CN105343877B - 一种5基因缺失伪狂犬病重组病毒活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种5基因缺失伪狂犬病重组病毒活疫苗及其制备方法。该疫苗是以自行分离的一株伪狂犬病病毒(SX株)为母本，通过分子生物学、细胞生物学等手段，缺失gE基因、gI基因、US9基因、UL49.5部分基因和TK基因，获得的1株伪狂犬病病毒5基因缺失病毒株(rPRV/gE‑/gI‑/US9‑/△UL49.5/TK‑)作为生产种毒，接种CEF细胞单层后经培养收获病毒液，加入冻干保护剂进行冷冻真空干燥而成，该疫苗可用于预防伪狂犬病。
Description
技术领域
本发明涉及一种5基因缺失伪狂犬病重组病毒活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies，PR；又名Aujeszky’s disease，AD)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病，可感染多种家畜、伴侣动物及野生动物。猪是感染后可以存活的唯一物种，也是贮存宿主。感染猪主要表现为神经症状、流涎、呼吸困难、母猪繁殖障碍、仔猪高死亡率等，给养猪业造成巨大的经济损失。
PRV是疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘病毒属的成员，与其同属的还有I型牛疱疹病毒(BHV-1)、马疱疹病毒(EHV)以及水痘带状疱疹病毒(VSV)。PRV基因组为线性双股DNA，约145Kb，由长独特区(UL)和短独特区(US)及US两侧的末端倒转重复(TR)与内部重复(IR)组成，可编码70-100种蛋白质，成熟的病毒粒子约有50种蛋白。在上述基因产物中，UL区段中的gC、TK及US区段中的PK、gG、gI、gE、11K和28K为病毒增殖的非必需成份，一般认为，TK、gC、gE、PK和CP(衣壳蛋白)等与PRV毒力相关。另外，疱疹病毒基因组中，UL49.5编码的囊膜蛋白gN能抑制TAP介导的多肽转运到内质网，在病毒感染的细胞内阻断MHCI类复合体的装配，从而下调MHC I类分子在细胞表面的表达，使得病毒有可能逃避宿主CD8+T细胞的识别，并在宿主鼻腔及上呼吸道上皮细胞中复制，引起化脓性反应或组织溃烂，进而导致细菌二次感染及严重的肺炎。最新研究表明(Shafiqul I et al,2014；Huiyoug W，et al，2012)，BHV-1病毒UL49.5胞质尾缺失和胞外域30～40aa部分缺失能增强病毒侵染宿主的能力，诱导更强的体液免疫和细胞免疫反应，在疫苗研制方面更具优势。目前尚未见伪狂犬病毒在这方面有相关的研究报道。
疫苗免疫接种是防制伪狂犬病的主要策略。伪狂犬疫苗主要分为三种：一是常规疫苗，即灭活疫苗和弱毒活疫苗，如目前应用较多的Bartha-K61株活疫苗；二是基因缺失疫苗，即通过分子生物学方法，人工缺失某些基因，使其毒力减弱的同时又保留其免疫原性。目前构建的伪狂犬病毒基因工程疫苗大多为TK、gI、gE、gG基因的单基因缺失或多基因缺失突变株。PRV作为基因工程载体具备相当的优势：(1)PRV不感染人，具有很好的安全性。现有的活疫苗株Bartha-K61或‘783’等在世界上已应用了几十年，未发生重大的安全事故。(2)基因组容量大：在PRV长达145Kb的基因组中，约一半基因被认为是非必需的，如gI、gE、gM、TK、PK、gC和dUTPase等，在这些区域可先后或同时插入和表达多种外源基因而不显著影响其繁殖及免疫原性。(3)生产原材料来源方便，生产成本低：PRV疫苗可以接种SPF鸡胚成纤维细胞及PK15、ST等传代细胞生产，原材料充足，生产工艺成熟，且PRV病毒滴度很容易达到免疫要求，大大降低了生产成本。(4)免疫期长：PRV以细胞免疫为主，病毒可以较长时间感染，外源基因可以在体内持续表达。(5)宿主范围广，多种家畜、经济动物(如狐和貂)、伴侣动物及野生动物均可感染PRV，可研制针对不同动物的活载体疫苗。
发明内容
本发明提供一种缺失gE、gI、US9、UL49.5、TK等5基因的伪狂犬病毒，用于制备伪狂犬病活疫苗，预防伪狂犬病。
本发明的技术方案
1.一种伪狂犬病重组病毒活疫苗，其特征在于该活疫苗主要含有伪狂犬病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株病毒，该毒株已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.11500。
2.如权利要求1所述的一种伪狂犬病重组病毒活疫苗，其特征在于该活疫苗含有的伪狂犬病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株病毒是同时缺失了gE基因、gI基因、US9基因、TK基因和部分UL49.5基因的重组伪狂犬病毒株。
3一种5基因缺失伪狂犬病重组病毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述的重组伪狂犬病毒活疫苗是，将伪狂犬病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株接种长满单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)，培养后，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
4.一种5基因缺失伪狂犬病重组病毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述的培养伪狂犬病毒5基因缺失株病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株传代细胞是ST细胞/或PK15细胞/或适合该病毒生长的传代细胞,培养后，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
具体实施方式
一、生产用病毒株的构建
1.载体
pMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程(大连)有限公司。含有GFP基因的载体pU-EGFP和含有RFP基因的载体pU-ERFP，均由本实验室保存。
2.引物设计
根据GenBank上发表的PRV序列设计合成以下引物：
(1)扩增gI基因左同源臂的引物：
US6F：5’-GACTTAAGGATCTCCGACCCGCAGGTGG-3’(序列1)
