CN110835633B - 利用优化的基因密码子扩展系统制备ptc稳定细胞系及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药领域，具体涉及PTC稳定细胞系制备方法及应用。基于基因密码子扩展/PTC扩展技术，利用正交的非天然氨基酸(UAA)和tRNA/氨酰tRNA合成酶通读提前终止密码子(PTC，UAG/UAA/UGA)，并在蛋白质中定点引入非天然氨基酸。本发明进一步涉及稳定细胞系的应用，如包装复制缺陷型(PTC)病毒疫苗。

Description

利用优化的基因密码子扩展系统制备PTC稳定细胞系及应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及提前终止密码子(Premature terminationcodons，PTC)稳定细胞系、其制备方法及其用途。本发明的PTC稳定细胞系可基于基因密码子扩展技术，利用正交的非天然氨基酸(non-canonical Amino Acids，ncAAs)和tRNA/氨酰tRNA合成酶通读提前终止密码子(包含TAG、TAA和TGA)，并在蛋白质中定点引入非天然氨基酸。本发明进一步涉及PTC稳定细胞系的用途，如包装复制缺陷型病毒疫苗等。

背景技术

PTC技术及其应用瓶颈

经过数年的研究，人们对原核生物核糖体的翻译机制已有较全面的理解，多种核糖体不同功能状态的晶体和电镜结构已得到解析，大多数氨酰tRNA合成酶的结构也已获得。基于这些研究成果，近年来发展起来了遗传密码子扩展的技术——在基因组中引入琥珀终止密码子(TAG)，利用外源非天然氨基酸生物正交翻译系统来编码多种非天然氨基酸，并在生物活体内将其定点插入。到目前为止，这一技术已经将数种非天然氨基酸(包括亲和标记和光致异构化的氨基酸、羰基氨基酸和糖基化氨基酸)成功地定点表达在活细胞的蛋白质当中，赋予了这些蛋白质新颖的物理、化学和生理性质(L.Wang等，2001，Science 292:498-500；J.W.Chin等，2002，Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J.W.Chin，&P.G.Schultz，2002，ChemBioChem 11:1135-1137)。这些研究表明，该技术可以有选择性将羰基、炔基和叠氮基团等特殊化学基团引入蛋白质中，实现蛋白质的定点特异修饰，改善蛋白质的性质。同时，该技术还可应用在活体生物体(如病毒、细菌等)的定点标记、定点修饰、复制的控制等方面(Si L等，2016，Science 354:1170-1173)。

PTC技术即为在病毒基因组中引入提前终止密码子(Premature terminationcodons，PTC)，以控制病毒的复制、蛋白表达，使其依赖于外源非天然氨基酸的病毒疫苗开发技术。PTC技术真正应用于病毒疫苗的开发上，一个亟待解决的问题就是如何构建稳定整合且大量表达正交tRNA/氨酰tRNA合成酶/GFP报告基因的工程细胞。实现稳定整合正交tRNA/氨酰tRNA合成酶/GFP报告基因的工程细胞的构建，将大大促进PTC技术在病毒疫苗研发中的应用。但是目前的该工程细胞的构建技术仍存在以下难点：

首先由于tRNA的转录和加工有异于蛋白质，因此如何在真核细胞中实现正交的原核tRNA的高效稳定表达依旧是个国际难题；其次，按照传统的方法，同时稳定表达三个不同的外源基因元件的工程细胞，需要先后经过三轮基因转染或病毒转导以及相应的三种不同抗生素的筛选过程，由于在多种抗生素压力下细胞状态不佳、难以成活，同时筛选所用抗生素价格昂贵，造成细胞系构建过程繁琐，成功率低且成本高昂；目前成功构建的稳定整合正交tRNA/氨酰tRNA合成酶/GFP报告基因的工程细胞其细胞来源为人胚肾HEK293T细胞，该细胞适应性较强，但在病毒疫苗的拯救和开发过程中的应用局限于艾滋病毒和流感病毒，多数病毒在这种细胞系中的拯救效率较低，难以得到广泛应用；另外，传统的基因密码子扩展技术多局限于琥珀终止密码子(TAG)，这是基于在研究基因密码子扩展技术的大肠杆菌模型中琥珀终止密码子(TAG)的使用频率最低而决定的，但是研究表明，某些病毒基因的密码子使用频率和宿主细胞不完全匹配，这也是PTC技术应用于研发病毒疫苗的又一局限。

Vero细胞在疫苗生产中的应用

1963年，日本千叶大学的Y.Yasumura和Y.Kawakita两位学者研制出Vero细胞系，来源于非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾上皮细胞。1964年，Simizu博士将第93代的Vero细胞提供给英国的Tripical病毒实验室(NIAID,NIH)。1979年，第113代Vero细胞提供给美国标准菌种保藏中心(America Type Culture Collection,ATCC)，传代至第121代建立细胞库。Vero细胞为连续细胞系，可在体外连续传代，并对多种病毒敏感，包括SV-40、SV-5、麻疹病毒、虫媒病毒、逆转录病毒、风疹病毒、猴病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、牛痘病毒等多品种病毒。因此，Vero细胞制备后被就广泛应用实验室的相关生物学检测，如病毒扩增和空斑检测等。

Vero细胞用于疫苗研制发展是自二十世纪九十年代以来快速发展的，并得到世界卫生组织和我国生物制品规程批准认可。近十年，我国病毒性疫苗的研究也取得了快速发展，新型疫苗不断涌现。随着先进的细胞培养技术，如生物反应器、发酵罐细胞悬浮培养技术的推广应用，也使得更多的生产企业倾向选择Vero细胞进行病毒性疫苗的生产。

与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比，Vero细胞具有以下特点：①来源方便，可连续传代，生长速度快；②对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高；③遗传性状稳定，恶性转化程度低，生物安全性较高；④培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器实施大规模培养。

发明内容

发明人经过对现有技术的思考和研究，为了应用PTC技术进行广泛的病毒疫苗研发、同时提高病毒的包装效率和将来工业化生产的可能，将可识别并通读提前终止密码子(包含TAG、TAA和TGA)的外源生物正交蛋白质翻译系统整合到Vero细胞基因组中。由于不同的生物正交翻译系统可插入的非天然氨基酸不同，其对于不同核酸序列的插入效率也不尽相同，因此发明人通过对现有文献研究，选择并优化了具有可改造的功能性非天然氨基酸且其插入效率相对较高的四种生物正交翻译系统如下：

1.来源于巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)的

(SEQ IDNO:1)和吡咯赖氨酰tRNA合成酶(MbPylRS_NAEK)(SEQ ID NO:2)，非天然氨基酸N-ε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸(N-ε-2-azidoethyloxycarbonyl-L-lysine,NAEK)；

2.来源于马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)的

(SEQ ID NO:3)、四氯乙烯降解菌(Desulfitobacterium hafniense)的

(SEQ ID NO:4)和巴氏甲烷八叠球菌的吡咯赖氨酰tRNA合成酶(MbPylRS_eBK)(SEQ ID NO:5)，非天然氨基酸N-ε-叔丁氧羰基赖氨酸(e-tBoc-lysine，eBK)；

3.来源于大肠杆菌的

(SEQ ID NO:6)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的

(SEQ ID NO:7)和氧甲基酪氨酰tRNA合成酶(OMeYRS)(SEQ ID NO:8)，非天然氨基酸对乙酰苯丙氨酸(p-acetylphenylalanine，pAcF)；

4.来源于大肠杆菌的

(SEQ ID NO:9)和亮氨酰tRNA合成酶(LeuRS)(SEQID NO:10)，非天然氨基酸3-(6-乙酰萘基)氨基丙酸(3-(6-acetylnaphthalen-2-ylamino)-2-aminopropanoic acid,Anap)。

发明人应用目前唯一在脊椎动物体内有自主转座活性并可携带大片段DNA转座的DNA转座子系统Tol2，对应于每一种生物正交翻译系统，构建了一套带有真核细胞筛选常用的抗性标记例如潮霉素、博来霉素、嘌呤霉素(优选嘌呤霉素)抗性的、携带外源DNA的转座载体质粒，该载体携带正交的氨酰tRNA合成酶、具有一定拷贝数(例如12个或更多个拷贝数)的tRNA以及引入提前终止密码子的报告基因(例如以TAG为例，在Y39位引入提前终止密码子的报告基因GFP，SEQ ID NO:11)。通过将转座载体质粒与转座酶质粒共同电转染宿主细胞例如Vero细胞并使用本领域常规筛选方法例如使用嘌呤霉素进行筛选，使正交tRNA/氨酰tRNA合成酶/报告基因整合到宿主细胞中，建立了稳定表达正交tRNA/氨酰tRNA合成酶/报告基因(GFP)的特殊工程细胞系。该工程细胞系例如Vero工程细胞系能使特定功能性非天然氨基酸定点插入到特定病毒蛋白结构，从而能够得到定点突变、复制可控的PTC病毒疫苗。

相比于其它方法，本发明的优点可体现在如下中的一个或几个：

1.建立了一种通过一轮筛选稳定整合多个外源基因串联的长片段建立工程细胞系的方法，提高了多基因稳定整合细胞系构建的成功率，同时降低大量成本；

2.对应于每一种生物正交翻译系统，构建了一套同时携带高拷贝数正交tRNA、氨酰tRNA合成酶以及突变型EGFP报告基因的转座载体质粒；

3.对应于每一种生物正交翻译系统，获得了携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶/GFP报告基因的Vero细胞稳定细胞系Vero-Tol2-NAEK、Vero-Tol2-eBK、Vero-Tol2-pAcF和Vero-Tol2-Anap，通用名称为Vero-Tol2-ncAA；

4.稳定细胞系拓展了该系统可应用的病毒种类，可以实现在大多数的病毒蛋白任意位点引入非天然氨基酸，从而高效拯救PTC病毒，为PTC病毒疫苗的筛选创造条件；

5.利用稳定细胞系，可以在病毒蛋白上引入具有特定活性基团的非天然氨基酸，可以实现对病毒高效、特异性修饰的目的。

具体地，在本发明的一个具体的实施方案中，在宿主细胞Vero细胞中整合了正交tRNA/氨酰tRNA合成酶/GFP报告基因，主要通过以下步骤：(1)在Tol2-puro载体中连接氨酰tRNA合成酶，并用内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site,IRES)连接突变型GFP报告基因，构建转座载体质粒Tol2-RS-IRES-*GFP-puro；(2)步骤(1)转座载体质粒Tol2-RS-IRES-*GFP-puro中连接12个拷贝数的Pol III启动子启动的tRNA，获得同时串联正交多拷贝tRNA、氨酰tRNA合成酶和GFP报告基因的转座载体质粒Tol-RS-IRES-*GFP-12tRNA-puro；(3)步骤(2)中得到的转座载体质粒Tol2-RS-IRES-*GFP-12tRNA-puro和pCMV-Tol2(SEQ ID NO:12)转座酶质粒共同电转染Vero细胞，在培养基中加入非天然氨基酸和嘌呤霉素抗生素进行筛选，挑取带有绿色荧光的单克隆，并扩大培养，获得同时整合了正交tRNA、氨酰tRNA合成酶基因和突变型GFP报告基因的稳定细胞系，继续用含有嘌呤霉素扩大培养，最终得到稳定细胞系Vero-Tol2-ncAA。

该稳定细胞系能在报告基因上插入特定功能性非天然氨基酸的原理在于，以非天然氨基酸NAEK为例，整合的突变型

/MbPylRS满足下列关系：(1)突变型的

不能利用宿主细胞的赖氨酰tRNA合成酶，只能被突变型的MbPylRS酰化；(2)突变型的MbPylRS只能酰化

不能酰化其它tRNA，因此，突变型

和MbPylRS之间的关系是正交性的，即突变型的MbPylRS只能酰化突变型

同时突变型的

只能被突变型的MbPylRS酰化，也就是说同一质粒中的突变型的

和MbPylRS是绝对的相互专一的。这种正交性的酶并且是只有这种酶可以把非天然氨基酸NAEK酰化到这种正交的tRNA上，并且只能酰化这种tRNA，而不能酰化其它的tRNA。获得的正交

/MbPylRS系统，使非天然氨基酸NAEK与相应的提前终止密码子相对应，从而将非天然氨基酸NAEK定点引入到报告蛋白GFP或其它目的蛋白上。

更为具体地，本发明提供了：

1.四种功能性非天然氨基酸生物正交翻译系统的转座载体质粒，分别是

(1)NAEK系统Tol2-MbPylRS-IRES-*GFP-12

-puro(S EQ ID NO:13)，

(2)eBK系统Tol2-MbPylRS-IRES-*GFP-6

–puro(SEQ IDNO:14)，

(3)pAcF系统Tol2-OMeYRS-IRES-*GFP-6

-puro(SEQ IDNO:15)，

(4)Anap系统Tol2-LeuRS-IRES-*GFP-12

-puro(SEQ ID NO:16)；这些载体携带嘌呤霉素抗性基因，可用于进行包含这四种正交翻译系统的任意真核细胞系的筛选和构建。

2.稳定细胞系Vero-Tol2-NAEK，该细胞系由1轮质粒稳定电转染获得，携带有正交的突变型

/MbPylRS基因，利用该稳定细胞系，可以在目的病毒蛋白质任意位点引入非天然氨基酸NAEK，从而高效率拯救定点突变的PTC病毒疫苗。

3.稳定细胞系Vero-Tol2-eBK，该细胞系由1轮质粒稳定电转染获得，携带有正交的突变型

/MbPylRS基因，利用该稳定细胞系，可以在目的病毒蛋白质任意位点引入非天然氨基酸eBK，从而高效率拯救定点突变的PTC病毒疫苗。

4.稳定细胞系Vero-Tol2-pAcF，该细胞系由1轮质粒稳定电转染获得，携带有正交的突变型

/OMeYRS基因，利用该稳定细胞系，可以在目的病毒蛋白质任意位点引入非天然氨基酸pAcF，从而高效率拯救定点突变的PTC病毒疫苗。

5.稳定细胞系Vero-Tol2-Anap，该细胞系由1轮质粒稳定电转染获得，携带有正交的突变型

/LeuRS基因，利用该稳定细胞系，可以在目的病毒蛋白质任意位点引入非天然氨基酸Anap，从而高效率拯救定点突变的PTC病毒疫苗。

6.制备含有特定功能性非天然氨基酸的目的蛋白(例如EGFP)的方法，包括步骤：

(1)获得携带有与特定功能性非天然氨基酸的相应的突变型正交tRNA/氨酰tRNA合成酶基因的稳定细胞系Vero-Tol2-ncAA。

(2)选择位点：在目的蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点；

(3)基因突变：将编码对应于(2)中选择的位点的目的蛋白的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为提前终止密码子UAG、UAA或UGA；

