CN102727884A

CN102727884A - 猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102727884A
Application number: CN2011103312069A
Authority: CN
Inventors: 武华
Original assignee: SINOVET (BEIJING) BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SINOVET (JIANGSU) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2031-10-27
Also published as: CN102727884B

Abstract

本发明提供一种预防猪繁殖与呼吸综合征与猪伪狂犬病的二联疫苗组合物及其制备方法和用途。本发明提供的二联疫苗组合物之间无免疫抑制，与各单苗比较，在安全性、免疫原性、免疫持续期和免疫保护效果上无显著差别，对预防猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病具有显著的免疫保护效果。

Description

猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，更具体是涉及一种猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病二联疫苗及其制备方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)和伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是危害集约化养猪业的两大重要传染病，在我国猪群中广泛存在，给养猪业造成巨大的经济损失。免疫接种是猪繁殖与呼吸综合征和伪狂犬病防制的重要措施。

但是，猪用疫苗品种很多，在实际操作中，多针次、多剂量、多种免疫程序难以合理安排，既繁琐费时、费力、增加成本，且容易造成漏种，直接影响免疫效果。频繁免疫还容易造成免疫麻痹，增加对猪群的应激。

另外，猪繁殖与呼吸综合征病毒感染会降低猪的免疫力(如，通过破坏肺泡巨噬细胞的正常功能)并引发免疫抑制(见，例如，庞海洋等，第三届猪病防控学术研讨会会议论文集，第262-265页，2008年)。因此，当免疫猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗时，会降低与其共同免疫的其他猪疫苗的免疫效果。所以，即使将猪繁殖与呼吸综合征疫苗与其他疫苗联合免疫，也难以实现与单苗免疫相当的效果。

因此，本领域迫切需要能够进行多联(或多价)疫苗免疫接种的PRRSV疫苗和PRV疫苗，以达到预防多种传染病的目的。

发明内容

在一方面，本发明提供了一种疫苗组合物，其含有猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗与猪伪狂犬疫苗。在某些实施方式中，所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗与猪伪狂犬疫苗之间基本上无免疫抑制。

在某些实施方式中，所述猪伪狂犬疫苗的基因组序列中的一个或多个基因失活，所述基因选自下组：TK、PK、RR、dUTPase、gG、gC、gE、gD和gI。

在某些实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗含有Nsp1核苷酸序列，所述序列的编码序列与SEQ ID NO：1具有至少90％的同源性。在某些实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗进一步含有Nsp2核苷酸序列，所述Nsp2核苷酸的编码序列与SEQ IDNO：2具有至少90％的同源性。

在一方面，本发明提供了一种制备所述的疫苗组合物的方法，以及用该方法制备得到的疫苗组合物，其含有猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗和猪伪狂犬疫苗。

本发明还提供了所述疫苗组合物在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征与猪伪狂犬病的生物制品中的用途。

本发明还提供了一种免疫猪的方法，包括对猪施用本发明所述的疫苗组合物。

本发明还提供了一种猪伪狂犬疫苗，其是在Marc-145细胞、MDBK细胞、BT细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、猪肾传代细胞(IBRS-2)、兔肾传代细胞(RK)、鸡胚成纤维细胞、或猪肾原代细胞中培养得到。

本发明还提供了一种细胞用于培养猪伪狂犬疫苗的用途，所述细胞选自：Marc-145细胞、MDBK细胞、BT细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、猪肾传代细胞(IBRS-2)、兔肾传代细胞(RK)、鸡胚成纤维细胞、和猪肾原代细胞。

附图说明

图1为高致病性猪繁殖与呼吸综合征TJM疫苗株与强毒株鉴别检验电泳图。其中M是指分子量标记MarkDL2000，1是指PRRSV TJ强毒株，2是PRRSV TJM疫苗株，3是水对照。

图2为伪狂犬病毒疫苗株与强毒株鉴别检验电泳图。其中M是指分子量标记Mark DL2000，1是指PRV疫苗毒株，2是指PRV强毒株，3是指水对照。

图3为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗2～8℃耐老化试验(PRRSV毒价)。SD001、SD002、SD003分别表示三个不同批次的二联活疫苗。

图4为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗2～8℃耐老化试验(PRV毒价)。

图5为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗37℃耐老化试验(PRRSV毒价)。

图6为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗37℃耐老化试验(PRV毒价)

图7为PRRSV疫苗和PRV疫苗接种后，抗PRV中和抗体的效价。一组分次接种了PRRSVTJM单苗和PRVBarthaK61单苗，二组接种了二联活疫苗，三组只接种了PRV Bartha K61单苗，四组仅接种了无菌PBS。

具体实施方式

本发明的目的之一是提供免疫力高、无免疫干扰的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗与猪伪狂犬疫苗的二联疫苗组合物。

本发明的目的之二是提供一种制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗与猪伪狂犬疫苗的二联疫苗组合物的方法。

本申请提供了一种疫苗组合物，其含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗与猪伪狂犬(PRV)疫苗。

PRRSV是一种正链RNA病毒，目前已发现两种基因型：欧洲型和美洲型。PRRSV基因组中有多个开放阅读框，其中第一个开放阅读框(ORF1a和ORF1b)含有PRRSV基因组的80％的序列，其编码PRRSV病毒复制所必须的RNA复制酶(Straw et al，Diseases of Swine，9TH edition，chapter24(2006))。ORF1a和ORF1b被翻译成一个多蛋白(poly-protein)，该多蛋白被其中含有的蛋白酶活性区域切割成多个非结构蛋白，包括Nsp1-Nsp12(见，例如，Vries et al，Seminars in Virology，8：33-47(1997)；Allende et al，Journal of General Virology，80：307-315(1999))。

猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病毒引起的高死亡率的急性传染病。猪伪狂犬病毒可感染各种日龄阶段的猪。怀孕母猪感染后可出现流产、死胎、弱胎、木乃伊胎，新生仔猪感染后出现发热、食欲下降、神经症状、麻痹、衰竭直至死亡，成年猪多耐过而呈隐性感染，成为该病的主要传染源。猪伪狂犬病毒可在康复猪的嗅球、三叉神经节和扁桃体中潜伏。在猪体内潜伏的病毒可以被一些应激因素激活，如冷、热应激、或活性化合物如地塞米松等，导致病毒在易感猪群中散毒和传播。世界动物卫生组织(World Organization forAnimalHealth，OIE)将猪伪狂犬病列为法定报告动物疾病，我国也将其列为二类传染病。

猪伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒科(Herpesvirdae)、α2疱疹病毒亚科(Alpherpesvirinae)。目前仅发现一种血清型的PRV。PRV的基因组是双链线性DNA，约为150kb。病毒基因组由长独特区(UL)和短独特区(US)以及US两侧的末端重复序列(TR)与内部重复序列(IR)组成。目前PRV基因组中已有65种基因被定位，其中大多数基因的功能也有所了解。在UL区已被定位的基因有UL1-UL54共56种，包括了已被测序的糖蛋白gB、gC、gH、gK、gL、gM、gN、胸腺激酶TK、碱性核酸酶(AN)、核苷酸还原酶(RR)、DNA聚合酶(POL)、DBP基因、MCP基因、ICP18.5基因和早期蛋白0(EP0)基因等。US区已被全部测序，其中被定位的基因有7种：糖蛋白gD、gE、gG、gI、蛋白激酶(PK)基因、11kd和28kd蛋白基因。

在一方面，本发明提供了疫苗组合物，其含有猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗(PRRSV疫苗)与猪伪狂犬病疫苗(PRV疫苗)，且所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗与猪伪狂犬疫苗之间基本上无免疫抑制。

“基本上无免疫抑制”是指，所述PRRSV疫苗与所述PRV疫苗在免疫猪以后不会显著削弱对方的免疫效果。例如，在免疫所述疫苗组合物后，所述疫苗组合物在猪体内产生的抗PRV抗体的量或者该抗体中和抗原的效价不显著低于单独免疫所述PRV疫苗时产生的抗体的量或效价；或者所述疫苗组合物在猪体内产生的抗PRRSV抗体的量或者该抗体中和抗原的效价不显著低于单独免疫所述PRRSV疫苗时产生的抗体的量或效价。可以通过常规的方法在免疫后的适当的时间检测抗体产生的量或者中和抗原的效价。例如，可以通过ELISA的方法，用对应的抗原进行检测。

在某些实施方式中，所述疫苗组合物中，所述PRRSV疫苗与所述PRV疫苗可以以适当的比例混合。例如，可以将所述PRRSV疫苗与所述PRV疫苗分别制成具有一定病毒滴度的抗原液，再根据测得的病毒滴度计算混合的比例。病毒滴度可以通过50％组织培养感染剂量(TCID50)表征，TCID50值可以通过本领域已知的适当方法进行测定。例如，可以将病毒进行10倍系列稀释，接种长满特异细胞的96孔细胞培养板，每个稀释度接种8孔，100ul/孔，接种后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养4-5天，观察细胞病变，根据出现细胞病变的孔数计算TCID50。具体方法可见参考文献Reed LJ，Muench H.A simple methodof estimating fifty percent end points.Am J Hyg 1938；27：493-97。在某些实施方式中，可以根据测得的所述PRRSV疫苗与所述PRV疫苗的TCID50值进行混合，使得混合物中两种疫苗的TCID50值在适当的比例范围。在某些实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗与所述猪伪狂犬疫苗的混合比例为1∶1到1∶10，例如，1∶1到1∶9，1∶1到1∶8，1∶1到1∶7，1∶1到1∶6，1∶1到1∶5，1∶1到1∶4，1∶1到1∶3，或1∶1到1∶2。

在某些实施方式中，所述疫苗组合物中含有适当量的所述PRRSV疫苗与所述PRV疫苗。例如，在每头份疫苗中，所述PRRSV疫苗和PRV疫苗的含量分别不低于10^4.5～10^5.5和10^5.0～10^6.0TCID₅₀。

在某些实施方式中，本发明提供的疫苗组合物中的所述PRV疫苗是减毒的PRV疫苗。“减毒的猪伪狂犬疫苗”(或减毒PRV疫苗)是指一种PRV，其能够感染宿主，但是不能引起猪伪狂犬病，或者其引起的症状较少和/或较轻。减毒PRV包括活的减毒PRV以及由其灭活得到的灭活产物。“猪伪狂犬病”是指天然的PRV感染猪后引起的一系列生理和病理的症状。这些症状包括，但不限于，流产、死胎、弱胎、木乃伊胎，发热、食欲下降、神经症状、麻痹、衰竭、甚至死亡等。

在某些实施方式中，所述PRV疫苗是减毒的PRV活疫苗。在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗的基因组序列与NCBI参考号NC_006151的核苷酸序列具有至少80％的同源性，或者至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同源性。所述“同源性”在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，Altschul S.F.et al，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Stephen F.et al，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www.eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例如，Higgins D.G.et al，Methods in Enzymology，266：383-402(1996)；Larkin M.A.et al，Bioinformatics(Oxford，England)，23(21)：2947-8(2007))；和TCoffee软件等(在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，Poirot O.et al，Nucleic Acids Res.，31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.et al，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。