US6R：5’-GACTTAAGGGAGCCGGGTCACGTCGCGCG-3’(序列2)
(2)扩增US9基因右同源臂的引物：
US2F：5’-GACTAGTATGGGGGTGACGGCCATCAC-3’(序列3)
US2R：5’-GACTAGTCGGAGAGATCCTGCCGTCTAGG-3’(序列4)
(3)扩增GFP基因的引物：
EGFP-F：5’-GGTATACGGATCCAAGGAGATATAACA-3’(序列5)
EGFP-R：5’-GACTAGTGAGCTCTTAAAGCTCATCAT-3’(序列6)
(4)扩增US9基因的引物：
PUS9-F：5’-AGAAACCGGAAGTGACGAATGG-3’(序列7)
PUS9-R：5’-AGGAGCACCTGGTCGCAGAG-3’(序列8)
(5)扩增UL49.5基因的引物(扩增含37-40aa基因片段)：
PUL50F：5’-GCCTGCAAGATGTAGCCGGAGA-3’(序列9)
PUL50R：5’-TGGCGAGCGAGTGGGGTC-3’(序列10)
(6)扩增缺失△37-40aa基因的UL49.5部分基因的引物(引入AflII酶切位点，用于UL49.5基因的连接)：
rPUL50F2：5’-TAAGCTTGCCTGCAAGATGTAGCCGGAGA-3’(序列11)
rPUL50R2：5’-ACTTAAGTTAGGCGTAACCCAGGGCgAC-3’(序列12)
(7)扩增UL49.5基因的引物(扩增缺失了CT的UL49.5部分基因片段)：
rPUL49F：5’-TACTAGTAGATCGATCCGCACGCGC-3’(序列13)
rPUL49R：5’-AGAATTCGCAGCGTGGACACGAAG-3’(序列14)
rPUL49F2：5’-ACTTAAGATCGATCCGCACGCGC-3’(引入AflII酶切位点，用于UL49.5基因的连接)(序列15)
(8)扩增UL49.5基因左同源臂的引物：
UL50F：5’-TAAGCTTGCCTGCAAGATGTAGCCG-3’(序列16)
UL50R:5’-ACTTAAGTTAGGCGTAACCCAG-3’(序列17)
(9)扩增UL49.5基因右同源臂的引物：
UL48F:5’-TACTAGTAGATCGATCCGCACGCGCCCG-3’(序列18)
UL48R:5’-AGAATTCGCAGCGTGGACACGAA-3’(序列19)
(10)扩增TK基因左同源臂的引物：
UL24F：5’-GGTATACCCGTGGTCGTCACGCCCATGAA-3’(序列20)
UL24R：5’-GGTATACATGCGCATCCCGGCGCGCTTC-3’(序列21)
(11)扩增TK基因右同源臂的引物：
UL22F：5’-GACTAGTATGCCCGCGTCGTCCGTGCGC-3’(序列22)
UL22R：5’-GACTAGTGCGGTACGCCTCGGCGACGGT-3’(序列23)
(12)扩增RFP基因的引物：
RFP-F：5’-GGTATACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’(序列24)
RFP-R：5’-GACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’(序列25)
3.含GFP标记的伪狂犬缺失病毒(rPRV/gE-/gI-/US9-/GFP+)的构建
(1)转移载体pMD-US6-GFP-US2的构建
以本发明人由我国山西省太原市自行分离到的PRV(SX株)基因组为模板，采用引物US6F/R和US2F/R分别扩增gE、gI、US9缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；以pU-EGFP为模板，用引物EGFP-F/EGFP-R扩增GFP基因。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒。以SbfI/AflII双酶切左臂，以SpeI/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段后依次与pMD-GFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体pMD-US6-GFP-US2。
(2)同源重组
将转移载体pMD-US6-GFP-US2与PRV(SX株)亲本株共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒(Invitrogen公司)说明书(见附件1)进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于1ml DMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为rPRV/gE-/gI-/US9-/GFP+。
(4)重组病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/GFP+的鉴定
采用gE、gI、US9和GFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI和US9片段，扩增出GFP片段。经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI和US9三段基因，并成功插入了GFP标记基因。
4.伪狂犬病毒双荧光标记缺失病毒(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/GFP+/RFP+)的构建
(1)转移载体的构建
通过基因克隆技术以PRV(SX株)UL49.5基因为模板，构建两个克隆载体pMD18T-△37-40和pMD18T-CT-null，分别缺失UL49.5中胞外域37-40氨基酸基因序列和胞质尾区(CT)80-96氨基酸，并将缺失了这两部分的基因片段通过引入酶切位点AflII进行连接，构建含有CT基因两端部分基因序列的同源臂的转移载体pMD-UL50-UL49.5-△37～40-CT-RFP-PU49。
(2)同源重组
将rPRV/gE-/gI-/US9-/GFP+病毒和上述转移载体共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色和红色双色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功，获得缺失gE、gI、US9、部分UL49.5基因(37-40氨基酸基因序列和CT基因序列)的缺失病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/GFP+/RFP+。