(4)表达载体构建：将(3)基因突变步骤得到的突变的目的蛋白的编码序列与合适的载体可操作地连接，得到突变序列表达载体；

(5)蛋白表达：将步骤(4)得到的突变序列表达载体转染到步骤(1)中的稳定细胞系Vero-Tol2-ncAA中，将转染成功后的宿主细胞在含有相应功能性非天然氨基酸的培养基中培养，在适当的时间收集细胞；

(6)裂解细胞，检测含有非天然氨基酸的目的蛋白(例如GFP)蛋白表达量。

7.制备含有特定功能性非天然氨基酸的复制缺陷型PTC病毒疫苗方法，包括步骤：

(1)获得携带有与特定功能性非天然氨基酸的相应的突变型正交tRNA/氨酰tRNA合成酶基因的稳定细胞系Vero-Tol2-ncAA。

(2)在病毒目的蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个氨基酸位点；

(3)在步骤(2)所述的目的蛋白的核酸分子中将步骤(2)中所选择的位点的氨基酸的密码子突变为提前终止密码子UAG、UAA或UGA；

(4)将步骤(3)中得到的突变的核酸与合适的载体可操作地连接，得到核酸的表达载体；

(5)将步骤(4)得到的突变的核酸的表达载体转染步骤(1)所述的细胞系，将转染成功后的宿主细胞在含有相应功能性非天然氨基酸的培养基中培养，在适当的时间收集病毒；

(6)检测病毒的包装滴度和活性。

在一个方面，本发明提供一种用于在蛋白质或肽的任意位点引入非天然氨基酸的细胞系，其特征在于所述细胞系携带有吡咯赖氨酰-tRNA合成酶基因和源自古甲烷球菌的tRNA(tRNA^Pyl)。

在一个实施方案中，其中所述的tRNA^Pyl是多个拷贝数的启动子-tRNA Pyl。

在又一个实施方案中，其中所述的tRNA^Pyl是12个拷贝数的type-3Pol III启动子启动的tRNA^Pyl。

在一个实施方案中，其中所述的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶基因如SEQ ID NO:2所示。

在又一个实施方案中，其中所述的tRNA^Pyl来自于序列如SEQ ID NO:13所示的载体12tRNA。

在一个实施方案中，其中所述细胞系是通过下述的步骤获得的：

(1)在tol2-puro上连接吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶基因和IRES连接突变的绿色荧光蛋白基因，获得携带的转座子载体Tol2-pylRS-IRES-*GFP-puro；

(2)在Tol2-pylRS-IRES-*GFP-puro上连接12个拷贝数的type-3 Pol III启动子启动的tRNA^Pyl，获得病毒载体Tol2-pylRS-IRES-*GFP-12tRNA-puro；

(3)将(2)中所述的转座子载体tol2-pylRS-IRES-*GFP-12tRNA-puro，转导Vero细胞，用嘌呤霉素筛选，在培养基中加入非天然氨基酸，挑取带有绿色荧光的单克隆，并扩大培养，最终得到稳定细胞系，获得整合了吡咯赖氨酸-tRNA合成酶基因、突变型绿色荧光蛋白报告基因和12个拷贝数tRNA Pyl的稳定细胞系。

在又一个方面，本发明提供利用本发明的稳定细胞系制备含有非天然氨基酸的复制缺陷型(PTC)病毒疫苗方法，包括步骤：

(1)在病毒目的蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个氨基酸位点；

(2)在编码(1)所述的目的蛋白的核酸分子中将(1)中所选择的位点的氨基酸的密码子突变为终止密码子UAG、UAA或UGA；

(3)将(2)中得到的突变的核酸与合适的载体可操作地连接，得到核酸的表达载体；

(4)将(3)得到的突变的核酸的表达载体转染权利要求1-5中任一项所述的细胞系，将转染成功后的宿主细胞在含有非天然氨基酸的培养基中培养，在适当的时间收集病毒；

(5)检测病毒的包装滴度和活性。

在一个实施方案中，本发明所获得的定点突变的病毒，其特征在于将选自病毒至少一个蛋白的至少一个位点的氨基酸突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸选自：

(I)所示的Lys-diazirine，

(II)所示的Lys-azido，或其它含有双吖丙啶、叠氮结构的非天然氨基酸中的至少1种。

在另一个实施方案中，本发明所获得的定点突变的病毒，其中所述的非天然氨基酸是位于第N位的Lys-diazirine，其在病毒蛋白中的连接方式如下式所示：

其中，由R₁到R₂的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，第N位可以是病毒的蛋白中的任意一位，相应地，R₁为第1至第N-1位氨基酸残基，R₂为第N+1位至C末端的氨基酸残基，

R₃为

在又一个实施方案中，本发明所获得的定点突变的病毒，其中所述的非天然氨基酸是位于第N位的Lys-azido，其在病毒蛋白中的连接方式如下式所示：

其中，由R₁到R₂的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，第N位可以是病毒的蛋白中的任意一位，相应地，R₁为第1至第N-1位氨基酸残基，R₂为第N+1位至C末端的氨基酸残基，

R₄为

在另一方面，本发明提供突变蛋白或肽的核酸分子。

在一个实施方案中，本发明提供的突变病毒蛋白或肽的核酸分子，其特征在于编码非天然氨基酸的密码子为终止密码子UAG、UAA或UGA。

在又一方面，本发明提供使用本发明的方法制备的含有定点突变的病毒。

在另一方面，本发明提供含有有效量的本发明的定点突变的病毒的组合物。

在又一方面，本发明提供含有有效量的本发明的定点突变的病毒的疫苗。

在另一方面，本发明提供药物组合物，其含有有效量的本发明的定点突变的病毒，以及药学上可接受的赋形剂。

在又一方面，本发明提供本发明的定点突变的病毒在制备减毒活疫苗、制备预防和治疗病毒感染相关药物中的用途。

在另一方面，本发明提供本发明的定点突变的病毒在预防和治疗感染中的用途。

在一方面，本发明提供生物正交翻译系统，所述系统包含：正交的tRNA和氨酰tRNA合成酶；所述tRNA来源于原核生物，其反密码子环对应于提前终止密码子；所述氨酰tRNA合成酶能够将非天然氨基酸与所述tRNA结合；其中所述tRNA和氨酰tRNA合成酶位于同一载体上。

在一个实施方案中，所述载体是转座载体；在一个实施方案中，该转座载体是Tol2转座载体。

在另一个实施方案中，所述tRNA为来源于巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinabarkeri)的

所述氨酰tRNA合成酶为来源于巴氏甲烷八叠球菌的吡咯赖氨酰tRNA合成酶(MbPylRS_NAEK)；在一个实施方案中，所述

为SEQ ID NO:1，所述MbPylRS_NAEK为SEQ ID NO:2；或者，所述tRNA为来源于马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)的

或来源于四氯乙烯降解菌(Desulfitobacteriumhafniense)的

所述氨酰tRNA合成酶为来源于巴氏甲烷八叠球菌的吡咯赖氨酰tRNA合成酶(MbPylRS_eBK)；在一个实施方案中，

为SEQ ID NO:3，所述MbPylRS_eBK为SEQ ID NO:5；在一个实施方案中，所述

为SEQ ID NO:4，所述MbPylRS_eBK为SEQ ID NO:5；或者，所述tRNA为来源于大肠杆菌的

或来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的

所述氨酰tRNA合成酶为来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的氧甲基酪氨酰tRNA合成酶(OMeYRS)；在一个实施方案中，所述

为SEQID NO:6，所述OMeYRS为SEQ ID NO:8；在一个实施方案中，所述

为SEQ ID NO:7，所述OMeYRS为SEQ ID NO:8；或者，所述tRNA为来源于大肠杆菌的

所述氨酰tRNA合成酶为来源于大肠杆菌的亮氨酰tRNA合成酶(LeuRS)；在一个实施方案中，所述

为SEQ ID NO:9，所述LeuRS为SEQ ID NO:10。

在又一个实施方案中，本发明的生物正交翻译系统还包含非天然氨基酸和真核细胞；在一个实施方案中，非天然氨基酸选自NAEK、eBK、pAcF、Anap或其组合；在一个实施方案中，真核细胞选自293T、BHK-21、MDCK、RD、Vero或CHO细胞。

在另一方面，本发明提供真核细胞，其包含：正交的tRNA和氨酰tRNA合成酶；所述tRNA来源于原核生物，其反密码子环对应于提前终止密码子；其中所述氨酰tRNA合成酶能够将非天然氨基酸与所述tRNA结合；其中所述tRNA和氨酰tRNA合成酶以位于同一载体的方式导入所述真核细胞。

在一个实施方案中，所述载体是转座载体；在一个实施方案中，该转座载体是Tol2转座载体。

在又一个实施方案中，所述tRNA为来源于巴氏甲烷八叠球菌的

所述氨酰tRNA合成酶为来源于巴氏甲烷八叠球菌的吡咯赖氨酰tRNA合成酶(MbPylRS_NAEK)；在一个实施方案中，所述

为SEQ ID NO:1，所述MbPylRS_NAEK为SEQ ID NO:2；或者，所述tRNA为来源于马氏甲烷八叠球菌的

或来源于四氯乙烯降解菌的

所述氨酰tRNA合成酶为来源于巴氏甲烷八叠球菌的吡咯赖氨酰tRNA合成酶(MbPylRS_eBK)；在一个实施方案中，

为SEQ ID NO:3，所述MbPylRS_eBK为SEQ ID NO:5；在一个实施方案中，所述

为SEQ ID NO:4，所述MbPylRS_eBK为SEQ ID NO:5；或者，所述tRNA为来源于大肠杆菌的

或来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的

所述氨酰tRNA合成酶为来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的氧甲基酪氨酰tRNA合成酶(OMeYRS)；在一个实施方案中，所述

为SEQ ID NO:6，所述OMeYRS为SEQ ID NO:8；在一个实施方案中，所述

为SEQ ID NO:7，所述OMeYRS为SEQ ID NO:8；或者，所述tRNA为来源于大肠杆菌的

所述氨酰tRNA合成酶为来源于大肠杆菌的亮氨酰tRNA合成酶(LeuRS)；在一个实施方案中，所述

为SEQ ID NO:9，所述LeuRS为SEQ ID NO:10。

在另一个实施方案中，本发明的真核细胞选自293T、BHK-21、MDCK、RD、Vero或CHO细胞。

在又一方面，本发明提供制备本发明的真核细胞的方法，其包括：

(1)提供在同一载体中包含tRNA和氨酰tRNA合成酶的载体；在一个实施方案中，所述载体是转座载体；在一个实施方案中，该转座载体是Tol2转座载体；

(2)将包含tRNA和氨酰tRNA合成酶的载体导入真核细胞；

(3)获得稳定整合tRNA和氨酰tRNA合成酶基因的真核细胞。

在另一方面，本发明提供制备含有非天然氨基酸的目的蛋白的方法，其包括：

(1)在目的蛋白的氨基酸序列中选择期望导入非天然氨基酸的一个或多个氨基酸位点；

(2)将目的蛋白中编码步骤(1)中所选择的氨基酸位点的密码子突变为提前终止密码子；

(3)将编码突变的目的蛋白的基因导入本发明的真核细胞；

(4)在含有非天然氨基酸的培养基中培养导入了编码突变的目的蛋白的基因的真核细胞，使含有非天然氨基酸的目的蛋白得到表达；

(5)收获表达的含有非天然氨基酸的目的蛋白。

在一个实施方案中，所述非天然氨基酸选自NAEK、eBK、pAcF、Anap或其组合。

在另一方面，本发明提供制备含有非天然氨基酸的复制缺陷型PTC病毒的方法，其包括：

(1)在病毒目的蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个氨基酸位点；

(2)在编码(1)所述的目的蛋白的核酸分子中将(1)中所选择的位点的氨基酸的密码子突变为提前终止密码子UAG、UAA或UGA；

(3)将(2)中得到的突变的核酸与合适的载体可操作地连接，得到核酸的表达载体；

(4)将(3)得到的突变的核酸的表达载体转染本发明的真核细胞，将转染成功后的真核细胞在含有非天然氨基酸的培养基中培养，在适当的时间收集病毒；

(5)检测病毒的包装滴度和活性。

在一个实施方案中，非天然氨基酸选自NAEK、eBK、pAcF、Anap或其组合。

在又一方面，本发明提供使用本发明的制备方法制备的复制缺陷型PTC病毒。

在另一方面，本发明提供药物组合物，其含有有效量的本发明的复制缺陷型PTC病毒以及药学上可接受的赋形剂。

在又一方面，本发明提供本发明的复制缺陷型PTC病毒在制备减毒活疫苗、制备预防和治疗病毒感染相关药物中的用途。

在另一方面，本发明提供本发明的复制缺陷型PTC病毒在预防和治疗感染中的用途。

附图说明

本发明采用以下附图来举例说明本发明的有益效果。应当理解的是，这些仅用于说明本发明的具体实施方案，并不意图限制本发明的范围。

图1：Tol2-PylRS-IRES-*GFP-12tRNA-puro转座载体和pCMV-Tol2转座酶质粒结构示意图

图2：筛选稳定细胞系的流程(非天然氨基酸NAEK为例)