在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗的基因组序列中的一个或多个与毒力相关的基因失活。基因“失活”是指，由于基因的全部或部分被删除或缺失，或者基因中存在突变或插入，导致基因原本的功能减弱或丧失。与PRV毒力相关的基因的例子包括，但不限于，TK(例如，NCBI Gene ID：2952559)、PK(例如，NCBI Gene ID：2952530或2952561)、RR(例如，NCBI Gene ID：2952535或2952536)、dUTPase(例如，NCBI Gene ID：2952537)、gG(例如，NCBI Gene ID：2952520)、gC(例如，NCBI Gene ID：2952505)、gE(例如，NCBI Gene ID：2952517)、gD(例如，NCBI Gene ID：2952521)和gI(例如，NCBI Gene ID：2952516)。

在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗的基因组序列中的一个或多个基因失活，所述基因选自下组：TK、PK、RR、dUTPase、gG、gC、gE、gD和gI。在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗的基因组序列中的gE基因失活。在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗的基因组序列中仅有gE基因失活。在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗的基因组序列中除gE基因失活外，还进一步失活了一个或多个其他的毒力基因，例如，TK、PK、RR、dUTPase、gG、gC、gD和/或gI。

减毒的PRV活疫苗可以通过本领域公知的方法获得。例如，可以将分离到的猪伪狂犬野生毒株用非猪源的细胞传代，或在鸡胚中培养，或者加入致突变剂在较高培养温度下培养，从而致弱获得猪伪狂犬弱毒苗。本领域已知多种这样的减毒的PRV活疫苗，例如，Bartha K61株(见，例如，Bartha，A.Experiments to reduce the virulence of Aujeszky′s virus.Magyar allatorvosok lapja 16，42-45(1961))、BUK株、NIA4株、Alfort株、和VGNKI株等。这些减毒的PRV活疫苗都可以在本发明中使用。例如，还可以将野生的或减毒的PRV毒株进行基因工程改造，使得目标毒力基因失活，但病毒仍然能够复制，从而获得减毒的PRV活疫苗。本领域公知，通过基因工程改造已经获得多种减毒的PRV活疫苗，例如，PRV-BUK-d13株(见，例如Kit S.et al，Am.J.Vet.Res.，1985，46(6)：1359-1367)、PRV dlgC/dlTK株(见，例如Kit S.et al，Am.J.Vet.Res.，1987，48(5)：780-793)、S-PRV-002缺失疫苗株(见，例如Shin Y S.et al，J.Vet.Med.Sci.，1997，59(1)：51-53)、PRV783株(见，例如Van Oirschot J T et al，Am.J.Vet.Res.，1984，45(10)：2099-2103)、EL-001、PRV376等。

在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗是Bartha K61株。在某些实施方式中，Bartha K61株缺失gE基因。在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗在Bartha K61株的基础上进一步失活了其他基因。

在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗还可以进一步缺失一个或多个非毒力相关的基因，或者进一步具有插入的异源的基因。例如，非毒力相关的基因可以包括不影响病毒复制、感染宿主等的基因。缺失的非毒力基因和插入的异源基因可以有助于疫苗的检测和/或诊断。

在某些实施方式中，所述PRRSV疫苗是减毒的PRRSV。在本申请中，“减毒PRRSV”是指一种PRRSV，其能够感染宿主，但是不能引起猪繁殖与呼吸综合征，或者其引起的症状较少和/或较轻。减毒PRRSV包括活的减毒PRRSV以及由其灭活得到的灭活产物。“猪繁殖与呼吸综合征”是指天然的PRRSV感染猪后引起的一系列生理和病理的症状。这些症状包括，但不限于，发热、嗜睡、食欲不振、倦怠、呼吸困难、咳嗽、母猪繁殖障碍、仔猪生长缓慢或死亡等。

在某些实施方式中，所述PRRSV疫苗是减毒的PRRSV活疫苗。在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV活疫苗含有Nsp1核苷酸序列，所述序列的编码序列与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同源性。在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV活疫苗进一步含有Nsp2核苷酸序列，所述Nsp2核苷酸序列的编码序列与SEQ ID NO：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同源性。

“编码序列”在本申请中是指一种DNA序列，其能够被转录得到相应的RNA序列。PRRSV是正链RNA病毒。PRRSV的编码序列是一种DNA，其能够被转录成正链RNA，该正链RNA与PRRSV病毒本身的基因组中的RNA序列相同。

在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV活疫苗含有由SEQ ID NO：1编码的Nsp1核苷酸序列，且含有由SEQ ID NO：2编码的Nsp2核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV活疫苗含有PRRSV的核苷酸序列，该序列的编码序列与SEQ ID NO：3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同源性。在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV活疫苗的核苷酸序列由SEQ IDNO：3编码。

在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV活疫苗是减毒的高致病性PRRSV的活疫苗。

“高致病性PRRSV”是指，所述PRRSV的Nsp2蛋白的编码序列与PRRSV VR-2332株的Nsp2蛋白的编码序列(SEQ ID NO：6)相比，在SEQ IDNO：6的第1440位到第1680位的核苷酸片段中(即：SEQ IDNO：7)缺失了不连续的90个核苷酸。缺失了所述不连续的90个核苷酸的PRRSV通常比PRRSV VR-2332毒株具有更强的致病性。在某些实施方式中，所述90个不连续的核苷酸包括SEQ ID NO：6中第1440-1442位的“TTT”以及如SEQ ID NO：8所示的序列。在某些实施方式中，所述高致病性PRRSV的Nsp2蛋白编码序列含有如SEQ ID NO：4(即：PRRSV TJ株的Nsp2核苷酸序列)所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述高致病性PRRSV为PRRSV TJ株，其基因组编码序列见GenBank登录号EU860248所示。

