CN114717204B

CN114717204B - 复制缺陷型伪狂犬病病毒及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN114717204B
Application number: CN202210220569.3A
Authority: CN
Inventors: 汤艳东; 蔡雪辉; 王同云
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2022-03-08
Filing date: 2022-03-08
Publication date: 2023-12-26
Anticipated expiration: 2042-03-08
Also published as: CN114717204A

Abstract

本发明公开了一种复制缺陷型伪狂犬病病毒构建方法和应用。所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒是在包含PRV全基因组的BAC感染性克隆的基础上，将其中的gB基因编码序列中的第151或196位精氨酸突变为终止密码子TGA后得到的。本发明用tRNA反密码子编辑(Anticodon‑engineeredtransferRNAs，ACE‑tRNAs)技术实现DNA病毒提前终止密码子(Prematurestopcodon，PTC)的高效通读并应用于动物病毒疫苗的研究。证明了基于ACE‑tRNAs技术研究的复制缺陷病毒作为疫苗应用的可行性。本发明的提出为伪狂犬病病毒的防治提供了一种新的技术手段，同时也为解决一直困扰人们的疫苗安全性和有效性的问题提供了一种新的思路，代表了一种有前途的疫苗研究工具，为其它疫苗研究困难的病毒新型疫苗开发打开一扇新的大门。

Description

复制缺陷型伪狂犬病病毒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种复制缺陷型伪狂犬病病毒及其构建方法和应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

在过去20年中，人类病毒暴发的种类和数量不断增加，其中一些病毒的流行可导致大量的发病率和死亡率，如严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、埃博拉病毒、寨卡病毒和目前流行的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。毫无疑问，疫苗接种是控制病毒大流行最有效的方法之一。

目前，疫苗的类型主要包括减毒活疫苗和灭活疫苗。尽管灭活疫苗在病毒防控中起着至关重要的作用，但它们也有一些局限性，如保护效果差等。而减毒活疫苗则会存在毒力返强的风险，引发安全问题。因此，开发安全有效的疫苗是一项具有挑战性的任务。

近年来，密码子拓展技术代表了一种新型的创新技术，可以将致病性强的病毒转化为活的但不能复制的病毒疫苗，并针对亲本毒株和抗原变异毒株产生强大的免疫力。密码子拓展技术涉及一个正交翻译系统，该系统首先将提前终止密码子(Premature stopcodon，PTC)引入病毒必须蛋白的编码区，从而产生提前终止密码子病毒。PTC病毒的复制依赖于巴氏甲烷八叠球菌MS吡咯基tRNA合成酶/tRNA_CUA对(MbpyIRS/tRNA_CUA)和非天然氨基酸(Uaa)的合作。事实上，Uaa作为开关精确地控制病毒的复制是这项技术的基础。密码子拓展技术已经成功应用于丁型肝炎病毒、HIV-1和寨卡病毒并能精确控制病毒的复制。然而，这项技术还有多项问题有待解决。首先，在哺乳动物细胞中将Uaa有效地、位点特异性地插入靶蛋白是一个重大挑战(SchmiedWH,Elsasser SJ,Uttamapinant C,ChinJW.2014.Efficientmultisite unnatural amino acidincorporation inmammaliancells via optimizedpyrrolysyl tRNA synthetase/tRNAexpression and engineeredeRF1.JAm Chem Soc 136:15577-83.)。其次，与天然氨基酸相比，靶蛋白质中Uaa的插入可能对蛋白质折叠产生有害影响，进而影响蛋白功能(Wilkerson JW,SmithAK,WildingKM,Bundy BC,Knotts TAt.2020.The Effects ofp-Azidophenylalanine IncorporationonProtein Structure and Stability.J Chem InfModel 60:5117-5125.)。

ACE-tRNAs是将细胞中普遍存在的tRNA的反密码子进行编辑使其识别并通读UGA、UAA或UAG PTC位点。ACE-tRNAs能够被内源性细胞翻译机制识别，只需细胞内的氨酰-tRNA合成酶和真核细胞延伸因子1α(eEF-1α)便将ACE-tRNAs与其对应的氨基酸运送到核糖体上。与GCE技术相比，其对PTC突变位点的通读不依赖于外源的特殊的氨酰tRNA合成酶、tRNA以及Uaa。仅对tRNA的反密码子进行突变改造，通过转染、注射或电转等方法就可以实现携带天然氨基酸的tRNA识别终止密码子(UAG或UAA及UGA)并插入到对应的位置。

本发明在病毒层面上，探索ACE-tRNAs取代GCE技术通过控制PTC病毒的复制，从而生产一种活的复制缺陷病毒疫苗的可能性。我们选取伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)为研究对象，首次用ACE-tRNAs技术进行PRV复制缺陷病毒疫苗的研究。因为Arg^UGAtRNA和Gly^UGAtRNA(记载于申请号为202110516652.0，发明名称为“经过反密码子编辑的tRNA作为分子开关在精准控制蛋白表达及病毒复制中的应用”的专利申请中)对PTC具有较好的通读活性，因此首先在PRV必需基因gB上针对15个精氨酸位点和14个甘氨酸位点作了一系列点突变。对突变体在ACE-tRNAs存在下的表达以及膜融合功能进行评价，成功寻找出对gB蛋白功能和表达影响较小的氨基酸突变点如111R、115R、123R、137R、151R和196R。进一步，利用PRV BAC感染性克隆，成功构建PRV-PTC病毒，pPRV-Arg-151-PTC以及pPRV-Arg-196-PTC。将Arg^UGAtRNA与PRV-PTC突变体共同转染HEK-293T细胞，结果表明，当Arg^UGAtRNA在细胞中表达时，可以成功的拯救出PRV-PTC突变体病毒。因此，通过控制细胞中ACE-tRNAs的有无就可以精确控制体外病毒的复制。从而证明了ACE-tRNAs技术用于DNA病毒复制缺陷疫苗研究的可行性。最终在小鼠体内评价pPRV-Arg-151-PTC、pPRV-Arg-196-PTC作为复制缺陷病毒疫苗的可能性，结果表明两株PRV-PTC病毒对小鼠无致病性并且可以对野毒攻击提供完全免疫保护。

