CN111154733A

CN111154733A - 一种伪狂犬病毒弱毒株及应用

Info

Publication number: CN111154733A
Application number: CN202010021958.4A
Authority: CN
Inventors: 李守军; 孙阳阳; 张学贤; 辛波; 车艳杰
Original assignee: Tianjin Ringpu Bio Technology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Ringpu Bio Technology Co Ltd
Priority date: 2020-01-09
Filing date: 2020-01-09
Publication date: 2020-05-15

Abstract

本发明提供了一种伪狂犬病毒弱毒株，同时提供了该弱毒株的重组病毒的构建方法，以及将该弱毒株应用于疫苗制备。本发明采用伪狂犬病病毒中国流行株，经基因工程技术，将伪狂犬病病毒的毒力基因缺失，获得了TK、gE、11K联合缺失的重组病毒，该基因缺失重组病毒的疫苗具有安全性高、免疫保护效果好等优势。

Description

一种伪狂犬病毒弱毒株及应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种伪狂犬病毒弱毒株及应用。

背景技术

伪狂犬病(pseudorabies,PR)，是伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PR)引起的猪、牛、羊等多种家畜和野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。该病毒可以感染不同年龄段的猪，主要引起妊娠母猪流产、产死胎和木乃伊胎，哺乳仔猪出现神经症状，衰竭死亡，死亡率高达100％，给养猪业带来巨大损失。

现有伪狂犬病毒的免疫主要以Bartha-K61株制备的疫苗为主，但随着毒株的变异，该疫苗对变异后毒株不能提供有效的保护，亟需开发针对变异株的伪狂犬病毒疫苗。此外，在现有疫苗产品中基因缺失疫苗在减少伪狂犬病感染的机会，减轻感染后的症状，减少散毒量等方面都有较大的优势，因此成为当前预防控制该病的主要手段。但基因缺失疫苗也存在诸多缺陷，如人工缺失某些基因，一方面虽然使其毒力减弱，另一方面也会降低免疫原性，同时还会存在毒力返强的安全隐患。

发明内容

本发明提供了一种伪狂犬病毒弱毒株疫苗，解决了现有伪狂犬病毒疫苗不能对伪狂犬病毒的变异株起到有效保护的问题。

本发明提供了一种基因缺失的伪狂犬病毒及其构建方法，解决了现有基因缺失的伪狂犬病毒免疫原性低，在多次传代后毒力返强的问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种伪狂犬病毒弱毒株，所述弱毒株是同时缺失了部分TK氨基酸序列、部分GE氨基酸序列、部分11K氨基酸序列以及gE基因第56位碱基至11K基因的103位碱基间的基因序列。

进一步的，所述弱毒株缺失部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示，所述基因序列如SEQ ID NO:4所示。

一种伪狂犬病毒弱毒株制备的伪狂犬病毒疫苗。

进一步的，该弱毒株的重组伪狂犬病毒的制备方法包括以下步骤：

(1)将pHA2质粒重组到猪伪狂犬病毒的TK基因内，获得rPRV；

(2)将rPRV基因组转化至大肠杆菌DH10B菌株，扩增获得pPRV；

(3)然后将pPRV转化至大肠杆菌GS1783中；

(4)通过Red/ET两步重组法在GS1783中缺失掉gE、11K基因；

(5)在步骤(4)获得的产物中提取质粒pPRV-dTK-dgE-d11K；

(6)将步骤(5)提取的质粒用脂质体转染法，转染至BHK-21细胞；

(7)提取感染性克隆质粒与转移载体共转染BHK-21细胞，通过同源重组将BAC质粒去掉，得到缺失TK、gE、11K中部分基因的重组伪狂犬病毒。

进一步的，构建该重组伪狂犬病毒弱毒株的载体包括：伪狂犬病毒TK基因和11K基因的部分序列。

进一步的，该载体还包括：CMV启动子控制下的EGFP基因。

进一步的，该疫苗的免疫方式包括滴鼻和注射。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

1、本发明提供的伪狂犬病弱毒株疫苗安全性高、免疫保护效果好，尤其对伪狂犬病变异株能起到有效的保护作用。

2、本发明提供的基因缺失的重组伪狂犬病毒及构建方法，致弱了伪狂犬病毒的毒力，同时使该病毒保持了良好的免疫原性。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1携带大肠杆菌F质粒的BAC载体pHA2通过同源重组插入PRV TK基因的示意图。

