CN113151195A

CN113151195A - 一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合重组疫苗株及其应用

Info

Publication number: CN113151195A
Application number: CN202011454643.5A
Authority: CN
Inventors: 徐高原; 周明光; 张华伟; 曾小燕; 陈映瑾; 郝根喜; 周飞燕; 邵伟; 金建云
Original assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Current assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2040-12-10
Also published as: CN113151195B

Abstract

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合重组疫苗株及其应用。所述猪繁殖与呼吸综合征嵌合重组疫苗株为通过将猪繁殖与呼吸综合征WH株GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因替换为NADC30‑like毒株对应的基因得到。本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征嵌合重组疫苗株的致病力低，性状稳定，经过40次传代仍然不会引起仔猪发病，安全性较高；并且免疫保护效果较好，可以同时免疫猪繁殖与呼吸综合征以及NADC30‑like感染，在新型二价疫苗的研制领域有重要价值。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合重组疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合重组疫苗株及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种严重影响生猪产业的重要病毒性疫病。该病影响广泛，对全世界养猪业造成了巨大经济损失。例如之前暴发的高致病性PRRS(HP-PRRS)，其临床发病率与死亡率高，给现有养猪业带来前所未有的经济损失，该病原与传统经典PRRSV相比，其特征为在Nsp2基因上存在30个不连续氨基酸缺失。之后又出现了PRRSV变异株，其病毒基因组特征为Nsp2存在131个不连续氨基酸缺失，缺失模式为“111+1+19”，并被命名为NADC30毒株。现有技术陆续分离到与NADC30基因同源性较高的毒株，统称为PRRSV类NADC30毒株(NADC30-like毒株)。NADC30-like毒株在发病猪场临床症状主要表现为：母猪流产等繁殖障碍，流产率高达30％-40％，保育及生长育肥猪严重的呼吸道症状，容易继发细菌性疾病，死淘率可达15％-20％，给现有生猪养殖带来了新的挑战。

目前，市场上的商品化PRRSV疫苗主要有两大类：灭活疫苗和弱毒疫苗。疫苗免疫是防控PRRSV感染的常用手段之一，但两类疫苗各存在优缺点。PRRSV灭活疫苗具有较高安全性，不存在散毒和毒力返强的风险，但免疫剂量大，副反应作用大，也不能有效激发机体的细胞免疫，从而难以有效控制PRRSV的发生及流行；弱毒疫苗在PRRSV防控中发挥重要作用，但是PRRSV弱毒苗对异源毒株提供的交叉保护效力有限，且存在毒力返强等风险。伴随着NADC30-like毒株持续遗传变异和毒株的多样性，加剧了疫苗预防与控制的难度。临床应用过程中发现，使用PRRSV弱毒活疫苗均不能有效抵抗NADC30-like毒株的感染，如免疫了VR2332毒株商品苗的猪场同样爆发了HENAN-XINX毒株、HENAN-HEB毒株、JL580毒株感染。

发明内容

本发明提供一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合重组疫苗株，通过将猪繁殖与呼吸综合征病毒株的GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因替换为NADC30-like毒株对应的基因得到了一种可以同时预防猪繁殖与呼吸综合征和NADC30-like的感染的毒株。

本发明提供一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合重组疫苗株，所述嵌合重组疫苗株为通过将猪繁殖与呼吸综合征病毒株的GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因替换为NADC30-like毒株对应的基因得到。

进一步地，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒株为猪繁殖与呼吸综合征WH株，所述NADC30-like毒株为SD1602株(GenBank No.MH651743)，该毒株为中国近年来的PRRS V流行毒株。

进一步地，所述嵌合重组疫苗株为通过将猪繁殖与呼吸综合征WH株基因序列中如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列替换为如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列得到。

本发明将弱毒株PRRSV经典毒株WH株的部分结构蛋白GP5、M、N替换为国内主要流行毒株NADC30-like毒株SD1602株的相应蛋白，相较于现有技术保留了更多毒株的结构蛋白，使得嵌合疫苗株对于PRRS而言具备更好的免疫原性。同时，NADC30-like毒株SD1602株本身具有较强的致病性，不适合直接作为活疫苗毒株，但是在灭活后，其免疫原性大幅度下降，难以提供足够的保护效果，而本发明构建的嵌合疫苗株相较于SD1602的灭活疫苗而言免疫效果更好，相较于SD1602的活疫苗而言安全性更好，同时达到活疫苗对于免疫原性和安全性的要求。

进一步地，所述嵌合重组疫苗株的基因组序列包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

进一步地，本发明将经过基因编辑得到的一株猪繁殖与呼吸综合征嵌合重组疫苗株进行了保藏，保藏信息如下：

保藏编号为：CCTCC NO:V202084；分类命名为：猪繁殖与呼吸综合症嵌合病毒WH-SD株；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072；保藏日期为：2020年12月1日。

本发明鉴定其生理特征，与猪繁殖与呼吸综合症嵌合病毒WH类似，确定为猪繁殖与呼吸综合症嵌合病毒。本发明通过遗传标记检测该猪繁殖与呼吸综合症嵌合病毒WH-SD株的各代次毒种均含有遗传标记。

本发明进一步提供一种疫苗，包括所述嵌合重组疫苗株和佐剂。

进一步地，所述嵌合重组疫苗株在所述疫苗汇总含量不低于10⁵TCID₅₀/mL，所述佐剂为明胶，所述明胶和所述嵌合重组疫苗株的质量比为1:5～8。

本发明进一步提供一种用于检测所述嵌合重组疫苗株的引物对，包括：

SD-F：5’-aggcgttcgcctgcaaacca-3’，

SD-R：5’-aatttcggccgcatggttct-3’。

本发明进一步提供一种构建猪繁殖与呼吸综合征嵌合重组疫苗株的方法，包括：

通过基因重组技术将猪繁殖与呼吸综合征WH株GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因替换为NADC30-like毒株对应的基因得到所述嵌合重组疫苗株的基因组全长cDNA，经过病毒拯救得到所述嵌合重组疫苗株。