携带有突变型正交

/MbPylRS基因的稳定细胞系Vero-Tol2-NAEK通过1轮筛选获得，将Tol2-MbPylRS-IRES-*GFP-12

-puro转座载体质粒和pCMV-Tol2转座酶质粒共同电转染Vero细胞，用浓度为5μg/ml的嘌呤霉素进行筛选，在培养基中加入非天然氨基酸NAEK，挑取带有绿色荧光的单克隆，并扩大培养，获得同时整合了正交

MbPylRS基因和突变型GFP报告基因的稳定细胞系，继续用5μg/ml的嘌呤霉素扩大培养，最终得到稳定细胞系Vero-Tol2-NAEK。

图3：稳定细胞系的鉴定

A：稳定细胞系培养中加入的四种功能性非天然氨基酸结构示意图；

B：

在Vero-Tol2-NAEK细胞中基因拷贝数标准曲线；

C：稳定细胞系加入(+NAEK)/未加入(-NAEK)非天然氨基酸后的绿色荧光蛋白成像，只有加入非天然氨基酸后，才能使带有提前终止密码子突变的GFP基因通读；在未加入非天然氨基酸10天的细胞中再次加入非天然氨基酸(-+NAEK)后，荧光成像显示提前终止密码子重新被通读；

D：蛋白质印迹检测稳定细胞系加入/未加入非天然氨基酸后正交氨酰tRNA合成酶和绿色荧光蛋白的表达，加入/未加入非天然氨基酸均可以检测到氨酰tRNA合成酶的表达，而只有加入非天然氨基酸后，才能检测到全长的绿色荧光蛋白。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。何与本发明等价的变体或者实施方案都包括在本发明中。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1：Tol2-RS-IRES-*GFP-12tRNA-puro转座载体的构建及获得

为了保证生物正交的tRNA和氨酰-tRNA合成酶的表达量、阳性细胞的筛选效率以及基因的整合效率，需要将多拷贝串联表达的启动子-tRNA、pylRS和单点突变的GFP报告基因克隆到一个转座载体上。

因此，发明人设计了如图1中左图所示的Tol2-RS-IRES-*GFP-12tRNA-puro转座载体，首先在Tol2-puro转座子载体中引入CAG启动子启动的氨酰tRNA合成酶，并用内部核糖体进入位点连接引入提前终止密码子的突变型GFP报告基因；同时设计了12个拷贝数的PolIII启动子启动的tRNA，并将多拷贝串联的tRNA片段交付北京百奥赛图基因生物技术有限公司(Beijing Biocytogen Co.,Ltd.)进行基因合成，合成完成后克隆至转座载体中即获得同时串联正交多拷贝tRNA、氨酰tRNA合成酶和GFP报告基因的转座载体质粒Tol-RS-IRES-*GFP-12tRNA-puro。

实施例2：Vero-Tol2-NAEK稳定细胞系的筛选

(1)制备细胞悬液：

Vero细胞(ATCC，CCL-81)用完全培养基(MEM，Gibco，11095080；10％胎牛血清，PAN，P30-3302；1％青/链霉素，Macgene，CC004)培养至汇合度为70％～80％时消化、收集细胞，用Opti-MEM(Gibco，31985070)漂洗三次，以洗去培养基中的抗生素和血清，然后用Opti-MEM重悬，上下吹打细胞使之无结团，取少量悬液进行细胞计数并算出总细胞数量。

(2)制备细胞和质粒的混合液：

将一定量的细胞与质粒DNA混合，充分混匀，使其最终浓度达到每管100μl混合液中含有1×10⁶细胞和10μg质粒DNA(转座载体与转座酶质粒DNA比例为3:2)，其中细胞体积为90μl，质粒DNA体积为10μl。

(3)电转实验参数设置：

使用NEPA21高效基因转染系统(NEPA GENE，Japan)和EC-002S中号电转杯进行实验，电转仪参数如表1所示：

表1.Vero细胞质粒电转染程序参数

(4)电转实验：

将细胞/DNA混合液分装至电转杯中，100μl/杯，并做好标记；敲打电转杯，清除体系内的气泡后将电转杯放入电转杯腔；按下“Ω”键，测定并记录电阻值(测量得到的电阻值应处于30-50Ω之间)；按下“start”键，执行电转程序；电转程序结束后迅速取出电转杯，用配备的吸管，从预先准备好的10cm培养皿中吸取少量培养基(约200-300μl)加入电转杯中轻微吹打2-3下，然后将悬液全部吸出，加入到10cm培养皿中；一个10cm培养皿需要重复电转5-7次以达到筛选所需细胞量。

(5)抗生素筛选：

质粒电转48小时后换液，并加入非天然氨基酸NAEK和嘌呤霉素抗生素筛选，筛选浓度要根据具体细胞的杀伤曲线来决定，Vero细胞嘌呤霉素筛选浓度为5μg/ml；隔天换液，抗生素筛选10天，直至电转野生型EGFP质粒的空白组全部死亡，电转转座子系统转座载体和转座酶的实验组形成克隆；经过多轮流式细胞分选分离纯化GFP阳性克隆，扩大培养得到稳定细胞系Vero-Tol2-NAEK。

实施例3：Vero-Tol2-ncAA稳定细胞系的鉴定(以Vero-Tol2-NAEK为例)

本发明中构建的稳定细胞系Vero-Tol2-NAEK中含有源自巴氏甲烷八叠球菌的tRNA

和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(MbPylRS)，在稳定细胞系的蛋白表达中，以提前终止密码子(包含TAG、TAA和TGA)为有义编码子，能够使非天然氨基酸NAEK掺入到蛋白中。下面，发明人对NAEK的掺入可能性和突变蛋白质的生产性能进行了检测。

(1)非天然氨基酸NAEK的合成和鉴定：

非天然氨基酸NAEK的化学合成反应式如下：

如上式所述，将原料1(2-溴乙醇)2.3mL溶于90mL丙酮以及15mL水的混合溶液，加入NaN3 3.12g，60℃油浴加热回流反应20h。冷却至室温，旋蒸除去丙酮，无水乙醚萃取(30mL×8)，无水Na₂SO₄干燥，旋蒸除去溶剂得2.62g无色液体产物2。

将产物2(500mg，5.74mmol)加入到三光气(1.70g，5.74mmol)的THF(10ml)溶液中。0℃搅拌反应8h，溶剂蒸干。剩余物在真空下干燥1h，得到无色油状产物3。

将3溶解在1.5ml的THF中并缓慢加入Boc-Lys-OH(1.7g，6.88mmol)的1M NaOH(20ml)/THF(5ml)的溶液中。0℃搅拌反应12h并逐渐升温到室温。重新将反应液冷却到0℃并用0℃的1M的盐酸溶液将反应液pH值调整至2～3。反应液用EtOAc萃取(30mL×5)，有机层用2×100ml的饱和食盐水洗涤。无水Na₂SO₄干燥有机层、过滤、旋蒸除去溶剂得到1.65g无色粘稠液体产物4不用进一步纯化。

将4溶于15mL CH₂Cl₂中，搅拌下缓慢滴加15mL TFA，室温下反应30min后蒸出溶剂，剩余液体产物用5mL甲醇溶解，加入100mL乙醚，析出大量白色固体沉淀，过滤干燥得到1.38g白色固体终产物5。1H NMR(D2O):δ＝1.22-1.45(m,4H),1.67-1.73(m,2H),2.99(m,2H),3.38(m,2H),3.70(m,1H),4.09(m,2H).13C NMR(D2O):δ＝21.4,28.4,29.6,39.5,53.4,56.2,57.8,116.0(TFA),153.1,162.3(TFA),172.9.HRMS:m/z calcd for C9H17N5O4[M]+:259.1281；found:259.1283，证明得到的NAEK结构(图3A)正确。

(2)

在Vero-Tol2-NAEK细胞中基因拷贝数的检测：

a.标准曲线的建立：

将含有外源转座载体质粒Tol2-MbPylRS-IRES-*GFP-12

-puro与Vero细胞的基因组DNA混合，设置含有12个、24个、48个、96个及192个外源基因质粒拷贝数的标准品对照，方法如下：

①假设Vero细胞的基因组DNA用量为x ng；

②含有外源基因的质粒的大小为y bp；

③Vero细胞的基因组DNA大小为2.97Gb；

④每个转座载体质粒中都有12个

串联，外源基因片段完全随机的头尾相连的插入在一条染色体上，则

⑤设计引物分别扩增转座载体质粒上的12-tRNA^Pyl以及管家基因是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因片段，应用

qPCR Master Mix(Promega,A6001)和Stratagene Mx3005P^TM Real-Time PCR扩增仪进行实验，每个样品做三次重复，PCR反应体系如表2所示，反应结果取平均C(t)，数值用Mean±SD表示。将C(t)_12-tRNAPyl-C(t)_GAPDH得到ΔC(t)，再对样品拷贝数除以12后以2为底的对数值即

作图，得到绝对定量标准曲线(图3B)。

b.

实时荧光定量PCR检测

按照天根基因组DNA提取试剂盒(DP304，天根生化科技(北京)有限公司)提取待检测细胞基因组DNA，设计引物分别扩增外源基因12-tRNA^Pyl以及管家基因GAPDH基因片段。应用

qPCR Master Mix(Promega,A6001)和Stratagene Mx3005P^TM Real-TimePCR扩增仪进行实验，每个样品做三次重复，PCR反应体系如表2所示，反应结果取平均C(t)，数值用Mean±SD表示。得到的外源基因C(t)代入标准曲线中可计算得到外源基因

的拷贝数。

表2.外源基因12-

的检测PCR反应体系

(3)吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(MbPylRS)表达鉴定：

本发明中构建的稳定细胞系Vero-Tol2-NAEK中含有源自巴氏甲烷八叠球菌的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(MbPylRS)，在Vero-Tol2-NAEK的培养过程中加入或不加NAEK至终浓度1mM，37℃，5％CO₂表达48小时后裂解细胞，进行免疫印迹实验检测，结果如图3D所示。由此结果可见，加入或不加非天然氨基酸，均能检测到吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的表达。

(4)突变型绿色荧光蛋白的NAEK掺入表达鉴定：

本发明中构建的稳定细胞系Vero-Tol2-NAEK中含有引入提前终止密码子的绿色荧光蛋白的突变型，在Vero-Tol2-NAEK的培养过程中加入或不加入NAEK至终浓度1mM，37℃，5％CO₂表达48小时后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，并裂解细胞进行免疫印迹实验检测，结果如图3C和图3D所示。由此结果可见，加入非天然氨基酸后，才能检测到全长有活性的突变型绿色荧光蛋白的表达；且在未加入非天然氨基酸10天的细胞中再次加入非天然氨基酸后，荧光成像显示提前终止密码子重新被通读，突变型绿色荧光蛋白表达。

实施例4：非天然氨基酸依赖的PTC EV71病毒疫苗的拯救

(1)野生型EV71病毒的质粒获得

基于人肠道病毒EV71国内流行株AH/08/06(Genbank登录号：HQ611148.1)，利用莫洛尼氏鼠白血病毒逆转录酶(M-MLV Reverse Transcriptase,Invitrogen,C28025011)和高保真DNA聚合酶(NEB，M0536L)，将病毒基因组进行全长RT-PCR扩增，同时在基因组5’端上游引入SP6启动子序列和SnaBⅠ单克隆位点，在3’端polyA下游引入MluⅠ单克隆位点。然后将全长基因组经双酶切后克隆至基于pBR22载体改造的pEV载体，经酶切鉴定及核酸序列测定验证，构建了EV71基因组全长感染性cDNA克隆EV71-A12。

(2)复制缺陷位点的选择

通过生物信息学工具Consurf对EV71病毒各个蛋白的氨基酸的保守性进行分析，同时根据已被解析的流感病毒蛋白的晶体结构(VP1-VP3-PDB:3VBF；2A-PDB:4FVB；2C-PDB:5GRB；3C-PDB:4GHQ；3D-PDB:3N6L)，保持其重要的功能结构域的完整性。从中选择不影响蛋白功能的保守、相对保守、相对不保守、不保守的氨基酸位点进行突变。

