CN114134179B - 表达g2型猪流行性腹泻病毒s/s1的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒及其应用 - Google Patents

表达g2型猪流行性腹泻病毒s/s1的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种表达G2型猪流行性腹泻病毒S/S1的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒及其应用，属于兽用生物制品技术领域。本发明提供两株重组表达G2型PEDV流行株S或S1基因的PRRSV嵌合病毒。基于PRRSV天然弱毒株感染性克隆平台构建的这两株嵌合病毒，均可诱导猪体同时产生抵抗PEDV和PRRSV的中和抗体。这些嵌合病毒可作为活载体疫苗候选株，用于研制同时抵抗PEDV和PRRSV流行株的新型基因工程疫苗。本发明涉及两株重组表达G2型PEDV流行株S或S1基因的PRRSV嵌合病毒的构建与拯救。这些嵌合病毒为有效防控PED和PRRS疫情提供了新型疫苗候选株和关键技术支持,同时抵抗PEDV和PRRSV流行株的基因工程活疫苗的成功研制可以实现“一针两防”，具有巨大经济价值和良好的市场前景。

Description

表达G2型猪流行性腹泻病毒S/S1的猪繁殖与呼吸综合征嵌合 病毒及其应用
技术领域
本发明涉及表达G2型猪流行性腹泻病毒S/S1的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒及其应用，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
猪流行性腹泻(PED)是严重危害全球养猪业的烈性传染病。临床上能引起仔猪腹泻，呕吐，脱水和代谢性酸中毒等症状。其病原体猪流行性腹泻病毒(PEDV)为单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科阿尔法冠状病毒属(CoV-α)。PEDV可以感染所有年龄猪，10日龄内仔猪感染后发病率和死亡率都可达到100％。疫苗免疫是防控PED的有效方法，然而，现有PEDV商品化疫苗(包含灭活疫苗以及基于G1型毒株的弱毒疫苗)无法为2010年以来出现的新型PEDV变异株(G2型)提供足够的交叉保护力。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)同样给全球养猪业造成巨大经济损失。临床上主要引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统综合征。其病原体猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)。PRRSV是目前已知变异最快的RNA病毒之一，然而，现有商品化疫苗无法提供抵抗新型流行株的良好交叉保护。
纤突蛋白(Spike,S)是PEDV的主要跨膜蛋白。S蛋白一般可分为2个结构域：S1和S2。S1(1-789氨基酸)为高突变区，可识别并与特异性受体结合。S2(790-1383氨基酸)为保守区，主要与细胞膜融合。S蛋白主要位于病毒表面，可与细胞上的受体结合，并通过膜融合的方式使病毒进入宿主细胞。同时，S蛋白含有至少四个中和表位，在刺激宿主产生中和抗体诱导保护性免疫应答中起重要作用。因此，S蛋白常作为PED基因工程疫苗研制的靶标抗原。
反向遗传操作技术已成为新型基因工程疫苗研制的重要方法。为减轻当前猪群多种病原疫苗免疫压力，利用PRRSV反向遗传操作技术研制同时防控PED和PRRS的基因工程活疫苗，实现“一针防两病”具有重要意义。但相关研究尚未有报道。
发明内容
针对目前缺乏同时有效防控我国PEDV和PRRSV流行株的商品化疫苗问题，本发明提供两株重组表达G2型PEDV流行株S或S1基因的PRRSV嵌合病毒。这两株嵌合病毒接种猪体均可同时诱导PEDV和PRRSV的中和抗体，为研制国内外首个PEDV重组PRRSV基因工程活载体疫苗，实现“一针两防”，提供了疫苗候选株。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种重组载体，用于构建表达G2型猪流行性腹泻病毒S蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种重组载体，用于构建表达G2型猪流行性腹泻病毒S1蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
表达G2型猪流行性腹泻病毒S/S1基因的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，利用如权利要求1或2所述重组载体所拯救构建。
在本发明的一个方面，提供了重组表达G2型PEDV流行株S或S1蛋白的HP-PRRSV 嵌合病毒。这两株嵌合病毒不仅包含全长HP-PRRSV天然弱毒株JSTZ1712-12的全基因序列，还包含G2型PEDV流行株XJ1904-34(GenBank登录号：OL348059)的S或者S1基因。