进一步地，所述病毒拯救过程包括：

将所述嵌合重组疫苗株的基因组全长cDNA经过体外转录，感染Marc-145细胞，待观察到明显细胞病变后裂解Marc-145细胞即得。

本发明进一步提供所述嵌合重组疫苗株和所述疫苗在制备同时免疫猪繁殖与呼吸综合征病毒和NADC30-like感染的药物中的应用。

本发明具备如下有益效果：

1、本发明利用反向遗传学构建经典PRRSV低致病性毒株WH株的感染性克隆，WH株致病性低，毒力及遗传稳定性好，为PRRSV活疫苗的研制奠定基础。随后，在WH株骨架的基础上嵌合NADC30-like株的主要免疫原性蛋白GP5+M+N，可保护猪只免受NADC30-like的感染。

2、本发明所提供的经典PRRSV低致病性毒株WH株的感染性克隆具有广泛的应用价值，可在感染性克隆的基础上，根据PRRSV流行毒株的改变而嵌合不同PRRSV毒株的免疫原性蛋白，为PRRSV疫苗的研制节约大量的时间，也可插入其他病毒的免疫原性蛋白(例如猪圆环病毒的Cap)蛋白，为新型二联疫苗的研制提供可能。除此之外，对于PRRSV病毒结构功能的研究、PRRSV与宿主之间的相互作用研究、病毒的毒力基因鉴定及影响病毒复制研究等方面都具有重要作用。

附图说明

图1为本发明提供的经典PRRSV WH株感染性克隆构建图；图中，A为经典PRRSV WH株感染性克隆构建模式，B为pACYC177-WH酶切鉴定图；

图2为本发明提供的rWH拯救病毒检测结果；图中，A为rWH拯救病毒病变图，A中1为Marc-145细胞对照，2为rWH，B为rWH拯救病毒的遗传标记检测，B中1为亲本毒株WH株，2为拯救病毒rWH株，3为细胞对照；

图3为本发明提供的rWH拯救病毒鉴定结果；图中，A为rWH拯救病毒的间接免疫荧光鉴定，A中1为亲本毒株WH株，2为拯救病毒rWH株，3为细胞对照，B为rWH拯救病毒的Western Blot鉴定结果，B中1为亲本毒株WH株，2为拯救病毒rWH株，3为细胞对照；

图4为本发明提供的rWH-SD嵌合毒株的构建模式图；图中A为rWH-SD嵌合毒株感染性克隆构建模式，B为pACYC177-WH/SD酶切鉴定结果；

图5为本发明提供的rWH-SD拯救病毒检测结果；图中，A为rWH-SD拯救病毒病变图，A中1为细胞对照，2为rWH-SD；

图6为本发明提供的rWH-SD拯救病毒鉴定结果；图中，A为WH-SD拯救病毒的间接免疫荧光检测，A中1为亲本毒株WH株，2为拯救病毒rWH-SD株，3为细胞对照，B为rWH-SD拯救病毒的Western Blot鉴定结果，B中1为亲本毒株WH株，2为拯救病毒rWH-SD株，3为细胞对照；

图7为本发明提供的嵌合病毒rWH-SD的生长及传代情况，其中A为嵌合病毒rWH-SD的生长曲线，B为嵌合病毒rWH-SD从P5到P80的病毒滴度测定结果；

图8为本发明提供的拯救病毒rWH-SD株中和抗体滴度。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1、经典PRRSV WH株全长cDNA克隆质粒的构建

1.1经典PRRSV WH株cDNA的获得

提取经典PRRSVWH株全基因组，反转录为cDNA。

PRRSV基因组RNA提取方法：取300μL病毒液上清，加1mL trizol，用枪吹打混匀，冰上放10min；加200μL氯仿，振荡混匀，冰上放3min，13000rpm 4℃15min，取上层水相至新EP管；加500μL异丙醇，轻轻混匀，冰上放30min；13000rpm 4℃10min，弃上清；加1mL 75％乙醇，洗涤沉淀，13000rpm 4℃10min，弃上清；晾干，加30μL DEPC水。

表1反转录体系：

组分	体积(μL)
		5×Primescript RT master mix	2
RNA	8

反应程序：37℃15min，85℃50s

1.2经典PRRSV WH株基因组的分段扩增与连接

对经典PRRSV WH株进行全基因组测序，参照测序结果，选择合适的酶切位点，将经典PRRSV的全长cDNA分成A、B、C、D、E、F、G、H八段进行扩增，引物信息见表2。依次利用同源重组方式连接到改造后的低拷贝质粒pACYC177，构建包含经典PRRSV WH株全长cDNA的质粒pACYC177-WH，构建模式图见附图1中的A，最终得到包含WH株全长cDNA的pACYC177-WH载体，对pACYC177-WH进行酶切鉴定并测序，酶切鉴定结果见附图1中的B，并对pACYC177-WH载体上的全长cDNA序列进行测序，与PRRSV WH株序列进行比较，仅个别碱基发生突变。进行为了区分通过感染性克隆获得的拯救病毒与亲本病毒，在构建全长cDNA质粒时通过定点突变PCR在基因组中引入1个遗传标记Bstz17I(259nt)，该突变为沉默突变。

表2经典PRRSV Clone20感染性克隆构建片段分段扩增引物信息

引物名称	序列信息(5’-3’)
		A-F1	cctgcaggTAATACGACTCACTATAGGGtatgacgtataggtgttggc
A-F2	ctttgccgcggccctctcaccctgcaggTAATACGACTC
		A-R	gcactgaggcatcgtgtgcagtatacttggccctccgccataaac
B-F	gtttatggcggagggccaagtatactgcacacgatgcctcagtgc
		B-R	ggcgaatgatatcatgtacgcttaagtacgtacttggcgcta
C-F	gtgcttgtactagcgccaagtacgtactta
		C-R	gccggagtcctaggtggcgaatgatatccgggggtcgttgcca
D-F	ttggcaacgacccccggatat
		D-R	cgataggcatatgcgccggagtcctagggcctgctccacggaaag
E-F	tacatgatatcattcgccacctaggtatgatgaatgtcgac
		E-R	gctggatttataacgataggcatatgctgtgcatagatcacca
F-F	tagtttggtgatctatgcaca
		F-R	aagttcgcgaatcgctggatttataaattttcccttcctg
G-F	cgccaggaagggaaaatttataaggcc
		G-R	tcccctatttaaattgaagttcgcgatgcctaaggcacctga
H-F	ccttaggcatcgcgactcg
		H-R	ATTTAAATtttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttaatttcggccgc

表3PCR扩增体系

PCR扩增后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。

表4载体线性化体系

酶切后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。

表5重组反应

利用ClonExpress II One Step Cloning Kit进行重组反应，线性化载体及插入片段的使用体积按照说明书计算确定。重组反应结束后，将重组产物全部转化DH10B感受态，涂平板。挑取单克隆菌落，采用质粒抽提试剂盒提取质粒，酶切鉴定并送测序，将8个片段逐一克隆至pACYC177载体上，最终得到含有WH株全长cDNA的pACYC177-WH载体。

2、经典PRRSV WH株感染性克隆病毒的拯救及鉴定

全长cDNA克隆质粒完全线性化后，使用mMessage Mmachine T7(InvitrogenAM1344 LOT 00749605)试剂盒在体外转录出全长RNA，用脂质体将其转染Marc-145细胞，48h后转染细胞进行反复冻融3次，上清转移至Marc-145细胞培养瓶中，72h后即出现典型的PRRSV CPE，将拯救病毒命名为rWH，并选择P3代病毒进行拯救病毒的鉴定。

2.1重组质粒的酶切线性化与RNAase的去除

(1)用SwaI单酶切pACYC177-WH载体，总体积100μL

(2)在酶切后的反应体系中加入Protease K去除RNAase

(3)回收

加入等体积苯酚氯仿异戊醇(体积比25：24：1)，轻轻混匀，12000rpm 4℃15min，水相转移至新EP管中，加入1/10体积3M NaAC醋酸钠(pH5.2)，混匀，加入2.5倍体积无水乙醇，-20℃沉淀过夜。乙醇沉淀后，12000rpm 4℃15min，弃上清，预冷70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm 4℃15min，弃上清，沉淀在超净台中吹干，加10μL DEPC水溶解。浓度需在1μg/μL左右。

2.2RNA的体外转录与加帽反应

使用T7 RNA聚合酶将已处理好的DNA在体外转录成RNA，并在5’端加上帽子结构，具体方法按mMessage Mmachine T7(Invitrogen AM1344 LOT 00749605)使用说明书进行，转录与加帽操作步骤如下：

体外转录及加帽反应体系配制：除10×reaction buffer需室温放置外，其余均放冰上

室温下配制体系：

2*NTP/CAP：10μL

Enzyme mix：2μL

线性化质粒：1μg

10×reaction buffer：2μL

GTP(30mM)：1μL

无RNA酶水补齐至20μL轻轻混匀，37℃4h(PCR仪提前预热)

上一步混合液20μL体系中加入TUBBO Dnase 1μL，37℃15min。

跑胶检测：3％琼脂糖胶，缓冲液提前预冷，且电泳槽外放置冰袋，150V 30min即可。

回收：20μL上述反应液中加115μL DEPC水，15μL ammonium aceteate stopsolution，混匀，加入等体积(150μL)等体积水饱和酚，12000rpm，4℃，5min。取上层水相至新EP管，再水饱和酚萃取一次。加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃放置过夜。12000rpm4℃15min离心去上清，预冷70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm，4℃，15min，弃上清，沉淀在超净台中吹干，加100μL DEPC水溶解。(RNA浓度一般在400ng/μL以上)

2.3体外转录RNA的脂质体转染

(1)转染细胞前的准备：转染前一天，取生长状态良好的Marc-145细胞单层，胰酶消化制成细胞悬液，1000rpm离心3min，弃上清液，加10％DMEM培养基(1％双抗)，调整细胞浓度为2×105个/ml,铺6孔细胞板，使转染时细胞达到80％左右。

(2)在245μL Opti-MEM培养基中加入10μL转录RNA，小心轻柔混匀；

(3)在240μL Opti-MEM培养基中加入10μL Lipofectin Reagent，轻柔混匀，室温下孵育15min；

(4)把(2)混匀的转录RNA与(3)孵育15min的混合液轻柔混匀，室温下孵育45min；同时用250μL Opti-MEM与(3)孵育15min的混合液轻柔混匀，室温下孵育45min后作阴性对照；

(5)取出6孔板，使用无血清和无双抗的DMEM培养基漂洗两遍，再用Opti-MEM培养基漂洗一遍待用；

(6)将(4)孵育45min后的转染混合液及阴性对照500μL，加入到漂洗过的6孔细胞培养板中，轻柔摇动细胞培养板，使混合液完全覆盖细胞表面，置5％CO₂培养箱中37℃作用6h；

(7)作用6h后，将细胞单层用无血清和无双抗的DMEM培养基漂洗三遍，加入2ml2％DMEM培养基(1％双抗)，置5％CO₂培养箱中37℃培养48h。

2.4盲传拯救的病毒

(1)使用T25细胞瓶，5％CO₂培养箱中37℃培养Marc-145细胞48h，使细胞密度达到80％左右；

(2)将转染的Marc-145细胞反复冻融3次，4℃、12000rpm离心15min；

(3)转染的Marc-145细胞反复冻融后上清液转移至T25瓶中的Marc-145，在5％CO₂培养箱中37℃吸附1h；

(4)弃去吸附液，加入5mL、2％DMEM培养基(1％双抗)，5％CO2培养箱中37℃培养箱中培养72h后收取病毒，作为F1代，每隔12h观察一次。盲传3代。

2.5拯救病毒rWH的检测

2.5.1拯救病毒rWH的细胞病变观察

将转染后的细胞反复冻融三次后，上清转移至长满80％左右的Marc-145细胞，接种前将Marc-145细胞的培养基换为含2％FBS的DMEM维持液。72h后在显微镜下观察拯救病毒F1代的细胞病变。F1代即可观察到明显的细胞病变，如附图2中的A所示。

2.5.2遗传标记检测

分别提取拯救病毒rWH F3代和亲本毒的病毒RNA，并反转录为cDNA。以反转录的cDNA为模板利用引物对259-F/R扩增包含遗传标记的序列，引物信息见表6。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果见附图2中的B，回收目的片段，进行测序。测序结果表明，拯救病毒含有遗传标记，而亲本毒株无遗传标记。