(2)PTC EV71病毒疫苗的拯救：以Vero-Tol2-NAEK为例

按照正常的拯救EV71病毒而方法，将野生型或引入相应PTC位点的EV71-A12质粒用Mlu I(Fermentas，FD0564)进行线性化并进行体外转录(Promega，P1280)，对得到的mRNA进行富集纯化后转染Vero-Tol2-NAEK稳定细胞系，mRNA转染量为6孔板每孔3μg。转染后，每天观察细胞在加入/未加入非天然氨基酸的条件下的病变情况并测定病毒滴度。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。例如，本申请虽然以EV71病毒为例对稳定细胞系的应用进行了说明，但是很显然，本发明不应当仅仅限于EV71病毒，本发明适用于任何目的病毒插入非天然氨基酸。

本文提供的任何和所有实施例或示例性语言的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于实施本发明是必要的。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

序列表

<110> 北京大学

<120> 利用优化的基因密码子扩展系统制备PTC稳定细胞系及应用

<130> IDC180058

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggaaacctga tcatgtagat cgaatggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60

gggtttccgc ca 72

<210> 2

<211> 1394

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggagcaaa agctcatttc tgaagaggac ttggataaaa aaccactaaa cactctgata 60

tctgcaaccg ggctctggat gtccaggacc ggaacaattc ataaaataaa acaccacgaa 120

gtctctcgaa gcaaaatcta tattgaaatg gcatgcggag accaccttgt tgtaaacaac 180

tccaggagca gcaggactgc aagagcgctc aggcaccaca aatacaggaa gacctgcaaa 240

cgctgcaggg tttcggatga ggatctcaat aagttcctca caaaggcaaa cgaagaccag 300

acaagcgtaa aagtcaaggt cgtttctgcc cctaccagaa cgaaaaaggc aatgccaaaa 360

tccgttgcga gagccccgaa acctcttgag aatacagaag cggcacaggc tcaaccttct 420

ggatctaaat tttcacctgc gataccggtt tccacccaag agtcagtttc tgtcccggca 480

tctgtttcaa catcaatatc aagcatttct acaggagcaa ctgcatccgc actggtaaaa 540

gggaatacga accccattac atccatgtct gcccctgttc aggcaagtgc ccccgcactt 600

acgaagagcc agactgacag gcttgaagtc ctgttaaacc caaaagatga gatttccctg 660

aattccggca agcctttcag ggagcttgag tccgaattgc tctctcgcag aaaaaaagac 720

ctgcagcaga tctacgcgga agaaagggag aattatctgg ggaaactcga gcgtgaaatt 780

accaggttct ttgtggacag gggttttctg gaaataaaat ccccgatcct gatccctctt 840

gagtatatcg aaaggatggg cattgataat gataccgaac tttcaaaaca gatcttcagg 900

gttgacaaga acttctgcct gagacccatg cttgctccaa acctttacaa ctacctgcgc 960

aagcttgaca gggccctgcc tgatccaata aaaatttttg aaataggccc atgctacaga 1020

aaagagtccg acggcaaaga acacctcgaa gagtttacca tgctgaactt ctgccagatg 1080

ggatcgggat gcacacggga aaatcttgaa agcataatta cggacttcct gaaccacctg 1140

ggaattgatt tcaagatcgt aggcgattcc tgcatggtct atggggatac ccttgatgta 1200

atgcacggag acctggaact ttcctctgca gtagtcggac ccataccgct tgaccgggaa 1260

tggggtattg ataaaccctg gataggggca ggtttcgggc tcgaacgcct tctaaaggtt 1320

aaacacgact ttaaaaatat caagagagct gcaaggtccg agtcttacta taacgggatt 1380

tctaccaacc tgta 1394

<210> 3

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaaacctga tcatgtagat cgaacggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60

gggtttccg 69

<210> 4

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggggggtgga tcgaatagat cacacggact ctaaatccgt gcaggcgggt gaaactcccg 60

caccccccg 69

<210> 5

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggataaaa aaccattaga tgttttaata tctgcgaccg ggctctggat gtccaggact 60

ggcacgctcc acaaaatcaa gcaccatgag gtctcaagaa gtaaaatata cattgaaatg 120

gcgtgtggag accatcttgt tgtgaataat tccaggagtt gtagaacagc cagagcattc 180

agacatcata agtacagaaa aacctgcaaa cgatgtaggg tttcggacga ggatatcaat 240

aattttctca caagatcaac cgaaagcaaa aacagtgtga aagttagggt agtttctgct 300

ccaaaggtca aaaaagctat gccgaaatca gtttcaaggg ctccgaagcc tctggaaaat 360

tctgtttctg caaaggcatc aacgaacaca tccagatctg taccttcgcc tgcaaaatca 420

actccaaatt cgtctgttcc cgcatcggct cctgctcctt cacttacaag aagccagctt 480

gatagggttg aggctctctt aagtccagag gataaaattt ctctaaatat ggcaaagcct 540

ttcagggaac ttgagcctga acttgtgaca agaagaaaaa acgattttca gcggctctat 600

accaatgata gagaagacta cctcggtaaa ctcgaacgtg atattacgaa atttttcgta 660

gaccggggtt ttctggagat aaagtctcct atccttattc cggcggaata cgtggagaga 720

atgggtatta ataatgatac tgaactttca aaacagatct tccgggtgga taaaaatctc 780

tgcttgaggc caatgcttgc cccgactctt tacaactatc tgcgaaaact cgataggatt 840

ttaccaggcc caataaaaat tttcgaagtc ggaccttgtt accggaaaga gtctgacggc 900

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ccatggatag gtgcaggttt tggtcttgaa cgcttgctca aggttatgca cggctttaaa 1200

aacattaaga gggcatcaag gtccgaatct tactataatg ggatttcaac caatctgtaa 1260

<210> 6

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtggggttc ccgagcggcc aaagggagca gactctaaat ctgccgtcac agacttcgaa 60

ggttcgaatc cttcccccac ca 82

<210> 7

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggaggggtag cgaagtggct aaacgcggcg gactctaaat ccgctccctt tgggttcggc 60

ggttcgaatc cgtccccctc ca 82

<210> 8

<211> 1284

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggcaagca gtaacttgat taaacaattg caagagcggg ggctggtagc ccaggtgacg 60

gacgaggaag cgttagcaga gcgactggcg caaggcccga tcgcactcgt gtgtggcttc 120

gatcctaccg ctgacagctt gcatttgggg catcttgttc cattgttatg cctgaaacgc 180

ttccagcagg cgggccacaa gccggttgcg ctggtaggcg gcgcgacggg tctgattggc 240

gacccgagct tcaaagctgc cgagcgtaag ctgaacaccg aagaaactgt tcaggagtgg 300

gtggacaaaa tccgtaagca ggttgccccg ttcctcgatt tcgactgtgg agaaaactct 360

gctatcgcgg ccaataatta tgactggttc ggcaatatga atgtgctgac cttcctgcgc 420

gatattggca aacacttctc cgttaaccag atgatcaaca aagaagcggt taagcagcgt 480

ctcaaccgtg aagatcaggg gatttcgttc actgagtttt cctacaacct gctgcagggt 540

tatagtatgg cctgtttgaa caaacagtac ggtgtggtgc tgcaaattgg tggttctgac 600

cagtggggta acatcacttc tggtatcgac ctgacccgtc gtctgcatca gaatcaggtg 660

tttggcctga ccgttccgct gatcactaaa gcagatggca ccaaatttgg taaaactgaa 720

ggcggcgcag tctggttgga tccgaagaaa accagcccgt acaaattcta ccagttctgg 780

atcaacactg cgcgtgccga cgtttaccgc ttcctgaagt tcttcacctt tatgagcatt 840

gaagagatca acgccctgga agaagaagat aaaaacagcg gtaaagcacc gcgcgcccag 900

tatgtactgg cggagcaggt gactcgtctg gttcacggtg aagaaggttt acaggcggca 960

aaacgtatta ccgaatgcct gttcagcggt tctttgagtg cgctgagtga agcggacttc 1020

gaacagctgg cgcaggacgg cgtaccgatg gttgagatgg aaaagggcgc agacctgatg 1080

caggcactgg tcgattctga actgcaacct tcccgtggtc aggcacgtaa aactatcgcc 1140

tccaatgcca tcaccattaa cggtgaaaaa cagtccgatc ctgaatactt ctttaaagaa 1200

gaagatcgtc tgtttggtcg ttttacctta ctgcgtcgcg gtaaaaagaa ttactgtctg 1260

atttgctgga aagggcccgt ttaa 1284

<210> 9

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcccggatgg tggaatcggt agacacaagg gattctaaat ccctcggcgt tcgcgctgtg 60

cgggttcaag tcccgctccg ggta 84

<210> 10

<211> 2592

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atggaagagc aataccgccc ggaagagata gaatccaaag tacagcttca ttgggatgag 60

aagcgcacat ttgaagtaac cgaagacgag agcaaagaga agtattactg cttttctggc 120

cctccctatc cttctggtcg actacacatg ggccacgtac gtaactacac catcggtgac 180

gtgatcgccc gctaccagcg tatgctgggc aaaaacgtcc tgcagccgat cggctgggac 240

gcgtttggtc tgcctgcgga aggcgcggcg gtgaaaaaca acaccgctcc ggcaccgtgg 300

acgtacgaca acatcgcgta tatgaaaaac cagctcaaaa tgctgggctt tggttatgac 360

tggagccgcg agctggcaac ctgtacgccg gaatactacc gttgggaaca gaaattcttc 420

accgagctgt ataaaaaagg cctggtatat aagaagactt ctgcggtcaa ctggtgtccg 480

aacgaccaga ccgtactggc gaacgaacaa gttatcgacg gctgctgctg gcgctgcgat 540

accaaagttg aacgtaaaga gatcccgcag tggtttatca aaatcactgc ttacgctgac 600

gagctgctca acgatctgga taaactggat cactggcctg acaccgttaa aaccatgcag 660

cgtaactgga tcggtcgttc cgaaggcgtg gagatcacct tcaacgttaa cgactatgac 720

aacacgctga ccgtttacac tacccgcccg gacaccttta tgggttgtac ctacctggcg 780

gtagctgcgg gtcatccgct ggcgcagaaa gcggcggaaa ataatcctga actggcggcc 840

tttattgacg aatgccgtaa caccaaagtt gccgaagctg aaatggcgac gatggagaaa 900

aaaggcgtcg atactggctt taaagcggtt cacccattaa cgggcgaaga aattcccgtt 960

tgggcagcaa acttcgtatt gatggagtac ggcacgggcg cagttatggc ggtaccgggg 1020

cacgaccagc gcgactacga gtttgcctct aaatacggcc tgaacatcaa accggttatc 1080

ctggcagctg acggctctga gccagatctt tctcagcaag ccctgactga aaaaggcgtg 1140

ctgttcaact ctggcgagtt caacggtctt gaccatgaag cggccttcaa cgccatcgcc 1200

gataaactga ctgcgatggg cgttggcgag cgtaaagtga actaccgcct gcgcgactgg 1260

ggtgtttccc gtcagcgtta ctggggcgcg ccgattccga tggtgactct agaagacggt 1320

accgtaatgc cgaccccgga cgaccagctg ccggtgatcc tgccggagga tgtggtaatg 1380

gacggcatta ccagcccgat taaagcagat ccggagtggg cgaaaactac cgttaacggt 1440

atgccagcac tgcgtgaaac cgacactttc gacaccttta tggagtcctc ctgggttctt 1500

gcgcgctaca cttgcccgca gtacaaagaa ggtatgctgg attccgaagc ggctaactac 1560

tggctgccgg tggatatcgc gattggtggt attgaacacg ccattatgga gagtctctac 1620

tgtcgcttct tccacaaact gatgcgtgat gcaggcatgg tgaactctga cgaaccagtt 1680

aaacagttgc tgtgtcaggg tatggtgctg gcagatgcct tctactatgt tggcgaaaac 1740

ggcgaacgta actgggtttc cccggttgat gctatcgttg aacgtgacga gaaaggccgt 1800

atcgtgaaag cgaaagatgc ggcaggccat gaactggttt ataccggcat gagcaaaatg 1860

tccaagtcga agaacaacgg tatcgacccg caggtgatgg ttgaacgtta cggcgcggac 1920

accgttcgtc tgtttatgat gtttgcttct ccggctgata tgactctcga atggcaggaa 1980

tccggtgtgg aaggggctaa ccgcttcctg aaacgtgtct ggaaactggt ttacgagcac 2040

acagcaaaaa gtgatgttgc ggcactgaac gttgatgcgc tgactgaaaa tcagaaagcg 2100

ctgcgtcgcg atgtgcataa aacgatcgct aaagtgaccg atgatatcgg ccgtcgtcag 2160

accttcaaca ccgcaattgc ggcgattatg gagctgatga acaaactggc gaaagcacca 2220

accgatggcg agcaggatcg cgctctgatg caggaagcac tgctggccgt tgtccgtatg 2280

cttaacccgt tcaccccgca catctgcttc acgctgtggc aggaactgaa aggcgaaggc 2340

gatatcgaca acgcgccgtg gccggttgct gacgaaaaag cgatggtgga agactccacg 2400

ctggtcgtgg tgcaggttaa cggtaaagtc cgtgccaaaa tcaccgttcc ggtggacgca 2460

acggaagaac aggttcgcga acgtgctggc caggaacatc tggtagcaaa atatcttgat 2520

ggcgttactg tacgtaaagt gatttacgta ccaggtaaac tcctcaatct ggtcgttggc 2580

gggcccgttt aa 2592

<210> 11

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctag 120

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ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

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<210> 12

<211> 5693

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aattcgagct tgcatgcctg caggtcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 60

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tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 360

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tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc 600

