CN104250638B

CN104250638B - 猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104250638B
Application number: CN201410133403.3A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 谭菲菲; 田克恭
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2014-04-03
Filing date: 2014-04-03
Publication date: 2017-01-25
Anticipated expiration: 2034-04-03
Also published as: CN104250638A

Abstract

本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，该猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株是将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的Nsp9基因、Nsp10基因分别置换为经典猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株的Nsp9基因、Nsp10基因，重组成一个新的嵌合病毒。该猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株可以进一步含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株的GP5基因。本发明还公开了含该弱毒株的疫苗组合物及其在制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。该弱毒株克服了人工传代致弱疫苗的安全性问题；该弱毒株制备的疫苗组合物既可用于预防普通的猪繁殖与呼吸综合征，又能预防高致病性的猪繁殖与呼吸综合征。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及利用反向遗传技术构建猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV）所引起的猪的一种高度传染病，以母猪发热、厌食、早期流产、死胎、木乃伊胎、产弱仔等繁殖障碍及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为主要特征（殷震，刘景华.动物病毒学.第2版.北京：科学出版社.1997）。同时，PRRSV可引起动物机体发生免疫抑制，进而继发多种病原的感染。

该疾病首先于1987年在美国被发现，随后在欧洲发现，二十世纪九十年代早期在亚洲被鉴定。通过对全球不同地域分离的PRRSV进行系统进化分析，发现PRRSV主要存在两种基因型：I型（欧洲型），以荷兰分离到的Lelystad病毒（LV株）为代表；II型（美洲型），以美国分离到的VR2332株为代表。

1996年，国际病毒学分类委员会（International committee on taxonomy ofvirus,ICTV）在世界病毒学大会上正式将猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV、马动脉炎病毒（equine arteritis virus,EAV）、鼠乳酸脱氢酶病毒（lactate dehydrogenase elevatingvirus,LDV）、猴出血热病毒（simian haemorrhagic fever virus,SHFV）都归到新建立的动脉炎病毒科（Arteriviridae）中，并将动脉炎病毒科归到套式病毒目（Nidovirales）中（Cavanagh D.Nidovirales:a new order comprising Coronaviridae andArteriviridae.Archives of virology,1997,142(3):629-633;Gonzalez JM,Gomez-Puertas P,Cavanagh D,et al.A comparative sequence analysis to revise thecurrent taxonomy of the family Coronaviridae.Archives of virology,2003,148(11):2207-2235）。

PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约15.0kb，由结构蛋白编码区、非结构蛋白编码区、5'非编码区（5'UTR）和3'端非编码区（3'UTR）组成，其中5'UTR上游为帽子结构，3'UTR下游为Poly(A)尾，包含9个开放阅读框（Open reading frame,ORF），分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7，分别编码pp1a、pp1ab、GP2a、GP2b（又称E）、GP3、GP4、GP5、M、N蛋白（Snijder EJ,Meulenberg JJ.The molecular biology ofarteriviruses.Journal of general virology,1998(79):961-979;Dea S,Gagnon CA,Mardassi H,et al.Current knowledge on the structural proteins of porcinereproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus:comparison of the NorthAmerican and European isolates.Archives of Virology,2000,145:659-688;Wu WH,Fang Y,Farwell R,et al.A10-kDa structural protein of porcine reproductive andrespiratory syndrome virus encoded by ORF2b.Virology,2001,287:183-191）。其中，pp1a和pp1ab是由ORF1通过核糖体移码机制编码产生的两个多聚蛋白，由经ORF1a编码产生的三种蛋白酶切割产生12种非结构蛋白，分别为：为Nsp1α、Nsp1β、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7α、Nsp7β、Nsp8、Nsp9（RNA依赖的RNA聚合酶）、Nsp10（解旋酶）、Nsp11（核酸内切酶）和Nsp12（Fang Y,Snijder EJ.The PRRSV replicase:exploring themultifunctionality of an intriguing set of nonstructural proteins.Virusresearch,2010,154:61-76;Charerntantanakul W.Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus vaccines:immunogenicity,efficacy and safetyaspects.World journal of virology,2012,1(1):23-30）。已有研究证实，单独Nsp9、Nsp10、Nsp11对病毒致病性以及病毒在体内的复制无影响（姜一峰,周艳君,王亚欣,等.猪繁殖和呼吸综合征病毒HuN4株Nsp9、Nsp10、Nsp11对毒力影响的研究.中国动物传染病学报,2011,19(6):1-6）。

目前，PRRS已普遍存在于世界范围内，每年都会造成巨大的经济损失，已经成为养猪业的巨大威胁。尤其是2006年在我国爆发的“猪高热综合征”（porcine high feversyndrome,PHFS）或“高致病性猪繁殖与呼吸综合征”（Highly pathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS），传播范围多达10个省，感染超过200万头猪，约40万头猪死亡的病例。经研究表明：该病的主要病原为发生遗传变异的美洲型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRS virus,HP-PRRSV）（Tian KG,Yu XL,Zhao TZ,etal.Emergence of fatal PRRSV variants:Unparalleled outbreaks of atypical PRRSin China and molecular dissection of the unique hallmark.PLoS ONE,2007,2(6):e526）。

目前，已有的PRRS商品化疫苗包括灭活疫苗和弱毒活疫苗，但灭活疫苗接种次数多，抗体产生慢，保护效果不稳定，经常导致免疫失败；不能诱导针对异源PRRS病毒株的强的免疫作用。弱毒活疫苗是将强毒株经连续传代致弱而成，需要投入大量的人力和物力，研发周期长，甚至还存在毒力返强的风险，此外，弱毒活疫苗对于不同型和变异较大的毒株之间的免疫保护也很弱。因此，迫切需要研发一种安全有效、免疫广谱的疫苗。

发明内容

本发明为了克服上述现有技术存在的问题及缺点，提供了利用基因工程手段制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株。

本发明的主要目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株是将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的Nsp9基因、Nsp10基因分别置换为经典猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株的Nsp9基因、Nsp10基因，重组而成一个新的嵌合病毒。

作为本发明的进一步改进，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株是将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株的GP5基因进一步置换为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株的GP5基因，重组而成一个新的嵌合病毒。

优选地，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株包括10FUJ-2株、JXA1株。

10FUJ-2株公开于Yu XL,Chen NH,Wang LL,et al.New genomiccharacteristics of highly pathogenic porcine reproductive and respiratorysyndrome viruses do not lead to significant changes inpathogenicity.Veterinary Microbiology,2012,158:291-299.