表6引物序列

引物	序列信息(5’-3’)
		259-F	tatgacgtataggtgttggc
259-R	acctcgtgctccttggcctg

2.5.3免疫荧光鉴定

将拯救病毒rWH F3代和亲本毒接种至在24孔板生长为80％的Marc-145细胞中，待接种48h后进行免疫荧光实验，同时设立未接毒的阴性对照组，结果为拯救病毒rClone20与亲本毒均可检测到绿色荧光，而空白对照没有绿色荧光，证明病毒拯救成功(附图3中的A)。本实验一抗使用的是针对PRRSV N蛋白的单克隆抗体，二抗为FITC标记山羊抗小鼠IgM二抗。其具体步骤为：

(1)病毒接种48h后，将细胞上清弃掉，用PBS将细胞清洗一遍；

(2)清洗完毕后，弃掉清洗液PBS，用甲醇：丙酮(1：1)混合液对细胞进行固定，4℃固定30min，固定结束后弃掉固定液，并用PBS将细胞清洗一遍；

(3)每孔加入250μL 2％PBSA，37℃封闭1h；

(4)弃封闭液，PBS洗细胞3次，每孔加入250μL经PBS 1:1000稀释的一抗，37℃孵育1h；

(5)弃一抗，PBS洗细胞3次，每孔加入250μL经PBS 1：500稀释的二抗，37℃封闭1h；

(6)弃二抗，PBS洗细胞3次，每孔加入250μL PBS，荧光显微镜下观察。

2.5.4 Western Blot鉴定

将拯救病毒rWH F3代和亲本毒接种到铺于六孔板中成长为80％的Marc-145细胞中，72h后进行Western Blot鉴定。结果为拯救病毒rWH F3代和亲本毒均可检测到N蛋白，空白对照检测不到N蛋白(附图3中的B)，最终确定病毒拯救成功。具体步骤为：

(1)将培养液去除，加入4℃预冷的PBS清洗3次，将细胞用细胞刮刀刮下，收集细胞，4℃1000rpm离心5min；

(2)弃上清，按照细胞：RIPA＝1：3的体积比用4℃预冷的含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA重悬细胞，冰上裂解30min；

(3)4℃1000rpm离心15min，收集上清，上清液即为细胞总蛋白；

(4)收集的蛋白样品与4×loading buffer按照体积比3：1混合，振荡混匀后100℃沸水浴中煮3-5min,使蛋白变性。将煮好的样品每孔上样20μL，并做好阴阳性对照；

(5)电泳时，浓缩胶电压80V，15min，分离胶电压110V，等到溴酚蓝指示剂跑到分离胶底部时，关闭电源；

(6)转膜：剪取合适大小的PVDF膜和滤纸，PVDF膜需甲醇激活，按照滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸顺序置于半干转膜仪中，电压为15V，1h；

(7)封闭：5％脱脂乳的PBS 4℃封闭过夜，封闭结束后PBST洗涤3次，10min/次；

(8)孵育一抗：一抗经PBST 1：1000稀释，室温置于低速水平摇床上孵育2h，孵育结束后PBST洗涤3次，10min/次；

(9)孵育二抗：二抗经PBST 1：5000稀释，室温置于低速水平摇床上孵育2h，孵育结束后PBST洗涤3次，10min/次；

(10)显色：按照ECL化学发光检测试剂盒说明书进行发光显色。

3、经典PRRSV和NADC30-like株嵌合毒株rWH-SD株的构建

利用PRRSV rWH感染性克隆，将rWH的基因ORF5、ORF6、ORF7及3’UTR替换为NADC30-like SD1602对应序列，构建方案见附图4中的A。SD1602上对应片段进行基因合成，即pUC-SD ORF567序列见序列1。对质粒pACYC177-WH及pUC-SD ORF567均进行NruI和SwaI双酶切，回收载体及合成的基因片段，连接并转化DH10B感受态，从平板上挑选单克隆，提取质粒并进行酶切验证，酶切鉴定结果附图4中的B所示。

4、经典PRRSV和NADC30-like株嵌合毒株rWH-SD的病毒拯救及鉴定

4.1嵌合病毒的拯救

嵌合病毒rWH-SD的拯救过程可参照rWH的拯救过程(2.1、2.2、2.3、2.4)，即先提取含嵌合病毒rWH-SD全长cDNA克隆质粒，酶切线性化，进行体外转录，转录产物转染Marc-145细胞，盲传三代，观察并记录细胞病变CPE的产生情况。

4.2嵌合病毒rWH-SD的CPE观察

将转染后的Marc-145细胞反复冻融三次后，上清转移至T25瓶长满80％左右的Marc-145细胞，接种前将Marc-145细胞的培养基换为含2％FBS的DMEM维持液。72h后在显微镜下观察拯救嵌合病毒F1代的细胞病变。F1代即可观察到明显的细胞病变，如附图5中的A所示。

4.3嵌合病毒rWH-SD的遗传标记及嵌合片段检测

分别提取拯救的嵌合病毒rWH-SD F3代和亲本毒的病毒RNA，并反转录为cDNA。以反转录的cDNA为模板利用引物对SD-F/R扩增嵌合片段，引物信息见表7。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果见附图5中的B，回收目的片段，进行测序。测序结果表明，拯救的嵌合病毒含有遗传标记且含有嵌合片段。

表7用于检测的引物

引物	序列信息(5’-3’)
		SD-F	aggcgttcgcctgcaaacca
SD-R	aatttcggccgcatggttct

4.4嵌合病毒的免疫荧光鉴定

具体操作步骤参照2.5.3，结果为拯救的嵌合病毒rWH-SD与亲本毒均可检测到绿色荧光，而空白对照没有绿色荧光，证明病毒拯救成功(附图6中的A)。

4.5嵌合病毒的Western Blot鉴定

具体操作参照2.5.4，结果为拯救的嵌合病毒rWH-SD P3代和亲本毒均可检测到N蛋白，空白对照检测不到N蛋白(附图6中的B)，最终确定病毒拯救成功。

5、嵌合病毒rWH-SD一步生长曲线的绘制

将嵌合病毒rWH-SD、亲本拯救病毒rWH及亲本毒WH株均MOI为0.1接种生长至单层80％左右的Marc-145细胞，每隔12h(至72h)取上清测定其TCID₅₀值，绘制病毒在宿主细胞的一步生长曲线。结果显示，嵌合病毒rWH-SD、亲本拯救病毒rWH及亲本毒WH株在Marc-145细胞中增殖情况相似，均在48h达到增殖高峰(图7中的A)，在Marc-145细胞上嵌合病毒rWH-SD和亲本拯救病毒rWH具有与亲本毒WH株相同的增殖动态曲线，病毒增殖能力差异不大。