在某些实施方式中，所述减毒的高致病性PRRSV的活疫苗在Nsp2蛋白的编码序列中不仅缺失了上述不连续的90个核苷酸，还进一步具有部分序列的缺失。在某些实施方式中，所述减毒的高致病性PRRSV的活疫苗的Nsp2蛋白的编码序列与SEQ ID NO：4相比，缺失了如SEQ ID NO：5所示的360个核苷酸。在某些实施方式中，所述减毒的高致病性PRRSV的活疫苗的Nsp2蛋白编码序列含有由SEQ ID NO：2编码的序列。在某些实施方式中，所述减毒的高致病性PRRSV为PRRSV TJM株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.3121。

在本申请提供的疫苗组合物中还可以进一步含有佐剂。佐剂可以保护疫苗不受体内破坏和/或非特异性地刺激免疫系统，从而有助于增强对所述疫苗的免疫反应。佐剂的例子包括，但不限于，矿物盐类(例如，氢氧化铝、磷酸铝、氢氧化钙)、油包水乳剂(例如，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等)、皂苷类(saponin)佐剂(如：Stimulon^TM等)、细菌或微生物衍生物类(如，脂多糖、脂A衍生物(lipid Aderivatives)等)、和微粒(如聚-α羟基酸等)。

在本申请提供的疫苗组合物中还可以进一步含有冻干保护剂。冻干保护剂可以保护生物制品在冻干过程中的稳定性，减少冻干过程对疫苗的生物活性的破坏。冻干保护剂的例子包括蔗糖、L-谷氨酸钠、或水解乳蛋白。

在某些实施方式中，本申请的疫苗组合物中的PRRSV疫苗和PRV疫苗的混合液与冻干保护剂的比例为2∶1-4∶1。在某些实施方式中，本发明的疫苗组合物在冻干后，每头份疫苗PRRSV和PRV病毒含量分别不低于10^5.0和10^5.5TCID₅₀。

在某些实施方式中，本申请提供的疫苗组合物含有减毒的高致病性PRRSV的活疫苗和减毒PRV的活疫苗。在某些实施方式中，所述减毒的高致病性PRRSV的活疫苗优选是TJM株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.3121；所述减毒PRV的活疫苗优选是Bartha K61株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.5076。

PRRSVTJM株的具体保藏信息如下：微生物保藏号：CGMCCNo.3121；分类命名：猪繁殖与呼吸综合征病毒；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2009年6月15日。

BarthaK61株的具体保藏信息如下：微生物保藏号：CGMCCNo.5076；分类命名：伪狂犬病病毒；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2011年7月21日。

PRRSV TJM株和猪伪狂犬疫苗Bartha K61株之间无免疫抑制，并且均具有良好的安全性、免疫原性和特异性，能够很好的预防当前猪群中主要流行的高致病性猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病。含有PRRSV TJM株和猪伪狂犬疫苗Bartha K61株的二联疫苗通过一次免疫，有效预防和控制PRRS与PR两种疫病的发生与流行，减轻免疫接种的工作量，减少免疫次数，避免因频繁免疫所造成的免疫麻痹，相应减少了对猪群的应激。

本发明还提供了一种制备本发明所述疫苗组合物的方法，包括：

(1)将猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗和猪伪狂犬病病毒疫苗分别接种于各自的易感细胞，并培养所述接种后的易感细胞；

(2)收获并混合所述步骤(1)得到的细胞培养物中的病毒。

所述易感细胞可以是传代细胞系，也可以是原代细胞。适合于猪繁殖与呼吸综合征病毒的易感细胞包括，但不限于，非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系、MA-104细胞系、Vero细胞系、CL-2621细胞系等传代细胞系，或者PAM细胞等原代细胞。适合于猪伪狂犬病病毒的易感细胞包括，但不限于，ST细胞系(ATCC编号：CRL-1746)、PK-15细胞系(ATCC编号：CCL-33)、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系(ATCC编号：CRL-12219)、牛肾细胞MDBK细胞系(ATCC编号：CCL-22)、牛睾丸传代细胞BT细胞系(ATCC编号：CRL-1390)、Vero细胞系(ATCC编号：CCL-81)、BHK-21细胞系(ATCC编号：CCL-10)、猪肾传代细胞系(如：IBRS-2，见例如，DECASTRO，M.P.1964.Behavior offoot and mouth diseasevirus in cell culture：susceptibility of the IB-RS-2swine cell line.Arquivos Instituto Biologica 31：63-78)、兔肾传代细胞系(RK，如：ATCC编号：CCL-106)等传代细胞系，或者鸡胚成纤维细胞和猪肾细胞等原代细胞。原代细胞可以通过本领域公知的方法，用动物体内的组织进行分离和制备。

在某些实施方式中，步骤(1)中的所述易感细胞可以通过以下方法培养得到：在转瓶中培养，使其细胞密度达到5×10⁷/ml-1×10⁸/ml；或者在生物反应器中添加附着载体进行悬浮培养，使其细胞密度达到5×10⁸/ml-1×10⁹/ml。

在某些实施方式中，步骤(1)中所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗接种的感染剂量(MOI)为0.01-0.5。

在某些实施方式中，步骤(1)中所述的猪伪狂犬疫苗接种的感染剂量(MOI)为0.005-0.5。

在某些实施方式中，步骤(2)包括收获步骤(1)得到的细胞培养液，测定病毒TCID50，以及混合所述细胞培养液，使得猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗与猪伪狂犬疫苗的TCID50值的比例为1∶1到1∶10。