再通过同源重组将RFP缺失，最终筛选出rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/GFP+缺失病毒。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于1ml DMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/GFP+。
(4)重组病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/GFP+的鉴定
采用gE、gI、US9、UL49.5和GFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI和US9片段，扩增出缺失了相应大小片段的UL49.5，扩增出GFP片段。并经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI、US9、UL49.5的37-40氨基酸对应的核苷酸和CT基因，并含有GFP标记基因。
5.伪狂犬病毒双荧光标记缺失病毒(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+/RFP+)的构建
(1)转移载体的构建
以PRV(SX株)基因组为模板，采用引物UL24F/R和UL22F/R分别扩增TK缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；以pU-RFP为模板，用引物RFP-F/RFP-R扩增RFP基因。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒。以SbfI/BstZ17I双酶切左臂，以SpeI/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段后依次与pMD-RFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体pMD-UL24-RFP-UL22。
(2)同源重组
将转移载体pMD-UL24-RFP-UL22与rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/GFP+共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色和红色双色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察荧光，挑选同时表达了绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的单个荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化4次，将获得的重组病毒命名为伪狂犬病毒双荧光标记缺失rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+/RFP+株，该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.11500。
(4)重组病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+/RFP+的鉴定
采用gE、gI、US9、GFP、UL49.5、TK和RFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI、US9、TK基因片段，扩增出GFP、RFP基因片段，扩增出缺失了相应大小片段的UL49.5基因。经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI、US9、TK基因，成功缺失了UL49.5的37-40氨基酸对应碱基和CT基因，并成功插入了GFP、RFP标记基因。
6.伪狂犬病毒荧光标记缺失病毒(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+)的构建
(1)转移载体的构建
以PRV(SX株)基因组为模板，采用引物UL24F/R和UL22F/R分别扩增TK缺失的同源重组左同源臂和右同源臂，扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，获得转移载体pMD-UL24-UL22。
(2)同源重组
将转移载体pMD-UL24-UL22与rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+/RFP+共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察荧光，挑选只表达了绿色荧光蛋白、无红色荧光蛋白的单个荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化4次，将获得的重组病毒命名为rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+株。
7.伪狂犬病毒病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株的构建
(1)转移载体的构建
以PRV(SX株)基因组为模板，采用引物US6F/R和US2F/R分别扩增gE、gI、US9缺失的同源重组左同源臂和右同源臂，扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒，获得转移载体pMD-US6-US2。
(2)同源重组
将转移载体pMD-US6-US2与rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察，挑选不表达绿色荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株。该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.11500。
8.重组病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株生物学特性