总的来说，这些数据支持ACE-tRNAs技术用于病毒疫苗的研究，ACE-tRNAs与病毒疫苗的联合应用可能会解决一直困扰人们的疫苗安全性的问题，该研究代表了一种有前途的疫苗研究工具，为新型疫苗的开发打开一扇新的大门。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复制缺陷型伪狂犬病病毒及其构建方法和应用。本发明利用tRNA反密码子编辑(Anticodon-engineeredtransferRNAs，ACE-tRNAs)技术技术实现DNA病毒提前终止密码子(Premature stop codon，PTC)的高效通读并应用于动物病毒疫苗的研究。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明以PRV为模式病毒，系统探讨了ACE-tRNAs技术应用于复制缺陷病毒疫苗研究的可能性。结果表明，Arg^UGAtRNA在PRV gB PTC多位点均具有良好的通读效力。通过PRVBAC感染性克隆成功获得两个在gB基因中含PTC位点的PRV感染性克隆，分别命名为pPRV-Arg-151-PTC、pPRV-Arg-196-PTC。仅在Arg^UGAtRNA存在时含PTC位点的病毒感染性克隆拯救成功。在病毒水平上证明ACE-tRNAs作为开关可以精确控制PTC病毒的复制。最终，我们在小鼠体内评价估了pPRV-Arg-151-PTC、pPRV-Arg-196-PTC复制缺陷病毒作为疫苗应用的可能性，结果表明两株PRV-PTC病毒对小鼠安全无致病性，且对强毒攻击提供完全免疫保护作用。

本发明的一种复制缺陷型伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)，所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒是在包含PRV全基因组的BAC感染性克隆质粒的基础上，将其中的gB基因编码序列中的第151或196位精氨酸突变为终止密码子TGA后经过病毒拯救后得到的。

其中，优选的，所述的包含PRV全基因组的BAC感染性克隆质粒为pJS-2012BAC。

进一步的，本发明还提出了所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒BAC感染性克隆在制备复制缺陷型伪狂犬病病毒疫苗中的应用。

进一步的，本发明还提出了一种复制缺陷型伪狂犬病病毒疫苗，所述的疫苗中含有有效量的所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒BAC感染性克隆。

更进一步的，本发明还提出了一种所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒BAC感染性克隆的拯救方法，包括将经过反密码子编辑的tRNAArg^UGAtRNA与复制缺陷型伪狂犬病病毒BAC感染性克隆质粒共同转染细胞的步骤。

其中，优选的，所述的方法的步骤如下：

(1)取出待转染的复制缺陷型伪狂犬病病毒BAC感染性克隆质粒、转染试剂以及稀释液使其恢复室温；所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒质粒是在包含PRV全基因组的BAC感染性克隆质粒的基础上，将其中的gB基因编码序列中的第151或196位精氨酸突变为终止密码子TGA后得到的；

(2)在超净台内将2μg的复制缺陷型伪狂犬病病毒感染性克隆质粒与2μg的Arg^UGAtRNA置于200μLjetPRIMEbuffer中进行稀释，轻轻吹打混匀；

(3)按质粒：转染试剂体积比1:2向该体系中加入8μLjetPRIME转染试剂，并立刻轻轻吹打混匀，室温孵育10min；

(4)将上述反应体系逐滴均匀加入细胞培养上清中，轻轻晃动细胞培养板使之分布均匀，置37℃温箱中培养；

(5)转染后6h换含有2％FBS的新鲜培养液，重新放回37℃细胞培养箱培养。

(6)转染48h后，于倒置荧光显微镜下观察细胞的发光情况，得到所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒。

其中，所述的Arg^UGAtRNA记载于申请号为202110516652.0，发明名称为“经过反密码子编辑的tRNA作为分子开关在精准控制蛋白表达及病毒复制中的应用”的专利申请中。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明将ACE-tRNAs与病毒疫苗研究相结合用于活的复制缺陷病毒疫苗的研究。结果表明，Arg^UGAtRNA在PRVgB PTC多位点均具有良好的通读效力。通过PRV BAC感染性克隆成功获得两株gB基因含PTC位点的毒株，分别命名为pPRV-Arg-151-PTC、pPRV-Arg-196-PTC。两株PTC病毒仅在ACE-tRNAs存在时能够拯救成功。首次在病毒水平上证明ACE-tRNAs作为开关可以精确控制PTC病毒的复制。最终在小鼠体内评价pPRV-Arg-151-PTC、pPRV-Arg-196-PTC作为复制缺陷病毒疫苗的可能性，结果表明两株PRV-PTC病毒对小鼠安全无致病性，经过两次免疫可以对野毒攻击提供完全免疫保护。