在本发明的另一个方面，提供了构建重组表达G2型PEDV流行株S或S1基因的 HP-PRRSV嵌合病毒的方法。具体包括以HP-PRRSV天然弱毒株感染性克隆rJSTZ1712-12 为活病毒载体，利用同源重组或者双酶切连接等方法在其ORF1b和ORF2a基因之间插入G2 型PEDV流行株S或S1基因序列。构建拯救表达G2型PEDV流行株S或S1蛋白的PRRSV 嵌合病毒。
在本发明的另一个方面，提供了一种活病毒载体。具体为HP-PRRSV天然弱毒株感染性克隆rJSTZ1712-12活病毒载体。包含HP-PRRSV JSTZ1712-12分离株基因组全长cDNA序列，该全长cDNA序列的5’端加有巨细胞病毒真核启动子序列，3’端Poly(A)尾下游加有丁肝炎病毒核酶序列以及牛生长激素多聚腺苷酸信号转录终止序列；上述活病毒载体是以pACYC177低拷贝载体为框架，在pACYC177载体上插入四个单一限制性酶切位点PacI,AflII,AscI和NotI，用于构建天然弱毒株JSTZ1712-12感染性克隆。
优选的，所述的方法包括如下步骤：
1)PEDV-S和PEDV-S1基因扩增；
2)rJSTZ1712-12-S或rJSTZ1712-12-S1重组质粒的构建；
2-1：将PEDV-S或PEDV-S1片段插入rJSTZ1712-12-F3中间质粒；
2-2：将F3-S或F3-S1片段插入到rJSTZ1712-12全长质粒。
3)rJSTZ1712-12-S或rJSTZ1712-12-S1嵌合病毒拯救。
在本发明的另一个方面，嵌合病毒在制备新型基因工程疫苗中的应用。具体为，本发明提供了能同时抵抗我国PEDV和PRRSV流行株的新型基因工程活疫苗候选株。将上述构建拯救的两株嵌合病毒体外连续传代后用于接种猪体，均可同时诱导猪体产生抵抗PEDV和PRRSV的中和抗体，这两株嵌合病毒可用于制备新型PEDV和PRRSV的基因工程疫苗。
在本发明的另一方面，还涉及上述PEDV和PRRSV基因工程活疫苗在怀孕母猪免疫中的应用。上述嵌合病毒免疫母猪后诱导的PEDV和PRRSV中和抗体可通过母乳为新生仔猪提供抵抗PEDV和PRRSV流行株的感染。
有益效果：
本发明的显著特点包含：
1、以HP-PRRSV天然弱毒株感染性克隆病毒为活疫苗载体，构建重组表达G2型PEDV流行株S或S1蛋白的嵌合病毒；
2、所构建的嵌合病毒有良好的体内外增殖效力，接种Marc-145传代细胞均可引起细胞病变(CPE)，接种猪体可以出现特异性病毒血症；
3、所构建的嵌合病毒均具有良好的安全性，接种猪体后不引起发热(体外<40℃)，不影响增重，更不会引起仔猪死亡；
4、所构建的嵌合病毒可以诱导保护性免疫应答，接种猪均可同时诱导产生PEDV和PRRSV的中和抗体；
5、所构建的嵌合病毒可用于研制同时抵抗PEDV和PRRSV流行株的新型基因工程疫苗，减轻多种病原多次免疫压力，实现“一针防两病”，有利于我国PED和PRRS疫情的防控。
附图说明
图1是本发明实施例1中rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1嵌合病毒基因组全长cDNA 连接构建示意图；
图2是本发明实施例1中G2型PEDV流行株XJ1904-34的S和S1基因片段PCR扩增结果图；
图3是本发明实施例1中rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1重组质粒双酶切鉴定结果图；
图4是本发明实施例1中rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1感染性克隆病毒感染Marc-145细胞引起的细胞病变图；
图5是本发明实施例1中利用针对PEDV的S蛋白单克隆抗体和针对PRRSV的N蛋白单克隆抗体的间接免疫荧光检测法检测拯救的rJSTZ1712-12-S(A)和rJSTZ1712-12-S1(B)感染性克隆病毒结果图；
图6是本发明实施例1中利用荧光定量PCR方法检测rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1 感染性克隆病毒在Marc-145细胞上的动态增殖结果图；
图7是本发明实施例1中rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1感染性克隆病毒感染Marc-145细胞的噬斑结果图；
图8是本发明实施例2中rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1嵌合病毒接种猪体引起病毒血症结果图；
图9是本发明实施例2中rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1嵌合病毒接种猪体体温变化结果图；
图10是本发明实施例2中rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1嵌合病毒接种猪体体重变化结果图；
图11是本发明实施例2中rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1嵌合病毒接种猪血清体外中和G2型PEDV流行株的病毒中和试验结果图；