在某些实施方式中，所述方法进一步包括：将步骤(2)中得到的混合的病毒与冻干保护剂混合。在某些实施方式中，所述混合的病毒的体积约为6-8份，所述冻干保护剂的体积为2-4份。任选地，还可以加入抗生素。混合物可以经冷冻真空干燥，得到猪繁殖与呼吸综合征和伪狂犬病的二联活疫苗。

在某些实施方式中，所述方法可以包括：

(I)将猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗与猪伪狂犬疫苗分别接种易感细胞，用维持液培养，制备生产种毒；

(II)将所制备的生产种毒分别接种长满90-100％细胞的介质上，用维持液培养增殖得到猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原液和猪伪狂犬疫苗抗原液；

(III)将猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原液和猪伪狂犬疫苗抗原液混合。

在某些实施方式中，所述步骤(I)可以包括如下步骤：

(Ia)易感细胞的培养：当所述易感细胞是传代细胞时，可以经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，用细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层；当所述易感细胞是原代细胞时，可以通过常规方法获得原代细胞，并培养所述原代细胞形成细胞单层；

(Ib)细胞毒种的繁殖：将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗、伪狂犬病病毒疫苗分别接种至所述步骤(Ia)中得到的易感细胞单层，用细胞维持液继续培养，2-3日后收获细胞培养毒液作为猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗生产用毒种；

(Ic)制苗毒液的繁殖：

猪繁殖与呼吸综合征活疫苗制苗毒液的繁殖：取所述步骤(1a)中得到的传代细胞单层，弃去所述细胞生长液，接种所述步骤(1b)中得到的含猪繁殖与呼吸综合征病毒的细胞维持液，继续培养；

伪狂犬病活疫苗制苗毒液的繁殖：取所述步骤(1a)中得到的传代细胞单层，弃去所述细胞生长液，接种所述步骤(1b)中得到的含伪狂犬病病毒的细胞维持液，继续培养；

所述步骤(II)收获所述细胞培养毒液为：

将含猪繁殖与呼吸综合征病毒的维持液接种到传代细胞单层后培养，接种感染量(MOI)为0.01-0.5，接种后2-3日，CPE达70％以上时收获细胞培养毒液，收获的毒液置于-15℃下保存：

将含伪狂犬病病毒的维持液接种到传代细胞单层后培养，接种感染量(MOI)为0.005-0.5，接种后2-3日收获细胞培养毒液，CPE达80％以上时收获的毒液置于-15℃下保存。

优选地，所述步骤(Ia)、(Ib)和(Ic)中的细胞培养所用的温度为36℃-37℃。

优选地，所述步骤(Ib)和(Ic)中的接种时的接种量(MOI)为0.01-0.5。

优选地，所述步骤(Ia)中的细胞生长液为含90％-94％体积百分比的MEM液、6％-10％体积百分比的犊牛血清和抗菌素，所述细胞生长液的pH值为7.0-7.2。

优选地，所述步骤(Ib)和(Ic)中的细胞维持液为含95％-98％体积百分比的MEM液、2％-5％体积百分比的犊牛血清和抗菌素，所述细胞生长液的pH值为7.2-7.4。

优选地，所述传代细胞选自非洲绿猴肾细胞Marc-145、牛肾细胞MDBK和牛睾丸传代细胞BT。

本发明提供的制备方法与现有技术相比具有多种优势。例如，其制备过程简单且稳定、易操作、病毒含量高、批间差异小、质量易控、可显著提高疫苗产量和质量、减少过敏反应等。利用本发明的制备方法得到的猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗安全好、免疫效力高，对猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病的强毒攻击具有较好的免疫保护作用。

本发明还提供了用本发明所述的方法制得的PRRSV和PRV二联疫苗组合物。

本发明还提供了所述的疫苗组合物在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征与猪伪狂犬病的生物制品中的用途。

本发明还提供了免疫猪的方法，包括对猪施用本发明所述的疫苗组合物。可以通过例如注射的方式对猪免疫。可以进行单剂量给药、多剂量重复给药等方式进行免疫。具体的免疫方式和免疫剂量可以根据由有兽医经验的人员根据实际情况进行调整。

本发明还提供了一种猪伪狂犬疫苗，其是在Marc-145细胞、MDBK细胞、BT细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、猪肾传代细胞(IBRS-2)、兔肾传代细胞(RK)、鸡胚成纤维细胞、或猪肾原代细胞中培养得到。在某些实施方式中，本发明提供的疫苗组合物中，所述猪伪狂犬疫苗是在Marc-145细胞、MDBK细胞、BT细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、猪肾传代细胞(IBRS-2)、兔肾传代细胞(RK)、鸡胚成纤维细胞、或猪肾原代细胞中培养得到。在某些实施方式中，所述猪伪狂犬疫苗在非洲绿猴肾细胞Marc-145、牛肾细胞MDBK或牛睾丸传代细胞BT中培养得到。

本发明进一步提供了一种细胞用于培养猪伪狂犬疫苗的用途，所述细胞选自：Marc-145细胞、MDBK细胞、BT细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、猪肾传代细胞(IBRS-2)、兔肾传代细胞(RK)、鸡胚成纤维细胞、和猪肾原代细胞。