本发明首次用ACE-tRNAs技术代替GCE技术实现提前终止密码子(Premature stopcodon，PTC)的高效通读并应用于动物病毒疫苗的研究中。本发明的提出为伪狂犬病病毒的防治提供了一种新的技术手段，该技术应用于病毒疫苗研究可能会解决一直困扰人们的疫苗安全性和有效性的问题，代表了一种有前途的疫苗研究工具，为其它疫苗研究困难的病毒新型疫苗开发打开一扇新的大门。

附图说明

图1为ACE-tRNAs用于PRV复制缺陷病毒疫苗研究的原理示意图；

其中，无义突变PTC病毒可以在含有ACE-tRNAs的细胞中拯救，ACE-tRNAs将其同源氨基酸带到TGA终止密码子的位置，并确保蛋白质的完整表达，从而实现PTC病毒拯救；缩写：ACE-tRNAs，反密码子编辑tRNAs；PTC，提前终止密码子；eRF，真核生物释放因子；

图2为膜融合实验用于评价ACE-tRNAs对gB PTC位点的通读效率；

其中，将0.15μg的pCAGGS-gD、0.15μg pCAGGS-gH、0.15μg pCAGGS-gL、0.15μgpDC315-GFP，0.15μg pCAGGS-gB突变体与0.4μg指定的ACE-tRNAs(A)Arg^UGAtRNA(B)Gly^UGAtRNA共转染生长于24孔板中的RK13细胞；转染后48h，用倒置荧光显微镜观察细胞膜融合情况；转染野生型gB蛋白组为阳性对照，未转染组为Mock，转染空载体pCAGGS和ACE-tRNAs空载体pUC57的为阴性对照。细胞核用DAPI进行染色，scale bar＝200μm；

图3为Westernblot用于ACE-tRNAs对于gB PTC抑制功能的验证；

其中，(A)(C)0.75μg pCAGGS-gB精氨酸突变体与0.75μg Arg^UGAtRNA共转染生长于24孔板中的HEK-293T细胞；(B)(D)0.75μg pCAGGS-gB精氨酸突变体与0.75μg pUC57空载体共转染生长于24孔板中的HEK-293T细胞；(E)(G)0.75μg pCAGGS-gB甘氨酸突变体与0.75μgGly^UGAtRNA共转染生长于24孔板中的HEK-293T细胞；(F)(H)0.75μg pCAGGS-gB甘氨酸突变体与0.75μg pUC57空载体共转染生长于24孔板中的HEK-293T细胞；将0.75μg pCAGGS-gB与0.75μg pUC57转染组作为阳性对照，未转染组为阴性对照；

图4为PRV-PTC病毒在Vero细胞以及HEK-293T细胞上的拯救；

其中，2μgBAC-PRV、pPRV-Arg-151-PTC或pPRV-Arg-196-PTC BAC感染性克隆与2μgArg^UGAtRNA或pUC57质粒共同转染细胞；(A)在Vero细胞上转染36h，病毒的拯救情况；(B)在Vero细胞上转染48h病毒的拯救情况；(C)在HEK-293T细胞上转染27h，病毒的拯救情况；(D)在HEK-293T细胞上转染48h，病毒的拯救情况；

图5为PRV-PTC病毒的电镜观察；

图6为PRV-PTC病毒的传代以及稳定性检测；

其中，(A)倒置荧光显微镜观察PRV-PTC病毒的复制情况；(B)测序分析PRV-PTC病毒的稳定性；

图7为病毒感染性克隆转染后不同时间点病毒滴度的测定；

其中，(A)倒置荧光显微镜观察不同时间点拯救的PRV-PTC病毒的复制情况；(B)TCID₅₀测定不同时间点拯救的PRV-PTC病毒的滴度；

图8为PRV-PTC对小鼠安全性检测；

图9为PRV-PTC病毒免疫后对强毒攻击的保护率。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施过程中的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

实施例1包含提前终止密码子TGA的PRV-PTCBAC感染性克隆的构建

1材料和方法

1.1细胞和病毒

本研究使用的传代细胞系：Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)、HEK-293T细胞(人胚胎肾细胞)和RK13(兔肾细胞)由本实验室保存。包含PRV全基因组的BAC感染性克隆pJS-2012BAC，该BAC感染性克隆已在学位论文(伪狂犬病毒变异株JS-2012感染性细菌人工染色体克隆的构建及应用，王涛)中公开，并由中国农业科学院上海兽医研究所郑浩研究员提供。

1.2主要试剂

表1实验试剂

1.3含有单个提前终止密码子TGA的gB PTC突变体的构建

选取pCAGGS-gB质粒进行突变，对gB基因编码序列中的第9、26、63、111、115、123、137、151、196、226、246、256、290、315、329和357位精氨酸；第17、39、57、79、91、132、187、216、254、303、328、394、404和422位甘氨酸进行点突变，突变为终止密码子TGA，用于点突变的引物见表2。构建突变体质粒所用的PCR反应体系以及步骤见表3，4，5。

表2构建PRVgB基因TGA突变体所用的引物

表3 PCR反应体系

表4 PCR反应条件

在100μL反应体系内转移至1.5mL离心管中，加入200μL无水乙醇，室温静置10min，12000r/min离心10min，有可见的白色沉淀，弃上清，用水溶解，加入DpnI进行酶切，酶切反应体系和条件如下：