JXA1株，该毒株的保藏号为CGMCC No.1964，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，在中国专利CN101045917A中公开。

更优选地，所述经典猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株包括PRRS MLV株、CH-1R株。

PRRS MLV株其疫苗可以通过商业途径获得：商品名为PRRS MLV疫苗。生产商为德国勃林格殷格翰(上海)动物保健品有限公司。

CH-1R株可以通过商业途径获得：商品名为“蓝力佳”，成都天邦生物制品有限公司。

本发明的一种实施方式中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株为10FUJ-2株，所述经典猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株为PRRS MLV株或CH-1R株。

更优选地，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株包括JXA1-R株。

本发明的一种优选实施方式中，一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，其中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株是将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒10FUJ-2株的Nsp9基因、Nsp10基因分别置换为经典猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株PRRS MLV株或CH-1R株的Nsp9基因、Nsp10基因，重组而成一个新的嵌合病毒。

本发明的一种优选实施方式中，一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，其中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株是将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒10FUJ-2株的Nsp9基因、Nsp10基因分别置换为经典猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株PRRS MLV株的Nsp9基因、Nsp10基因；以及将所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株的GP5基因进一步置换为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株JXA1-R株的GP5基因，重组而成一个新的嵌合病毒。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株JXA1-R株的保藏号为CGMCC No.2467，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，在中国专利CN101307305A中公开。

本发明所用术语“高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）”可以在出现以下一种或几种临床症状的猪中检测到：皮肤发红（rubefaction）、出血点（blood spots）、瘀斑（petechiae）、红斑转白疹和小脓包（pimple），常见于耳、口、鼻、背和大腿内侧。其他常见症状可包括：高热（超过40℃）、抑郁（depression）、厌食（anorexia）、咳嗽（cough）、哮喘（asthma）、跛行（lameness）、战栗、呼吸道疾病和腹泻（diarrhea）。高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）是由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）引起的。

本发明所用术语“高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒”、“高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株”或“HP-PRRSV”是指，但不限于，具有与SEQ ID No.1基本相同的核苷酸序列的PRRSV。优选地，HP-PRRSV具有与SEQ ID No.1基本相同的核苷酸序列的PRRSV。与SEQ IDNo.1基本相同是指，PRRSV的核苷酸序列优选包含与SEQ ID No.1有85%-100%相同的序列，优选在HP-PRRSV并非本文所述PRRSV的条件下，例如与作为参考病毒分离物的VR2332相比，ORF5的核苷酸同源性低于91%，优选低于92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。HP-PRRSV核苷酸序列优选有超过80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，与SEQ ID No.1相同，同样优选在HP-PRRSV并非本文所述PRRSV的条件下，例如与作为参考病毒分离物的VR2332相比，ORF5的核苷酸同源性低于91%，优选低于92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。还更优选地，PRRSV核苷酸序列有超过90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或超过99%与SEQID No.1相同，优选在HP-PRRSV并非本文所述PRRSV的条件下，例如与作为参考病毒分离物的VR2332相比，ORF5的核苷酸同源性低于91%，优选低于92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

本发明所用术语HP-PRRSV还指任何在Nsp2蛋白中具有指定修饰的PRRSV。根据该定义，HP-PRRSV是指编码Nsp2蛋白的PRRSV，其中对应于SEQ ID No.2的氨基酸位置482的亮氨酸缺失，而且它引起高热临床症状。或者除SEQ ID No.2的氨基酸位置482的亮氨酸缺失以外，对应于SEQ ID No.2的氨基酸534-562的氨基酸也发生了缺失。在本发明中SEQ IDNo.2也应被理解为是一种举例，术语Nsp2蛋白不应限于SEQ ID No.2所示的Nsp2蛋白。根据以上教导，本领域技术人员很容易在具有与SEQ ID No.2不同的Nsp2蛋白序列、但具有相同修饰的PRRSV中鉴别出任意相应修饰，这意味着，缺失与SEQ ID No.2的482位亮氨酸对应的亮氨酸，和/或缺失与SEQ ID No.2的氨基酸534-562对应的氨基酸。

此外，本发明所用术语HP-PRRSV还指，具有与SEQ ID No.1（如上述定义）基本相同的核苷酸序列、且编码Nsp2蛋白的PRRSV，其中与SEQ ID No.2的氨基酸位置482的亮氨酸对应的氨基酸，和/或与SEQ ID No.2的氨基酸534-562对应的氨基酸在PRRSV编码的Nsp2蛋白中缺失。

此外，本发明所用术语HP-PRRSV还指，作为具有与SEQ ID No.1基本相同核苷酸序列的PRRSV的HP-PRRSV，在HP-PRRSV并非本文所述PRRSV的条件下，例如与作为参考病毒分离物的VR2332（如上述）相比，ORF5的核苷酸同源性低于91%，优选低于92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，且编码Nsp2蛋白，其中与SEQ ID No.2的氨基酸位置482的亮氨酸对应的氨基酸和/或与SEQ ID No.2的氨基酸534-562对应的氨基酸在PRRSV编码的Nsp2蛋白中缺失。

此外，本发明所用术语HP-PRRSV还指，作为具有与SEQ ID No.1基本相同核苷酸序列的PRRSV的HP-PRRSV，优选在HP-PRRSV并非本文所述PRRSV的条件下，如与作为参考病毒分离物的VR2332（如上所述）相比，ORF5的核苷酸同源性低91%，优选低于92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，且编码Nsp2蛋白，其中与针对氨基酸位置536-550、546-560或476-490的肽反应的抗体显示无反应性。

本发明所述PRRSV VR-2332株，于1992年7月7日按照布达佩斯条约的规定保藏于美国典型培养物保藏中心，Roclville，Maryland，保藏号为ATCC VR-2332。

本发明所用术语“Nsp2”指由PRRSV ORF1a编码的pp1a蛋白裂解后的非结构蛋白之一，具有高度变异性，在欧洲型毒株中的氨基酸位置为Ala386-Gly1463（共1078氨基酸），在北美型毒株中的氨基酸位置为Ala384-Gly1579（共1196氨基酸）（Fang Y,Snijder EJ.ThePRRSV replicase:exploring the multifunctionality of an intriguing set ofnonstructural proteins.Virus research,2010,154:61-76）。

此外，以下PRRSV分离物已知是HP-PRRSV。因此，术语HP-PRRSV在本文中应包括以下病毒株中的任一种，以及它们的后代：10FUJ-2、AH-1、AHCFSH、AHCFZC、BB07、BD-8、BQ07、CL07、CX07、CZ07、FY060915、FY080108、GC-2、GCH-3、GD1、GD2、GD2007、GD3、GD4、GDSD1、GDY1-2007、GDY2-2007、GDYF1、GS2008、GXHZ12、GXHZ13、GXHZ14、GXHZ16、GXHZ19、GXHZ2、GXHZ21、GXHZ4、GXLZ5、GXLZ7、GY、GZCJ、GZDJ、GZHW1、GZHW2、GZHX、GZJS、GZKB、GZKY、GZLJ1、GZWB、GZWM、GZZB、Hainan-1、Hainan-2、HB1、HB2、HB3、HB-Tsh1、HB-Xt1、HEN46、HeN-KF、HeN-LH、HeN-LY、HLJDF、HLJMZ1、HLJMZ2、HLJMZ3、HLJZY、HM-1、HN2、HN2007、HN3、HNld、HNly、HNLY01、HNNX01、HNPJ01、HNsp、HNXT1、HNyy、HNyz、HQ-5、HQ-6、HUB、HuN、HUN1、HUN11、HUN15、HUN16、HUN17、HUN2、HUN3、HUN4、HUN5、HUN6、HUN7、Hunan-1、Hunan-2、Hunan-3、HUNH2、HUNH4、HuNh1、HUNL1、HUNX4、HZ061226、HZ070105、Jiangsu-1、Jiangsu-2、Jiangsu-3、Jiangxi-2、Jiangxi-4、JLYS、JN、JX1、JX143、JX2、JX-2、JX2006、JX3、JX4、JX5、JXA1、KS06、LC07、LJ、LS06、LS-4、LY07、NB070319、SC07、SD、SD14、SDWF2、SH02、ST-7、SX2007、SY0608、TJDMJ、TJZHJ2、TJZHJ3、TQ、TQ07、TWO7、WF07、XJ07、XL2008、YN2008、YNBS、YNDL、YNMG、YNWS、YNYS、YNYX1、YNYX3、ZJ06、ZJCJ、ZJWL、ZX07、ZS070921。后代是指，但不限于，来源于上述任一种亲代病毒，且与相应的亲本病毒株有超过86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的核苷酸序列同一性的病毒。

本发明所用术语“经典猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株”或“PRRSV-经典弱毒株”是指，但不限于，包括来源于上述任一种HP-PRRSV的任何减毒病毒，如与VR2332保藏的病毒分离株或其任何后代基本相同的PRRSV；或其任何减毒病毒分离株的后代，如：VR2332保藏的病毒分离株的任何减毒后代。在一些优选形式中，PRRSV-经典弱毒株和可药用载体可以是Boehringer Ingelheim Vetmedica,Inc.（Saint Joseph,MO）的PRRS MLV疫苗（系列号JA-A64A-149）。术语PRRSV-经典弱毒株还可包括已知为如下的分离物：CH-1R、R98、PTK、CH-1a、CH-1R01、HB-2、HN1、HT06、HZ07、LS05、LY03、NH04、PL97-1、S1、SH061130、SX071226、TW07-1、WF03、XX03、ZJJ04、ZJJ05、ZJJ07，均为起源于中国的非HP-PRRSV。

本发明所用术语“高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株”或“HP-PRRSV-弱毒株”是指，但不限于，包括来源于上述任一种HP-PRRSV经传代致弱而成的疫苗用毒株，如与JXA1保藏的病毒分离株经传代致弱而成且基本相同的PRRSV疫苗株。在一些优选形式中，HP-PRRSV-弱毒株和可药用载体可以是普莱柯生物工程股份有限公司的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）、吉林正业生物制品股份有限公司的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（HuN4-F112株）或北京健翔和牧生物科技有限公司的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（TJM-92株）。

本发明所用术语“猪繁殖与呼吸综合征”与“PRRS”，“猪繁殖与呼吸综合征病毒”、“猪繁殖与呼吸综合征病毒株”与“PRRSV”，“高致病性猪繁殖与呼吸综合征”与“HP-PRRS”，“高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒”、“高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株”与“HP-PRRSV”，“经典猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株”与“PRRSV-经典弱毒株”、“高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株”与“HP-PRRSV-弱毒株”在本发明中均可互换使用。另外，本发明所用术语“PRRSV”除非另有说明，是指任何美洲型或欧洲型PRRSV。

本发明所用术语“美洲型PRRSV”是指具有与美洲型PRRSV分离株相关遗传特征的任何PRRSV，所述美洲型PRRSV分离株如但不限于20世纪90年代早期在美国分离的PRRSV（Collins JE,Benfield DA,Christianson WT,et al.Isolation of swine infertilityand respiratory syndrome virus(isolate ATCC VR-2332)in North America andexperimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs.Journal ofveterinary diagnostic investigation,1992,4:117-126）、美洲型PRRSV分离株MN-1b（Kwang J,Kim HS,Joo HS.Cloning,expression,and sequence analysis of theORF4gene of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus MN-1b.Journal of veterinary diagnostic investigation,1994,6:293-296）、PRRSVQuebec IAF-exp91株（Mardassi H,Mounir S,Dea S.Molecular analysis of theORFs3to7of porcine reproductive and respiratory syndrome virus,Quebecreference strain.Archives of virology,1995,140:1405-1418）和美洲型PRRSV分离株VR-2385（Meng XJ,Paul PS,Halbur PG.Molecular cloning and nucleotide sequencingof the3'-terminal genomic RNA of the porcine reproductive and respiratorysyndrome virus.Journal of general virology,1994,75:1795-1801）。

本发明所用术语“欧洲型PRRSV”是指具有与下述欧洲型PRRSV相关的遗传特征的任何PRRSV，所述欧洲型PRRSV是指1991年在欧洲第一次分离的（Wensvoort G,Terpstra C,Pol JMA,et al.Mystery swine disease in the Netherlands:the isolation ofLelystad virus.Veterinary quarterly,1991,13(3):121-130），在本领域中有时也称为“Lelystad病毒”。

本发明所用术语“遗传特征”是指相应毒株共享的基因组核苷酸序列相似性和氨基酸序列相似性。

本发明所用术语“猪”是指任何属于猪科（Suidae）成员的动物，如猪。

本发明所用术语“开放阅读框”或“ORF”是指编码不含插入的终止密码子的特定PRRSV蛋白质所需的最小核苷酸序列。

本发明所用术语“Nsp9”是指RNA依赖的RNA聚合酶，是由PRRSVORF1编码的pp1ab蛋白裂解后的4个非结构蛋白之一，含有685氨基酸，在欧洲型中的氨基酸位置为Ala2352-Glu3036，在美洲型中的氨基酸位置为Ala2459-Glu3143（Fang Y,Snijder EJ.The PRRSVreplicase:exploring the multifunctionality of an intriguing set ofnonstructural proteins.Virus research,2010,154:61-76）。

本发明所用术语“Nsp10”是指解旋酶，是由PRRSV ORF1b编码的pp1ab蛋白裂解后的4个非结构蛋白之一，在欧洲型中氨基酸的位置为Gly3037-Glu3478（共442氨基酸），在美洲型中氨基酸的位置为Gly3144-Glu3584（共441氨基酸）（Fang Y,Snijder EJ.The PRRSVreplicase:exploring the multifunctionality of an intriguing set ofnonstructural proteins.Virus research,2010,154:61-76）。

本发明所用术语“减毒”是指：经遗传修饰的PRRSV与未经修饰的亲本株相比毒力减弱。如果病毒株的一种或多种确定疾病严重性的参数在统计学上显示显著性降低，则其“毒性更小”。这类参数可包括病毒血症水平、发烧、呼吸性窘迫严重性、生殖症状严重性或肺损伤的严重性等。

除非另有说明，本发明所用术语“经遗传修饰”是指通过人工改造的遗传突变。

本发明所用术语“反向遗传技术”又称“反向遗传操作技术”（Reverse geneticsmanipulation technique），是指在体外通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项研究技术（Neumann G,Whitt MA,Kawaoka Y.Adecade after the generation of a negative-sense RNA virus from cloned cDNA-what have we learned?Journal of general virology,2002,83(11):2635-2662），也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因敲除（缺失）、基因插入、基因置换和基因互补（即构建嵌合病毒）等改造，解决了对RNA病毒基因组难以操作这一难题，极大地方便了人们进行病毒各基因的功能、致病机理和病毒病防治策略的研究，同时为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路（Huang Z,Elankumaran S,Panda A,et al.Recombinant Newcastledisease virus as a vaccine vector.Poultry science,2003,83(6):899-906）。

本发明所用术语“突变”是指将一个氨基酸替换为另一个，或将编码核苷酸替换为另一个（如“C”替换为“T”），即所谓的“取代”，优选以编码的氨基酸被该改变的形式进行，或指任何其它突变，如“缺失”或“插入”。突变通常在编码核苷酸序列中进行。

可使用本领域常规技术人员已知的重组技术对多核苷酸分子进行遗传修饰，包括本领域已知的通过定向突变，或通过随机突变（如通过暴露于化学诱变剂或辐射中），还可通过本领域已知的标准方法完成，如对所述的感染性克隆（如Meulenberg JJ,Bos-deRuijter JN,Wensvoort G,et al.An infection cDNA clone of porcine reproductiveand respiratory syndrome virus.Advances in experimental medicine biology,1998,440:199-206）进行定向诱变（如Sambrook J,Russell DW.Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,2001）。

本发明所用术语“相同”或“同一性”又称“同源性”，是指描述两个或更多个多肽或核苷酸序列时，可以表示这些序列在特定区域具有特定百分比的相同残基或核苷酸。所述百分比可以如下计算：优选地比对这两个序列，比较这两个序列的所述特定区域，确定这两个序列中出现相同残基的位置的数量，以此得到匹配位置数，将该匹配位置数除以该特定区域的位置总数，将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。当这两个序列长度不同或比对时出现一个或多个错开的末端，以及所比较的该特定区域仅包括单个序列时，将单个序列的残基包括在该计算公式的分母而非分子中。

本发明所用术语“疫苗组合物”又叫“致免疫组合物”，表示一种包含减毒的HP-PRRSV或PRSSV-经典弱毒株（或其灭活病毒），或两者的任何重组毒株，或两者任何免疫原性片段或组分的组合物，优选为猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，其在宿主中激发“免疫应答”，是抗PRRSV的细胞免疫应答和/或抗体介导的免疫应答。

本发明所用术语“激发免疫学应答”或“免疫应答”是指针对致免疫组合物或疫苗组合物的任何细胞免疫应答和/或抗体介导的免疫应答，所述疫苗组合物或致免疫组合物被施用给接受该疫苗组合物或致免疫组合物的动物。通常，“免疫应答”包括但不限于下列一或多种效应：产生或激活抗体、B细胞、T辅助细胞、T抑制细胞、和/或细胞毒T细胞、和/或yd T细胞，它们特异性针对目标组合物或疫苗中所含的一或多种抗原。优选地，宿主表现出治疗性或保护性免疫学应答，从而与未接受所述致免疫组合物或疫苗的对照相比，增强对新感染的抵抗力，和/或减弱疾病的临床严重程度。这样的保护作用通过上述与宿主感染有关的症状的发生率减少、或严重程度减弱、或直至症状消失来证实。

本发明所用术语“保护”或“保护作用”是指，因被施用本发明的疫苗组合物，使HP-PRRS或PRRS感染的临床症状的严重程度减弱或发生率减少。所述严重程度的减弱或发生率的减少，是指与一个或多个未接受本发明疫苗组合物的动物相比。

本发明所用术语“基本相同”可表示SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，在有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内，有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%相同，或从核酸的角度分析，与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的互补序列基本互补。

本发明的另一目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株以及药学上可以接受的载体。

优选地，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株含量为≥10^5.0TCID₅₀/头份。

本发明的再一目的在于提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：（1）培养增殖所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株；以及（2）收获所述培养增殖的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，加入药学上可以接受的载体。

本发明的还一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。

优选地，所述猪繁殖与呼吸综合征是由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或经典猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起。

基于此，本发明具有以下突出的优点：

（1）本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株遗传背景清楚；且不会出现毒力返强，这可克服人工传代致弱疫苗安全性的问题。

（2）由于本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株中既有弱毒株的部分抗原基因，又有高致病性毒株的部分抗原基因，该弱毒株既可用于预防普通的猪繁殖与呼吸综合征，又能预防高致病性的猪繁殖与呼吸综合征。

（3）相对于病毒在连续传代致弱需要的更长时间来说，基因工程疫苗的构建过程所花费的时间要短得多。

附图说明

图1为亲本病毒10FuJ-2株和拯救病毒vBSMN-FuJ株的多步生长曲线。

序列表中：

序列1为HP-PRRSV JX143株的全部核苷酸序列；

序列2为PRRSV VR2332株Nsp2的氨基酸序列；

序列3为PRRSV-经典弱毒株MLV Nsp9的核苷酸序列；

序列4为PRRSV-经典弱毒株MLV Nsp10的核苷酸序列；

序列5为PRRSV-经典弱毒株CH-1R Nsp9的核苷酸序列；

序列6为PRRSV-经典弱毒株CH-1R Nsp10的核苷酸序列；

序列7为HP-PRRSV-弱毒株JXA1-R株GP5的核苷酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本实施例中所用HP-PRRSV（10FUJ-2株）全序列在NCBI中的登录号为JQ663547；所用PRRSV-经典弱毒株（PRRS MLV株）的基因序列在NCBI中的登录号为AF159149，所用PRRSV-经典弱毒株（CH-1R株）的基因序列在NCBI中的登录号为EU807840；所用HP-PRRSV-弱毒株（JXA1-R株）GP5的基因序列在NCBI中的登录号为KC422725，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

以下实施例中以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株10FUJ-2株、JXA1株，经典猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株PRRS MLV株、CH-1R株、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株JXA1-R株说明本发明。

实施例中所用的攻毒毒株为中国分离株JXA1株，该毒株的保藏号为CGMCCNo.1964，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，在中国专利CN101045917中公开。

下述实施例中所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1HP-PRRSV10FUJ-2株感染性分子克隆的构建及生物学特性研究

1.1HP-PRRSV10FUJ-2株感染性分子克隆的构建

1.1.1pBluescript II KS(+)载体的改造

根据对10FuJ-2全基因组序列的酶切位点分析，将pBluescript II KS(+)的多克隆位点区进行改造，以便于后续的全长cDNA拼接。改造后的多克隆位点区的酶切位点依次为：MluI-SfiI-XhoI-BamHI-BglII-NotI。改造好的载体经NotI酶切鉴定正确后送Invitrogen测序，验证改造后的多克隆位点区的正确性。改造后的载体命名为pBSMN。

1.1.2引物设计与合成

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中报道的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒10FUJ-2株（登录号：JQ663547）基因组全序列，用Primer Premier5.0软件设计了5对扩增PRRSV10FUJ-2株全基因组cDNA各个片段的引物（见表1）。其中引物SF1中引入了MluI酶切位点和T7启动子，引物SR15347中引入了NotI酶切位点。

表1PRRSV10FUJ-2株全基因组cDNA各个片段的引物

1.1.3HP-PRRSV10FUJ-2株基因组各片段的扩增、鉴定及纯化

将HP-PRRSV10FUJ-2株病毒接种于Marc-145细胞，48h后待约70%细胞出现病变时，收获病毒培养上清，按照RNA提取试剂盒Rneasy Mini Kit（QINGEN公司）的操作说明提取PRRSV10FUJ-2株病毒RNA。提出后的总RNA可立即用于反转录反应或-80℃冻存备用。

参照Superscipt III reverse transcriptase（Life technology公司）产品说明书，以每个片段的下游引物（表1）为反转录引物，合成cDNA第一链，并将合成后的cDNA保存于-20℃备用。

HP-PRRSV10FUJ-2株的各片段PCR扩增参照PfuUltra II Fusion HS DNAPolymerase（Stratagene公司）产品说明书进行。各个PCR反应循环参数的设定根据各对引物和PCR扩增片段长度的不同而不同。并对PCR扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，结果表明扩增后的各基因片段与预期大小相符，初步说明成功地扩增出10FUJ-2株基因组的各片段，扩增的各个片段依次命名为A、B、C、D、E。

采用OMEGA公司的E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit对PCR扩增产物进行纯化，按照操作说明书进行，将纯化后的产物放置于-20℃备用。

1.1.4HP-PRRSV10FUJ-2株基因组全长cDNA连接及鉴定

将实施例1.1.3纯化后的PCR产物通过相应的酶切位点分别连接到改造后的载体pBSMN，从载体上酶切片段利于后续的连接，各片段连入载体的顺序为：E-D-C-B-A。首先将片段E和载体pBSMN分别用BglII和NotI酶切后连接，连接产物命名为pBSMN-E；片段D和载体pBSMN用BamHI和BglII双酶切后连接，产物命名为pBSMN-D；片段C和载体pBSMN用XhoI和BamHI双酶切后连接，产物命名为pBSMN-C；片段B和载体pBSMN用SfiI和XhoI双酶切后连接，产物命名为pBSMN-B；片段A和载体pBSMN用MluI和SfiI双酶切后连接，产物命名为pBSMN-A。从pBSMN-D上用BamHI和BglII双酶切下片段D连入pBSMN-E，命名为pBSMN-ED。其余的片段按照C-B-A的顺序依次连入pBSMN-ED，最后获得的包含全长cDNA的质粒命名为pBSMN-FuJ。

用DNA Star中SeqBuilder软件分析pBSMN-FuJ全长质粒经酶切后各片段的大小，用限制性内切酶BamHI进行酶切鉴定，并测序，鉴定结果表明：HP-PRRSV10FUJ-2株基因组全长cDNA已经连入pBSMN载体，测序后的序列与NCBI公布的10FUJ-2全基因组序列完全一致。说明HP-PRRSV10FUJ-2全长cDNA克隆构建成功。

1.1.5病毒拯救

利用3'末端Poly(A)尾引入的NotI酶切位点将包含全长cDNA的质粒进行线性化，用QIAquick PCR purification Kit（QIAGEN）回收线性化产物。根据体外转录试剂盒T7mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit（Ambion）的说明书进行操作。线性化后进行RNA电泳鉴定体外转录出的RNA的浓度。

Marc-145细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍，将2μL的RNA和2μL的DMRIE-C转染试剂在1mL的Opti-MEM中振荡混匀，然后加入六孔板的一个孔中，37℃温育6h后将上清吸除，PBS洗两遍后加入维持液（2％FBS的DMEM）培养基，37℃、5％CO₂培养箱中培养（Zhou YJ,Hao XF,Tian ZJ,et al.Highly virulent porcinereproductive and respiratory syndrome virus emerged in China.Transboundaryand emerging diseases,2008,55(3-4):152-164;Zhang SR,Zhou YJ,Jiang YF,etal.Generation of an infection clone of HuN4-F112an attenutated live vaccinestrain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus.Virologyjournal,2011,8:410）。

转染后每天观察细胞状态变化，结果显示：pBSMN-FuJ在转染后第96h出现轻微的细胞病变（CPE），转染后第104h细胞病变更加严重，说明pBSMN-FuJ病毒拯救成功，拯救病毒命名为vBSMN-FuJ。

1.1.6拯救病毒的鉴定

将转染上清在Marc-145细胞上连传3代后，分别提取亲本病毒和拯救病毒感染后的上清进行RT-PCR鉴定，用PRRSV特异的引物进行检测，扩增的序列克隆后测序表明是PRRSV特异的序列。同时将亲本病毒和传代的P3代病毒vBSMN-FuJ分别感染长满单层的Marc-145细胞，待有轻微细胞病变出现时固定细胞进行间接免疫荧光鉴定，所用抗体为PRRSV N蛋白特异的单抗。结果亲本病毒10FuJ-2和拯救病毒vBSMN-FuJ均观察到了特异的荧光。

1.1.7拯救病毒的生物学分析

在Marc-145细胞上分别测定亲本病毒10FuJ-2和拯救病毒vBSMN-FuJ的滴度。分别将10^-3-10^-9连续稀释的病毒感染96孔板中长满单层的Marc-145细胞，每24h观察细胞病变，记录出现病变的孔数，用Reed-Muench法计算TCID₅₀，并根据公式PFUs=0.7TCID₅₀的滴度将病毒滴度换算成PFU/mL。

分别用0.01M.O.I的亲本病毒10FuJ-2和拯救病毒vBSMN-FuJ感染Marc-145细胞，分别在感染后6、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120h收取200μL细胞上清，同时补充培养基，收取的上清在-70℃冻存。每个时间点收获的病毒上清按照上述方法测定病毒滴度，并根据病毒滴度绘制亲本病毒和拯救病毒的多步生长曲线（见图1）。可以看出，拯救病毒与亲本病毒的生长特性差异不大。

实施例2猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株（10FUJ-2-MLV）的构建及鉴定

2.1猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株（10FUJ-2-MLV）的构建

2.1.1引物设计与合成

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中报道的PRRS MLV株（登录号：AF159149）中非结构蛋白Nsp9、Nsp10的基因序列（依次见序列表SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4），合成包含Nsp9和Nsp10的基因序列。在TAKARA公司合成MLV基因组7591-9382bp这段序列（其中7601-7612bp位置为10FuJ-2和MLV共有的单酶切位点BstXI，7591-7600bp之间序列替换为10FuJ-2对应位置的序列；9366-9372bp位置为10FuJ-2和MLV共有的单酶切位点BamHI，9373-9382bp之间序列为10FuJ-2对应位置的序列），合成基因命名为MLV-C。合成MLV基因组9357-11220bp这段序列（其中9366-9372bp位置为10FuJ-2和MLV共有的单酶切位点BamHI，9357-9365bp之间序列替换为10FuJ-2对应位置的序列；11210-11215bp位置为10FuJ-2和MLV共有的单酶切位点BspEI，11216-11220bp之间序列为10FuJ-2对应位置的序列），合成基因命名为MLV-D。

2.1.210FUJ-2-MLV的构建

因为Nsp9和Nsp10跨了C段和D段两部分，所以分两段合成MLV的Nsp9和Nsp10序列，分别替换pBSMN-C和pBSMN-D中的包含Nsp9和Nsp10的部分。将2.1.1中合成的MLV-C和pBSMN-C分别用BstXI和BamHI双酶切后连接，用MLV的Nsp9/Nsp10前半部分序列替换pBSMN-C中10FuJ-2的相应部分，产物命名为pBSMN-MLV-C。同样，将将2.1.1中合成的MLV-D和pBSMN-D分别用BamHI和BspEI双酶切后连接，用MLV的Nsp9/Nsp10后半部分序列替换pBSMN-D中10FuJ-2的相应部分，产物命名为pBSMN-MLV-D。

按照1.1.3中的连接策略首先将pBSMN-MLV-D用BamHI和BglII双酶切后连入经同样双酶切的质粒pBSMN-E，命名为pBSMN-E-MLVD，再将pBSMN-MLV-C用XhoI和BamHI双酶切后连入经同样双酶切的质粒pBSMN-E-MLVD，命名为pBSMN-E-MLVD。再依次连入其余的片段B、A。构建好的全长质粒命名为p10FuJ-MLV。

2.1.3病毒拯救

按QIAGEN公司的质粒小提试剂盒方法提取Nsp9/Nsp10替换后的全长质粒p10FuJ-MLV，参照实施例1的1.1部分进行全长质粒的线性化和体外转录。按照1.1.4的方法进行转染和病毒拯救，转染后出现明显的细胞病变，说明重组病毒拯救成功，拯救出的病毒命名为v10FuJ-MLV。

2.2拯救病毒的鉴定

2.2.1基因鉴定

对重组病毒v10FuJ-MLV提取病毒上清RNA，经RT-PCR鉴定，扩增包含Nsp9和Nsp10的片段，送Invitrogen公司测序，结果表明重组病毒v10FuJ-MLV中的Nsp9和Nsp10的序列为MLV的序列，说明Nsp9-Nsp10片段替换成功。

2.2.2间接免疫荧光鉴定

参考实施例1.1.6的方法进行间接免疫荧光鉴定，表明拯救重组病毒v10FuJ-MLV能被PRRSV阳性血清识别。

实施例3猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株（10FUJ-2-CH-1R）的构建及鉴定

3.1猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株（10FUJ-2-CH-1R）的构建

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中报道的CH-1R株（登录号：EU807840）中非结构蛋白Nsp9、Nsp10的基因序列（依次见序列表SEQ ID No.5、SEQ ID No.6），按照实施例2.1的方法构建质粒并拯救病毒，将拯救后的病毒命名为v10FuJ-CH-1R。

3.2拯救病毒的鉴定

3.2.1基因鉴定

对重组病毒v10FuJ-CH-1R提取病毒上清RNA，经RT-PCR鉴定，扩增包含Nsp9和Nsp10的片段，送Invitrogen公司测序，结果表明重组病毒v10FuJ-CH-1R中的Nsp9和Nsp10的序列为CH-1R的序列，说明Nsp9-Nsp10片段替换成功。

3.2.2间接免疫荧光鉴定

参考实施例1.1.6的方法进行间接免疫荧光鉴定，表明拯救重组病毒v10FuJ-CH-1R能被PRRSV阳性血清识别。

实施例4猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株（10FUJ-2-MLV-JXA1-R）的构建及鉴定

4.1猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株（10FUJ-2-MLV-JXA1-R）的构建

4.1.1JXA1-R株GP5基因合成

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中报道的PRRSV-高致病性疫苗株JXA1-R株（登录号：KC422725）中GP5蛋白的基因序列（见序列表SEQ ID No.7）合成包含JXA1-R GP5序列在内的一段序列，用于替换重组病毒10FUJ-2-MLV中的10FuJ-2的GP5序列。在TAKARA公司合成JXA1-R的13553-14305bp这段序列（其中13558-13563bp位置为10FuJ-2和JXA1-R共有的单酶切位点AflIII，13553-13557bp之间为10FuJ-2对应位置的序列；14296-14301位置为10FuJ-2和JXA1-R共有的单酶切位点XbaI，14302-14305bp之间为10FuJ-2对应位置的序列）。合成基因命名为JXA1-R-GP5。

4.1.210FUJ-2-MLV-JXA1-R的构建

将4.1.1中合成的基因JXA1-R-GP5用AflIII和XbaI双酶切后，连入经同样双酶切的pBSMN-E质粒，用JXA1-R的GP5替换10FuJ-2的GP5，产物命名为pBSMN-JXA1E。

按照1.1.3中的连接策略首先将pBSMN-MLV-D用BamHI和BglII双酶切后连入经同样双酶切的质粒pBSMN-E-JXA1E，命名为pBSMN-JXA1E-MLVD，再将pBSMN-MLV-C用XhoI和BamHI双酶切后连入经同样双酶切的质粒pBSMN-JXA1E-MLVD，命名为pBSMN-JXA1E-MLVD。再依次连入其余的片段B、A。构建好的全长质粒命名为pFuJ-MLV-JXA1-R。

4.1.3病毒拯救

按QIAGEN公司的质粒小提试剂盒方法提取Nsp9/Nsp10、GP5替换后的全长质粒pFuJ-MLV-JXA1-R，参照实施例1的1.1部分进行全长质粒的线性化和体外转录。按照1.1.5的方法进行转染和病毒拯救，转染后出现明显的细胞病变，说明重组病毒拯救成功，拯救出的病毒命名为v10FuJ-MLV-JXA1-R。

4.2拯救病毒的鉴定

4.2.1基因鉴定

对重组病毒vFuJ-MLV-JXA1-R提取病毒上清RNA，经RT-PCR鉴定，扩增的GP5片段送Invitrogen公司测序，结果表明：重组病毒vFuJ-MLV-JXA1-R中GP5的序列为JXA1-R的序列，说明GP5片段替换成功。

4.2.2间接免疫荧光鉴定

参考实施例1.1.6的方法进行间接免疫荧光鉴定，表明拯救重组病毒vFuJ-MLV-JXA1-R能被PRRSV阳性血清识别。

实施例5猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株（10FUJ-2-CH-1R-JXA1-R）的构建及鉴定

5.1猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株（10FUJ-2-CH-1R-JXA1-R）的构建

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中报道的PRRSV-高致病性疫苗株JXA1-R株（登录号：KC422725）中GP5蛋白的基因序列（见序列表SEQ ID No.7），按照实施例4.1的方法构建质粒并拯救病毒，将拯救后的病毒命名为v10FuJ-CH-1R-JXA1-R。

5.2拯救病毒的鉴定

5.2.1基因鉴定

对重组病毒v10FuJ-CH-1R-JXA1-R提取病毒上清RNA，经RT-PCR鉴定，扩增的GP5片段送Invitrogen公司测序，结果表明：重组病毒v10FuJ-CH-1R-JXA1-R中GP5的序列为JXA1-R的序列，说明GP5片段替换成功。

4.2.2间接免疫荧光鉴定

参考实施例1.1.6的方法进行间接免疫荧光鉴定，表明拯救重组病毒v10FuJ-CH-1R-JXA1-R能被PRRSV阳性血清识别。

实施例6猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株病毒含量的测定

将构建的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株v10FUJ-MLV、v10FUJ-CH-1R、v10FUJ-MLV-JXA1-R、v10FUJ-CH-1R-JXA1-R，按10%（V/V）分别接种已长成单层的Marc-145细胞，37℃吸附1h后，加入细胞维持液继续培养，待70%细胞出现病变时，将细胞于-40℃反复冻融2次后分装，于-70℃冻存，作为F1代。取四种病毒的F1代在Marc-145细胞上继续传代至F20代，分别测定各重组毒株F1、F5、F10、F15、F20代病毒的TCID₅₀。测定结果（见表2）表明：四种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株繁殖特性均稳定；在Marc-145细胞上传代20代，病毒含量均≥10^7.0TCID₅₀/mL。

表2四种猪繁殖与呼吸综合征拯救病毒各代次病毒TCID₅₀的测定结果

实施例7猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合物的制备

所述的猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合物（见表3）是由实施例2-5的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株按生产活疫苗的方法制备而成，制备过程如下：

（1）制苗用细胞的传代与培养：将Marc-145细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层用于继续传代或接种病毒；

（2）细胞毒种的繁殖：将猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株病毒液按0.5MOI接入已经生长良好细胞单层的细胞瓶，吸附1h后加入细胞维持液，继续培养，当70%细胞出现病变后收获，收获的毒液冻融2次后置-70℃以下保存，取少量做半成品检验；

（3）配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液与常规稳定剂按1:1（V/V）的比例在一容器内混合，充分摇匀后定量分装，每头份含细胞毒液不少于10^5.0TCID₅₀，分装后迅速进行冷冻干燥即得成品。

表3猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合物详情

实施例8猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合物的安全性试验

选取20头PRRSV、猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）、猪瘟病毒（Classicalswine fever virus，CSFV）抗体阴性，PRRSV抗原阴性的30日龄仔猪，随机分为4组，5头/组，分栏饲养。各实验组仔猪肌肉注射实施例7制备的疫苗组合物，10头份/头，注射后每天观察、记录仔猪精神状态及体温。28天后剖杀全部试验猪，观察大体病变，并采集肺、肾、脾、腹股沟淋巴结病料冷冻保存，进行组织病理学检查。试验结果（见表4）表明：除疫苗1组、疫苗2组中有2头猪注射疫苗后第3-4天出现厌食之后转为正常外，其余仔猪均无不良反应；28天后解剖，各脏器无可见病变，将各淋巴结病料进行组织病理学观察，未见病理变化。

表4猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合物的安全性试验结果

注：高致病性猪繁殖与呼吸综合征发病的判断标准包括：

（1）至少3日体温在41℃以上；或出现精神食欲下降，眼结膜炎，咳嗽、喘等呼吸道症状；

（2）大体剖检，肺部出现片状实变。符合以上2条，判为发病。

实施例9猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合物的效力试验

9.1PRRSV VR2332株攻毒试验

选取25头PRRSV、猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）、猪瘟病毒（Classicalswine fever virus，CSFV）抗体阴性，PRRSV抗原阴性的30日龄仔猪，随机分为5组，5头/组，分栏饲养。各实验组仔猪肌肉注射实施例7制备的疫苗组合物进行免疫，1头份/头，免疫详情见表5。28天后，连同对照组5头，使用PRRSV VR2332株进行攻毒，颈部肌肉注射2mL/头。每天测温，观察临床症状，14天时进行IFA抗原检测，28天宰杀后解剖观测其肺脏及其他器官的变化。

试验结果（见表5）显示：免疫组仔猪均未发病，体温均未升高，无死亡现象，剖检无病理变化；对照猪5/5发病，3/5死亡。这一结果表明：用猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株制备的猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合物免疫仔猪后均可产生良好的保护效果。

表5猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合物的效力试验结果

注：猪繁殖与呼吸综合征发病的判断标准包括：

（1）临床症状：仔猪体温升高（≥40℃），至少持续4日；食欲减退，明显呼吸道症状。

（2）病例变化：剖检观察，仔猪肺部组织呈红褐色花斑状，不塌陷；淋巴结中度到重度肿大；个别猪的脾脏头部明显肿大，切面红髓增生。肺泡膈不均匀增宽，可见肿大、增生的毛细血管内皮细胞、巨噬细胞和浸润的淋巴细胞。

（3）抗原检测：用IFA方法检测肺脏、脾脏和淋巴结，应检测到大量的PRRSV抗原。

符合（1）、（2）、（3）中的任2条，即可判为发病。

9.2HP-PRRSV JXA1株攻毒试验

选取25头PRRSV、猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）、猪瘟病毒（Classicalswine fever virus，CSFV）抗体阴性，PRRSV抗原阴性的30日龄仔猪，随机分为5组，5头/组，分栏饲养。各实验组仔猪肌肉注射实施例7制备的疫苗组合物进行免疫，1头份/头，免疫详情见表6。28天后，连同对照组5头，使用HP-PRRSV JXA1株进行攻毒，颈部肌肉注射2mL/头。每天测温，观察临床症状，28天宰杀后解剖观测其肺脏及其他器官的变化。

试验结果（见表6）显示：免疫组仔猪均未发病，无高热现象，无死亡现象，剖检无病理变化；对照猪5/5发病，4/5死亡。这一结果表明：用猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株制备的猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合物免疫仔猪后均可产生良好的保护效果。

表6猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合物的效力试验结果

注：猪繁殖与呼吸综合征发病的判断标准包括：

（2）大体剖检，肺部出现片状实变。

符合以上2条，判为发病。

实施例10以HP-PRRSV JXA1株为亲本毒株构建猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株

以HP-PRRSV JXA1株为亲本毒株参照实施例1进行感染性分子克隆的构建，并参照实施例2构建Nsp9和Nsp10为MLV的Nsp9和Nsp10的嵌合弱毒株，并参照实施例2和实施例4构建Nsp9和Nsp10为MLV的Nsp9和Nsp10以及GP5为JXA1-R株的GP5的嵌合弱毒株；参照实施例8进行安全性试验，以10头份/头攻毒结果临床观察体温均不高于39.5℃，无不良反应，没有发病和死亡，组织剖检也无可见病变。参照实施例10进行效力试验，结果显示能保护PRRSVVR2332株以及HP-PRRSV JXA1株的攻击，均无死亡发热和病变

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株是将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的Nsp9基因、Nsp10基因分别置换为经典猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株的Nsp9基因、Nsp10基因，重组而成一个新的嵌合病毒。

2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株的GP5基因进一步置换为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株的GP5基因，重组而成一个新的嵌合病毒。

3.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，其中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株包括10FUJ-2株、JXA1株。

4.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，其中，所述经典猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株包括PRRSMLV株、CH-1R株。

5.根据权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，其中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株包括JXA1-R株。

6.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1～5任一项所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株以及药学上可以接受的载体。

7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株含量为≥10^5.0TCID₅₀/头份。

8.一种制备权利要求6～7任一项所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：

(1)培养增殖权利要求1～5任一项所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株；以及

(2)收获所述培养增殖的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，加入药学上可以接受的载体。

9.根据权利要求6～7任一项所述的疫苗组合物在制备预防猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述猪繁殖与呼吸综合征是由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或经典猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起。