优势

本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗与现有技术相比具有显著的的优势。现有技术中，猪繁殖与呼吸综合征疫苗和伪狂犬病疫苗的免疫存在诸多问题。第一，现有技术中的猪繁殖与呼吸综合征疫苗和伪狂犬疫苗之间存在免疫抑制，当两种疫苗联用时，其免疫效果显著低于分别免疫的效果，因此难以通过联用的方式实现对两种病毒的有效免疫。例如，猪繁殖与呼吸综合征病毒会影响淋巴细胞等免疫细胞的功能(陈仕龙等，福建畜牧兽医，第28卷第1期，24-25页，2006年)，进而导致免疫抑制。第二，由于前述免疫抑制的因素，现有技术中的猪繁殖与呼吸综合征疫苗和伪狂犬疫苗都是进行分别免疫，这增加了免疫次数，对猪群产生较大的应激刺激，进而影响猪群体重增长，且会刺激猪免疫系统导致原本潜伏的病毒被激活和发病。第三，现有技术中，反复多次的频繁免疫还可能导致猪群对疫苗产生免疫麻痹，使得疫苗在体内的免疫效果降低。

与现有技术相比，本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗不会产生免疫抑制，其联合使用时能够达到的免疫效果与分别使用时的免疫效果相当，因此能够同时使用，实现一针防两病的效果。由于无需进行分次免疫，因此本发明的二联活疫苗与现有技术相比，免疫次数显著减少，对猪群造成的应激刺激也相应减少，也不会造成因频繁免疫而导致的免疫麻痹。同时，本发明的二联疫苗还可大大减少免疫的工作量，节约免疫成本，有利于合理安排免疫程序。另外，本发明的二联疫苗无需进行两种疫苗的单独制备和包装，简化了疫苗制备和包装过程。

实施例

下面将详细介绍本发明的猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，以及制备出的猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗。

实施例1高致病性猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗的制备

通过如下方法制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗：

(1)选择易感细胞作为制苗用细胞：分别选用非洲绿猴肾细胞(Marc-145)作为PRRSV的易感细胞，选用Marc-145、牛肾细胞(MDBK)和牛睾丸传代细胞(BT)传代细胞作为PRV的易感细胞。

(2)制苗用细胞的传代与培养：上述传代细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层时，用于继续传代或接种病毒；细胞培养温度是36-37℃。

(3)生产用毒种的繁殖：

A.高致病性PRRSV活疫苗生产用毒种的繁殖：在含2-4％牛血清的MEM细胞维持液中，将PRRSV TJM株接种至生长良好的Marc-145传代细胞单层，37℃继续培养；2-3日后收获细胞培养液作为生产用毒种。

细胞毒种鉴定：对繁殖得到的生产用细胞毒种进行鉴定，完全符合高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每1ml含病毒≥10^7.0TCID₅₀。

B.PRV活疫苗生产用毒种的繁殖：在含2-4％牛血清的MEM细胞维持液中，将伪狂犬病病毒弱毒株Bartha K61株分别接种至生长良好的Marc-145、MDBK和BT传代细胞单层，37℃继续培养；2-3日后分别收获细胞培养液，作为生产用毒种。

细胞毒种鉴定：对繁殖得到的伪狂犬活疫苗生产用细胞毒种进行鉴定，完全符合伪狂犬病毒弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每1ml含病毒≥10^8.0TCID₅₀。

(4)制苗毒液的繁殖：

A.高致病性PRRSV活疫苗的制苗毒液的繁殖：将PRRSV TJM株以MOI：0.01-0.5接种于长满良好单层的Marc-145细胞，加入维持液，置36-37℃进行培养，当CPE达70％以上时收获病毒液。冻融2次，测定病毒含量(TCID₅₀)。每1ml含病毒≥10^7.0TCID₅₀。同时抽样进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验。按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页的描述，对制得的毒液进行检验，制苗用毒液须无细菌、霉菌、支原体生长。

将检验合格的病毒液作为制苗用抗原液，置-15℃以下保存备用。

B.伪狂犬病活疫苗的制苗毒液的繁殖：将PRV疫苗毒BarthaK61株以MOI：0.005-0.5分别接种于长满良好单层的Marc-145细胞、MDBK、和BT传代细胞，加入维持液，置36-37℃进行培养，当CPE达70％以上时收获病毒液。冻融2次，测定病毒含量(TCID₅₀)，每1ml含病毒≥10^8.0TCID₅₀。同时抽样进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验。按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页的描述，对制得的毒液进行检验，制苗用毒液须无细菌、霉菌、支原体生长。

(5)配苗、分装及冻干：将高致病性PRRSV活疫苗的制苗用抗原液、伪狂犬病活疫苗的制苗用抗原液按一定比例混合，置于同一容器内，抗原液占6-8份，加入冻干保护剂，比例为2-4份。同时加入适量的抗生素，充分摇匀，定量分装：分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得二联活疫苗的成品。

实施例2高致病性PRRSV、PRV二联活疫苗的纯净性检验

按《中华人明共和国兽药典》(2005年版)附录15、19、20页的描述，对实施例1制得的二联活疫苗进行检验，结果显示该二联活疫苗无细菌、霉菌及支原体生长，无外源病毒污染。

实施例3高致病性PRRSV、PRV二联活疫苗病毒基因鉴别检验

(1)高致病性PRRSV疫苗株TJM株的检验

针对PRRSV的nsp2基因设计合成特异性引物(上游引物：5’-GGCAAGAAGTTGAGGAAGT-3’；下游引物：5’-TGGCAGGTTGGTCACAGA-3’)，并用实施例1制得的含有PRRSV TJM株的病毒液进行PCR扩增，同时用高致病性PRRSV强毒TJ株作为阳性对照，水作为阴性对照。结果如图1所示。由于PRRSV TJM株的nsp2基因存在连续360个核苷酸的缺失，因此使用特异性引物扩增后，TJM株的样品可得到约207bp的特异性条带，而高致病性PRRSV强毒TJ株和经典强毒株可得到约567bp的目的条带(见图1)。