表5酶切反应体系

将反应体系置于37℃水浴锅中反应2h，直接用于转化。

1.4Western blot用于检测ACE-tRNAs对gB PTC突变体的抑制功能

将生长状态良好的HEK-293T细胞铺于24孔板中，待细胞生长至80％时，将0.75μgpCAGGS-gB突变体质粒分别与0.75μg的Arg^UGAtRNA或pUC57质粒按jetPRIME转染试剂说明书进行转染，0.75μg的pCAGGS-gB与0.75μg的pUC57转染组为阳性对照。转染后36h，检测蛋白的表达。70μL裂解液(50mM KCl、100mM NaCl、0.25％NP-40、1mM DTT和50mM NaOH)在冰上裂解30min，4℃ 12000×g离心10min。吸取上清，并与5×loading缓冲液混合，100℃加热10min。用12％SDS-PAGE蛋白胶80V 30min、120V 1h电泳，15V 90min转移到PVDF膜上。5％脱脂奶粉室温封闭2h，TBST洗涤3次。然后用指定的抗体孵育。随后，用TBST清洗膜3次，DyLight 800二抗(Sigma，美国)孵育1h。TBST洗膜，用Odyssey-CLx红外成像系统(LI-COR，美国)检测相关条带。

1.5膜融合实验用于检测ACE-tRNAs对gB PTC突变体的抑制功能

将生长状态良好的RK13细胞系铺24孔板中，将0.4μg指定的ACE-tRNAs质粒(Arg^UGAtRNA，Gly^UGAtRNA或pUC57质粒)与0.15μg的pCAGGS-gD、0.15μg pCAGGS-gH、0.15μgpCAGGS-gL、0.15μg pDC315-GFP，0.15μg pCAGGS-gB或其突变体共同转染细胞，转染6h后，换2％FBS的培养基。转染后48h，在倒置荧光显微镜下观察细胞融合情况，以此来筛选gB基因上对PRV复制感染影响较小的氨基酸突变位点。通过以上实验，初步筛选出对gB蛋白功能影响较小的氨基酸位点。

1.6包含提前终止密码子TGA的PRV-PTC感染性克隆的构建

1.6.1SW102电转感受态的制备

(1)SW102菌接种于5mL LB培养基中，32℃或更低温度过夜培养。

(2)将0.5mL过夜培养的SW102菌液接种到装有25mL含有氯霉素抗性的LB培养基中，32℃摇床培养3～5h，至OD_600nm达0.6(提前准备预冷的10％甘油以及高压灭菌的ddH₂O)。

(3)当OD_600nm达0.6时，将离心管置于冰水混合物中冷却1～2min。

(4)5000r/min，4℃离心5min。

(5)弃上清，离心管在纸巾上短暂倒置，添加1mL预冷的ddH₂O或10％甘油用来重悬菌液(操作在冰中进行)。当细菌完全重悬时，再添加9mL预冷的ddH₂O或10％甘油来回颠倒2次，5000rpm，4℃离心5min。

(6)弃上清，重复步骤(5)。

(7)弃上清，离心管在纸巾上短暂倒置去除上清液(注意不要丢失菌体)。250μL预冷的10％甘油用于重悬沉淀。感受态细胞直接用于转化。

1.6.2pJS-2012BAC质粒转化

(1)新制作的SW102电转感受态与1～5μg的pJS-2012BAC质粒混合，冰浴10min，转移至预冷的电转杯中。

(2)25mFD、200W、1.8kV电转，时间持续3～4ms。电转完毕后，立即将1mL LB培养基加入电转杯中，混匀。将LB与感受态转移至新的1.5mL离心管中，32℃摇床培养1h。

(3)涂氯霉素平板，32℃培养18～24h。

(4)挑取单菌落扩增并将其称为SW102-PRVBAC。

1.6.3galK基因表达盒的获得

首先使用galK选择培养基进行正筛选，即利用galK基因同源重组替换pJS-2012BAC的部分gB基因。只有替换成功的含有galK基因表达盒的重组子才可以在正筛选培养基上生长。以pgalK质粒为模板，使用引物gB-galKF/gB-galKR(gB-galKF：

5-GGGACCGCTTCTACGTCTGCCCGCCGCCGTCCGGCTCCACGGTGGTcctgttgacaattaatcatcggca-3；gB-galKR：

5-AGGCGGTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCGGCCTTGGAGACGCACTTGCCtcagcactgtcctgctcctt-3)和KOD DNA聚合酶(Toyobo，日本)，通过PCR扩增了1个带有galK表达盒的DNA片段，其两侧均带有50bp的gB同源臂基因。PCR反应的体系和条件如下：

表6 PCR反应体系

表7 PCR反应条件

胶回收PCR产物，加入1～2μLDpnI(Thermo，USA)37℃，酶切2h，消除模板质粒。胶回收目的片段，10～30ng PCR产物用于电转。

1.6.4正筛选电转感受态的制备

(1)SW102-PRV BAC菌液在含有氯霉素抗性的平板上划线培养。

(2)挑取单菌落于装有5mL含氯霉素抗性的LB中，32℃200rpm过夜培养。

(3)将0.5mL活化的菌液接种到25mL含氯霉素抗性的LB中。32℃200rpm培养3～4h。

(4)当OD₆₀₀达0.55～0.6时，停止培养。42℃水浴热激15min以诱导SW102产生重组酶。诱导完毕后立即冰浴10min，4℃5000r/min离心5min(使菌液保持近乎0℃很重要)。

(5)弃上清，取1mL预冷的去离子水加入离心管中，在冰水浴中轻轻旋转离心管(不要吹打)用于悬浮沉淀，重悬后再加入9mL预冷的ddH₂O。4℃5000r/min离心5min。