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<210> 13

<211> 17983

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gggcgaattg ggcccagagg tgtaaagtac ttgagtaatt ttacttgatt actgtactta 60

agtattattt ttggggattt ttactttact tgagtacaat taaaaatcaa tacttttact 120

tttacttaat tacatttttt tagaaaaaaa agtacttttt actccttaca attttattta 180

cagtcaaaaa gtacttattt tttggagatc acttcattct attttccctt gctattacca 240

aaccaattga attgcgctga tgcccagttt aatttaaata gatctggcca tctagacatg 300

gaatcgatgt caggtaccga gctcacgggg acagcccccc cccaaagccc ccagggatgt 360

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tggcacggga tcgctttcct ctgaacgctt ctcgctgctc tttgagcctg cagacacctg 540

gggggatacg gggaaaaagc tttaggctga aagagagatt tagaatgaca gaatcataga 600

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gggaaaaact gcctcctcat atccaaccca aacctcccct gtctcagtgt aaagccattc 840

ccccttgtcc tatcaagggg gagtttgctg tgacattgtt ggtctggggt gacacatgtt 900

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ggacgtggga catgcaggtg ttgagggctc tgggacactc tccaagtcac agcgttcaga 1020

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ctctccaagt cacagcgttc agaacagcct taaggataag aagataggat agaaggacaa 2280

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ctgtgtctga gcctgcatgt ttgatggtgt ctggatgcaa gcagaagggg tggaagagct 2400

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ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt 3660

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gactgcaaga gcgctcaggc accacaaata caggaagacc tgcaaacgct gcagggtttc 4800

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caaggtcgtt tctgccccta ccagaacgaa aaaggcaatg ccaaaatccg ttgcgagagc 4920

cccgaaacct cttgagaata cagaagcggc acaggctcaa ccttctggat ctaaattttc 4980

acctgcgata ccggtttcca cccaagagtc agtttctgtc ccggcatctg tttcaacatc 5040

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cattacatcc atgtctgccc ctgttcaggc aagtgccccc gcacttacga agagccagac 5160

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tttcagggag cttgagtccg aattgctctc tcgcagaaaa aaagacctgc agcagatcta 5280

cgcggaagaa agggagaatt atctggggaa actcgagcgt gaaattacca ggttctttgt 5340

ggacaggggt tttctggaaa taaaatcccc gatcctgatc cctcttgagt atatcgaaag 5400

gatgggcatt gataatgata ccgaactttc aaaacagatc ttcagggttg acaagaactt 5460

ctgcctgaga cccatgcttg ctccaaacct ttacaactac ctgcgcaagc ttgacagggc 5520

cctgcctgat ccaataaaaa tttttgaaat aggcccatgc tacagaaaag agtccgacgg 5580

caaagaacac ctcgaagagt ttaccatgct gaacttctgc cagatgggat cgggatgcac 5640

acgggaaaat cttgaaagca taattacgga cttcctgaac cacctgggaa ttgatttcaa 5700

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accctggata ggggcaggtt tcgggctcga acgccttcta aaggttaaac acgactttaa 5880

aaatatcaag agagctgcaa ggtccgagtc ttactataac gggatttcta ccaacctgta 5940

acccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 6000

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gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 6180

aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 6240

tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 6300

acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 6360

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ttcgatatca agcttatcga taatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact 7320

ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg 7380

tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg 7440

ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg 7500

tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg 7560

actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc 7620

tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca 7680

tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc 7740

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ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc 7860

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tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 7980

aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 8040

gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggaac 8100

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gatggctgtg agggacaggg gagtggcgcc ctgcaatatt tgcatgtcgc tatgtgttct 8280

gggaaatcac cataaacgtg aaatgtcttt ggatttggga atcttataag ttctgtatga 8340

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gggttagatt cccggggttt ccgccatttt tctcgacgac gccgccatct ctaggcccgc 8460

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tgcatataat atttcctagt aactatagag gcttaatgtg cgataaaaga cagataatct 8580

gttcttttta atactagcta cattttacat gataggcttg gatttctata agagatacaa 8640

atactaaatt attattttaa aaaacagcac aaaaggaaac tcaccctaac tgtaaagtaa 8700

ttgtgtgttt tgagactata aatatccctt ggagaaaagc cttgtttgga aacctgatca 8760

tgtagatcga atggactcta aatccgttca gccgggttag attcccgggg tttccgccat 8820

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tatacgatac aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat 8940

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attatgtttt aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt 9060

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ttgggaatct tataagttct gtatgagacc acagatcccc ggaaacctga tcatgtagat 9420

cgaatggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg gggtttccgc catttttctc 9480

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cggctactcc cctgccccgg ttaatttgca tataatattt cctagtaact atagaggctt 9600

aatgtgcgat aaaagacaga taatctgttc tttttaatac tagctacatt ttacatgata 9660

ggcttggatt tctataagag atacaaatac taaattatta ttttaaaaaa cagcacaaaa 9720

ggaaactcac cctaactgta aagtaattgt gtgttttgag actataaata tcccttggag 9780

aaaagccttg tttggaaacc tgatcatgta gatcgaatgg actctaaatc cgttcagccg 9840

ggttagattc ccggggtttc cgccattttt ctcgacaagg tcgggcagga agagggccta 9900

tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattaga 9960

attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa 10020

tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc 10080

gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc 10140

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taaaatggac tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata 10800

tatcttgtgg aaaggacgaa acaccggaaa cctgatcatg tagatcgaat ggactctaaa 10860

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tctaaatccg ttcagccggg ttagattccc ggggtttccg ccatttttgg atctctgcag 11220

tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac agccggaaat 11280

caagtccgtt tatctcaaac tttagcattt tgggaataaa tgatatttgc tatgctggtt 11340

aaattagatt ttagttaaat ttcctgctga agctctagta cgataagtaa cttgacctaa 11400

gtgtaaagtt gagatttcct tcaggtttat atagcttgtg cgccgcctgg gtacctcgga 11460

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tttccgccat ttttggatct aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt 11580

catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa 11640

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cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt 11760

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ccgatcatcg atatgtcgac gggcccataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 12300

cgtgctagat cgactgctag agtgacagat ctcatacaaa tccatagagc ccaccgcatc 12360

cccagcatgc ctgctattgt cttcccaatc ctcccccttg ctgtcctgcc ccaccccacc 12420

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tcgatgtgtc tgtcctccgg aagggccccc aacacgatgt ttgtgccggg caaggtcggc 13140

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ccggccgata tctcaccctg gtcgaggcgg tgttgtgtgg tgtagatgtt cgcgattgtc 13440

tcggaagccc ccagcacctg ccagtaagtc atcggctcgg gtacgtagac gatatcgtcg 13500

cgcgaaccca gggccaccag cagttgcgtg gtggtggttt tccccatccc gtgaggaccg 13560

tctatataaa cccgcagtag cgtgggcatg gatccggcac cgggcttgcg ggtcatgcac 13620

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atctcggcga acaccgcccc cgcttcgacg ctctccggcg tggtccagac cgccaccgcg 13980

gcgccgtcgt ccgcgaccca caccttgccg atgtcgagcc cgacgcgcgt gaggaagagt 14040

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gagactagtg agacgtgcta cttccatttg tcacgtcctg cacgacgcga gctgcggggc 14520

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ctttcttgct tttactttta cttccttaat actcaagtac aattttaatg gagtactttt 14940

ttacttttac tcaagtaaga ttctagccag atacttttac ttttaattga gtaaaatttt 15000

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ctaaatagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 15180

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gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 15300

tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 15360

cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 15420

gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 15480

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gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 15600

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gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 15720

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cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 15840

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 15900

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 15960

tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 16020

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 16080

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 16140

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 16200

ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 16260

tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 16320

agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 16380

gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 16440

ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 16500

gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 16560

cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 16620

acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 16680

cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 16740

cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 16800

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tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 16920

atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 16980

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 17040

actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 17100

aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 17160

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 17220

ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 17280

cgaaaagtgc cacctgatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg 17340

catcaggaaa ttgtaagcgt taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc 17400

agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag 17460

accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg 17520

gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca 17580

tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa 17640

gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg 17700

aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta 17760

accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtccattcg ccattcaggc 17820

tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 17880

aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 17940

gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact ata 17983

<210> 14

<211> 16960

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gggcgaattg ggcccagagg tgtaaagtac ttgagtaatt ttacttgatt actgtactta 60

agtattattt ttggggattt ttactttact tgagtacaat taaaaatcaa tacttttact 120

tttacttaat tacatttttt tagaaaaaaa agtacttttt actccttaca attttattta 180

cagtcaaaaa gtacttattt tttggagatc acttcattct attttccctt gctattacca 240

aaccaattga attgcgctga tgcccagttt aatttaaata gatctggcca tctagacatg 300

gaatcgatgt caggtaccga gctcacgggg acagcccccc cccaaagccc ccagggatgt 360

aattacgtcc ctcccccgct agggggcagc agcgagccgc ccggggctcc gctccggtcc 420

ggcgctcccc ccgcatcccc gagccggcag cgtgcgggga cagcccgggc acggggaagg 480

tggcacggga tcgctttcct ctgaacgctt ctcgctgctc tttgagcctg cagacacctg 540

gggggatacg gggaaaaagc tttaggctga aagagagatt tagaatgaca gaatcataga 600

acggcctggg ttgcaaagga gcacagtgct catccagatc caaccccctg ctatgtgcag 660

ggtcatcaac cagcagccca ggctgcccag agccacatcc agcctggcct tgaatgcctg 720

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gggaaaaact gcctcctcat atccaaccca aacctcccct gtctcagtgt aaagccattc 840

ccccttgtcc tatcaagggg gagtttgctg tgacattgtt ggtctggggt gacacatgtt 900

tgccaattca gtgcatcacg gagaggcaga tcttggggat aaggaagtgc aggacagcat 960

ggacgtggga catgcaggtg ttgagggctc tgggacactc tccaagtcac agcgttcaga 1020

acagccttaa ggataagaag ataggataga aggacaaaga gcaagttaaa acccagcatg 1080

gagaggagca caaaaaggcc acagacactg ctggtccctg tgtctgagcc tgcatgtttg 1140

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cagtaggact gggacaggca gctggagaat tgccatgtag atgttcatac aatcgtcaaa 1260

tcatgaaggc tggaaaagcc ctccaagatc cccaagacca accccaaccc acccaccgtg 1320

cccactggcc atgtccctca gtgccacatc cccacagttc ttcatcacct ccagggacgg 1380

tgaccccccc acctccgtgg gcagctgtgc cactgcagca ccgctctttg gagaaggtaa 1440

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ccccccaaag cccccaggga tgtaattacg tccctccccc gctagggggc agcagcgagc 1620

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ggacagcccg ggcacgggga aggtggcacg ggatcgcttt cctctgaacg cttctcgctg 1740

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gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 3120

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt cgaggtgagc 3180

cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta 3240

tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg gggggggggg gcgcgcgcca 3300

ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc 3360

aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc 3420

tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcgggg agtcgctgcg acgctgcctt cgccccgtgc 3480

cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg ttactcccac 3540

aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac 3600

ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt 3660

gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg 3720

gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc 3780

gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg 3840

aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg 3900

cgtcggtcgg gctgcaaccc cccctgcacc cccctccccg agttgctgag cacggcccgg 3960

cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt 4020

ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg 4080

aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg gctgtcgagg cgcggcgagc cgcagccatt 4140

gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc agggacttcc tttgtcccaa atctgtgcgg 4200

agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc cctctagcgg gcgcggggcg aagcggtgcg 4260

gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc 4320

ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg 4380

gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg 4440

ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc 4500

atcattttgg caaagaattg atttgatacc gcatttaaat gccaccatgg agcaaaagct 4560

catttctgaa gaggacttga tggataaaaa accattagat gttttaatat ctgcgaccgg 4620

gctctggatg tccaggactg gcacgctcca caaaatcaag caccatgagg tctcaagaag 4680

taaaatatac attgaaatgg cgtgtggaga ccatcttgtt gtgaataatt ccaggagttg 4740

tagaacagcc agagcattca gacatcataa gtacagaaaa acctgcaaac gatgtagggt 4800

ttcggacgag gatatcaata attttctcac aagatcaacc gaaagcaaaa acagtgtgaa 4860

agttagggta gtttctgctc caaaggtcaa aaaagctatg ccgaaatcag tttcaagggc 4920

tccgaagcct ctggaaaatt ctgtttctgc aaaggcatca acgaacacat ccagatctgt 4980

accttcgcct gcaaaatcaa ctccaaattc gtctgttccc gcatcggctc ctgctccttc 5040

acttacaaga agccagcttg atagggttga ggctctctta agtccagagg ataaaatttc 5100

tctaaatatg gcaaagcctt tcagggaact tgagcctgaa cttgtgacaa gaagaaaaaa 5160

cgattttcag cggctctata ccaatgatag agaagactac ctcggtaaac tcgaacgtga 5220

tattacgaaa tttttcgtag accggggttt tctggagata aagtctccta tccttattcc 5280

ggcggaatac gtggagagaa tgggtattaa taatgatact gaactttcaa aacagatctt 5340

ccgggtggat aaaaatctct gcttgaggcc aatgcttgcc ccgactcttt acaactatct 5400

gcgaaaactc gataggattt taccaggccc aataaaaatt ttcgaagtcg gaccttgtta 5460

ccggaaagag tctgacggca aagagcacct ggaagaattt actatggtga acttctgtca 5520

gatgggttcg ggatgtactc gggaaaatct tgaagctctc atcaaagagt ttctggacta 5580

tctggaaatc gacttcgaaa tcgtaggaga ttcctgtatg gtctttgggg atactcttga 5640

tataatgcac ggggacctgg agctttcttc ggcagtcgtc gggccagttt ctcttgatag 5700

agaatggggt attgacaaac catggatagg tgcaggtttt ggtcttgaac gcttgctcaa 5760

ggttatgcac ggctttaaaa acattaagag ggcatcaagg tccgaatctt actataatgg 5820

gatttcaacc aatctgtaac ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 5880

gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 5940

ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 6000

tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 6060

tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 6120

cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 6180

cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 6240

cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 6300

ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 6360

taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 6420

acaaccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 6480

ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 6540

acctagggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 6600

cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 6660

atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 6720

atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 6780

accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 6840

gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 6900

aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 6960

ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 7020

aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 7080

atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 7140

aagtaggcga tcgccaaatt cgatatcaag cttatcgata atcaacctct ggattacaaa 7200

atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac 7260

gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc 7320

ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt 7380

ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc 7440

tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc 7500

gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg 7560

gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt 7620

ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc 7680

cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt 7740

cggatctccc tttgggccgc ctccccgcat cgataccgtc gacctcgact gtgccttcta 7800

gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 7860

ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 7920

attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 7980

gcaggcatgc tggggaacta gtggcgcgcc tgcatgcctg caggtcgacg agggcctatt 8040

tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga taattagaat 8100

taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt 8160

tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt 8220

aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac gaaacaccgg 8280

aaacctgatc atgtagatcg aacggactct aaatccgttc agccgggtta gattcccggg 8340

gtttccgttt tttaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga 8400

aatccctatc agtgatagag acttataagt tccctatcag tgatagagac accggggggt 8460

ggatcgaata gatcacacgg actctaaatc cgtgcaggcg ggtgaaactc ccgcaccccc 8520

cgttttttgc taggagatcc gaaccaattg tgcttgagcc taggtcgggc aggaagaggg 8580

cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat 8640

tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta 8700

ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct 8760

taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa 8820

caccggaaac ctgatcatgt agatcgaacg gactctaaat ccgttcagcc gggttagatt 8880

cccggggttt ccgtttttta atatttgcat gtcgctatgt gttctgggaa atcaccataa 8940

acgtgaaatc cctatcagtg atagagactt ataagttccc tatcagtgat agagacaccg 9000

gggggtggat cgaatagatc acacggactc taaatccgtg caggcgggtg aaactcccgc 9060

accccccgtt ttttgagggc ctatttccca tgattccttc atatttgcat atacgataca 9120

aggctgttag agagataatt agaattaatt tgactgtaaa cacaaagata ttagtacaaa 9180

atacgtgacg tagaaagtaa taatttcttg ggtagtttgc agttttaaaa ttatgtttta 9240

aaatggacta tcatatgctt accgtaactt gaaagtattt cgatttcttg gctttatata 9300

tcttgtggaa aggacgaaac accggaaacc tgatcatgta gatcgaacgg actctaaatc 9360

cgttcagccg ggttagattc ccggggtttc cgttttttaa tatttgcatg tcgctatgtg 9420

ttctgggaaa tcaccataaa cgtgaaatcc ctatcagtga tagagactta taagttccct 9480

atcagtgata gagacaccgg ggggtggatc gaatagatca cacggactct aaatccgtgc 9540

aggcgggtga aactcccgca ccccccgttt tttgctagga gatccgaacc aattgtgctt 9600

gagcctaggt cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac 9660

gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag 9720

tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat 9780

gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt 9840

tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg gaaacctgat catgtagatc gaacggactc 9900

taaatccgtt cagccgggtt agattcccgg ggtttccgtt ttttaatatt tgcatgtcgc 9960

tatgtgttct gggaaatcac cataaacgtg aaatccctat cagtgataga gacttataag 10020

ttccctatca gtgatagaga caccgggggg tggatcgaat agatcacacg gactctaaat 10080

ccgtgcaggc gggtgaaact cccgcacccc ccgttttttg agggcctatt tcccatgatt 10140

ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga taattagaat taatttgact 10200

gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag 10260

tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag 10320

tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac gaaacaccgg aaacctgatc 10380

atgtagatcg aacggactct aaatccgttc agccgggtta gattcccggg gtttccgttt 10440

tttaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatccctatc 10500

agtgatagag acttataagt tccctatcag tgatagagac accggggggt ggatcgaata 10560

gatcacacgg actctaaatc cgtgcaggcg ggtgaaactc ccgcaccccc cgttttttgc 10620

taggagatcc gaaccaattg tgcttgagcc taggtcgggc aggaagaggg cctatttccc 10680

atgattcctt catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat tagaattaat 10740

ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt 10800

gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct taccgtaact 10860

tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa caccggaaac 10920

ctgatcatgt agatcgaacg gactctaaat ccgttcagcc gggttagatt cccggggttt 10980

ccgtttttta atatttgcat gtcgctatgt gttctgggaa atcaccataa acgtgaaatc 11040

cctatcagtg atagagactt ataagttccc tatcagtgat agagacaccg gggggtggat 11100

cgaatagatc acacggactc taaatccgtg caggcgggtg aaactcccgc accccccgtt 11160

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atcatcgata tgtcgacggg cccataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatcgt 11280

gctagatcga ctgctagagt gacagatctc atacaaatcc atagagccca ccgcatcccc 11340

agcatgcctg ctattgtctt cccaatcctc ccccttgctg tcctgcccca ccccaccccc 11400

cagaatagaa tgacacctac tcagacaatg cgatgcaatt tcctcatttt attaggaaag 11460

gacagtggga gtggcacctt ccagggtcaa ggaaggcacg ggggaggggc aaacaacaga 11520

tggctggcaa ctagaaggca cagtcgaggc tgatcagcga gctctagagc tcagttagcc 11580

tcccccatct cccgggcaaa cgtgcgcgcc aggtcgcaga tcgtcggtat ggagccgggg 11640

gtggtgacgt gggtctggac catcccggag gtaagttgca gcagggcgtc ccggcagccg 11700

gcgggcgatt ggtcgtaatc caggataaag acgtgcatgg gacggaggcg tttggccaag 11760

acgtccaagg cccaggcaaa cacgttgtac aggtcgccgt tgggggccag caactcgggg 11820

gcccgaaaca gggtaaataa cgtgtccccg atatggggtc gtgggcccgc gttgctctgg 11880

ggctcggcac cctggggcgg cacggccgtc cccgaaagct gtccccaatc ctcccgccac 11940

gacccgccgc cctgcagata ccgcaccgta ttggcaagca gcccgtaaac gcggcgaatc 12000

gcggccagca tagccaggtc aagccgctcg ccggggcgct ggcgtttggc caggcggtcg 12060

atgtgtctgt cctccggaag ggcccccaac acgatgtttg tgccgggcaa ggtcggcggg 12120

atgagggcca cgaacgccag cacggcctgg ggggtcatgc tgcccataag gtatcgcgcg 12180

gccgggtagc acaggagggc ggcgatggga tggcggtcga agatgagggt gagggccggg 12240

ggcggggcat gtgagctccc agcctccccc ccgatatgag gagccagaac ggcgtcggtc 12300

acggcataag gcatgcccat tgttatctgg gcgcttgtca ttaccaccgc cgcgtccccg 12360

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gaagccccca gcacctgcca gtaagtcatc ggctcgggta cgtagacgat atcgtcgcgc 12480

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acgccgacgg tggccaggaa ccacgcgggc tccttgggcc ggtgcggcgc caggaggcct 12840

tccatctgtt gctgcgcggc cagccgggaa ccgctcaact cggccatgcg cgggccgatc 12900

tcggcgaaca ccgcccccgc ttcgacgctc tccggcgtgg tccagaccgc caccgcggcg 12960

ccgtcgtccg cgacccacac cttgccgatg tcgagcccga cgcgcgtgag gaagagttct 13020

tgcagctcgg tgacccgctc gatgtggcgg tccggatcga cggtgtggcg cgtggcgggg 13080

tagtcggcga acgcggcggc gagggtgcgt acggccctgg ggacgtcgtc gcgggtggcg 13140

aggcgcaccg tgggcttgta ctcggtcccc atggtggcgt tggctgcagg tcgaaaggcc 13200

cggagatgag gaagaggaga acagcgcggc agacgtgcgc ttttgaagcg tgcagaatgc 13260

cgggcctccg gaggaccttc gggcgcccgc cccgcccctg agcccgcccc tgagcccgcc 13320

cccggaccca ccccttccca gcctctgagc ccagaaagcg aaggagcaaa gctgctattg 13380

gccgctgccc caaaggccta cccgcttcca ttgctcagcg gtgctgtcca tctgcacgag 13440

actagtgaga cgtgctactt ccatttgtca cgtcctgcac gacgcgagct gcggggcggg 13500

ggggaacttc ctgactaggg gaggagtaga aggtggcgcg aaggggccac caaagaacgg 13560

agccggttgg cgcctaccgg tggatgtgga atgtgtgcga ggccagaggc cacttgtgta 13620

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ctcccctacc ccagctgaga gtagcacaat ctaggcgtca taacttcgta taatgtatgc 13740

tatacgaagt tatacgcgta tcgggatccc agtgcggccg cactgtcgcg aatcgccatg 13800

gatcgctgca gatcgcaatt ccatggatat caagcttaaa caagaatctc tagttttctt 13860

tcttgctttt acttttactt ccttaatact caagtacaat tttaatggag tactttttta 13920

cttttactca agtaagattc tagccagata cttttacttt taattgagta aaattttccc 13980

taagtacttg tactttcact tgagtaaaat ttttgagtac tttttacacc tctgctcgac 14040

catatgggag agctcccaac gcgttggatg catagcttga gtattctata gtgtcaccta 14100

aatagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 14160

attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 14220

agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 14280

tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 14340

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 14400

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 14460

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 14520

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 14580

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 14640

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 14700

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 14760

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 14820

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 14880

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 14940

cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 15000

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 15060

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 15120

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 15180

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 15240

aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 15300

gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 15360

gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 15420

cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 15480

gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 15540

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 15600

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 15660

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 15720

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 15780

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 15840

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 15900

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 15960

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 16020

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 16080

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 16140

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 16200

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 16260

aaagtgccac ctgatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat 16320

caggaaattg taagcgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc 16380

tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc 16440

gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac 16500

tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca 16560

ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg 16620

agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag 16680

aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc 16740

accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt ccattcgcca ttcaggctgc 16800

gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag 16860

ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt 16920

gtaaaacgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata 16960

<210> 15

<211> 16996

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gggcgaattg ggcccagagg tgtaaagtac ttgagtaatt ttacttgatt actgtactta 60