(2)PRV疫苗株Bartha k61株的检验

针对PRV gE基因设计特异性引物(上游引物：5’-CGTCACGGTCACCAAGGAGC-3’；下游引物：5’-GCACAGCACGCAGAGCCAG-3’)，并用实施例1制得的含有PRV疫苗株Bartha k61株的病毒液进行PCR扩增，同时用PRV强毒株作为阳性对照，水作为阴性对照。结果如图2所示。由于伪狂犬病毒疫苗毒Bartha K61株中缺失了gE基因，因此扩增不到特异性条带，而强毒株可扩增到约232bp的特异性条带(见图2)。

实施例4高致病性PRRSV、PRV二联活疫苗的安全性试验

对用实施例1的方法制备得到的3批疫苗进行安全性试验，具体如下：

取实验室制备的3批二联活疫苗(含有高致病性PRRSV活疫苗TJM株和PRV活疫苗BarthaK61株)，经颈部肌肉注射4-5周龄PRRS、PR 阴性猪。将实验动物猪分为三个实验组，每组为15头猪，分别用3批二联活疫苗进行单剂量，单剂量重复接种和10倍超剂量接种。每份单剂量含10^5.0-10^5.5TCID₅₀的病毒。同时设5头不接种疫苗猪作为对照。疫苗接种后，连续14天每天定点测定试验动物直肠温度，观察临床症状，疫苗接种后21天将试验动物剖检观察肺脏有无病变。试验结果表明，疫苗单剂量、单剂量重复和10倍剂量接种猪后，体温正常，无任何临床症状，剖检观察肺脏无肉样变。实验结果证明，该二联活疫苗对猪安全。

实施例5高致病性PRRSV、PRV二联活疫苗的效力检验

取用实施例1的方法制备得到的3批二联活疫苗(含有高致病性PRRSV活疫苗TJM株和PRV活疫苗Bartha K61株)，分别接种4-5周龄健康PRRS、PR阴性断乳仔猪，试验分为4组，每组10头猪。

第一组至第三组(免疫组)分别免疫接种3批实验室制备的二联活疫苗，剂量为1头份/头猪，病毒含量分别为10^5.0TCID₅₀/头份/ml和10^5.5TCID₅₀/头份/ml，颈部肌肉注射。第四组为对照组，接种1ml MEM细胞培养液。

免疫后观察动物临床反应及疫苗副作用，每周采血、分离血清、用于血清抗体检测；每周测量体重。

免疫后4周，将每组动物中的5头使用PRRSV TJ株检验用强毒(效价为10^3.8-10^4.5TCID₅₀/ml，Genbank No.：EU860248)攻击，攻击剂量为3ml病毒液/头猪。另外5头猪使用PRV检验用强毒(为自行分离毒株，JL1株)(效价为10^3.5-10^4.5TCID50/ml)攻击，攻击剂量为3ml病毒液/头猪。

动物接种强毒后，每天观察临床症状，包括食欲、精神状态等；每天测定直肠体温；每2天采血分离血清或采集鼻拭子，用于病毒分离测定；试验于攻毒后21天结束。

试验结果：

1、疫苗接种后试验动物体温正常，未见任何临床症状，疫苗接种组和对照组试验动物增重无明显差异；

2、攻毒后，疫苗接种组针对两种强毒时攻毒保护率均可达4/5以上，对照组发病率均为5/5，针对PRRSV强毒株攻毒的死亡率为2/5，针对PRV强毒株攻毒的死亡率为3/5。

试验结果表明，本发明的二联疫苗对于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒和伪狂犬病强毒的攻击均可产生较好的保护作用，可有效预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征和伪狂犬病毒的感染。

实施例6高致病性PRRSV、PRV二联活疫苗的保存期试验

将3批(SD001、SD002、SD003)二联活疫苗的实验室制品(PRRSV TJM株的抗原含量分别为10^5.8TCID₅₀/ml/头份、10^5.9TCID₅₀/ml/头份、10^5.8TCID₅₀/ml/头份；PRV BarthaK61株的抗原含量分别为10^6.2TCID₅₀/ml/头份、10^6.1TCID₅₀/ml/头份、10^6.1TCID₅₀/ml/头份)于2～8℃保存3、6、9、12、18、21和24个月，分别取样进行性状、真空度、水分含量、效力试验(图3、4)以及37℃耐老化试验(图5、6)。结果表明：3批制品在2～8℃保存24个月性状仍为白色疏松团块，加入稀释液后迅速溶解；平均剩余水分在要求范围内；真空度检测为白色或紫色辉光：PRRSV抗原含量分别为10^5.3TCID₅₀/ml/头份、10^5.5TCID₅₀/ml/头份、10^5.3TCID₅₀/ml/头份；PRV抗原含量分别为10^5.8TCID₅₀/ml/头份、10^5.6TCID₅₀/ml/头份、10^5.7TCID₅₀/ml/头份。37℃放置14日后PRRSV抗原含量分别为10^5.3TCID₅₀/ml/头份、10^5.4TCID₅₀/ml/头份、10^5.2TCID₅₀/ml/头份；PRV抗原含量分别为10^6.0TCID₅₀/ml/头份、10^5.7TCID₅₀/ml/头份、10^5.9TCID₅₀/ml/头份，均高于冻干疫苗要求(PRRSV：10^5.0TCID₅₀/ml/头份，PRV：10^5.5TCID₅₀/ml/头份)，因此疫苗在2～8℃保存期为24个月。

实施例7高致病性PRRSV对伪狂犬病活疫苗免疫抑制性试验

用实施例1的方法制备得到的二联活疫苗(含有高致病性PRRSV活疫苗TJM株和PRV活疫苗Bartha K61株)、高致病性PRRSV活疫苗TJM株单苗和PRV活疫苗Bartha K61株单苗进行实验。