6、嵌合病毒rWH-SD的体外连续传代及其基因组变异分析

将嵌合病毒rWH-SD P3种毒1ml接种于生长良好的Marc-145细胞单层，37℃孵育1h后，加入2％DMEM培养液，培养2-3d，即约80％细胞出现CPE时收获病毒，反复冻融3次，取细胞冻融液1ml，重复以上步骤，进行传代，直至P80代。

分别测定嵌合毒株P5-P80的TCID₅₀，并选取P5、P10、P20、P30、P40、P60和P80进行全基因组序列测定，全基因组测序用引物见表8，扩增获得的目的序列送华大基因测序。运用DNASTAR，Clustaxl等生物信息软件对嵌合病毒各代次毒株的全基因组核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析。

表8PRRSV嵌合病毒rWH-SD株全基因组测序引物信息

嵌合毒株P5-P80的TCID₅₀结果见附图7中的B。嵌合病毒rWH-SD在Marc-145细胞上连续传代80次，病毒滴度从P5-P80一直稳定在10^7.2TCID₅₀/ml至10^7.5TCID₅₀/ml。经过多次连续的体外传代，嵌合病毒在Marc-145细胞上稳定增殖。

本实施例对嵌合毒株rWH-SD各代次全基因组核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行比对。嵌合毒株各代次毒种均含有遗传标记，P5、P10结构蛋白编码区与原始序列一致，P20有2个核苷酸发生点突变，均为同义突变，P30在P20的基础上又有3个点突变，其中1个为同义突变。P40在P30的基础上又有5个点突变，其中2个为同义突变。P60在P40的基础上又有7个点突变，其中3个为同义突变。P80在P60的基础上有8个点突变，其中2个为同义突变。

实施例2

1、嵌合病毒rWH-SD P5、P20、P40感染仔猪的致病性试验

将20头28日龄PRRSV抗体阴性仔猪随机分为4组，每组5头。分别为嵌合病毒P10感染组、嵌合病毒P20感染组、嵌合病毒P40感染组及对照组。4个试验组在不同的动物房内隔离饲养。感染组经滴鼻接种2ml(1×10⁵TCID₅₀/ml)嵌合毒株rWH-SD病毒液，对照组接种2ml2％的DMEM培养基，每日观察实验仔猪的临床症状、记录体温及体重变化，连续观察至试验结束。同时，分别于感染后0、3、5、7、10、14、21、28d采集各试验猪血液及鼻腔拭子，用RT-PCR方法检测血液及鼻腔拭子样本中病毒核酸，分析感染仔猪的排毒情况。试验结束时剖杀所有猪只，观察其肺脏、淋巴结、大脑等组织的大体病变，并选取肺脏、下颌淋巴结组织制成石蜡切片，免疫组化染色法分析各组织中的病毒抗原分布。

1.1感染仔猪的临床症状、体温及日增重变化

感染仔猪在试验过程与对照组仔猪临床症状、体温、日增重变化无明显差异，仅P5感染组猪只在感染后6d体温升高到40.1℃，持续一天后体温恢复正常。结果表明嵌合毒株rWH-SD对仔猪无明显致病性。

1.2感染仔猪病毒血症、鼻腔排毒

在感染后不同时间点采集试验仔猪血清样本，利用RT-PCR检测样本中嵌合毒株的核酸，分析仔猪病毒血症持续情况，结果见表9，P5感染组仔猪均从7天开始2/5病毒血症为阳性，21天后全部为阴性；P20感染组仔猪和P40感染组仔猪与对照组一致，在试验过程均未出现病毒血症。

表9仔猪血清中病毒核酸的RT-PCR检测结果

注：分母表示检测样品数，分子表示阳性数

在感染后不同时间点采集试验仔猪鼻拭子，利用RT-PCR检测样本中嵌合毒株的核酸，分析感染仔猪鼻腔排毒情况，结果见表10。P5感染组仔猪在第7天2/5出现鼻腔排毒，排毒一直持续到14天转为阴性；P20、P40感染组仔猪在试验过程中与对照组一直，均未检测到鼻腔排毒。

表10仔猪鼻腔排毒检测结果

注：分母表示检测样品数，分子表示阳性数

1.3感染仔猪大体剖检变化

采集仔猪肺脏及下颌淋巴结，制成石蜡切片，进行免疫组化染色，观察PRRSV抗原在感染仔猪组织中的分布，结果见表11。参照Halbur等的方法，对免疫组化结果进行评分，即随机选取5个视野，按照PRRSV阳性细胞数记平均值：无PRRSV阳性细胞为0分；1-10个阳性细胞为1分；11-30个阳性细胞为2分；31-100个阳性细胞为3分；多于100个阳性细胞为4分。嵌合病毒不同代次毒株感染仔猪的免疫组化打分情况见表。结果显示，随着嵌合病毒传代次数增多，感染仔猪组织中的病毒抗原呈减少趋势。

表11感染仔猪肺脏及下颌淋巴结PRRSV抗原的免疫组化评分结果

2、嵌合毒株rWH-SD的免疫保护效果评估

2.1免疫仔猪攻毒后PRRSV中和抗体的检测

已有报道，猪血清中PRRSV中和抗体滴度与保护性之间存在相关关系，当中和抗体滴度达到1：16时可以保护母猪，防止产生繁殖障碍，并阻止胎盘感染；当中和滴度≥1：8时，可以保护仔猪，防止病毒血症；当中和抗体滴度达到1：32时，能够完全消除病毒。这些研究表明，中和抗体滴度≥1：16时可以保护猪免受PRRSV感染。