agtattattt ttggggattt ttactttact tgagtacaat taaaaatcaa tacttttact 120

tttacttaat tacatttttt tagaaaaaaa agtacttttt actccttaca attttattta 180

cagtcaaaaa gtacttattt tttggagatc acttcattct attttccctt gctattacca 240

aaccaattga attgcgctga tgcccagttt aatttaaata gatctggcca tctagacatg 300

gaatcgatgt caggtaccga gctcacgggg acagcccccc cccaaagccc ccagggatgt 360

aattacgtcc ctcccccgct agggggcagc agcgagccgc ccggggctcc gctccggtcc 420

ggcgctcccc ccgcatcccc gagccggcag cgtgcgggga cagcccgggc acggggaagg 480

tggcacggga tcgctttcct ctgaacgctt ctcgctgctc tttgagcctg cagacacctg 540

gggggatacg gggaaaaagc tttaggctga aagagagatt tagaatgaca gaatcataga 600

acggcctggg ttgcaaagga gcacagtgct catccagatc caaccccctg ctatgtgcag 660

ggtcatcaac cagcagccca ggctgcccag agccacatcc agcctggcct tgaatgcctg 720

cagggatggg gcatccacag cctccttggg caacctgttc agtgcgtcac caccctctgg 780

gggaaaaact gcctcctcat atccaaccca aacctcccct gtctcagtgt aaagccattc 840

ccccttgtcc tatcaagggg gagtttgctg tgacattgtt ggtctggggt gacacatgtt 900

tgccaattca gtgcatcacg gagaggcaga tcttggggat aaggaagtgc aggacagcat 960

ggacgtggga catgcaggtg ttgagggctc tgggacactc tccaagtcac agcgttcaga 1020

acagccttaa ggataagaag ataggataga aggacaaaga gcaagttaaa acccagcatg 1080

gagaggagca caaaaaggcc acagacactg ctggtccctg tgtctgagcc tgcatgtttg 1140

atggtgtctg gatgcaagca gaaggggtgg aagagcttgc ctggagagat acagctgggt 1200

cagtaggact gggacaggca gctggagaat tgccatgtag atgttcatac aatcgtcaaa 1260

tcatgaaggc tggaaaagcc ctccaagatc cccaagacca accccaaccc acccaccgtg 1320

cccactggcc atgtccctca gtgccacatc cccacagttc ttcatcacct ccagggacgg 1380

tgaccccccc acctccgtgg gcagctgtgc cactgcagca ccgctctttg gagaaggtaa 1440

atcttgctaa atccagcccg accctcccct ggcacaacgt aaggccatta tctctcatcc 1500

aactccagga cggagtcagt gagaatattc tcgacggtac cgagctcacg gggacagccc 1560

ccccccaaag cccccaggga tgtaattacg tccctccccc gctagggggc agcagcgagc 1620

cgcccggggc tccgctccgg tccggcgctc cccccgcatc cccgagccgg cagcgtgcgg 1680

ggacagcccg ggcacgggga aggtggcacg ggatcgcttt cctctgaacg cttctcgctg 1740

ctctttgagc ctgcagacac ctggggggat acggggaaaa agctttaggc tgaaagagag 1800

atttagaatg acagaatcat agaacggcct gggttgcaaa ggagcacagt gctcatccag 1860

atccaacccc ctgctatgtg cagggtcatc aaccagcagc ccaggctgcc cagagccaca 1920

tccagcctgg ccttgaatgc ctgcagggat ggggcatcca cagcctcctt gggcaacctg 1980

ttcagtgcgt caccaccctc tgggggaaaa actgcctcct catatccaac ccaaacctcc 2040

cctgtctcag tgtaaagcca ttcccccttg tcctatcaag ggggagtttg ctgtgacatt 2100

gttggtctgg ggtgacacat gtttgccaat tcagtgcatc acggagaggc agatcttggg 2160

gataaggaag tgcaggacag catggacgtg ggacatgcag gtgttgaggg ctctgggaca 2220

ctctccaagt cacagcgttc agaacagcct taaggataag aagataggat agaaggacaa 2280

agagcaagtt aaaacccagc atggagagga gcacaaaaag gccacagaca ctgctggtcc 2340

ctgtgtctga gcctgcatgt ttgatggtgt ctggatgcaa gcagaagggg tggaagagct 2400

tgcctggaga gatacagctg ggtcagtagg actgggacag gcagctggag aattgccatg 2460

tagatgttca tacaatcgtc aaatcatgaa ggctggaaaa gccctccaag atccccaaga 2520

ccaaccccaa cccacccacc gtgcccactg gccatgtccc tcagtgccac atccccacag 2580

ttcttcatca cctccaggga cggtgacccc cccacctccg tgggcagctg tgccactgca 2640

gcaccgctct ttggagaagg taaatcttgc taaatccagc ccgaccctcc cctggcacaa 2700

cgtaaggcca ttatctctca tccaactcca ggacggagtc agtgagaata ttctcgagga 2760

tccgcggccg cttaattaac cgtttaaaca attctgcagg aatctagtta ttaatagtaa 2820

tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 2880

gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 2940

tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 3000

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 3060

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 3120

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt cgaggtgagc 3180

cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta 3240

tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg gggggggggg gcgcgcgcca 3300

ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc 3360

aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc 3420

tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcgggg agtcgctgcg acgctgcctt cgccccgtgc 3480

cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg ttactcccac 3540

aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac 3600

ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt 3660

gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg 3720

gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc 3780

gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg 3840

aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg 3900

cgtcggtcgg gctgcaaccc cccctgcacc cccctccccg agttgctgag cacggcccgg 3960

cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt 4020

ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg 4080

aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg gctgtcgagg cgcggcgagc cgcagccatt 4140

gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc agggacttcc tttgtcccaa atctgtgcgg 4200

agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc cctctagcgg gcgcggggcg aagcggtgcg 4260

gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc 4320

ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg 4380

gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg 4440

ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc 4500

atcattttgg caaagaattg atttgatacc gcatttaaat gccaccatgg agcaaaagct 4560

catttctgaa gaggacttgg caagcagtaa cttgattaaa caattgcaag agcgggggct 4620

ggtagcccag gtgacggacg aggaagcgtt agcagagcga ctggcgcaag gcccgatcgc 4680

actcgtgtgt ggcttcgatc ctaccgctga cagcttgcat ttggggcatc ttgttccatt 4740

gttatgcctg aaacgcttcc agcaggcggg ccacaagccg gttgcgctgg taggcggcgc 4800

gacgggtctg attggcgacc cgagcttcaa agctgccgag cgtaagctga acaccgaaga 4860

aactgttcag gagtgggtgg acaaaatccg taagcaggtt gccccgttcc tcgatttcga 4920

ctgtggagaa aactctgcta tcgcggccaa taattatgac tggttcggca atatgaatgt 4980

gctgaccttc ctgcgcgata ttggcaaaca cttctccgtt aaccagatga tcaacaaaga 5040

agcggttaag cagcgtctca accgtgaaga tcaggggatt tcgttcactg agttttccta 5100

caacctgctg cagggttata gtatggcctg tttgaacaaa cagtacggtg tggtgctgca 5160

aattggtggt tctgaccagt ggggtaacat cacttctggt atcgacctga cccgtcgtct 5220

gcatcagaat caggtgtttg gcctgaccgt tccgctgatc actaaagcag atggcaccaa 5280

atttggtaaa actgaaggcg gcgcagtctg gttggatccg aagaaaacca gcccgtacaa 5340

attctaccag ttctggatca acactgcgcg tgccgacgtt taccgcttcc tgaagttctt 5400

cacctttatg agcattgaag agatcaacgc cctggaagaa gaagataaaa acagcggtaa 5460

agcaccgcgc gcccagtatg tactggcgga gcaggtgact cgtctggttc acggtgaaga 5520

aggtttacag gcggcaaaac gtattaccga atgcctgttc agcggttctt tgagtgcgct 5580

gagtgaagcg gacttcgaac agctggcgca ggacggcgta ccgatggttg agatggaaaa 5640

gggcgcagac ctgatgcagg cactggtcga ttctgaactg caaccttccc gtggtcaggc 5700

acgtaaaact atcgcctcca atgccatcac cattaacggt gaaaaacagt ccgatcctga 5760

atacttcttt aaagaagaag atcgtctgtt tggtcgtttt accttactgc gtcgcggtaa 5820

aaagaattac tgtctgattt gctggaaagg gcccgtttaa cccctctccc tccccccccc 5880

ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat 5940

tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct 6000

tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg 6060

tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc 6120

tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg 6180

tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg 6240

tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga 6300

aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt 6360

agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa 6420

aaacacgatg ataatatggc cacaaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 6480

gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 6540

ggcgagggcg agggcgatgc cacctagggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 6600

ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 6660

ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 6720

ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 6780

gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 6840

aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 6900

tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac 6960

atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 7020

ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 7080

cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 7140

ctcggcatgg acgagctgta caagtaggcg atcgccaaat tcgatatcaa gcttatcgat 7200

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 7260

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 7320

atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 7380

tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 7440

ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 7500

attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 7560

ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 7620

gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 7680

aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 7740

cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca tcgataccgt 7800

cgacctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt 7860

ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat 7920

cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg 7980

gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggaact agtggcgcgc ctgcatgcct 8040

gcaggtcgac gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 8100

tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 8160

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 8220

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 8280

gtggaaagga cgaaacaccg gtggggttcc cgagcggcca aagggagcag actctaaatc 8340

tgccgtcaca gacttcgaag gttcgaatcc ttcccccacc attttttaat atttgcatgt 8400

cgctatgtgt tctgggaaat caccataaac gtgaaatccc tatcagtgat agagacttat 8460

aagttcccta tcagtgatag agacaccgga ggggtagcga agtggctaaa cgcggcggac 8520

tctaaatccg ctccctttgg gttcggcggt tcgaatccgt ccccctccat tttttgaggg 8580

cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat 8640

tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta 8700

ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct 8760

taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa 8820

caccggtggg gttcccgagc ggccaaaggg agcagactct aaatctgccg tcacagactt 8880

cgaaggttcg aatccttccc ccaccatttt ttaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg 8940

gaaatcacca taaacgtgaa atccctatca gtgatagaga cttataagtt ccctatcagt 9000

gatagagaca ccggaggggt agcgaagtgg ctaaacgcgg cggactctaa atccgctccc 9060

tttgggttcg gcggttcgaa tccgtccccc tccatttttt gagggcctat ttcccatgat 9120

tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac 9180

tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta 9240

gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa 9300

gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg gtggggttcc 9360

cgagcggcca aagggagcag actctaaatc tgccgtcaca gacttcgaag gttcgaatcc 9420

ttcccccacc attttttaat atttgcatgt cgctatgtgt tctgggaaat caccataaac 9480

gtgaaatccc tatcagtgat agagacttat aagttcccta tcagtgatag agacaccgga 9540

ggggtagcga agtggctaaa cgcggcggac tctaaatccg ctccctttgg gttcggcggt 9600

tcgaatccgt ccccctccat tttttgaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca 9660

tatacgatac aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat 9720

attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa 9780

attatgtttt aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt 9840

ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa caccggtggg gttcccgagc ggccaaaggg 9900

agcagactct aaatctgccg tcacagactt cgaaggttcg aatccttccc ccaccatttt 9960

ttaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atccctatca 10020

gtgatagaga cttataagtt ccctatcagt gatagagaca ccggaggggt agcgaagtgg 10080

ctaaacgcgg cggactctaa atccgctccc tttgggttcg gcggttcgaa tccgtccccc 10140

tccatttttt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 10200

tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 10260

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 10320

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 10380

gtggaaagga cgaaacaccg gtggggttcc cgagcggcca aagggagcag actctaaatc 10440

tgccgtcaca gacttcgaag gttcgaatcc ttcccccacc attttttaat atttgcatgt 10500

cgctatgtgt tctgggaaat caccataaac gtgaaatccc tatcagtgat agagacttat 10560

aagttcccta tcagtgatag agacaccgga ggggtagcga agtggctaaa cgcggcggac 10620

tctaaatccg ctccctttgg gttcggcggt tcgaatccgt ccccctccat tttttgaggg 10680

cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat 10740

tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta 10800

ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct 10860

taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa 10920

caccggtggg gttcccgagc ggccaaaggg agcagactct aaatctgccg tcacagactt 10980

cgaaggttcg aatccttccc ccaccatttt ttaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg 11040

gaaatcacca taaacgtgaa atccctatca gtgatagaga cttataagtt ccctatcagt 11100

gatagagaca ccggaggggt agcgaagtgg ctaaacgcgg cggactctaa atccgctccc 11160

tttgggttcg gcggttcgaa tccgtccccc tccatttttt ggatctccgg gtaccctgtg 11220

cgctagcatc gagcgctatc gctcgagatg gtaccgatca tcgatatgtc gacgggccca 11280

taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatcgtgcta gatcgactgc tagagtgaca 11340

gatctcatac aaatccatag agcccaccgc atccccagca tgcctgctat tgtcttccca 11400

atcctccccc ttgctgtcct gccccacccc accccccaga atagaatgac acctactcag 11460

acaatgcgat gcaatttcct cattttatta ggaaaggaca gtgggagtgg caccttccag 11520

ggtcaaggaa ggcacggggg aggggcaaac aacagatggc tggcaactag aaggcacagt 11580

cgaggctgat cagcgagctc tagagctcag ttagcctccc ccatctcccg ggcaaacgtg 11640

cgcgccaggt cgcagatcgt cggtatggag ccgggggtgg tgacgtgggt ctggaccatc 11700

ccggaggtaa gttgcagcag ggcgtcccgg cagccggcgg gcgattggtc gtaatccagg 11760

ataaagacgt gcatgggacg gaggcgtttg gccaagacgt ccaaggccca ggcaaacacg 11820

ttgtacaggt cgccgttggg ggccagcaac tcgggggccc gaaacagggt aaataacgtg 11880

tccccgatat ggggtcgtgg gcccgcgttg ctctggggct cggcaccctg gggcggcacg 11940

gccgtccccg aaagctgtcc ccaatcctcc cgccacgacc cgccgccctg cagataccgc 12000

accgtattgg caagcagccc gtaaacgcgg cgaatcgcgg ccagcatagc caggtcaagc 12060

cgctcgccgg ggcgctggcg tttggccagg cggtcgatgt gtctgtcctc cggaagggcc 12120

cccaacacga tgtttgtgcc gggcaaggtc ggcgggatga gggccacgaa cgccagcacg 12180

gcctgggggg tcatgctgcc cataaggtat cgcgcggccg ggtagcacag gagggcggcg 12240

atgggatggc ggtcgaagat gagggtgagg gccgggggcg gggcatgtga gctcccagcc 12300

tcccccccga tatgaggagc cagaacggcg tcggtcacgg cataaggcat gcccattgtt 12360

atctgggcgc ttgtcattac caccgccgcg tccccggccg atatctcacc ctggtcgagg 12420

cggtgttgtg tggtgtagat gttcgcgatt gtctcggaag cccccagcac ctgccagtaa 12480

gtcatcggct cgggtacgta gacgatatcg tcgcgcgaac ccagggccac cagcagttgc 12540

gtggtggtgg ttttccccat cccgtgagga ccgtctatat aaacccgcag tagcgtgggc 12600

atggatccgg caccgggctt gcgggtcatg caccaggtgc gcggtccttc gggcacctcg 12660

acgtcggcgg tgacggtgaa gccgagccgc tcgtagaagg ggaggttgcg gggcgcggag 12720

gtctccagga aggcgggcac cccggcgcgc tcggccgcct ccactccggg gagcacgacg 12780

gcgctgccca gacccttgcc ctggtggtcg ggcgagacgc cgacggtggc caggaaccac 12840

gcgggctcct tgggccggtg cggcgccagg aggccttcca tctgttgctg cgcggccagc 12900

cgggaaccgc tcaactcggc catgcgcggg ccgatctcgg cgaacaccgc ccccgcttcg 12960

acgctctccg gcgtggtcca gaccgccacc gcggcgccgt cgtccgcgac ccacaccttg 13020

ccgatgtcga gcccgacgcg cgtgaggaag agttcttgca gctcggtgac ccgctcgatg 13080

tggcggtccg gatcgacggt gtggcgcgtg gcggggtagt cggcgaacgc ggcggcgagg 13140

gtgcgtacgg ccctggggac gtcgtcgcgg gtggcgaggc gcaccgtggg cttgtactcg 13200

gtccccatgg tggcgttggc tgcaggtcga aaggcccgga gatgaggaag aggagaacag 13260

cgcggcagac gtgcgctttt gaagcgtgca gaatgccggg cctccggagg accttcgggc 13320

gcccgccccg cccctgagcc cgcccctgag cccgcccccg gacccacccc ttcccagcct 13380

ctgagcccag aaagcgaagg agcaaagctg ctattggccg ctgccccaaa ggcctacccg 13440

cttccattgc tcagcggtgc tgtccatctg cacgagacta gtgagacgtg ctacttccat 13500

ttgtcacgtc ctgcacgacg cgagctgcgg ggcggggggg aacttcctga ctaggggagg 13560

agtagaaggt ggcgcgaagg ggccaccaaa gaacggagcc ggttggcgcc taccggtgga 13620

tgtggaatgt gtgcgaggcc agaggccact tgtgtagcgc caagtgccca gcggggctgc 13680

taaagcgcat gctccagact gccttgggaa aagcgcctcc cctaccccag ctgagagtag 13740

cacaatctag gcgtcataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttata cgcgtatcgg 13800