使用4～5周龄PRRS和PR抗原、抗体阴性仔猪16头，分成4组，每组4头仔猪。第一组在首次免疫时，经颈部肌肉注射高致病性PRRSV TJM株单苗，每头猪接种1头份，疫苗接种后1周每头猪再接种PRVBarthaK61株单苗，每头猪接种1头份。第二组接种二联活疫苗，每头猪接种1头份，接种时间同第一组PRV疫苗的接种时间。第三组只接种PRVBarthaK61株的单苗，每头猪接种1头份，接种时间同第一组PRV疫苗的接种时间。第四组为对照组，接种无菌PBS。动物在接种PRV疫苗后，每周进行采血，直至PRV疫苗接种后28日。测定采集的血液样品中，抗PRV抗体的效价。结果显示(见图7)，第一组、第二组和第三组的PRV抗体中和效价差异不显著，说明PRRSV TJM株不会对PRV疫苗产生免疫抑制。无论PRRSVTJM与PRV疫苗是分次免疫还是以二联活疫苗的形式同时免疫，PRRSV TJM株都不会影响PRV抗体的效价。当PRV疫苗与PRRSV TJM株联合免疫时，其免疫效果与PRV单独免疫的效果相当。

以上所述仅为本发明的优选实施例，不应限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种疫苗组合物，含有猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗与猪伪狂犬疫苗。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗与猪伪狂犬疫苗之间基本上无免疫抑制。

3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗与所述猪伪狂犬疫苗的TCID50值的比例为1∶1到1∶0。

4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述猪伪狂犬疫苗的基因组序列与NCBI参考号NC_006151的核苷酸序列具有至少80％的同源性。

5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中所述猪伪狂犬疫苗的基因组序列中的一个或多个基因失活，所述基因选自下组：TK、PK、RR、dUTPase、gG、gC、gE、gD和gI。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中所述猪伪狂犬疫苗的基因组序列中的gE基因失活。

7.根据权利要求1-6任一所述的疫苗组合物，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗含有Nsp1核苷酸序列，所述序列的编码序列与SEQ ID NO：1具有至少90％的同源性。

8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗进一步含有Nsp2核苷酸序列，所述Nsp2核苷酸的编码序列与SEQ ID NO：2具有至少90％的同源性。

9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗含有由SEQ ID NO：1编码的Nsp1核苷酸序列，且含有由SEQ ID NO：2编码的Nsp2核苷酸序列。

10.根据权利要求1-6任一所述的疫苗组合物，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗含有猪繁殖与呼吸综合征病毒的核苷酸序列，该序列的编码序列与SEQ ID NO：3其有至少90％的同源性。

11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗含有猪繁殖与呼吸综合征病毒的核苷酸序列，该序列由SEQ ID NO：3编码。

12.根据权利要求1或2所述的疫苗组合物，其进一步含有佐剂。

13.根据权利要求1或2所述的疫苗组合物，其进一步含有冻干保护剂。

14.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其中所述冻干保护剂含有蔗糖、L-谷氨酸钠、或水解乳蛋白。

15.一种制备权利要求1或2所述的疫苗组合物的方法，包括：

(1)将猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株和猪伪狂犬病病毒弱毒株分别接种于各自的易感细胞，并培养所述接种后的易感细胞；

(2)收获并混合所述步骤(1)得到的细胞培养物中的病毒。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的易感细胞为Marc-145细胞系、MA-104细胞系、Vero细胞系、CL-2621细胞系等传代细胞系或PAM细胞等原代细胞。

17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述猪伪狂犬疫苗的易感细胞为ST细胞、PK-15细胞、Marc-145细胞、MDBK细胞、BT细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、猪肾传代细胞(IBRS-2)、兔肾传代细胞(RK)、鸡胚成纤维细胞、或猪肾原代细胞。

18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的细胞培养方法为以下任意一种：在转瓶中培养，使其细胞密度达到：5×10⁷/ml-1×10⁸/ml；或者在生物反应器中添加附着载体进行悬浮培养，使其细胞密度达到5×10⁸/ml-1×10⁹/ml。

19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗接种的感染剂量(MOI)为0.01-0.5。

20.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的猪伪狂犬疫苗接种的感染剂量(MOI)为0.005-0.5。

21.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：步骤(2)包括收获步骤(1)得到的细胞培养液，测定病毒TCID50，以及混合所述细胞培养液使得猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗与猪伪狂犬疫苗的TCID50值的比例为1∶1到1∶10。

22.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括：将步骤(2)中得到的混合的病毒与冻干保护剂混合。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：所述混合的病毒的体积约为6-8份，所述冻干保护剂的体积为2-4份。

24.根据权利要求14-23任何一项制备方法得到的疫苗组合物，其含有猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗和猪伪狂犬疫苗。

25.权利要求1所述的疫苗组合物在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征与猪伪狂犬病的生物制品中的用途。

26.一种免疫猪的方法，包括对猪施用权利要求1或2所述的疫苗组合物。

27.一种猪伪狂犬疫苗，其是在Marc-145细胞、MDBK细胞、BT细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、猪肾传代细胞(IBRS-2)、兔肾传代细胞(RK)、鸡胚成纤维细胞、或猪肾原代细胞中培养得到。

28.一种细胞用于培养猪伪狂犬疫苗的用途，所述细胞选自：Marc-145细胞、MDBK细胞、BT细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、猪肾传代细胞(IBRS-2)、兔肾传代细胞(RK)、鸡胚成纤维细胞、和猪肾原代细胞。