(6)重复步骤(5)

(7)弃上清，在纸巾上吸去多余的水分，用10％甘油重悬沉淀，80μL体系等量分装后用于电转。

1.6.5正筛选电转感受态的转化及鉴定

(1)将30ngPCR扩增的galK基因加入到25μL SW102-PRVBAC感受态中混匀，冰浴10min。

(2)转移至预冷的0.1cm电转杯中，按照1.5KV，25μF，200Ω的条件进行电转化。电转完毕，立即加入1mL无抗LB。

(3)将上述液体转移至1.5mL离心管中，32℃200r/min培养1.5h。

(4)将复苏的菌体用1mLM9洗涤两次。洗完后，用1mLM9重悬沉淀

(5)取150μLM9重悬菌体涂在含有氯霉素的MacConkey培养基上。32℃倒置培养3d观察转化结果并鉴定筛选galK⁺菌落。

(6)挑取单菌落在含氯霉素的LB试管中培养过夜，并使用gB-F/gB-R(gB-F:5-cgacggtatcgataagcttgatCGCTGGTGGCGGTCTTTG-3gB-R:5-ccgggctgcaggaattcgatGAGTCCAGGTCGATGGGGTAG-3)引物进行PCR扩增，检测galK是否成功整合。成功整合的克隆命名为pBAC-JS2012-gB-galK。

1.6.6负筛选目的基因的制备

不引入任何外源基因的前提下，从pBAC-JS2012-gB-galK中去除galK基因也就是反筛选。使用表2所示的引物从含有终止密码子突变碱基的pCAGGS-gB质粒模板中扩增含有gB突变点的目的DNA片段。PCR反应的体系和条件参考表6。胶回收PCR产物，加入1μLDpnI(Thermo，USA)37℃，酶切2h，胶回收目的片段。

1.6.7负筛选电转感受态的制备

(1)在氯霉素抗性的平板上对正筛选获得的pBAC-JS2012-gB-galK菌液划线培养。

(2)挑取单菌落接种在含有5mL氯霉素抗性的LB培养基中培养，32℃200rpm摇12h。

(3)按照1：20的比例，取1.25mL菌液于25mL含氯霉素的LB中培养，32℃200rpm至OD值达0.6左右停止培养。

(4)42℃水浴15min，立即冰浴10min。

(5)4℃5000r/min离心机离心5min，弃上清。

(6)无菌水预冷，重悬菌体，洗涤，离心，弃上清。重复3次。

(7)用10％的甘油重悬菌体，于冰上分装，每个1.5mL EP管分装80μL。

1.6.8负筛选电转感受态的转化及鉴定

(1)将30ng PCR扩增的含有gB突变点的目的DNA片段加入到80μL pBAC-JS2012-gB-galK感受态中混匀，冰浴10min。

(2)转移至0.1cm电转杯中，按照1.5KV，25μF，200Ω的条件进行电转化。电转完毕，立即加入1mL无抗LB。

(3)将上述液体转移至1.5mL离心管中，32℃200r/min培养1.5h。

(4)将复苏的菌体用1mL M9洗涤两次。洗完后，用1mL M9重悬沉淀

(5)取150μLM9重悬菌体涂在含有氯霉素的负筛选平板上。32℃温箱中倒置培养3d观察转化结果并鉴定筛选成功重组gB突变体片段的菌落。

(6)挑取单菌落在含氯霉素的LB中培养过夜，并使用gB-F/gB-R引物进行PCR扩增，检测带有突变位点的gB基因片段是否成功替换galK基因。得到gB基因编码序列中的第9、26、63、111、115、123、137、151、196、226、246、256、290、315、329和357位精氨酸以及第17、39、57、79、91、132、187、216、254、303、328、394、404和422位甘氨酸突变为终止密码子TGA的PRV-PTC BAC感染性克隆。gB基因编码序列中的第151位精氨酸突变为终止密码子TGA的PRV-PTC BAC感染性克隆命名为PRV-Arg-151-PTC，以此类推。

1.7PRV-PTC BAC感染性克隆的拯救

将生长状态良好的HEK-293T细胞以及Vero细胞铺于6孔板中，待细胞生长至80％时，将2μg的Arg^UGAtRNA与2μg的PRV-BAC或PRV-PTC BAC共同转染细胞，PRV-PTC BAC感染性克隆与pUC57质粒共转组为阴性对照。具体操作按jetPRIME转染试剂说明书进行转染。步骤如下：

(1)取出待转染的质粒、转染试剂以及稀释液使其恢复室温。

(2)在超净台内将2μg的PRV-PTC BAC感染性克隆质粒或分别与2μg的Arg^UGAtRNA或pUC57对照质粒置于200μLjetPRIME buffer中进行稀释，轻轻吹打混匀。

(3)按质粒：转染试剂(1:2)向该体系中加入8μLjetPRIME转染试剂，并立刻轻轻吹打混匀。室温孵育10min。

(4)将上述反应体系逐滴均匀加入细胞培养上清中，轻轻晃动细胞培养板使之分布均匀，置37℃温箱中培养。

(6)转染48h后，于倒置荧光显微镜下观察细胞的发光情况。

1.8PRV-PTC病毒的电镜观察

电镜样本由哈尔滨兽医研究所电镜团队根据标准操作程序制备，用于电子显微镜观察。按如上方法拯救感染性克隆，同时做转染PRV-BAC的阳性对照与不做转染处理的Mock组。置于37℃，5％CO₂条件下培养72h，500r/min、4℃离心10min后弃上清，收获细胞培养物，用2.5％(w/v)戊二醛固定，4℃作用2h，然后用磷钨酸负染后进行电镜观察。