图2 pPRV-dgE-d11K缺失gE基因的第一次Red重组的PCR鉴定

图3 pPRV-dgE缺失gE、11K基因第二次Red重组的PCR鉴定

图4 pPRV-dgE-d11K的RFLP分析(BamHI酶切)鉴定图

图5 pPRV-dgE-d11K病毒拯救蚀斑

具体实施方式

在本发明的下述实施例中，使用的实验材料如下：

病毒和细胞：BHK-21细胞，PK-15细胞，伪狂犬病毒RP株(瑞普生物技术股份有限公司分离的伪狂犬毒株)。

质粒与菌株：pHA2质粒由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所的张存老师提供；PRV病毒RP株，由南京农业大学动物医学院吕英军老师提供，pMD18-T载体购自TaKaRa公司(大连)；大肠杆菌DH5α由本实验室保存；电转化感受态细胞ElectroMax DH10B T1购自Invitrogen公司。

其他试剂：MEM和DMEM，Invitrogen公司产品；AseI、SacI、XhoI、ScaI和T4DNA连接酶，NEB公司产品；invitrogen lipo2000转染试剂，promega公司产品；DNA片段小量快速回收试剂盒，Omega公司；2×GC BufferⅡ，dNTP Mix(2.5mmol/L each)，LA-Taq，DL-15000，DL-2000DNA Marker购自TakaRa；其它化学试剂均是进口或国产分析纯。

实施例1.缺失病毒rPRV-dTK-dgE-d11K的构建

通过使用Bac质粒构建PRV感染性质粒pPRV，将其转化入细菌GS1783中，利用两步Red重组缺失伪狂犬病毒的重要基因TK、gE等相关基因。最后通过病毒拯救，去除Bac质粒，得到重组缺失病毒，具体构建过程如下：

1.引物设计

根据已发表的PRV基因组序列(GenBank登录号NC_006151)，按照T K基因及其上、下游序列设计合成了2对引物PRV-UL22-s与PRV-UL22-as、PRV-UL24-s与PRV-UL24-as。引物序列见表1，斜体部分为酶切位点。引物由Invitrogen公司合成。

表1 PCR引物和测序引物

2.重组病毒转移载体的构建

将PRV接种于单层PK-15细胞，待细胞病变达到80％，收取感染的细胞。提取病毒DNA作为PCR模板，用设计的引物对PRV-UL22-s和PRV-UL22-as、PRV-UL24-s和PRV-UL24-as(见表1)分别扩增PRV株的UL22、UL24同源臂，产物大小分别为1733bp、1439bp，分别克隆到pMD18T载体，经酶切和测序鉴定所获得的阳性克隆分别命名为pMD-22和pMD-24，pMD-22和pMD-24经过PacI和EcoRI双酶切后电泳，分别切胶回收UL22 DNA片段和pMD-24质粒的载体片段，经过T4连接反应后转化DH5α，酶切分析鉴定阳性克隆并测序验证，获得的质粒命名为pMD22-24。pHA2和pMD22-24均以PacⅠ酶切后切胶回收，从pMD22-24酶切回收的518kb片段与从pHA2酶切回收的818kb片段连接，最终获得重组病毒转移载体pMD22-gfp-24-HA2。图1显示了携带大肠杆菌F质粒的BAC载体pHA2通过同源重组插入PRV TK基因的示意图。

3.PRV重组病毒的构建和噬斑纯化

从感染PRV的细胞提取病毒基因组DNA；转移质粒pMD22-gfp-24-HA2以HindⅢ酶切后纯化，溶解于灭菌水。线性化的pMD22-gfp-242-HA2和PRV DNA以磷酸钙法共转染PK-15细胞(按Promega公司提供的磷酸钙转染试剂盒说明书操作略作调整)。将3μg PRV病毒基因组DNA和10μg转移载体pMD-22-gfp-24-HA2加入10mmol/L Tris2Cl至总体积50μL，再加入388μL纯水，室温放置2h后，加入62.5μL 2mol/L CaC12，混合均匀，4℃过夜。次日在上述DNA-CaC1₂混合物中加入等体积的2×HBS(1.5mmol/LNa2HPO4，280mmol/L NaCl，50mmol/LHEPES，pH7.1)，混匀后室温作用15min。将这种混合物加入已长成单层的PK-15细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养3h；弃培养上清液，PBS洗1次，15％甘油2HBS高渗缓冲液作用2min，PBS洗1次，加入生长液，继续培养，观察细胞病变。转染后36h，可以在荧光显微镜下见到绿色荧光的噬斑(即为重组病毒噬斑)，挑取显示绿色荧光的单个噬斑，在PK-15细胞上进行噬斑纯化。经4轮纯化后，获得重组病毒命名为rPRV-HA2。