(1)病毒含量测定对重组病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-病毒株进行病毒含量测定。结果发现重组病毒含量可达107.2TCID50/ml。
(2)对小鼠安全性试验将rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-病毒株及亲本株SX株分别以106.0TCID50病毒量接种Balb/c小鼠，每组6只，观察14天，结果rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-接种的小鼠在14天均表现正常，而接种SX株PRV的小鼠全部死亡。
(3)对仔猪的安全性将rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-病毒株以107.0TCID50病毒量接种7日龄易感仔猪5头，观察14天，均健活
(4)免疫原性将rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-病毒株以105.0TCID50病毒量接种21日龄仔猪5头，免疫21天用强毒株(SX-12株)攻毒，107.0TCID50/头，攻毒后观察14日，免疫组5头均保护，对照组5头均发病，且死亡2头。
二、伪狂犬病毒重组活疫苗(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株)的制备与检验
1.疫苗制备
本发明所提供的制备疫苗的方法，是将伪狂犬病毒5基因缺失株病毒(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株)接种长满单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)、ST细胞和PK15细胞等传代细胞，培养后，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
2.疫苗成品检验
(1)性状淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
(2)无菌检验按《中国兽药典》规定方法进行检验，应无菌生长。
(3)支原体检验按《中国兽药典》规定方法进行检验，应无支原体生长。
(4)外源病毒检验按《中国兽药典》规定方法进行检验，应无外源病毒污染。
(5)鉴别检验将疫苗用灭菌生理盐水稀释至100TCID50/0.1ml，与等量抗伪狂犬病毒特异性血清混合，置室温作用60分钟后，接种5个已长成CEF单层的细胞孔(48孔细胞板)，每孔0.2ml，同时设病毒对照组，置37～38℃条件下，培养观察120小时。病毒对照组全部出现病变，中和组未出现细胞病变。
(6)安全检验用5～7日龄易感仔猪5只，按瓶签注明头份，每只肌肉接种疫苗10头份，观察14日，均健活，无全身和局部反应。
(7)效力检验下列方法任择其一。
病毒含量测定按瓶签注明头份，将疫苗稀释至每0.1ml含1羽份，再继续作10倍系列稀释，取3个适宜稀释度，分别接种5个已长成CEF单层的细胞孔(96孔细胞培养板)，每孔0.1ml，置37～38℃条件下，培养观察120小时。根据CPE产生情况，按Reed-Muench法计算TCID50，每头份病毒含量应不低于106.0TCID50。
免疫攻毒法用2～4周龄健康易感仔猪10头，随机分成2组，每组5头。一组各颈部肌肉注射疫苗1头份，另一组不接种疫苗，作为对照，在相同条件下各类饲养。21日后，所有猪用伪狂犬病毒(SX-12株)强毒肌肉注射和滴鼻各2ml(107.0TCID50/ml)，观察14日，每日测温。对照猪应全部发病，免疫猪应至少4头保护。
(8)剩余水分测定按《兽药典》附录进行测定，应符合规定。
(9)真空度测定按《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及的微生物为：伪狂犬病毒SX株，系本申请人自行由山西某猪场采集的病死猪脑组织病料中分离、鉴定而获得；并对此分离病毒经分子生物技术，缺失gE基因、gI基因、US9基因、UL49.5部分基因和TK基因，命名为伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株，该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.11500。
本发明的积极意义
本发明涉及一种5基因缺失伪狂犬病重组病毒活疫苗及其制备方法。该疫苗是以自行分离的一株伪狂犬病毒(SX株)为母本，通过分子生物学、细胞生物学等手段，缺失gE基因、gI基因、US9基因、UL49.5部分基因和TK基因，获得的1株伪狂犬病毒5基因缺失病毒株(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-)作为生产种毒，接种CEF细胞单层后经培养收获病毒液，加入冻干保护剂进行冷冻真空干燥而成，该疫苗可用于预防伪狂犬病。
实施例
以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。
实施例1
——生产用病毒株的构建
1.载体
pMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程(大连)有限公司。含有GFP基因的载体pU-EGFP和含有RFP基因的载体pU-ERFP，均由本实验室保存。
2.引物设计
根据GenBank上发表的PRV序列设计合成以下引物：
(1)扩增gI基因左同源臂的引物：
US6F：5’-GACTTAAGGATCTCCGACCCGCAGGTGG-3’(序列1)
US6R：5’-GACTTAAGGGAGCCGGGTCACGTCGCGCG-3’(序列2)
(2)扩增US9基因右同源臂的引物：
US2F：5’-GACTAGTATGGGGGTGACGGCCATCAC-3’(序列3)
US2R：5’-GACTAGTCGGAGAGATCCTGCCGTCTAGG-3’(序列4)
(3)扩增GFP基因的引物：
EGFP-F：5’-GGTATACGGATCCAAGGAGATATAACA-3’(序列5)
EGFP-R：5’-GACTAGTGAGCTCTTAAAGCTCATCAT-3’(序列6)
(4)扩增US9基因的引物：
PUS9-F：5’-AGAAACCGGAAGTGACGAATGG-3’(序列7)
PUS9-R：5’-AGGAGCACCTGGTCGCAGAG-3’(序列8)
(5)扩增UL49.5基因的引物(扩增含37-40aa基因片段)：