1.9PRV-PTC病毒的传代与稳定性检测

HEK-293T细胞按每孔10^5.0个细胞接种于6孔板中，待细胞生长至80％时，将2μg的Arg^UGA tRNA与2μg pUC57质粒分别转染细胞。转染后24h，收集上一代冻存的病毒液，离心去除细胞碎片，0.45μm的滤膜过滤，用于感染细胞。按此步骤进行下一轮的感染。在Arg^UGAtRNA存在及不存在的细胞中进行平行实验，以检测病毒对Arg^UGAtRNA的依赖性。每次传代后，使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(天根，北京)提取病毒的DNA。采用PCR方法扩增PRV-PTC的gB基因片段，胶回收的产物直接用于测序。PCR引物为gB-F/gB-R(gB-F:

5-cgacggtatcgataagcttgatCGCTGGTGGCGGTCTTTG-3gB-R:

5-ccgggctgcaggaattcgatGAGTCCAGGTCGATGGGGTAG-3)。

1.10 PRV-PTC病毒不同时间点TCID₅₀的测定

HEK-293T细胞按每孔10^5.0个细胞接种于6孔板中，待细胞生长至80％时，将2μg的Arg^UGAtRNA与2μg PRV-PTC感染性克隆分别转染细胞，同时用2μg PRV-WT与2μg的pUC57转染组作为阳性对照。于转染后24、36、48和72h收集病毒上清与细胞的冻存液，离心去除细胞碎片，0.45μm的滤膜过滤，10倍稀释后用于感染提前铺于96孔板中的HEK-293T细胞。根据感染的发光细胞个数测定不同时间段病毒的TCID₅₀。

1.11动物实验

安全性评价：6-7周龄BALB/c小鼠，为了评价PRV-Arg-151-PTC、PRV-Arg-196-PTC对小鼠是否致病，进行如下的操作，对照组每只皮下注射100μL DMEM。低剂量组组每只分别皮下接种10⁴TCID₅₀ WT-PRV、PRV-Arg-151-PTC、PRV-Arg-196-PTC。高剂量组每只皮下接种10⁵TCID₅₀ WT-PRV、PRV-Arg-151-PTC、PRV-Arg-196-PTC。持续观察至21天时，每组取1只鼠颈椎脱臼处死，用于组织病理切片以及免疫组化观察。WT-PRV攻毒组在小鼠濒临死亡时即处死，取脑观察。

保护性评价：为了评价PRV-Arg-151-PTC、PRV-Arg-196-PTC的免疫保护能力。小鼠进行2次免疫，用1×10⁵TCID₅₀ PRV-PTC进行免疫，21d后用3×10⁴TCID₅₀的WT-PRV攻毒，对照组每只肌肉注射100μLDMEM，观察小鼠的状态及死亡情况。

伦理声明：所有小鼠实验均严格按照国家实验动物护理和使用指南(中国)和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所机构动物护理和伦理委员会(批准文号210926-02)进行。所有小鼠均被饲养在哈尔滨兽医研究所的动物房内。

2结果

2.1 ACE-tRNAs用于PRV复制缺陷病毒疫苗研究的原理

ACE-tRNAs用于PRV复制缺陷病毒疫苗研究的原理如下(图1)：在PRV基因组中编码关键蛋白质(如gB)的位置引入PTC位点，蛋白质翻译在PTC处终止，从而产生截短的无功能多肽和无活性的病毒。相反，当存在ACE-tRNAs时，PTC位点会翻译对应的氨基酸并产生完整的多肽。这种tRNA可以识别PTC并忠实地编码同源氨基酸，从而产生功能性蛋白质和有活性的病毒(图1)。组装后的PRV-PTC病毒可作为新型的复制缺陷病毒疫苗。它能进入细胞并进行单周期复制，因此解决活疫苗安全性的问题，又可以引起细胞和体液免疫。

2.2膜融合实验用于评价ACE-tRNAs对gB PTC位点的通读效率

基于上述实验结果精氨酸和甘氨酸ACE-tRNAs拥有较好的PTC通读效果。所以分别检测了Arg^UGAtRNA，Gly^UGAtRNA对gB PTC位点的通读效率。为了尽可能筛选出对gB蛋白膜融合功能影响较小的点，首先选择了15个精氨酸和15个甘氨酸位点并在gB基因真核表达质粒中将它们突变为终止密码子TGA。将构建的gB蛋白突变质粒与gD、gH、gL、315GFP及其对应的ACE-tRNAs(Arg^UGAtRNA或Gly^UGAtRNA)共转染RK13细胞。不含tRNA元件的pUC57空载体为阴性对照。野生型的gB、gD、gH、gL、315GFP转染组为阳性对照。结果表明，与野生型gB蛋白相比对照组中没有出现细胞融合。然而，当ACE-tRNAs存在时，会出现不同程度的膜融合。值得注意的是，在15个精氨酸突变体中，位于gB基因中111、115、123、137、151和196位的5个PTC位点可引起较好的膜融合，意味着这些位点通读效率较高(图2A)。任何甘氨酸突变位点在Gly^UGAtRNA存在时膜融合失败，这可能与Gly^UGAtRNA介导的插入效率低相关(图2B)。