图12是本发明实施例2中rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1嵌合病毒接种猪血清体外中和PRRSV2流行株的病毒中和试验结果图。
核苷酸序列说明：
SEQ ID NO.1：重组载体rJSTZ1712-12-S的序列；
SEQ ID NO.2：重组载体rJSTZ1712-12-S1的序列；
SEQ ID NO.3：引物S/S1-KpnI-fusion-F的序列；
SEQ ID NO.4：引物S-BclI-fusion-R的序列；
SEQ ID NO.5：引物S1-Bcl1-fusion-R的序列。
具体实施方式
下列实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。
在本发明的实施例中，病毒有PEDV的XJ1904-34(GenBank登录号：OL348059)和YC2014(KU252649)分离株；PRRSV的SD1612-1(MN119304)，JSYC2005-1(MT746146)和JSTZ1712-12(MK906026)分离株。细胞有BHK-21细胞系，Vero细胞系和Marc-145细胞系。
在本发明实施例中，质粒和菌株：pACYC177质粒购自优宝生物，rJSTZ1712-12-F3和 rJSTZ1712-12质粒(Chen et al.,Veterinary Research,2021,52(1):74)保存于本实验室，Trans1-T1 感受态细胞购自北京全式金生物有限公司。
在本发明实施例中，使用的其他试剂：RNase Free H2O、胰酶细胞消化液(酚红)购自 Solarbio公司；TRIpure Reagent总RNA提取试剂购自艾德莱生物公司；PrimeScript1stStrand cDNA Synthesis Kit、2×PrimeSTAR MAX DNA Polymearse购自TAKARA公司；FastPure Plasmid Mini Kit购自诺维赞生物科技有限公司；DMEM培养基购自HyClone生物化学制品有限公司；胎牛血清购自Sigma公司；DyLight 594,Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody购自Invitrogen；DNA Marker购自浙江博而金科技股份有限公司；2×BioGold Tag Plus PCR MasterMix购自浙江博而金科技股份有限公司；同源重组试剂盒CloneExpress MultiS One Step Cloning Kit购自Vazyme公司；Gel Extraction Kit购自北京康为世纪生物科技有限公司； DNA限制性内切酶购自Thermo Fisher公司；T4 DNALigase、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent购自Invitrogen。
实施例1重组表达G2型PEDV流行株S/S1蛋白的PRRSV2嵌合病毒基因组全长cDNA克隆构建与拯救
1.1 PEDV-S和PEDV-S1基因扩增
为构建rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1重组质粒(图1)，首先根据我们实验室前期分离鉴定的G2型PEDV野毒株XJ1904-34基因组序列，使用Primer 5.0设计S和S1基因的特异性扩增引物。详见表1。PCR反应体系详见表2。PCR反应程序详见表3。取PCR反应产物2μL，使用浓度为0.9％的琼脂糖凝胶进行电泳。如图2所示，获得PEDV-S基因片段大小为4158bp，PEDV-S1基因片段大小为2376bp。扩增产物均通过测序验证序列正确。
表1、扩增PEDV的S和S1基因引物表
*特异性酶切位点由下划线标出。
#同源臂由斜体粗体标出。
表2、扩增PEDV的S和S1基因反应体系表
名称 体积
模板 XJ1904-34cDNA 2μL
引物 S或S1引物对 1μL
试剂 2×PrimeSTAR MAX DNA Polymearse 20μL
水 RNase Free H2O 补至40μL
表3、PEDV的S和S1基因PCR扩增程序
1.2 rJSTZ1712-12-S或rJSTZ1712-12-S1重组质粒的构建
1.2.1将PEDV-S或PEDV-S1片段插入rJSTZ1712-12-F3中间质粒
用前期报道的相同方法(Chen et al.,Transboundary and Emerging Diseases,2020, 67:1820-1827)，BclⅠ和KpnⅠ对rJSTZ1712-12-F3中间载体质粒进行双酶切，获得rJSTZ712-12-F3线性化载体片段。双酶切体系详见表4。反应条件：37℃水浴2h。
表4、rJSTZ1712-12-F3-RFP质粒双酶切反应体系
名称 体积
模板质粒 rJSTZ712-12-F3质粒 20μL
内切酶 BclⅠ 2μL
内切酶 KpnⅠ 2μL
试剂 10×CutSmart Buffer 4μL
水 RNase Free H2O 补至40μL