将28日龄PRRSV抗体阴性仔猪20头分为4组，每组5头，第一组、第二组和第三组为免疫组，其中第一组为嵌合毒株rWH-SD免疫组(rWH-SD P20，10⁵TCID₅₀/ml)，第二组为市售勃林格VR2332疫苗免疫组，第三组为SD1602株灭活疫苗免疫组(10^8.5TCID₅₀/头)，第四组为非免疫对照组。第1、2免疫组各颈部肌肉注射1.0ml；第3组颈部肌肉注射2ml，一免后21日，以相同剂量，相同途径进行二免。所有免疫组首免后连同对照猪5头，每周采血，分离血清，测定PRRSV中和抗体效价。

病毒中和试验(间接免疫荧光法)：

(1)血清处理无菌待检血清56℃水浴灭活30min。

(2)血清稀释在96孔细胞培养板各孔中加入50μL无血清的DMEM培养基，随后将待检血清作连续系列稀释，从1:2至1:128，每个稀释度作4个重复。

(3)病毒中和用无血清的DMEM培养基将PRRSV-NADC30 SD1602株稀释为200TCID₅₀/50μL病毒液，将稀释好的病毒液加入到血清稀释孔中，每孔50μl，置37℃、含5％CO₂的培养箱中作用1h。

(4)病毒对照设200TCID₅₀/50μL、20TCID₅₀/50μL、2TCID₅₀/50μL和0.2TCID₅₀/50μL 4个不同病毒含量的病毒对照，各接种上述96孔细胞培养板8孔，每孔50μL，再在每孔补加50μL无血清的DMEM培养基。

(5)加入Marc-145细胞将长满单层的Marc-145细胞用胰酶消化后，用DMEM培养基(含4％新生牛血清)吹下，计数后用DMEM培养基(含4％新生牛血清)调整细胞密度至2.0×10⁵个/ml，将调整好的细胞悬液接种于病毒中和完成的96孔细胞培养板，每孔100μl置37℃、含5％CO₂的培养箱培养。

(6)细胞对照在上述96孔细胞培养板中设置8孔细胞对照，每孔加入100μL无血清的DMEM培养基。

(7)荧光检测将96孔板置37℃、5％CO₂条件72小时。弃掉培养基，用PBS(0.01mol/L，pH值7.4，下同)洗3次，每次5分钟。每孔加入200μL预冷的甲醇：丙酮＝1：1混合液，-15℃以下固定30分钟。PBS洗3次，每次5分钟，最后一次拍干。每孔加入2％PBSA(含2％BSA的PBS)200μl，室温封闭1小时。PBS洗3次，每次5分钟，最后一次拍干。每孔加入PRRSV N蛋白单抗1F5(工作浓度1：100)100μL，37℃作用1小时。PBS洗5次，每次5分钟，最后一次拍干。每孔加入FITC标记的羊抗鼠IgG的二抗(工作浓度1：100)，37℃作用1小时。PBS洗5次，每次5分钟。随后在荧光显微镜下观察结果。

(8)结果判定病毒对照中200TCID₅₀和20TCID₅₀应全部孔出现特异性荧光信号、2TCID₅₀应有1～4孔出现特异性荧光信号、0.2TCID₅₀应全部孔不出现特异性荧光信号，细胞对照应无荧光信号，按Reed-Muench法计算被检血清中PRRSV中和抗体的效价。

中和抗体滴度结果见附图8。结果表明，嵌合毒株制备而成的疫苗，免疫后35d达到1：16，相比较VR2332和SD1602株制备的灭活疫苗能够较快的将中和抗体滴度提高至保护猪免受感染的水平，并且在其后达到并维持1：16以上的中和抗体滴度峰值水平。综上，嵌合毒株制备而成的活疫苗可保护猪免受PRRSV和NADC30的感染，且相较于SD1602株，免疫原性得到显著提高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合重组疫苗株及其应用

<130> KHP201117178.8

<160> 49

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgttggaga aatgcttgac cgcgggctgt tgctcgcaat tgctttcttt gtggtgtatc 60

gtgccgttct gttttgctgt gctcgccaac gccagcagcg acagcagctc ccatctacag 120

ctgatttaca acttgacgct atgtgagctg aatggcacag attggctagc taacaaattt 180

gattgggcag tggagagttt tgtcatcttt cccgttttga ctcacattgt ctcctatggt 240

gccctcacta ccagccattt ccttgacaca gtcgctttag tcactgtgtc taccgccggg 300

tttgttcacg ggcggtatgt cctaagtagc atctacgcgg tctgtgccct ggctgcgttg 360

acttgcttcg tcattaggtt tgcaaagaat tgcatgtcct ggcgctacgc gtgtaccaga 420

tataccaact ttcttctgga cactaagggc ggactctatc gttggcggtc gcctgtcatc 480

atagagaaaa ggggcaaagt tgaggtcgaa ggtcatctga tcgacctcaa aagagttgtg 540

cttgatggtt ccgtggcaac ccctataacc agagtttcag cggaacaatg gggtcgtcct 600

tagatgactt ctgtcatgat agcacggctc cagaaaaggt gcttttggcg ttttctatta 660

cctacacgcc agtgatgata tatgccctaa aggtgagtcg cggccgactg ctagggcttc 720

tgcacctttt gatcttcctg aattgtgctt tcaccttcgg gtacatgact ttcgcgcact 780

ttcagagtac aaataaggtc gcgctcacta tgggagcagt agttgcactc ctttgggggg 840

tgtactcagc catagaaacc tggaaattca tcacctccag atgccgtttg tgcttgctag 900

gccgcaagta cattctggcc cctgcccacc acgttgaaag tgccgcaggc tttcatccga 960

ttgcggcaaa tgataaccac gcatttgtcg tccggcgtcc cggctccact acggtcaacg 1020

gcacattggt gcccgggtta aaaagcctcg tgttgggtgg cagaaaagct gttaaacagg 1080

gagtggtaaa ccttgtcaaa tatgccaaat aacaacggca agcagcagaa gagaaagaag 1140

ggggatggcc agccagtcaa tcagctgtgc cagatgctgg gtaagatcat cgctcagcaa 1200

aaccagtcca gaggcaaggg accgggaaag aaaaataaga agaaaaaccc ggagaagccc 1260

cattttcctc tagcgactga agatgatgtc agacatcact ttacccctag tgagcggcaa 1320

ttgtgtctgt cgtcaatcca gaccgccttt aatcaaggcg ctgggacttg caccctgtca 1380

gattcaggga ggataagtta cactgtggag tttagtttgc ctacgcatca tactgtgcgc 1440

ctgatccgcg tcacagcatc accctcagca tga 1473

<210> 2

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgttgggga aatgcttgac cgcgggttat tgctcgcaat tgcctttttt gtggtgtatc 60