gatcccagtg cggccgcact gtcgcgaatc gccatggatc gctgcagatc gcaattccat 13860

ggatatcaag cttaaacaag aatctctagt tttctttctt gcttttactt ttacttcctt 13920

aatactcaag tacaatttta atggagtact tttttacttt tactcaagta agattctagc 13980

cagatacttt tacttttaat tgagtaaaat tttccctaag tacttgtact ttcacttgag 14040

taaaattttt gagtactttt tacacctctg ctcgaccata tgggagagct cccaacgcgt 14100

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<213> 人工序列

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gacttataag ttccctatca gtgatagaga caccgcccgg atggtggaat cggtagacac 10860

aagggattct aaatccctcg gcgttcgcgc tgtgcgggtt caagtcccgc tccgggtatt 10920

ttttgatcta atatttgcat gtcgctatgt gttctgggaa atcaccataa acgtgaaatc 10980

cctatcagtg atagagactt ataagttccc tatcagtgat agagacaccg cccggatggt 11040

ggaatcggta gacacaaggg attctaaatc cctcggcgtt cgcgctgtgc gggttcaagt 11100

cccgctccgg gtattttttg gatctaatat ttgcatgtcg ctatgtgttc tgggaaatca 11160

ccataaacgt gaaatcccta tcagtgatag agacttataa gttccctatc agtgatagag 11220

acaccgcccg gatggtggaa tcggtagaca caagggattc taaatccctc ggcgttcgcg 11280

ctgtgcgggt tcaagtcccg ctccgggtat tttttggatc taatatttgc atgtcgctat 11340

gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tccctatcag tgatagagac ttataagttc 11400

cctatcagtg atagagacac cgcccggatg gtggaatcgg tagacacaag ggattctaaa 11460

tccctcggcg ttcgcgctgt gcgggttcaa gtcccgctcc gggtattttt tggatctaat 11520

atttgcatgt cgctatgtgt tctgggaaat caccataaac gtgaaatccc tatcagtgat 11580

agagacttat aagttcccta tcagtgatag agacaccgcc cggatggtgg aatcggtaga 11640

cacaagggat tctaaatccc tcggcgttcg cgctgtgcgg gttcaagtcc cgctccgggt 11700

attttttgga tctccgggta ccctgtgcgc tagcatcgag cgctatcgct cgagatggta 11760

ccgatcatcg atatgtcgac gggcccataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 11820

cgtgctagat cgactgctag agtgacagat ctcatacaaa tccatagagc ccaccgcatc 11880

cccagcatgc ctgctattgt cttcccaatc ctcccccttg ctgtcctgcc ccaccccacc 11940

ccccagaata gaatgacacc tactcagaca atgcgatgca atttcctcat tttattagga 12000

aaggacagtg ggagtggcac cttccagggt caaggaaggc acgggggagg ggcaaacaac 12060

agatggctgg caactagaag gcacagtcga ggctgatcag cgagctctag agctcagtta 12120

gcctccccca tctcccgggc aaacgtgcgc gccaggtcgc agatcgtcgg tatggagccg 12180

ggggtggtga cgtgggtctg gaccatcccg gaggtaagtt gcagcagggc gtcccggcag 12240

ccggcgggcg attggtcgta atccaggata aagacgtgca tgggacggag gcgtttggcc 12300

aagacgtcca aggcccaggc aaacacgttg tacaggtcgc cgttgggggc cagcaactcg 12360

ggggcccgaa acagggtaaa taacgtgtcc ccgatatggg gtcgtgggcc cgcgttgctc 12420

tggggctcgg caccctgggg cggcacggcc gtccccgaaa gctgtcccca atcctcccgc 12480

cacgacccgc cgccctgcag ataccgcacc gtattggcaa gcagcccgta aacgcggcga 12540

atcgcggcca gcatagccag gtcaagccgc tcgccggggc gctggcgttt ggccaggcgg 12600

tcgatgtgtc tgtcctccgg aagggccccc aacacgatgt ttgtgccggg caaggtcggc 12660

gggatgaggg ccacgaacgc cagcacggcc tggggggtca tgctgcccat aaggtatcgc 12720

gcggccgggt agcacaggag ggcggcgatg ggatggcggt cgaagatgag ggtgagggcc 12780

gggggcgggg catgtgagct cccagcctcc cccccgatat gaggagccag aacggcgtcg 12840

gtcacggcat aaggcatgcc cattgttatc tgggcgcttg tcattaccac cgccgcgtcc 12900

ccggccgata tctcaccctg gtcgaggcgg tgttgtgtgg tgtagatgtt cgcgattgtc 12960

tcggaagccc ccagcacctg ccagtaagtc atcggctcgg gtacgtagac gatatcgtcg 13020

cgcgaaccca gggccaccag cagttgcgtg gtggtggttt tccccatccc gtgaggaccg 13080

tctatataaa cccgcagtag cgtgggcatg gatccggcac cgggcttgcg ggtcatgcac 13140

caggtgcgcg gtccttcggg cacctcgacg tcggcggtga cggtgaagcc gagccgctcg 13200

tagaagggga ggttgcgggg cgcggaggtc tccaggaagg cgggcacccc ggcgcgctcg 13260

gccgcctcca ctccggggag cacgacggcg ctgcccagac ccttgccctg gtggtcgggc 13320

gagacgccga cggtggccag gaaccacgcg ggctccttgg gccggtgcgg cgccaggagg 13380

ccttccatct gttgctgcgc ggccagccgg gaaccgctca actcggccat gcgcgggccg 13440

atctcggcga acaccgcccc cgcttcgacg ctctccggcg tggtccagac cgccaccgcg 13500

gcgccgtcgt ccgcgaccca caccttgccg atgtcgagcc cgacgcgcgt gaggaagagt 13560

tcttgcagct cggtgacccg ctcgatgtgg cggtccggat cgacggtgtg gcgcgtggcg 13620

gggtagtcgg cgaacgcggc ggcgagggtg cgtacggccc tggggacgtc gtcgcgggtg 13680

gcgaggcgca ccgtgggctt gtactcggtc cccatggtgg cgttggctgc aggtcgaaag 13740

gcccggagat gaggaagagg agaacagcgc ggcagacgtg cgcttttgaa gcgtgcagaa 13800

tgccgggcct ccggaggacc ttcgggcgcc cgccccgccc ctgagcccgc ccctgagccc 13860

gcccccggac ccaccccttc ccagcctctg agcccagaaa gcgaaggagc aaagctgcta 13920

ttggccgctg ccccaaaggc ctacccgctt ccattgctca gcggtgctgt ccatctgcac 13980

gagactagtg agacgtgcta cttccatttg tcacgtcctg cacgacgcga gctgcggggc 14040

gggggggaac ttcctgacta ggggaggagt agaaggtggc gcgaaggggc caccaaagaa 14100

cggagccggt tggcgcctac cggtggatgt ggaatgtgtg cgaggccaga ggccacttgt 14160

gtagcgccaa gtgcccagcg gggctgctaa agcgcatgct ccagactgcc ttgggaaaag 14220

cgcctcccct accccagctg agagtagcac aatctaggcg tcataacttc gtataatgta 14280

tgctatacga agttatacgc gtatcgggat cccagtgcgg ccgcactgtc gcgaatcgcc 14340

atggatcgct gcagatcgca attccatgga tatcaagctt aaacaagaat ctctagtttt 14400

ctttcttgct tttactttta cttccttaat actcaagtac aattttaatg gagtactttt 14460

ttacttttac tcaagtaaga ttctagccag atacttttac ttttaattga gtaaaatttt 14520

ccctaagtac ttgtactttc acttgagtaa aatttttgag tactttttac acctctgctc 14580

gaccatatgg gagagctccc aacgcgttgg atgcatagct tgagtattct atagtgtcac 14640

ctaaatagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 14700

acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 14760

gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 14820

tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 14880

cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 14940

gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 15000

aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 15060

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 15120

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 15180

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 15240

ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 15300

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 15360

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 15420

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 15480

tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 15540

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 15600

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 15660

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 15720

ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 15780

tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 15840

agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 15900

gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 15960

ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 16020

gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 16080

cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 16140

acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 16200

cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 16260

cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 16320

ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 16380

tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 16440

atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 16500

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 16560

actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 16620

aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 16680

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 16740

ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 16800

cgaaaagtgc cacctgatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg 16860

catcaggaaa ttgtaagcgt taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc 16920

agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag 16980

accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg 17040

gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca 17100

tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa 17160

gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg 17220

aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta 17280

accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtccattcg ccattcaggc 17340

tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 17400

aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 17460

gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact ata 17503

Claims (5)

1.生物正交翻译系统，所述系统包含：

正交的tRNA和氨酰tRNA合成酶；

所述tRNA来源于原核生物；

所述tRNA的反密码子环对应于提前终止密码子；

所述氨酰tRNA合成酶能够将非天然氨基酸与所述tRNA结合；

其中所述tRNA和氨酰tRNA合成酶位于同一载体上，

其中：

所述tRNA为来源于巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)的

所述氨酰tRNA合成酶为来源于巴氏甲烷八叠球菌的吡咯赖氨酰tRNA合成酶MbPylRS；其中，所述

为SEQ ID NO:1，所述MbPylRS为SEQ ID NO:2；

其中所述载体是

转座载体，*GFP为单点突变的GFP报告基因；

其中所述系统还包含非天然氨基酸和真核细胞，所述真核细胞是转入上述转座载体的Vero细胞；

其中非天然氨基酸是NAEK。

2.真核细胞，其包含：

正交的tRNA和氨酰tRNA合成酶；

所述tRNA来源于原核生物；

所述tRNA的反密码子环对应于提前终止密码子；

其中所述氨酰tRNA合成酶能够将非天然氨基酸与所述tRNA结合；

其中所述tRNA和氨酰tRNA合成酶以位于同一载体的方式导入所述真核细胞，

其中：

所述tRNA为来源于巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)的

所述氨酰tRNA合成酶为来源于巴氏甲烷八叠球菌的吡咯赖氨酰tRNA合成酶MbPylRS；其中，所述

为SEQ ID NO:1，所述MbPylRS为SEQ ID NO:2；

其中所述载体是

转座载体，*GFP为单点突变的GFP报告基因；

其中所述真核细胞是转入上述转座载体的Vero细胞。

3.制备权利要求2所述的真核细胞的方法，其包括：

(1)提供在同一载体中包含tRNA和氨酰tRNA合成酶的载体，所述载体是Tol2转座载体；

(2)将包含tRNA和氨酰tRNA合成酶的载体导入真核细胞；

(3)获得稳定整合tRNA和氨酰tRNA合成酶基因的真核细胞。

4.制备含有非天然氨基酸的目的蛋白的方法，其包括：

(1)在目的蛋白的氨基酸序列中选择期望导入非天然氨基酸的一个或多个氨基酸位点；

(2)将目的蛋白中编码步骤(1)中所选择的氨基酸位点的密码子突变为提前终止密码子；

(3)将编码突变的目的蛋白的基因导入权利要求2所述的真核细胞；

(4)在含有非天然氨基酸的培养基中培养导入了编码突变的目的蛋白的基因的真核细胞，使含有非天然氨基酸的目的蛋白得到表达；

(5)收获表达的含有非天然氨基酸的目的蛋白，

其中所述非天然氨基酸是NAEK。

5.制备含有非天然氨基酸的复制缺陷型PTC病毒的方法，其包括：

(1)在病毒目的蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个氨基酸位点；

(2)在编码(1)所述的目的蛋白的核酸分子中将(1)中所选择的位点的氨基酸的密码子突变为提前终止密码子UAG、UAA或UGA；

(3)将(2)中得到的突变的核酸与合适的载体可操作地连接，得到核酸的表达载体；

(4)将(3)得到的突变的核酸的表达载体转染权利要求2所述的真核细胞，将转染成功后的真核细胞在含有非天然氨基酸的培养基中培养，在适当的时间收集病毒；

(5)检测病毒的包装滴度和活性，

其中所述非天然氨基酸是NAEK。

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