利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收。使用同源重组的方法将PEDV-S或S1基因连接到pJSTZ1712-12-F3线性化载体上。同源重组体系详见表5。
表5同源重组体系
将同源重组产物转化到Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用检测引物进行菌液PCR检测。选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，使用AscⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，0.9％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的重组质粒保留。
按照上述方法，完成将PEDV-S和PEDV-S1插入到rJSTZ1712-12-F3中，获得rJSTZ1712-12-F3-S或rJSTZ1712-12-F3-S1。
1.2.2将F3-S或F3-S1片段插入到rJSTZ1712-12全长质粒
用AscⅠ和NotⅠ对rJSTZ1712-12(Chen et al.,Veterinary Research,2021,52(1):74)和 rJSTZ1712-12-F3-S或rJSTZ1712-12-F3-S1进行双酶切，获得pJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-S以及F3-S1。rJSTZ1712-12，rJSTZ1712-12-F3-S和rJSTZ1712-12-F3-S1双酶切体系详见表6。反应条件：37℃水浴2h。
表6、重组质粒双酶切体系
利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收。胶回收的rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-S或F3-S1按摩尔比为1:8,以T4 DNA连接酶连接，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用检测引物进行菌液PCR检测。选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，然后，通过PacⅠ+AflⅡ、AflⅡ+AscⅠ和AscⅠ+HF-NotⅠ等内切酶组合对rJSTZ1712-12，rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1嵌合质粒进行双酶切鉴定，0.8％琼脂糖凝胶电泳。双酶切鉴定结果如图3所示，插入S基因后,F3-S片段的大小为7719bp，F3-S1的大小为5937bp。
按照上述方法，完成rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1重组质粒的构建。这两个重组质粒序列详见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
1.3rJSTZ1712-12-S或rJSTZ1712-12-S1嵌合病毒拯救
预先使用含10％FBS的DMEM培养基将BHK-21细胞按2.5×105细胞/孔的密度接种于 24孔细胞培养板，置于37℃,5％CO2的培养箱培养至细胞密度达到80％左右。按照LipofectamineTM3000Transfection Reagent说明进行细胞转染，具体操作如下：
首先在一个EP管中配置质粒预混液：感染性克隆质粒500ng,P3000 1μL,DMEM 25μL；在另一个EP管中配置Lip3000预混液：Lip3000 1.5μL,DMEM 25μL；最后将上述两步获得的预混液混合，室温静置15min,加入待转染的细胞。
预先使用含10％FBS的DMEM培养基将Marc-145细胞按2×105细胞/孔的密度接种于 12孔细胞培养板，置于37℃,5％CO2的培养箱培养，至细胞密度达到80％左右，换用含2％ FBS的DMEM培养基。
细胞转染后36-48h,将整个培养板冻于－80℃,反复冻融两次后取全部细胞悬液，10, 000×g离心1min。取全部上清加入Marc-145细胞，继续培养，每天观察细胞情况。如图4所示，拯救病毒接种Marc-145后72h后可见细胞出现皱缩、聚集、脱落等CPE现象，阴性对照组细胞无明显CPE产生。rJSTZ1712-12-S或rJSTZ1712-12-S1嵌合病毒与亲本毒株(rJSTZ1712-12)CPE特征基本一致。如图5所示，取第3代拯救病毒接种Marc-145,48hpi 后使用PEDV抗S2蛋白单抗Anti-S2和PRRSV抗N蛋白单抗IC9C8作为一抗进行IFA检测，可见PEDV-S蛋白特异性绿色荧光，由于缺乏S1特异性单抗，未检测到S1特异性荧光信号，但两株重组病毒的PRRSV-N蛋白均出现特异性红色荧光，阴性对照组无荧光产生，再次证实两株嵌合病毒均拯救成活。
1.4 rJSTZ1712-12-S和S1与亲本毒rJSTZ1712-12的增值特性比对
预先使用含10％FBS的DMEM培养基将Marc-145细胞按1×105细胞/孔的密度接种于 24孔细胞培养板，置于37℃,5％CO2的培养箱培养，至细胞密度达到80％左右，换用含2％ FBS的DMEM培养基。