2.3 Westernblot用于评价ACE-tRNAs对gB PTC位点的通读效率

为了进一步验证在不同PTC位点插入效率对gB蛋白表达的影响，在蛋白水平检测了ACE-tRNAs对不同gB基因突变体PTC的通读效率。gB基因及其突变体在有和无ACE-tRNAs的条件下共同转染HEK-293T细胞，实验结果表明，不存在ACE-tRNAs时，几乎没有gB蛋白表达。相反，存在ACE-tRNAs时，相比对照组gB蛋白有明显的表达(图3)。Arg^UGAtRNA存在的前提下，PRV-Arg-111-PTC、PRV-Arg-115-PTC、PRV-Arg-123-PTC、PRV-Arg-137-PTC、PRV-Arg-151-PTC和PRV-Arg-196-PTC都有较好的表达(图3A、B、C、D)，与膜融合结果一致。有趣的是，Gly^UGAtRNA虽然没有引起膜融合，但是在PRV-Gly-17-PTC、PRV-Gly-51-PTC、PRV-Gly-59-PTC、PRV-Gly-79-PTC、PRV-Gly-91-PTC和PRV-Gly-132-PTC位点却有较好的表达(图3E、G、F、H)。然而，在Gly^UGAtRNA存在时，只有一种形式的gB蛋白有表达(图3E)，这可能是导致膜融合失败的原因。综上所述，Arg^UGAtRNA在体外可以有效通读PTC位点实现病毒蛋白的表达。

2.4 PRV-PTC病毒的构建

基于以上的研究结果，我们尝试将上述表达以及膜融合功能较好的点回复到PRV基因组中将其突变为TGA终止密码子。使用PRV-BAC感染性克隆结合galK基因正负筛选系统进行突变。本发明成功获得了在gB基因151、196精氨酸位点突变的感染性克隆，分别命名为pPRV-Arg-151-PTC、pPRV-Arg-196-PTC。

2.5 PRV-PTC病毒感染性克隆的拯救

Arg^UGAtRNA存在的前提下，在HEK-293T细胞以及Vero细胞中转染PRV-PTC BAC感染性克隆用于拯救PRV-PTC病毒。2μg pPRV-Arg-151-PTC或pPRV-Arg-196-PTC分别与2μgArg^UGAtRNA共同转染生长于6孔板中的Vero细胞中，同时设立了PRV-PTC感染性克隆与tRNA空载体pUC57共同转染的阴性对照。转染后36h在倒置荧光显微镜下观察，Arg^UGAtRNA转染组有多处膜融合现象(图4A)，疑似病毒拯救成功，而转染tRNA空载体的阴性对照组绿色荧光呈点状分布。转染后48h，Arg^UGAtRNA转染组成堆的绿色荧光有所扩增，转染tRNA空载体的阴性对照组绿色荧光始终呈点状分布(图4B)，说明两个病毒均拯救成功。在HEK-293T细胞中得出相同的结论，转染后27h，Arg^UGAtRNA转染组与tRNA空载体的阴性对照组相比即出现显著差异，Arg^UGAtRNA转染组有大量膜融合现象，阴性对照组绿色荧光依旧呈点状分布(图4C)。转染后48h变化不想明显(图4D)。显然，PTC病毒的产生和复制仅在转染Arg^UGAtRNA的细胞中观察到。本研究证明，ACE-tRNAs可以控制PRV-PTC病毒复制，在不含ACE-tRNAs的常规细胞中不能复制。

2.6 PRV-PTC病毒的电镜观察

我们进一步观察了PRV-PTC病毒粒子的形态，Arg^UGAtRNA与PRV-PTC BAC感染性克隆共同转染HEK-293T细胞用于拯救PRV-PTC病毒，同时转染PRV-WT BAC感染性克隆作阳性对照，不含tRNA的pUC57质粒与PRV-PTC BAC感染性克隆共同转染组作对照，未转染组为Mock。转染后72h，对第一代拯救的PRV-PTC病毒进行电镜观察。结果如下，pPRV-Arg-151-PTC或pPRV-Arg-196-PTC BAC感染性克隆与PRV-WT BAC野生型感染性克隆拯救出的病毒粒子形态一致，在电镜下可以明显的观查到出细胞膜的病毒粒子呈球形、有囊膜，而在细胞核内的病毒粒子具有疱疹病毒典型的二十面体对称结构(图5)。而不含Arg^UGAtRNA的对照组以及不作处理的Mock组无病毒粒子存在。总的来说，与上述结果一致，ACE-tRNAs可以控制PRV-PTC病毒的复制，拯救出活的病毒，而在常规细胞中没有组装的PRV-PTC病毒粒子产生。进一步说明PRV-PTC病毒有成为活的复制缺陷病毒疫苗的潜力。

2.7 PRV-PTC病毒的传代以及稳定性检测

PTC病毒在复制过程中存在病毒回复突变为有义密码子的风险，为了进一步确认拯救出的PTC病毒是否有突变，对其进行传代并检验。由于HEK-293T细胞的转染效率较高，感染性克隆转染后出现病变的时间早，因此后续的实验在HEK-293T细胞中进行。将生长状态良好的HEK-293T细胞铺于六孔板中，每孔转染2μg Arg^UGAtRNA，同时设立Arg^UGAtRNA空载体pUC57的转染组为阴性对照。转染后24h，将冻融一次的PRV-Arg-151-PTC或PRV-Arg-196-PTC病毒分别接种于Arg^UGAtRNA转染孔与pUC57转染的阴性对照孔，每孔接种200μL。感染后48h，于倒置荧光显微镜下进行观察。将转染组设为F1代，结果显示，F2代病毒与F3代病毒均无回复突变，但是两种PTC病毒在细胞间的扩增能力随着传代不断下降(图6A)。对F3代病毒进行测序结果与观察结果一致，未发现病毒回复突变的现象(图6B)。