4.PRV株BAC的克隆

将重组病毒rPRV-HA2接种PK-15细胞，提取病毒基因组，继而电转化入DH10B电转化感受态细胞。转化的细胞电击后迅速补入800μL SOC培养基，37℃振摇培养1h后，涂布于含34μg/mL氯霉素(chloramphenicol，CAP)的LB平板，并在37℃温箱继续培养48h。挑取单菌落接种于含CAP的LB培养液中，37℃220r/min振荡培养20h。碱裂解法小量提取质粒DNA。提取的质粒DNA分别用限制性核酸内切酶B amHⅠ和KpnⅠ酶切以进行RLFP分析，获得的阳性克隆即为PRV的BAC分子克隆，命名为pPRV。

5.pPRV的gE、11K相关基因的缺失及鉴定

重组引物设计与合成，根据参考序列GenBank(NC_006151)进行设计，由生工公司合成，序列见上表。

引物PRV-dgE-F/R用于缺失PRV gE基因，上游引物下划线部分与pEPKanS质粒模板结合的序列；粗体序列与PRV gE CDS起始密码子上游同源，斜体序列与gE下游同源，下游引物粗体序列与PRV gE CDS下游同源，斜体序列和gE起始密码子上游同源，下划线部分为与pEP-KanS质粒模板结合的序列；

表2 Red重组引物列表

电转化感受态细胞的制备：将pPRV/GS1783菌种按2～4％的接种量接种于氯霉素(CAM)抗性的100mlLB培养基中，32℃220r/min培养至OD600为0.5-0.7，42℃水浴摇床摇15min以诱导Red重组酶表达，置冰浴20min后，4500g 4℃离心5min，弃上请加4℃预冷的10％甘油40～50ml重悬，12000g4℃离心1min，弃上请，再加用4℃预冷的10％甘油40～50ml洗一次，弃上请，留1～2ml左右上清重悬(即为电转化感受态细胞)，每管50ul分装于预冷的EP管中，置-70℃保存。

第一步Red重组(用卡那霉素抗性Kan基因替代pPRV-Bac的gE基因)：

以pEP-KanS质粒为模板，利用引物对PRV-dgE-d11K-F/R扩增，共35个循环。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：95℃变性45s，56℃返火45s，72℃延伸3min，最后一个循环后72℃再延伸10min。

扩增产物经纯化后，取100ng加入50ul pPRV/GS1783的感受态细胞中，混匀后，转入冰浴预冷的1mm电击杯，电击参数(1.8kv、25uF、200欧姆)。立即加入1ml SOC，32℃振荡培养1h后，涂布含34μg/mL Cam和50ug/mL Kan的LB平板上，32℃培养30h。提取质粒，经BamH 1酶切筛选正确的克隆，命名为pPRV-Kan-dgE-d11K。

以pPRV-dgE为模板，在gE、11K基因的两端设计PCR引物，缺失gE基因后，PCR产物大小应为2790bp。见图2中样品02、03、06、07，大小符合要求，表明均成功进行第一次Red重组。

第二步Red重组(删除pPRV-Kan-EF1质粒中的Kan基因)。挑取含pPRV-Kan-EF1的单菌落，培养过夜，取100u L接种于2mL Cam抗性的LB培养基中，32℃220r/min至OD值为0.4-0.6时加入终浓度为1％的L-阿拉伯糖，继续培养1h诱导限制性核酸内切酶I-SceI的表达，转入42℃水浴摇床培养30min进行Red重组，32℃培养1h。

将细菌悬液作10-3～10-5稀释后涂布于含有1％L-拉伯糖的Cam抗性平板，32℃培养30h。挑取单菌落时分别在Kan抗性的平板和Cam抗性的平板接种，用BamH 1酶切鉴定在Cam抗性平板上生长，而Kan抗性平板上不长的菌落，筛选正确的阳性克隆命名为pPRV-dgE。

通过Red E/T两步重组，将pPRV的gE、11K基因缺失，经PCR鉴定，以pPRV-dgE-d11K为模板，在gE基因的两端设计PCR引物，缺失gE基因后，PCR产物大小应为1749bp。图3中样品01、02、04、05、06、07大小符合，表明均成功缺失gE基因。成功缺失gE基因的pPRV-dgE-d11K样品，用BamHI进行酶切，结果如图4所示。

pPRV：未缺失gE基因的pPRV对照；一dgE：将gE基因替换为卡那霉素抗性基因的pPRV-Bac；二dgE：缺失gE、11K基因的pPRV-dgE；可以观察到“二dgE”样品01、02、04、05条带一致，且符合预期。

分别提取原始的pPRV、第一次Red重组pPRV-dgE-d11K(将gE基因替换为卡那霉素抗性基因的pPRV-Bac)、第二次Red重组pPRV-dgE-d11K(缺失gE、11K基因的pPRV-dgE-d11K)的BacDNA，经BamH 1酶切图谱显示pPRV-Bac比第二次Red重组pPRV-dgE-d11K多一条7000bp左右的条带，与预期的结果一致，表明gE基因缺失成功。第一次Red重组pPRV-dgE-d11K比原始的pPRV和第二次Red重组pPRV-dgE-d11K多出一条6000bp左右的条带；表明卡那霉素抗性基因先被插入pPRV，然后又被去除掉。按照预期得到了替换、缺失。同时RLFP分析结果显示，pPRV经两步Red重组和细菌转化后得到的Bac突变体，除了外源序列括入外，未出现BamH 1酶切位点的变化和酶切片段大小的改变(图4)

用引物对PRV-Bac-2F/2R分别以第一次Red重组pPRV-dgE-d11K、第一次Red重组pPRV-dgE-d11K为模板进行PCR扩增，分别获得了2790bp、1749bp的片段(图2，图3)，测序结果(SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.6)表明目的片段已括入PRV基因组正确位置。结合酶切图谱和PCR产物大小及测序结果说明四种Bac突变体构建成功。

6.病毒的拯救及pPRV-dgE-d11K的BAC质粒删除

用碱裂解法分别提取感染性克隆质粒用invitrogen的lipo2000转染BHK-21细胞，48h后出现蚀斑，用荧光显微镜观察到蚀斑带有荧光(见图5)。表明病毒拯救成功。将此病毒命名为rPRV-dgE-d11K，图5中左图为白光下的病变情况，右图为蓝色激发光下的蚀斑。

rPRV-dgE-d11K病毒成功拯救之后，要将其中的Bac质粒去掉。合成转移载体DNA片段，其中SEQ IDNO.7的1-1750位碱基和1750-3888分别为TK基因上下游的同源臂，经同源重组之后，合成转移载体DNA片段会将原来插入TK基因的Bac质粒替换下来，并且造成TK基因第387-693位碱基的核苷酸序列缺失。

提取rPRV-dgE-d11K病毒的基因组，同时将病毒基因组和合成的转移载体DNA片段共转染入BHK-21细胞，通过在有荧光的蚀斑中挑取无荧光的蚀斑，即得到去掉Bac质粒的rPRV-dgE-d11K病毒，命名为rPRV-dTK-dgE-d11K。

经过挑取无荧光的蚀斑，并进行连续6代蚀斑纯化，得到缺失TK、gE、11K基因的重组伪狂犬病毒，即rPRV-dTK-dgE-d11K。

7.rPRV-dTK-dgE-d11K的滴度测定

将rPRV-dTK-dgE-d11K接种PK-15细胞，待80％细胞出现CPE时，收获病毒。用96孔组织培养板方法测定rPRV-dTK-dgE-d11K的滴度。将rPRV-dTK-dgE-d11K用含2％FBS的DMEM作10倍系列稀释后，将稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的PK-15单层细胞。每稀释度接种8孔，设8孔对照(以含2％FBS的DMEM接种)，置37℃5％的二氧化碳培养箱中培养，每天观察至接种后第4天，记录出现CPE的孔数，根据Reed-Muench法计算TCID₅₀。结果显示，rPRV-dTK-dgE-d11K毒在PK-15细胞上的滴度为10^6.5TCID₅₀/ml。

实施例2.缺失病毒rPRV-dgE-d11K的构建

按照实施例1的步骤1-5相同，在病毒拯救后，去掉Bac质粒的操作过程有所区别，为了去掉Bac质粒后保留完整的TK基因，合成的用于同源重组的转移载体片段应该含有TK基因的完整基因片段，具体过程如下：

1病毒的拯救及pPRV-dgE-d11K的BAC质粒删除

rPRV-dgE-d11K病毒成功拯救之后，要将其中的Bac质粒去掉。合成转移载体DNA片段(SEQ IDNO.7)，其中SEQ IDNO.8的1363-2325位碱基为完整的TK基因序列，1-1362位碱基和2326-4194位碱基分别为TK基因上下游的同源臂，经同源重组之后，合成转移载体DNA片段会将原来插入TK基因的Bac质粒替换下来，完整的TK基因替换到rPRV-dgE病毒基因组中。

提取rPRV-dgE-d11K病毒的基因组，同时将病毒基因组和合成的转移载体DNA片段共转染入BHK-21细胞，通过在有荧光的蚀斑中挑取无荧光的蚀斑，即得到去掉Bac质粒的rPRV-dgE病毒，命名为rPRV-dgE-d11K。

经过挑取无荧光的蚀斑，并进行连续6代蚀斑纯化，得到缺失TK、gE基因的重组伪狂犬病毒，即rPRV-dgE-d11K。

2.rPRV-dgE-d11K的滴度测定

将rPRV-dgE-d11K接种PK-15细胞，待80％细胞出现CPE时，收获病毒。用96孔组织培养板方法测定rPRV-dgE-d11K的滴度。将rPRV-dgE-d11K用含2％FBS的DMEM作10倍系列稀释后，将稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的PK-15单层细胞。每稀释度接种8孔，设8孔对照(以含2％FBS的DMEM接种)，置37℃5％的二氧化碳培养箱中培养，每天观察至接种后第4天，记录出现CPE的孔数，根据Reed-Muench法计算TCID₅₀，结果显示，rPRV-dgE毒在PK-15细胞上的滴度为10^7.2TCID₅₀/ml。

实施例3.伪狂犬病毒活疫苗的制备及检验

1.疫苗制备

将rPRV-dgE-dTK-d11K接种于PK-15单层细胞，收获病毒培养物，加入稳定剂，然后冷冻真空干燥制成疫苗。

按照实施例1-2的方法，制备rPRV-dgE、rPRV-dTK、rPRV-dgE-dTK、rPRV-dgE-dTK-d11K重组缺失病毒，并分别接种于PK-15单层细胞，收获病毒培养物，加入稳定剂，然后冷冻真空干燥制成疫苗。

2.试验仔猪

实验仔猪由瑞普生物技术股份有限公司提供，为11日龄健康仔猪，伪狂犬病毒gB和gE抗体均为阴性，且伪狂犬病毒(PRV)，蓝耳病病毒(PRRSV)，猪瘟病毒(CSFV)以及猪圆环病毒2型(PCV2)的病原检测均为阴性。

3.无菌检验和外源病毒

按照《中国兽药典》规定的方法对四种疫苗进行无菌检验和外源病毒检验，均符合规定。

4.安全性检验

将rPRV-dgE、rPRV-dTK、rPRV-dgE-dTK、rPRV-dgE-dTK-d11K四种基因缺失病毒的F2代接种11日龄仔猪，每种病毒接种6只仔猪(3只滴鼻3只肌肉注射)，观察14日，rPRV-dgE、rPRV-dTK会引起仔猪的体温升高，且引起1-2头猪死亡，表明上述基因缺失病毒的仍有毒力。rPRV-dgE-dTK注射后有短暂的体温升高现象，rPRV-dgE-dTK-d11K注射后无体温升高现象，也不导致仔猪死亡。

将rPRV-dgE-dTK和rPRV-dgE-dTK-d11K两种病毒连续传代至80代后，按照上述方法再进行接种，发现rPRV-dgE-dTK-d11K仍旧未引起仔猪体温升高，无发病死亡，但rPRV-dgE-dTK病毒仍有引起仔猪体温升高现象，说明rPRV-dgE-dTK-d11K未出现毒力返强的现象。

实施例4.攻毒保护试验

选取32头11日龄试验仔猪，将其随机分成7组。A组-E组，每组5只，按照表3.分别接种相应疫苗，各颈部注射1头份，对照组不接种疫苗，在相同条件下饲养21日后，用PRV-RP强毒，滴鼻和注射2毫升(含2×10⁵个TCID₅₀)，观察14日，结果，对照组全部发病，D组全部保护，A-C组分别为3/5保护、3/5保护、4/5保护、E组3/5保护。

表3.攻毒试验结果

组别	数量	接种疫苗	保护效果
				A组	5只	rPRV-dgE	3/5
B组	5只	rPRV-dTK	3/5
				C组	5只	rPRV-dgE-dTK	4/5
D组	5只	rPRV-dgE-dTK-d11K	5/5
				E组	5只	Bartha-k61株	3/5
对照组	2只	DMEM	0/2

按照上述实验方法，选择滴鼻免疫的方式，得到的结果与肌肉注射免疫的保护效果一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 天津瑞普生物技术股份有限公司

<120> 一种伪狂犬病毒弱毒株及应用

<141> 2019-12-30

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 102

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Ala Ala Ala Phe Val Gly Leu Ala Ala Thr Leu Pro Gly Glu Pro Pro

1 5 10 15

Gly Gly Asn Leu Val Val Ala Ser Leu Asp Pro Asp Glu His Leu Arg

20 25 30

Arg Leu Arg Ala Arg Ala Arg Ala Gly Glu His Val Asp Ala Arg Leu

35 40 45

Leu Thr Ala Leu Arg Asn Val Tyr Ala Met Leu Val Asn Thr Ser Arg

50 55 60

Tyr Leu Ser Ser Gly Arg Arg Trp Arg Asp Asp Trp Gly Arg Ala Pro

65 70 75 80

Arg Phe Asp Gln Thr Val Arg Asp Cys Leu Ala Leu Asn Glu Leu Cys

85 90 95

Arg Pro Arg Asp Asp Pro

100

<210> 2

<211> 579

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Arg Pro Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gln Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Leu Ala Leu Ser Thr Glu Ala Pro Ser Leu Ser Ala Glu Thr Thr Pro

20 25 30

Gly Pro Val Thr Glu Val Pro Ser Pro Ser Ala Glu Val Trp Asp Asp

35 40 45

Leu Ser Thr Glu Ala Asp Asp Asp Asp Leu Asn Gly Asp Leu Asp Gly

50 55 60

Asp Asp Arg Arg Ala Gly Phe Gly Ser Ala Leu Ala Ser Leu Arg Glu

65 70 75 80

Ala Pro Pro Ala His Leu Val Asn Val Ser Glu Gly Ala Asn Phe Thr

85 90 95

Leu Asp Ala Arg Gly Asp Gly Ala Val Leu Ala Gly Ile Trp Thr Phe

100 105 110

Leu Pro Val Arg Gly Cys Asp Ala Val Ser Val Thr Thr Val Cys Phe

115 120 125

Glu Thr Ala Cys His Pro Asp Leu Val Leu Gly Arg Ala Cys Val Pro

130 135 140

Glu Ala Pro Glu Met Gly Ile Gly Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Val Pro

145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Glu Pro Pro Ile Val Thr Pro Glu Arg Trp Ser Pro

165 170 175

His Leu Ser Val Leu Arg Ala Thr Pro Asn Asp Thr Gly Leu Tyr Thr

180 185 190

Leu His Asp Ala Ser Gly Pro Arg Ala Val Phe Phe Val Ala Val Gly

195 200 205

Asp Arg Pro Pro Ala Pro Ala Asp Pro Val Gly Pro Ala Arg His Glu

210 215 220

Pro Arg Phe His Ala Leu Gly Phe His Ser Gln Leu Phe Ser Pro Gly

225 230 235 240

Asp Thr Phe Asp Leu Met Pro Arg Val Val Ser Asp Met Gly Asp Ser

245 250 255

Arg Glu Asn Phe Thr Ala Thr Leu Asp Trp Tyr Tyr Ala Arg Ala Pro

260 265 270

Pro Arg Cys Leu Leu Tyr Tyr Val Tyr Glu Pro Cys Ile Tyr His Pro

275 280 285

Arg Ala Pro Glu Cys Leu Arg Pro Val Asp Pro Ala Cys Ser Phe Thr

290 295 300

Ser Pro Ala Arg Ala Arg Leu Val Ala Arg Arg Ala Tyr Ala Ser Cys

305 310 315 320

Ser Pro Leu Leu Gly Asp Arg Trp Leu Thr Ala Cys Pro Phe Asp Ala

325 330 335

Phe Gly Glu Glu Val His Thr Asn Ala Thr Ala Asp Glu Ser Gly Leu

340 345 350

Tyr Val Leu Val Met Thr His Asn Gly His Val Ala Thr Trp Asp Tyr

355 360 365

Thr Leu Val Ala Thr Ala Ala Glu Tyr Val Thr Val Ile Lys Glu Leu

370 375 380

Thr Ala Pro Ala Arg Ala Pro Gly Thr Pro Trp Gly Pro Gly Gly Gly

385 390 395 400

Asp Asp Ala Ile Tyr Val Asp Gly Val Thr Thr Pro Ala Pro Pro Ala

405 410 415

Arg Pro Trp Asn Pro Tyr Gly Arg Thr Thr Pro Gly Arg Leu Phe Val

420 425 430

Leu Ala Leu Gly Ser Phe Val Met Thr Cys Val Val Gly Gly Ala Ile

435 440 445

Trp Leu Cys Val Leu Cys Ser Arg Arg Arg Ala Ala Ser Arg Pro Phe

450 455 460

Arg Val Pro Thr Arg Ala Arg Thr His Met Leu Ser Pro Val Tyr Thr

465 470 475 480

Ser Leu Pro Thr His Glu Asp Tyr Tyr Asp Gly Asp Asp Asp Asp Asp

485 490 495

Glu Glu Ala Gly Val Ile Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Ser Gly Asp

500 505 510

Ser Gly Tyr Glu Gly Pro Tyr Ala Ser Leu Asp Pro Glu Asp Glu Phe

515 520 525

Ser Ser Asp Glu Asp Asp Gly Leu Tyr Val Arg Pro Glu Glu Ala Pro

530 535 540

Arg Ser Gly Phe Asp Val Trp Phe Arg Asp Pro Glu Lys Pro Glu Val

545 550 555 560

Thr Asn Gly Pro Asn Tyr Gly Val Thr Ala Asn Arg Leu Leu Met Ser

565 570 575

Arg Pro Ala

<210> 3

<211> 35

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Asp Thr Phe Asp Pro Ser Ala Pro Val Pro Thr Ser Val Ser Asn

1 5 10 15

Pro Ala Ala Asp Val Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Arg Ser Pro Leu

20 25 30

Arg Pro Gln

35

<210> 4

<211> 1956

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gcgccgtttt aaacctgggc acccccgcga gtctcgcaca caccggggtt gagaccatgc 60

ggccctttct gctgcgcgcc gcgcagctcc tggcgctgct ggccctggcg ctctccaccg 120

aggccccgag cctctccgcc gagacgaccc cgggccccgt caccgaggtc ccgagtccct 180

cggccgaggt ctgggacgac ctctccaccg aggccgacga cgatgacctc aacggcgacc 240

tcgacggcga cgaccgccgc gcgggcttcg gctcggccct cgcatccctg agggaggcgc 300

ccccggccca tctggtgaac gtgtccgagg gcgccaactt caccctcgac gcgcgcggcg 360

acggcgccgt gctggccggg atctggacgt tcctgcccgt ccgcggctgc gacgccgtgt 420

cggtgaccac ggtgtgcttc gagaccgcgt gccacccgga cctggtgctg ggccgcgcct 480

gcgtccccga ggccccggag atgggcatcg gcgactacct gccgcccgag gtgccgcggc 540

tccggcgcga gccgcccatc gtcaccccgg agcggtggtc gccgcacctg agcgtcctgc 600

gggccacgcc caacgacacg ggcctctaca cgctgcacga cgcctcgggg ccgcgggccg 660

tgttctttgt ggcggtgggc gaccggccgc ccgcgccggc ggacccggtg ggccccgcgc 720

gccacgagcc ccgcttccac gcgctcggct tccactcgca gctcttctcg cccggggaca 780

cgttcgacct gatgccgcgc gtggtctcgg acatgggcga ctcgcgcgag aactttaccg 840

ccacgctgga ctggtactac gcgcgcgcgc ccccgcggtg cctgctgtac tacgtgtacg 900

agccctgcat ctaccacccg cgcgcgcccg agtgcctgcg cccggtggac ccggcgtgca 960

gcttcacctc gccggcgcgc gcgcggctgg tggcgcgccg cgcgtacgcc tcgtgcagcc 1020

cgctgctcgg ggaccggtgg ctgaccgcct gccccttcga cgccttcggc gaggaggtgc 1080

acacgaacgc caccgcggac gagtcggggc tgtacgtgct cgtgatgacc cacaacggcc 1140

acgtcgccac ctgggactac acgctcgtcg ccaccgcggc cgagtacgtc acggtcatca 1200

aggagctgac ggccccggcc cgggccccgg gcaccccgtg gggccccggc ggcggcgacg 1260

acgcgatcta cgtggacggc gtcacgacgc cggcgccgcc cgcgcgcccg tggaacccgt 1320

acggccggac gacgcccggg cggctgtttg tgctggcgct gggctccttc gtgatgacgt 1380

gcgtcgtcgg gggggccatc tggctctgcg tgctgtgctc ccggcgccgg gcggcctcgc 1440

ggccgttccg ggtgccgacg cgggcgcgga cgcacatgct ctctccggtg tacaccagcc 1500

tgcccacgca cgaggactac tacgacggcg acgacgacga cgacgaggag gcgggcgtca 1560

tccgccggcg gcccgcctcc cccagcggag acagcggcta cgaggggccg tacgcgagcc 1620

tggaccccga ggacgagttc agcagcgacg aggacgacgg gctgtacgtg cgccccgagg 1680

aggcgccccg ctccggcttc gacgtctggt tccgcgatcc ggagaaaccg gaagtgacga 1740

atggacccaa ctatggcgtg accgccaacc gcctgttgat gtcccgcccc gcttaaatac 1800

cgggagaacc ggtccgcccg cattccgaca tgcccggcgc cgcctccgtc gacatggaca 1860

cgtttgaccc cagcgccccc gtcccgacga gcgtctcgaa cccggccgcc gacgtcctgc 1920

tggcccccaa gggaccccgc tccccgctgc gccccc 1956

Claims

1.一种伪狂犬病毒弱毒株，其特征在于，所述弱毒株是同时缺失了部分TK氨基酸序列、部分GE氨基酸序列、部分11K氨基酸序列以及gE基因第56位碱基至11K基因的103位碱基间的基因序列。

2.根据权利要求1所述的伪狂犬病毒弱毒株，其特征在于，所述弱毒株缺失部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示，所述基因序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一种如权利要求1所述的伪狂犬病毒弱毒株制备的伪狂犬病毒疫苗。

4.根据权利要求1所述的伪狂犬病毒弱毒株，其特征在于，该弱毒株的重组伪狂犬病毒的制备方法包括以下步骤：

(1)将pHA2质粒重组到猪伪狂犬病毒的TK基因内，获得rPRV；

(2)将rPRV基因组转化至大肠杆菌DH10B菌株，扩增获得pPRV；

(3)然后将pPRV转化至大肠杆菌GS1783中；

(4)通过Red/ET两步重组法在GS1783中缺失掉gE、11K基因；

(5)在步骤(4)获得的产物中提取质粒pPRV-dTK-dgE-d11K；

(6)将步骤(5)提取的质粒用脂质体转染法，转染至BHK-21细胞；

5.根据权利要求1所述的重组伪狂犬病毒弱毒株，其特征在于构建该重组伪狂犬病毒弱毒株的载体包括：伪狂犬病毒TK基因和11K基因的部分序列。

6.根据权利要求5所述的构建该重组伪狂犬病毒弱毒株的载体，其特征在于该载体还包括：CMV启动子控制下的EGFP基因。

7.根据权利要求2所述的伪狂犬病毒疫苗，其特征在于，该疫苗的免疫方式包括滴鼻和注射。