PUL50F：5’-GCCTGCAAGATGTAGCCGGAGA-3’(序列9)
PUL50R：5’-TGGCGAGCGAGTGGGGTC-3’(序列10)
(6)扩增缺失△37-40aa基因的UL49.5部分基因的引物(引入AflII酶切位点，用于UL49.5基因的连接)：
rPUL50F2：5’-TAAGCTTGCCTGCAAGATGTAGCCGGAGA-3’(序列11)
rPUL50R2：5’-ACTTAAGTTAGGCGTAACCCAGGGCgAC-3’(序列12)
(7)扩增UL49.5基因的引物(扩增缺失了CT的UL49.5部分基因片段)：
rPUL49F：5’-TACTAGTAGATCGATCCGCACGCGC-3’(序列13)
rPUL49R：5’-AGAATTCGCAGCGTGGACACGAAG-3’(序列14)
rPUL49F2：5’-ACTTAAGATCGATCCGCACGCGC-3’(引入AflII酶切位点，用于UL49.5基因的连接)(序列15)
(8)扩增UL49.5基因左同源臂的引物：
UL50F：5’-TAAGCTTGCCTGCAAGATGTAGCCG-3’(序列16)
UL50R:5’-ACTTAAGTTAGGCGTAACCCAG-3’(序列17)
(9)扩增UL49.5基因右同源臂的引物：
UL48F:5’-TACTAGTAGATCGATCCGCACGCGCCCG-3’(序列18)
UL48R:5’-AGAATTCGCAGCGTGGACACGAA-3’(序列19)
(10)扩增TK基因左同源臂的引物：
UL24F：5’-GGTATACCCGTGGTCGTCACGCCCATGAA-3’(序列20)
UL24R：5’-GGTATACATGCGCATCCCGGCGCGCTTC-3’(序列21)
(11)扩增TK基因右同源臂的引物：
UL22F：5’-GACTAGTATGCCCGCGTCGTCCGTGCGC-3’(序列22)
UL22R：5’-GACTAGTGCGGTACGCCTCGGCGACGGT-3’(序列23)
(12)扩增RFP基因的引物：
RFP-F：5’-GGTATACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’(序列24)
RFP-R：5’-GACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’(序列25)
3.含GFP标记的伪狂犬缺失病毒(rPRV/gE-/gI-/US9-/GFP+)的构建
(1)转移载体pMD-US6-GFP-US2的构建
以本发明人由我国山西省太原市自行分离到的PRV(SX株)基因组为模板，采用引物US6F/R和US2F/R分别扩增gE、gI、US9缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；以pU-EGFP为模板，用引物EGFP-F/EGFP-R扩增GFP基因。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒。以SbfI/AflII双酶切左臂，以SpeI/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段后依次与pMD-GFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体pMD-US6-GFP-US2。
(2)同源重组
将转移载体pMD-US6-GFP-US2与PRV(SX株)亲本株共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒(Invitrogen公司)说明书(见附件1)进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于1ml DMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为rPRV/gE-/gI-/US9-/GFP+。
(4)重组病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/GFP+的鉴定
采用gE、gI、US9和GFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI和US9片段，扩增出GFP片段。经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI和US9三段基因，并成功插入了GFP标记基因。
4.伪狂犬病毒双荧光标记缺失病毒(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/GFP+/RFP+)的构建
(1)转移载体的构建
通过基因克隆技术以PRV(SX株)UL49.5基因为模板，构建两个克隆载体pMD18T-△37-40和pMD18T-CT-null，分别缺失UL49.5中胞外域37-40氨基酸基因序列和胞质尾区(CT)80-96氨基酸，并将缺失了这两部分的基因片段通过引入酶切位点AflII进行连接，构建含有CT基因两端部分基因序列的同源臂的转移载体pMD-UL50-UL49.5-△37～40-CT-RFP-PU49。
(2)同源重组
将rPRV/gE-/gI-/US9-/GFP+病毒和上述转移载体共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色和红色双色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功，获得缺失gE、gI、US9、部分UL49.5基因(37-40氨基酸基因序列和CT基因序列)的缺失病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/GFP+/RFP+。
再通过同源重组将RFP缺失，最终筛选出rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/GFP+缺失病毒。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于1ml DMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/GFP+。
(4)重组病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/GFP+的鉴定