2.8 PRV-PTC病毒的生长特性

2μg pPRV-Arg-151-PTC或pPRV-Arg-196-PTC分别与2μg Arg^UGAtRNA共同转染生长于6孔板中的HEK-293T细胞中，同时设立2μg PRV-BAC与2μg pUC57转染组为阳性对照。分别于转染后24、36、48、60和72h在倒置荧光显微镜下观察病毒的复制情况(图7A)。结果显示，PRV-PTC病毒以及PRV-WT BAC感染性克隆转染后24h即可观察到拯救出的病毒，随着时间延长，病毒不断复制，PRV-PTC病毒的复制速度始终略低于亲本毒，PRV-Arg-151-PTC病毒的发光率高于PRV-Arg-196-PTC病毒。收取不同时间段的病毒，冻融一次后，对病毒10倍稀释进行TCID₅₀的测定(图7B)。结果显示：与倒置荧光显微镜观察的结果一致，PRV-PTC病毒与亲本毒随时间延长病毒滴度增高，PRV-BAC病毒滴度约10^5.0TCID₅₀/mL，PRV-Arg-151-PTC病毒约10^4.8TCID₅₀/mL，PRV-Arg-196-PTC病毒约10^4.3TCID₅₀/mL。

2.9小鼠体内评估PRV-PTC病毒作为复制缺陷病毒疫苗的潜力

2.9.1 PRV-PTC对小鼠安全性检测

我们使用PRV感染小鼠模型来评估PRV-PTC病毒作为疫苗的潜力。测试PRV-PTC病毒对小鼠是否仍具有致病性。对照组，每只皮下注射100μLDMEM。抵剂量组每只分别腿部肌肉接种10⁴TCID₅₀ WT-PRV、PRV-Arg-151-PTC、PRV-Arg-196-PTC。高剂量组每只腿部肌肉接种10⁵TCID₅₀ PRV-Arg-151-PTC、PRV-Arg-196-PTC。持续观察21d，WT-PRV感染组小鼠的死亡率如图8，感染后出现严重的神经症状。然而，PRV-Arg-151-PTC、PRV-Arg-196-PTC病毒无论高剂量还是低剂量接种与注射DMEM的对照组一样，小鼠的存活率为100％，未观察到任何临床症状(图8)。这些结果表明，PRV-PTC病毒对小鼠安全无致病性。

2.9.2 PRV-PTC病毒对野毒攻击后保护效率的检测

为了评价PRV-Arg-151-PTC、PRV-Arg-196-PTC的免疫保护能力，对照组，每只皮下注射100μLDMEM，在免疫21d后，各每组腿部肌肉注射3×10⁴TCID₅₀的WT-PRV(n＝6只)。观察小鼠的状态及死亡情况。研究结果表明到第5d为止，所有A组免疫DMEM的小鼠全部死亡，PRV-Arg-151-PTC以及PRV-Arg-196-PTC免疫组小鼠的存活率为100％(图9)。这表明PRV-PTC病毒对强毒攻击能够提供完全免疫保护作用。

Claims

1.一种复制缺陷型伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)，其特征在于，所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒是将经过反密码子编辑的tRNA ArgUGAtRNA与复制缺陷型伪狂犬病病毒BAC感染性克隆质粒共同转染细胞再通过病毒拯救后得到的，所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒BAC感染性克隆质粒是在包含PRV全基因组的BAC感染性克隆质粒的基础上，将其中的gB基因编码序列中的第151或196位精氨酸突变为终止密码子TGA后得到的。

2.如权利要求1所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒，其特征在于，所述的包含PRV全基因组的BAC感染性克隆质粒为pJS-2012BAC。

3.一种复制缺陷型伪狂犬病病毒疫苗，其特征在于，所述的疫苗中含有有效量的权利要求1或2所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒。

4.一种权利要求1或2所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）取出待转染的复制缺陷型伪狂犬病病毒BAC感染性克隆质粒、转染试剂以及稀释液使其恢复室温；所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒BAC感染性克隆质粒是在包含PRV全基因组的BAC感染性克隆质粒的基础上，将其中的gB基因编码序列中的第151或196位精氨酸突变为终止密码子TGA后得到的；

（2）在超净台内将2 μg的复制缺陷型伪狂犬病病毒BAC感染性克隆质粒与2 μg的ArgUGAtRNA置于200 μL jetPRIME buffer中进行稀释，轻轻吹打混匀；

（3）按质粒：转染试剂体积比1:2向步骤（2）得到的混合物中加入8 μL jetPRIME转染试剂，并立刻轻轻吹打混匀，室温孵育10 min；

（4）将步骤（3）得到的混合物逐滴均匀加入细胞培养上清中，轻轻晃动细胞培养板使之分布均匀，置37 ℃温箱中培养；

（5）转染后6 h换含有2 % FBS的新鲜培养液，重新放回 37 ℃细胞培养箱培养；

（6）转染48 h后，于倒置荧光显微镜下观察细胞的发光情况，得到所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒。