CN116036253B - 一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗及其制备方法，所述活疫苗通过将猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株的N蛋白基因替换为Betaarterivirus属病毒的N蛋白基因得到；所述猪繁殖与呼吸综合征病毒株2型毒株为SC2012株，所述Betaarterivirus属病毒为Betaarterivirus chinrav 1，Betaarterivirus ninra，Betaarterivirus sheoin，Betaarterivirus suid 1，Betaarterivirus timiclar中的一种；制备方法包括以下工艺步骤：1)选取毒株PRRSV SC2012株F80代构建包含其基因组序列的感染性克隆载体；2)合成Betaarterivirus属病毒的N蛋白基因并替换掉PRRSV SC2012株的N蛋白基因，使用感染性克隆载体拯救出含有特殊标记的重组病毒。本发明使得构建后获得的载体具有特殊的标记位，能够解决现有技术中疫苗均不能与流行毒株感染进行有效区分的技术问题，对PRRSV的防控和净化具有重要的临床价值。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗及其制备方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 （ Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV）引起的以猪群发生繁殖障碍和呼吸道症状为主的一种急性、高度传染性的病毒性重大传染病。根据基因组序列和抗原特征的差异，PRRSV分为PRRSV1（以 lelystad virus 毒株为代表）和 PRRSV2（以 VR-2332 株为代表）两个不同的血清型。
目前国内主要以PRRSV2为主，而PRRSV2根据其基因特征可以分为9个谱系，全国范围内存在着谱系 1（亚系 1.5 和 1.8）、3、5（亚系 5.1）、8（亚系 8.7）和 9等5个谱系的流行。针对PRRSV的流行国内有多种疫苗可供选择，包括谱系5衍生的经典株活疫苗VR2332株、CH1R株、R98株以及CH1a、M2株灭活疫苗以及谱系8高致病力PRRSV致弱的JXA1R株、GDr180株、HuN4-F112株、TJM-F92株等。
现有疫苗均不能与流行毒株感染进行有效区分，因此研发一种能够与流行毒株实现鉴别诊断的PRRSV标记疫苗对PRRSV的防控和净化具有重要的临床价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗及其制备方法，通过对猪繁殖与呼吸综合征疫苗部分序列进行替换，能够解决现有技术中疫苗均不能与流行毒株感染进行有效区的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，所述活疫苗通过将猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株的N蛋白基因替换为猪繁殖与呼吸综合征病毒同属其他病毒的N蛋白基因得到。
其中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒株2型毒株为SC2012株，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒同属病毒为Betaarterivirus chinrav 1，Betaarterivirus ninra，Betaarterivirus sheoin，Betaarterivirus suid 1，Betaarterivirus timiclar中的一种。
另外，本发明还包含了一种猪繁殖与呼吸综合活疫苗制备方法，包括以下工艺步骤：
1）选取毒株 PRRSV SC2012株F5代及F80代，F80代为连续传代后制备而成的弱毒株，感染仔猪后无体温反应，感染动物不发病；
2）PRRSV全基因组序列的扩增与感染性克隆的构建，具体工艺步骤如下：
按照常规方法提取PRRSV SC2012株F80代病毒RNA并进行反转录，使用引物进行序列扩增，按照常规方法回收扩增片段，然后将回收片段与经NheⅠ和NotⅠ酶切的pVAX1载体按照克隆试剂盒操作说明书进行载体组装，然后转化TOP感受态细胞，挑选菌落提取质粒进行测序验证，将测序正确的载体命名为pVAX-PRRSV SC2012；
3）人工合成Betaarterivirus属病毒N蛋白基因序列然后使用无缝克隆替换载体pVAX-PRRSV SC2012中的部分序列，构建获得的载体命名为pVAX-PRRSV-DIVA。
4）按照常规方法传代Marc145细胞和BHK21细胞，将比例为1:1的Marc145和BHK21细胞汇合度达到70%或以上时分别转染pVAX-PRRSV-DIVA和pVAX-PRRSV SC2012质粒，37℃5% CO2培养箱中培养，转染后72小时收获上清，接种新传代的Marc145细胞，37℃ 5% CO2培养箱中培养，连续传代至F5代，分别将其标注为rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012，按照常规方法测定其F5代病毒含量分别为1E+7.8和1E+7.5TCID50/ml。
其中，1）中，使用引物进行序列扩增时，引物为：PRRSV-1F、PRRSV-1R、PRRSV-2F、PRRSV-2R、PRRSV-3F、PRRSV-3R、PRRSV-4F、PRRSV-4R、PRRSV-5F、PRRSV-5R、PRRSV-6F、PRRSV-6R。
在本发明中，各引物对应的引物序列具体为：
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对PRRSV全基因组序列进行扩增后构建感染性克隆载体，使用无缝克隆替换载体pVAX-PRRSV SC2012中的部分序列，获得新的具有特殊标记的感染性克隆载体pVAX-PRRSV-DIVA，使用pVAX-PRRSV-DIVA转染细胞后获得具有特殊标记的PRRSV疫苗种毒株，能够解决现有技术中疫苗均不能与流行毒株感染进行有效区的技术问题，对PRRSV的防控和净化具有重要的临床价值。
附图说明
图1 为PRRSV SC2012、rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012在Marc145细胞上的增值曲线。
具体实施方式
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明实施例的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
实施例一
本实施例公开了一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，所述活疫苗通过将猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株的N蛋白基因替换为Betaarterivirus属病毒的N蛋白基因得到。
其中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒株2型毒株为SC2012株，所述Betaarterivirus属病毒为Betaarterivirus chinrav 1，Betaarterivirus ninra，Betaarterivirus sheoin，Betaarterivirus suid 1，Betaarterivirus timiclar中的一种。
优选地，所述活疫苗疫苗的基因组序列包括如序列2所示的核苷酸序列，具体如下：
atgacgtataggtgttggctctatgccagggcatttgtgttgtcaggagctgtgaccattggcacagcccaaaacttgctgcacgggaacaccctcctgtgacagccctcttcagggggattaggggtctgtccctaacaccttgcttccggagttgcactgctttacggtctctccacccctttaaccatgtctgggatacttgatcggtgcacgtgtacccccaatgccagggtgtttatggcggagggccaggtctactgcacacgatgtctcagtgcacggtccctccttcctctgaatccccaagtttctgagcttggggtgctgggtctattttataggcccgaagagccactccggtggacgttgccacgtgcattccccactgtcgagtgctcccccgccggggcctgctggctttctgcgatctttccgattgcacgaatgactagtggaaacctgaactttcaacaaagaatggtgcgggtcgcagctgaaatctacagagtcggccaacccacccctacagttctgaagactctacaagtttatgagcggggttgtcgctggtaccccattgtcgggcccgtccctggggtgggcgtttacgccaactccctgcatgtgagtgacaaacctttcccgggagcaactcatgtgttaaccaacctgccgctcccgcagaggcccaaacctgaggacttccgcccttttgagtgtgctatggctgacgtctatgacattggtcatggcgccgtcatgtatgtggccggaggaaaggtctcttgggcccctcgtggagggaatgaagtgaaatttgaacctgtccctaaggagttgaggttggttgcgaaccgactccacacctccttcccgccccatcacgtagtggacatgtccaggttcaccttcatgacccctgggagtggtgtctccatgcgggttgagtgccaatgcggctgcctccccgctgacactgtccctgaaggaaactgctggtggcgcttgtttgactccctcccaccggaagttcagtgcaaggaaattcgctatgctaaccaatttggctatcaaactaagcatggtgtccctggcaagtacctacagcggaggctgcaagttaatggtcttcgggcagtgaccgacacacatggacctatcgtcatacagtccttctctgttaaggagagttggatccgacacctgaagttggtagaagaacccagcctccccgggtttgaggatctcctcagaatcagggttgagcccaatacgtcaccactggctggaaaggatgagaagattttccggtttggcagtcttaagtggtacggtgccggaaagagagcaagaaaaacacgctctggtgcgactaccgtggtcgctcatcacgcttcgtccgctcataaaacccggcaggcaacgaagcacgagggtgccggcgctgacaaggctgagcatctcaagcgctactctccgcctgccgaagggaactgtggttggcactgcatttccgccatcgccaaccggatggtgaattccgtctttgagaccactctccctgaaagggtaaggccttcagatgattgggccaccgacgaggatcttgtgaataccatccaaatcctcaggctccctgcggccttggacaggaacggcgcctgcggtagcgccaagtacgtgcttaaactggagggtgagcattggactgtttctgtgacccctaggatgtcccctactttgctccccctcgaatgtgttcagggctgttgtgagcataagggcggtcttgtttccccggatgcagtcgaaatttctggatttgatcctgcctgccttgaccgactggccaaggtaatgcacttgcctagcagtgccatcccagccgctctggccgaattgtccgacggcgccaaccgtccggtttccccggccgctactacgtggactgtttcgcaactctatgctcgccatagaggaggagatcgtcatgaccaggtgtgcttagggaaaatcatcagcctttgtcaagttattgaggattgctgttgcaatcagaataaaaccaaccgggctactccagaagaggtcgcagcaccgattgatcagtacctccttggcgcaacaagtcttgaggaatgcttggccaaacttgagagagtttccccgccgggcgctgcggacacctcctttgattggaatgttgtgcttcctggggttgaggcggcgaatcagacaaccgaacaacctcgcgccaactcatgctgcaccctggttcctcctgtgactcaagagccttcgggcaaggaatcagtccctctgaccgccttctcactgtccaattgctattaccctgcacaaggtgacgaggttcatcaccgtgagaggttaaatctcgtactctctaagttggaagaggttgtcctggaagaatatgggctcatgtctactggacttggcccgcgacccgtgcttccgagcgggctcgacaggcttaaagaccagatggaggaggatctgctaaaactggccaactcccaggcgacctcagaaatgatggcccggaaggttgagcaggtcgatttaaaagcttgggtcaaaagctacccgcggtggacaccaccaccccctccaccaagagttcagcctcgaagaacaaagtctgtcaaaagcttgccagaggacaagcctgtccctgctctgcgcaggaaggtcagatccgattgcggcagcctggttttgatgggcaacaatgtccccaacggttcgatcacacgcccaaaatactcagctcaatccatcatcgactctggcgggccttgcagtgggcatctccaaaaggaaaaagaagcatgcctcagcatcatgcgtgaggcttgtgatgcgtccaagcttagtgatcctgccacgcaggagtggctctctcgcatgtgggatagggtcgacatgctgacttggcgcaacacgtctgcttaccaggcgttccgcatcttaaatggcaggtctgagttcctcccaaagatgattctcgagacaccgccgccccacccgtgcgggtttgtgatgttacctcacacgcctgcaccttctgtgagtgcagagagtgatctcaccattggctcagtggccaccgaggatgttccacgcatcctcgggagaataggaggcactaacgagctgcctgacctgggtccctcggcaccctccaagggagaaccggtctgtgaccaacctaccaaagatccccggatgtcgccgcgggagtctgacgagagcataatagctccgcccgcagatacaggtggtggcggctcattcactgatttgccgtcttcagacggcgtggatgtggacgggggggggctgttaagaacggtaaaaacaaaagcaggaaggctcttagaccaactgagccgccaggtttttagcctcgtttcccatctccctatcttcttctcacacctcttcaaatctgacagtggttattctccgggtgattggggttttgcagcttttactctattttgcctctttctatgttacagttacccattcttcggttttgctcccctcttgggtgtgttttctgggtcttctcggcgtgtgcgaatgggggtttttggctgctggttggcttttgctgttggcctgttcaagcctgtgtccgacccagtcggaactgcttgtgagtttgattcgccagagtgtaggaacgtccttcactcttttgagcttctcaaaccttgggaccctgtccgcagccttgttgtgggccccgtcggtctcggtcttgccattcttggcaggttactgggcggggcacgctacatctggcactttttgcttaggcttggcattgttgcagactgtatcttggctggagcttatgtgctttctcagggtaggtgtaaaaagtgctggggatcttgtgtaagaactgctcctaatgagatcgccttcaacgtgttcccttttacacgtgcgaccaggtcgtcactcatcgacctgtgcgatcggttctgcgcaccaaaaggcatggaccccatttttcttgccactgggtggcgtgggtgctggaccggccggagtcccattgagcaaccctctgaaaaacccatcgcgttcgcccagctggatgagaagaggattacggctagaactgtggtcgctcagccttatgatcccaaccaggccgtaaagtgcttgcgggtattacaagcaggtggggcgatggtggctgaggcagtcccgaaagtggtcaaagtttccgctattccgttccgagctcctttctttcccgctggagtgaaagttaatcctgaatgcagaatcgtggttgatcccgatactttcactacagctctccggtctggctattccaccacgaaccttgtccttggtatgggggactttgcccagctgaatggactaaagatcaggcaaatttccaagccttcagggggaggcccacacctcattgctgccttgcatgttgcctgctcgatggcgttacacatgcttgctggtatttatgtaactgcagtggggtcctgcggtaccggtaccaacgatccgtggtgcactaacccgtttgccgtccctggctacggacctggctccctttgcacgtctagattgtgcatctcccaacacggccttaccttgcccttgacagcacttgtggcgggattcggccttcaagagattgccttggtcgttttgatttttgtctccatcggaggcatggctcataggttgagttgtaaggctgacatgttgtgcatcttactcgcaatcgctagttatgtttgggtacctctcacctggttgctttgtgtgtttccttgttggttgcgctggttttctttgcacccactcaccatcctgtggttggtgtttttcttgatttctgtaaatataccctcgggaatcttggctgtggtgttattggtttctctctggcttttaggtcgttatactaacattgctggtctcgt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实施例二
本实施例公开了一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗制备方法，包括以下工艺步骤：
1）毒株 PRRSV SC2012株F5代（毛汐语,周远成,赵军,殷玥,吕雯婷,邓益超,樊毅,许思遥,朱玲,徐志文.猪繁殖与呼吸综合征病毒四川株的分离鉴定及Nsp2生物信息学分析[J].中国兽医科学,2016,46(12):1497-1504.DOI:10.16656/j.issn.1673-4696.2016.12.004.）及F80代。其中F80代为连续传代后制备而成的弱毒株，感染仔猪后无体温反应，感染动物不发病。
2)PRRSV全基因组序列的扩增与感染性克隆的构建
参照试剂盒说明书（FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit试剂盒，购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司）提取PRRSVSC2012株F80代病毒RNA并参照试剂盒说明书（HiScriptIII 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNAwiper)，购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行反转录，然后使用表1引物参照试剂盒说明书（2 × Phanta Flash Master Mix，购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司）序列扩增。回收扩增片段，然后将回收片段与经NheⅠ和NotⅠ酶切的pVAX1载体按照克隆试剂盒操作说明书进行载体组装（In-Fusion SnapAssembly Master Mix，购于TAKARA公司），然后转化TOP感受态细胞（购于生工生物工程(上海)股份有限公司），挑选菌落提取质粒送北京擎科生物科技有限公司进行测序验证，将测序正确的载体命名为pVAX-PRRSV SC2012。
表1为PRRSV基因组扩增引物
3）合成Betaarterivirus属病毒N蛋白基因序列（序列1）然后使用无缝克隆（In-Fusion Snap Assembly Master Mix，购于TAKARA公司）替换载体pVAX-PRRSV SC2012中的部分序列，构建获得的载体命名为pVAX-PRRSV-DIVA。
其中，序列1，具体为：
ccaaataaaaatcaaaggcagcagccccgcaaaaaggggaatggccagtcagtcaatcagctgtgccagctgttgggtcagatgatcaaacagcaaaactcccgtcaaaagggaggacctgggaagaaaaggaaaacccaggagaagcctcactttcctttggcaggagaagatgacgttagacatcacttcaaccccggtgaacgacagctatgtctagcgtcaattcaaaccgcctttaatcaaggcgccgggtcttgcactctgctcgactccgggagaattgcatacacagtggagtttagtctgcctcatcagcacaccgtccgcctaatccgcgcgacgaccaccaacctgagctccagctgatgggctggcattctttggcacctcagtgttagaattgggagaatgtgtggtgaatggcactgattgacactgtgcctctaagtcacctattcaattagggcgaccgtgtgggggcaaagtttgattggcgagaaccatgcggccgtaattaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。
其中，3)中替换的序列3具体为：
ccaaataacaacggcaggcagcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacaggcagtcaatcagctgtgccaaatgctgggtaagatcatcgcccaacaaaaccagtccagaggcaagggaccggggaagaaaaataggaagaaaaacccggagaagccccattttcctctagcgactgaagatgacgtcaggcatcactttacccctagtgagcggcaattgtgtctgtcgtcgatccagactgccttcaatcagggcgctggaacttgtaccctgtcagattcagggaggataagttacactgtggagtttagtttgccaacgcaccatactgtgcgtctgatccgcgccacggcatcaccctcaacatgatgagctggcattctttgattcctcggtgttataatcgggagaatgtgtggtgaatggcactgattgacactgtgcctctaagtcacctattctatttgggcgaccgtgtgggggtaaggtttaattggcgagaaccacgcggccgtaattaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
4）按照常规方法传代Marc145细胞和BHK21细胞，消化后接种12孔板，每孔中Marc145和BHK21细胞的比例为1:1，37℃ 5% CO2培养箱中培养24小时候按照Lipofectamine 3000（购于赛默飞世尔科技公司）说明书分别转染pVAX-PRRSV-DIVA和pVAX-PRRSV SC2012质粒，37℃ 5% CO2培养箱中培养，每日观察。转染后72小时收获上清，接种新传代的Marc145细胞，37℃ 5% CO2培养箱中培养，每日观察。连续传代至F5代，分别将其标注为rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012，按照常规方法测定其F5代病毒含量分别为1E+7.8和1E+7.5TCID50/ml。
其中，2）中，挑选菌落提取质粒进行测序验证，正确测序的结果如序列4所示，序列4具体为：
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针对PRRSV SC2012、rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012具体验证如下：
1. 拯救毒株与亲本毒株生长曲线测定
常规方法传代Marc145细胞，带细胞汇合度达到90%以上时，按照0.01MOI的病毒量分别接种PRRSV SC2012、rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012，37℃吸附1小时，去除吸附病毒液，并添加2%血清的DMEM维持液，37℃ 5% CO2培养箱中培养，每间隔12小时取样，-80℃保存备用。取样至96小时，然后对不同时间收获的样品进行病毒含量测定，病毒生长曲线如图1所示。
通过测定发现重组毒株rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012与亲本毒株PRRSV SC2012增值规律基本一致。
2. rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012的纯净性检验
取F5代病毒，按照按照现行《中国兽药典》附录记载的方法对不同代次病毒进行无菌、支原体、外源病毒检验，结果如表2所示。
表2为rPRRSV-DIVA和纯净性检验结果统计表
3. rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012的致病力试验
28日龄PRRSV抗体阴性仔猪20头，随机分为4组分别标记为A、B、C、D组，按照下表3进行感染试验。感染后连续观察21日，每日测定体温，感染后7日采集血清，在感染前和观察结束时称量体重。
表3为rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012对断奶仔猪的感染试验
感染后每日测定体温，观察试验猪是否出现异常症状，结果显示感染后至观察期末所有均未出现体温升高、食欲减退、精神萎靡以及呼吸道症状等PRRS的典型症状，未出现仔猪死亡。感染后7天采集血清按照GB/T 35912-2018猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法能够在血液中检测到PRRSV病毒核酸（具体见表4），亲本株与重组株之间差异不显著。试验期间各组试验期增重基本一致，差异不显著。该结果表明，本试验拯救的亲本毒株和标记毒株其致病力未发生改变。
表4为 rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012对断奶仔猪的感染试验结果统计
4. rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012对断奶仔猪免疫原性测试
选用3-4周龄PRRSV抗原抗体阴性仔猪20头，随机编为E、F、G、H四组，每组5头。按下表（表5）进行肌肉注射免疫接种，免疫前、免疫后7、14、21、28日采集血液样品保存备测；免后28日采血后，每头试验猪滴鼻接种PRRSV SC2012 F5（107TCID50/头）测试免疫效果，接种后观察21天，并在接种后7、14、21天采集血清备测，同时记录各组仔猪发病和死亡情况。
表5为rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012免疫原性试验分组
免疫后各组均正常，取免疫后免疫前、免疫后7、14、21、28日，攻毒后7、14、21天血清使用猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒测定N蛋白（PRRSV AB ELISA Kit,购于北京金诺百泰生物技术有限公司）抗体，结果显示rPRRSVSC2012和PRRSV SC2012 F80代免疫后能够检测到N蛋白抗体，但rPRRSV-DIVA和阴性对照组免疫后7-28天均检测不到N蛋白抗体。
感染后在所有免疫猪群和对照组存活猪种检测到N蛋白抗体。攻毒后免疫组无体温升高、呼吸道症症状等猪繁殖与呼吸综合征的典型症状，但对照组感染后第二日起均出现发热、厌食等猪繁殖与呼吸综合征的典型症状，至观察期结束，对照组5/5发病，2/5死亡，E、F、G免疫组无仔猪发病和死亡（表6）。
表6 为rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012免疫原性试验结果统计
以上数据表明，本发明构建的标记疫苗能够为免疫动物提供良好的保护效果，同时免疫本发明构建的疫苗后检测不到PRRSV 2型病毒的N蛋白抗体，可以达到与野毒感染区分的目的。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，其特征在于：所述疫苗通过将猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株的N蛋白基因替换为Betaarterivirus属病毒的N蛋白基因得到；所述的Betaarterivirus属病毒为Betaarterivirus chinrav 1，Betaarterivirus ninra，Betaarterivirus sheoin，Betaarterivirus suid 1，Betaarterivirus timiclar中的一种；所述猪繁殖与呼吸综合征病毒株2型毒株为SC2012株；所述疫苗的基因组序列为序列2所示的核苷酸序列。
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