采用gE、gI、US9、UL49.5和GFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI和US9片段，扩增出缺失了相应大小片段的UL49.5，扩增出GFP片段。并经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI、US9、UL49.5的37-40氨基酸对应的核苷酸和CT基因，并含有GFP标记基因。
5.伪狂犬病毒双荧光标记缺失病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+/RFP+株的构建
(1)转移载体的构建
以PRV(SX株)基因组为模板，采用引物UL24F/R和UL22F/R分别扩增TK缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；以pU-RFP为模板，用引物RFP-F/RFP-R扩增RFP基因。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒。以SbfI/BstZ17I双酶切左臂，以SpeI/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段后依次与pMD-RFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体pMD-UL24-RFP-UL22。
(2)同源重组
将转移载体pMD-UL24-RFP-UL22与rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/GFP+共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色和红色双色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察荧光，挑选同时表达了绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的单个荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化4次，将获得的重组病毒命名为伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)双荧光标记缺失rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+/RFP+株(又称伪狂犬病毒双荧光标记缺失株rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+/RFP+株)，该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.11493。
(4)重组病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+/RFP+株(CGMCC No.11493)的鉴定
采用gE、gI、US9、GFP、UL49.5、TK和RFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI、US9、TK基因片段，扩增出GFP、RFP基因片段，扩增出缺失了相应大小片段的UL49.5基因。经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI、US9、TK基因，成功缺失了UL49.5的37-40氨基酸对应碱基和CT基因，并成功插入了GFP、RFP标记基因。
6.伪狂犬病毒荧光标记缺失病毒(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+)的构建
(1)转移载体的构建
以PRV SX株基因组为模板，采用引物UL24F/R和UL22F/R分别扩增TK缺失的同源重组左同源臂和右同源臂，扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，获得转移载体pMD-UL24-UL22。
(2)同源重组
将转移载体pMD-UL24-UL22与rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+/RFP+共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察荧光，挑选只表达了绿色荧光蛋白、无红色荧光蛋白的单个荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化4次，将获得的重组病毒命名为rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+株。
7.伪狂犬病毒病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株的构建
(1)转移载体的构建
以PRV(SX株)基因组为模板，采用引物US6F/R和US2F/R分别扩增gE、gI、US9缺失的同源重组左同源臂和右同源臂，扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒，获得转移载体pMD-US6-US2。
(2)同源重组
将转移载体pMD-US6-US2与rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察，挑选不表达绿色荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株。该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.11500。
实施例2
——伪狂犬病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-病毒株生物学特性测定
(1)病毒含量测定对伪狂犬病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株进行病毒含量测定。结果发现重组病毒含量可达107.2TCID50/ml。
(2)对小鼠安全性试验将伪狂犬病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株及亲本株SX株分别以106.0TCID50病毒量接种Balb/c小鼠，每组6只，观察14天，结果rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-病毒株接种的小鼠在14天均表现正常，而接种SX株PRV的小鼠全部死亡。
