1)制备治疗肿瘤的产品；

(2)制备用于杀伤肿瘤细胞的产品。

6.能敲低内源性CTLA4表达的载体，其特征在于：所述能敲低内源性CTLA4表达的载体的序列为序列表中序列1或序列2所示。

7.权利要求6所述的载体在制备权利要求4所述CIK细胞制剂中的应用。