gtgccattct gttttgctgt gctcgtcaac gccaacaaca acagcagctc ccatttgcaa 120

ttgatttata acctgacgat atgtgagctg aatggcacag attggttgga taaaaaattt 180

gactgggcag tggagacttt cgttatcttt cctgtgttga ctcacatcgt ctcttacggt 240

gcccttacca ctagccattt tcttgacacg gtcggcctaa tcactgtgtc caccgccgga 300

tattatcacg agcggtatgt attgagtagc atctacgctg tctgtgctct ggctgcgttg 360

gtttgcttcg ccattaggtt ggcgaaaaat tgcatgtcct ggcgctactc atgcaccaga 420

tataccaatt ttcttctgga caccaagggc aaactttacc gttggcggtc acccgtcatt 480

atagagaagg gtggtaaagt tgatgtgggg ggtcatttaa tcgacctcaa gagagttgtg 540

cttgatggtt ccgcggcaac ccctgtaacc aagatttccg cggaacaatg gggtcgtcca 600

tagacgactt ctgcaatgac agcacggctg tacaaaaggt gcttttggcg ttttctatca 660

cctacacgcc aataatgata tatgccttaa aggtgagtcg cggtcgactg ctggggctct 720

tgcacctctt aattttccta aattgtgctt ttacttttgg gtatatgaca tttgctcatt 780

ttcagagtac aaacaaggtt gcactttcca tgggggctgt ggtcgccctc ctctgggggg 840

tctactcagc cattgaaacc tggagattca tcacctccag atgccggttg tgcttgctag 900

gccgcaagta cattctggcc cctgcccacc acgttgaaag tgccgcaggc tttcatccga 960

taacggcaag tgataaccac gcatttgtcg tccggcgtcc cggctccact acggttaacg 1020

gcacattggt gcccgggttg aagagcctcg tgttgggtgg cagaagagct gttaaacgag 1080

gagtggtgaa ccttgttaaa tatgccaaat aacaacggca ggcagcaaaa caaaaagaag 1140

gggaatggcc agccagtcaa tcagctgtgc cagatgctgg gtaagattat cgcccaacag 1200

agccagtcca gaggtagggg accgggaaag aggaataaga ataaaaaccc ggagaagcct 1260

cattttcctc tagcgactga agatgacgtc agacatcact ttacccctag tgagcggcaa 1320

ctgtgtctgt cgtctatccg gaccgccttt aaccaaggcg ctggaacttg taccctgtca 1380

gactcaggga gattaagtta cgctgtggag tttagtttgc ctactcataa taccgtgcgc 1440

ctgattcgcg tcacaacgtc accctcagca tga 1473

<210> 3

<211> 3188

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaatggg gtccatgcaa agcctttttc acaaaattgg ccaacttttt gtggatgctt 60

tcacggagtt cttggtgtcc attgttgata tcattatatt tttggccatt ttgtttggct 120

tcaccatcgc cggttggctg gtggtctttt gcatcagatt ggtttgctcc gcgatactcc 180

gtacgcgccc tgccattcac tctgagcaat tacagaagat cttatgaggc ctttctttcc 240

cagtgccaag tggacattcc cacctgggga actaaacatc ctttggggct gctttggcac 300

cataaggtgt caaccctgat tgatgaaatg gtgtcgcgtc gaatgtaccg catcatggaa 360

aaatcagggc aggctgcctg gaaacaggtg gtgagcgagg ctacgctgtc tcgcattagt 420

agtttggatg tggtggctca ttttcagcat ctagccgcca ttgaagccga gacctgtaaa 480

tatttggcct cccggctgcc catgctacac aacctgcgca tgacaggttc aaatgtaacc 540

atagtgtata atagcacttt gaatcaggtg tttgctattt ttccaacccc tggttcccgg 600

ccagagcttc atgattttca gcaatggtta atagctgtac attcctccat attttcctct 660

gttgcagctt cttgtactct ttttgttgtg ctgtggttgc gggttccaat actacgtact 720

gtttttggtt tccgctggtt aggggcaatt tttctttcga actcacagtg aattacacgg 780

tgtgtccacc ttgcctcacc cggcaagcag ccacagagat ctacgaaccc ggtaggtctc 840

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tggtaccgcc tggcctctcc agcgaaggcc acttgactag tgtttacgcc tggttggcgt 960

tcttgtcctt cagctacacg gcccagttcc atcccgagat attcgggata gggaatgtga 1020

gtcgagttta tgttgacatc aaacatcaac tcatctgcgc cgaacatgac gggcagaaca 1080

ccaccttgcc tcgtcatgac aacatttcag ccgtgtttca gacctattac caacatcaag 1140

tcgacggcgg caattggttt cacctagaat ggcttcgtcc cttcttttcc tcgtggttgg 1200

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tgcagatatt aagaccaaca ccaccgcagc ggcaggcttt gctgtcctcc aagacatcag 1320

gtgccttagg catcgcgact cggcctctga ggcgattcgc aaaatccctc agtgccgtac 1380

ggcgataggg acacccgtgt atgttaccat cacagccaat gtgacagatg agaattattt 1440

acattcttct gatctcctca tgctttcttc ttgccttttc tatgcttctg agatgagtga 1500

aaagggattt aaggtggtat ttggcaatgt gtcaggcatc gtggctgtgt gtgtcaattt 1560

taccagctac gtccaacatg tcaaggagtt tacccaacgc tccctggtgg tcgaccatgt 1620

gcggttgctc catttcatga cacctgagac catgaggtgg gcaactgttt tagcctgtct 1680

ttttgccatt ctgttggcaa tttgaatgtt taagtatgtt ggggaaatgc ttgaccgcgg 1740

gttattgctc gcaattgcct tttttgtggt gtatcgtgcc attctgtttt gctgtgctcg 1800

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agctgaatgg cacagattgg ttggataaaa aatttgactg ggcagtggag actttcgtta 1920