(3)对仔猪的安全性将rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-病毒株以107.0TCID50病毒量接种7日龄易感仔猪5头，观察14天，均健活
(4)免疫原性将rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-病毒株以105.0TCID50病毒量接种21日龄仔猪5头，免疫21天用强毒株(SX-12株)攻毒，107.0TCID50/头)，攻毒后观察14日，免疫组5头均保护，对照组5头均发病，且死亡2头。
实施例3
——伪狂犬病毒活疫苗(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株)的制备
本发明所提供的制备疫苗的方法，是将伪狂犬病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株接种长满单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
1.细胞制备选择发育良好的9～11日龄SPF鸡胚，按照常规胰酶消化法制成CEF，培养24小时左右长成单层备用。
2.病毒液的制备按体积比0.01％～0.5％的接毒量接种CEF细胞单层，37～38℃培养36～72小时，当病变率达75％以上收获病毒液，-20℃结冻保存。
3.半成品的检验
(1)无菌检验每组分别取样，按《中国兽药典》二〇一〇年版三部进行，应无菌生长。
(2)病毒含量测定每0.1ml病毒含量≥106.5TCID50。
(3)配苗及分装将检验合格的病毒液过滤混合，加入适量的5％蔗糖脱脂奶稳定剂和抗生素，充分混匀，定量分装。
(4)冻干分装后，按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程2000年版，化学工业出版社，2001，437页)附录中的方法迅速进行冷冻真空干燥。
实施例4
——伪狂犬病毒活疫苗(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株)的制备
本发明所提供的制备疫苗的方法，是将5基因缺失的伪狂犬病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株接种长满单层的ST细胞，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
实施例5
——伪狂犬病毒活疫苗(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株)的制备
本发明所提供的制备疫苗的方法，是将伪狂犬病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株接种长满单层的PK15细胞，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
实施例6
——伪狂犬病毒活疫苗(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-)成品检验
(1)性状淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
(2)无菌检验按《中国兽药典》规定方法进行检验，均无菌生长。
(3)支原体检验按《中国兽药典》规定方法进行检验，均无支原体生长。
(4)外源病毒检验按《中国兽药典》规定方法进行检验，均无外源病毒污染。
(5)鉴别检验将疫苗用灭菌生理盐水稀释至100TCID50/0.1ml，与等量抗伪狂犬病毒特异性血清混合，置室温作用60分钟后，接种5个已长成CEF单层的细胞孔(48孔细胞板)，每孔0.2ml，同时设病毒对照组，置37～38℃条件下，培养观察120小时。病毒对照组5/5出现病变，中和组未出现细胞病变。
(6)安全检验用5～7日龄易感仔猪5只，按瓶签注明头份，每只肌肉接种疫苗10头份，观察14日，均健活，无全身和局部反应。
(7)效力检验
病毒含量测定按瓶签注明头份，将疫苗稀释至每0.1ml含1羽份，再继续作10倍系列稀释，取3个适宜稀释度，分别接种5个已长成CEF单层的细胞孔(96孔细胞培养板)，每孔0.1ml，置37～38℃条件下，培养观察120小时。根据CPE产生情况，按Reed-Muench法计算TCID50，每头份病毒含量为106.8TCID50。
免疫攻毒法用2～4周龄健康易感仔猪10头，随机分成2组，每组5头。一组各颈部肌肉注射疫苗1头份，另一组不接种疫苗，作为对照，在相同条件下各类饲养。21日后，所有猪用伪狂犬病毒(SX-12株)强毒肌肉注射和滴鼻各2ml(107.0TCID50/ml)，观察14日，每日测温。对照猪5/5发病，免疫猪5/5保护。
(8)剩余水分测定按《兽药典》附录进行测定，均低于4.0％。
(9)真空度测定按《中国兽药典》附录进行测定，均为紫色辉光。
Claims (3)
1.一种伪狂犬病重组病毒活疫苗，其特征在于该活疫苗主要含有伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株病毒，该毒株是同时缺失了gE基因、gI基因、US9基因、TK基因和部分UL49.5基因的重组伪狂犬病病毒株；该毒株已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.11500。
2.如权利要求1所述一种伪狂犬病重组病毒活疫苗的制备方法，其特征在于其制备方法是，将伪狂犬病病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株接种长满单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)，培养后，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
3.如权利要求1所述一种伪狂犬病重组病毒活疫苗的制备方法，其特征在于培养伪狂犬病病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株的传代细胞是ST细胞或PK15细胞，培养后，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
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