tctttcctgt gttgactcac atcgtctctt acggtgccct taccactagc cattttcttg 1980

acacggtcgg cctaatcact gtgtccaccg ccggatatta tcacgagcgg tatgtattga 2040

gtagcatcta cgctgtctgt gctctggctg cgttggtttg cttcgccatt aggttggcga 2100

aaaattgcat gtcctggcgc tactcatgca ccagatatac caattttctt ctggacacca 2160

agggcaaact ttaccgttgg cggtcacccg tcattataga gaagggtggt aaagttgatg 2220

tggggggtca tttaatcgac ctcaagagag ttgtgcttga tggttccgcg gcaacccctg 2280

taaccaagat ttccgcggaa caatggggtc gtccatagac gacttctgca atgacagcac 2340

ggctgtacaa aaggtgcttt tggcgttttc tatcacctac acgccaataa tgatatatgc 2400

cttaaaggtg agtcgcggtc gactgctggg gctcttgcac ctcttaattt tcctaaattg 2460

tgcttttact tttgggtata tgacatttgc tcattttcag agtacaaaca aggttgcact 2520

ttccatgggg gctgtggtcg ccctcctctg gggggtctac tcagccattg aaacctggag 2580

attcatcacc tccagatgcc ggttgtgctt gctaggccgc aagtacattc tggcccctgc 2640

ccaccacgtt gaaagtgccg caggctttca tccgataacg gcaagtgata accacgcatt 2700

tgtcgtccgg cgtcccggct ccactacggt taacggcaca ttggtgcccg ggttgaagag 2760

cctcgtgttg ggtggcagaa gagctgttaa acgaggagtg gtgaaccttg ttaaatatgc 2820

caaataacaa cggcaggcag caaaacaaaa agaaggggaa tggccagcca gtcaatcagc 2880

tgtgccagat gctgggtaag attatcgccc aacagagcca gtccagaggt aggggaccgg 2940

gaaagaggaa taagaataaa aacccggaga agcctcattt tcctctagcg actgaagatg 3000

acgtcagaca tcactttacc cctagtgagc ggcaactgtg tctgtcgtct atccggaccg 3060

cctttaacca aggcgctgga acttgtaccc tgtcagactc agggagatta agttacgctg 3120

tggagtttag tttgcctact cataataccg tgcgcctgat tcgcgtcaca acgtcaccct 3180

cagcatga 3188

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggcgttcgc ctgcaaacca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatttcggcc gcatggttct 20

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctgcaggta atacgactca ctatagggta tgacgtatag gtgttggc 48

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctttgccgcg gccctctcac cctgcaggta atacgactc 39

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcactgaggc atcgtgtgca gtatacttgg ccctccgcca taaac 45

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtttatggcg gagggccaag tatactgcac acgatgcctc agtgc 45

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtttatggcg gagggccaag tatactgcac acgatgcctc agtgc 45

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtgcttgtac tagcgccaag tacgtactta 30

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gccggagtcc taggtggcga atgatatccg ggggtcgttg cca 43

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttggcaacga cccccggata t 21

<210> 14

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgataggcat atgcgccgga gtcctagggc ctgctccacg gaaag 45

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tacatgatat cattcgccac ctaggtatga tgaatgtcga c 41

<210> 17

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gctggattta taacgatagg catatgctgt gcatagatca cca 43

<210> 18

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctggattta taacgatagg catatgctgt gcatagatca cca 43

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aagttcgcga atcgctggat ttataaattt tcccttcctg 40

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgccaggaag ggaaaattta taaggcc 27

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tcccctattt aaattgaagt tcgcgatgcc taaggcacct ga 42

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccttaggcat cgcgactcg 19

<210> 23

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atttaaattt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttta atttcggccg 60

c 61

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tatgacgtat aggtgttggc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

acctcgtgct ccttggcctg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tatgacgtat aggtgttggc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

acctcgtgct ccttggcctg 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ttccggtttg gcagtcacaa 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gcggttagtc tttcacggtg 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cgcagaacgg gggcgttctg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cagagggttg ctcaatgggg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aactgctcct aatgaggtcg 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

acccgagctg aattgcccgt 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

acccgagctg aattgcccgt 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tgtcaccggg cgagagttga 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

aacatgagga atgcagcggg 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

catataactc aaacccgggg 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gttctgcaga atacaaggtt 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gttctgcaga atacaaggtt 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

cggctgcaat actcatggac 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ttatccccgt tgcctagagc 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

acacaggcag ctgcagggct 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

caacaatgga caccaagaac 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gccaccagct tgaagtttta 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ggattttgcg aatcgcctca 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

aggcgttcgc ctgcaaacca 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

gtggtgggca ggggccagaa 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

aataaggtcg cgctcactat 20

<210> 49

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttaatttcg gccgcat 47

Claims

1.一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合重组疫苗株，其特征在于，所述嵌合重组疫苗株为通过将猪繁殖与呼吸综合征病毒株的GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因替换为NADC30-like毒株对应的基因得到。

2.根据权利要求1所述的嵌合重组疫苗株，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒株为猪繁殖与呼吸综合征WH株，和/或，所述NADC30-like毒株为SD1602。

3.根据权利要求2所述的嵌合重组疫苗株，其特征在于，所述嵌合重组疫苗株为通过将猪繁殖与呼吸综合征WH株基因序列中如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列替换为如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列得到。

4.根据权利要求3所述的嵌合重组疫苗株，其特征在于，所述嵌合重组疫苗株的基因组序列包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1-4任一项所述的嵌合重组疫苗株，其特征在于，所述嵌合重组疫苗株的保藏号为：CCTCC NO:V202084。

6.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1-5任一项所述的嵌合重组疫苗株和佐剂。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述嵌合重组疫苗株在所述疫苗汇总含量不低于10⁵TCID₅₀/mL，和/或，所述佐剂为明胶，所述明胶和所述嵌合重组疫苗株的质量比为1:5～8。

8.一种构建猪繁殖与呼吸综合征嵌合重组疫苗株的方法，其特征在于，包括：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述病毒拯救过程包括：

10.权利要求1-4任一项所述嵌合重组疫苗株，或权利要求5或6所述疫苗在制备同时免疫猪繁殖与呼吸综合征病毒和NADC30-like感染的药物中的应用。