取rJSTZ1712-12、rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1第3代病毒液各200TCID50接种到24孔板的Marc-145细胞上。取2hpi、24hpi、48hpi、72hpi和96hpi共五个时间点进行多步生长曲线测定。多步生长曲线测定结果如图6所示，rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1的生长曲线与亲本毒rJSTZ1712-12无明显差异。
1.5 rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1噬斑实验
预先使用含10％FBS的DMEM培养基将Marc-145细胞按3×105细胞/孔的密度接种于6 孔细胞培养板，置于37℃,5％CO2的培养箱培养，至细胞密度达到80％左右，换用含2％FBS 的DMEM培养基。第二天观察细胞密度，直至细胞达到致密状态时进行下一步。
将rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1第3代病毒原液做10倍倍比稀释，稀释梯度为 -2～-4。将单层细胞的培养液弃去，加入600uL倍比稀释后的病毒液，感染1.5h，每20min摇晃一次。1.5h后弃去病毒液,用PBS轻柔清洗1到2次,配置0.7％低熔点琼脂糖培养液(30mL 培养基配方:15mL DMEM+600uL FBS+300uL青链霉素+最后倒入15mL1.4％低熔点琼脂液)，待冷却至37度左右，直接覆盖单层细胞。然后将6孔板倒置培养，四天后观察。空斑形成后，使用4％多聚甲醛覆盖培养基，固定过夜后进行结晶紫染色1h。染色完成后用水冲洗，观察。噬斑实验结果如图所示7所示，rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1的噬斑大小和形状与原毒相似。
实施例2嵌合病毒rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1仔猪接种试验及其安全性和免疫效力评价
2.1动物接种实验分组
3周龄的仔猪分为3组，5头猪接种rJSTZ1712-12-S，5头猪接种rJSTZ1712-12-S1，3头猪作为阴性对照。实验组仔猪分别鼻内和肌内接种2mL 105.0TCID50/mL rJSTZ1712-12-S和 rJSTZ1712-12-S1(第3代)。3只阴性组仔猪注射2ml DMEM。具体如表7所示：
表7动物实验分组
2.2动物实验PRRSV特异性病毒血症监测
接种rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1后，每周采集血清样本1～2次用于病毒载量测定。具体通过颈下前腔静脉采血，每次每只猪采血3mL。将采集的血清提取总RNA，然后反转录为cDNA，再用实时荧光定量(RT-PCR)法分析病毒血症动态。实时荧光定量法的具体反应体系和反应程序如下：
RT-PCR的体系：Probe 0.4μL、Primer 0.5μL、rTaq 10μL和血清cDNA 1μL，最后用RNase Free H2O补至20μL。
RT-PCR反应程序为：95℃30s热启动。95℃5s，60℃1min，40个循环。
根据上述方法，完成对接种后仔猪体内的病毒载量检测，结果如图8所示，rJSTZ1712-12-S 和rJSTZ1712-12-S1成功在仔猪体内复制。
2.3动物实验仔猪体温及体重测量
在接种后每天对仔猪进行体温测量，用3个肛温温度计分别用于rJSTZ1712-12-S组、 rJSTZ1712-12-S1组和阴性对照组仔猪的直肠温度进行测量。体温测量结果如图9所示， rJSTZ1712-12-S组和rJSTZ1712-12-S1组仔猪体温与阴性对照组相似，未出现发热(<40℃)。每周称量体重并做临床症状每日评估。体重测量结果如图10所示，rJSTZ1712-12-S组和 rJSTZ1712-12-S1组仔猪的体重与阴性对照组相似，无明显差异。初步显示其具有较好安全性。
2.4体外血清中和实验
预先使用含10％FBS的DMEM培养基将Vero细胞按4×104细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板，置于37℃,5％CO2的培养箱培养，至细胞密度达到80％左右。
将采集的rJSTZ1712-12-S组、rJSTZ1712-12-S1组和阴性对照组仔猪血清用DMEM按1：8、 1：16、1：32、1：64稀释。分别加入新96孔板中，然后在每个孔内加入100个TCID50YC2014 病毒。置于37℃,5％CO2的培养箱培养1.5h。然后将对应的血清病毒混合液加入接种有Vero 的96孔板的对应孔中。再置于37℃,5％CO2的培养箱培养1.5h，使病毒吸附。随后用PBS洗去未吸附的病毒颗粒，加入含2％FBS的DMEM培养基。四天后观察结果。PRRSV的血清中和实验同样按照上述方法进行。
中和实验结果如图11和图12所示，与阳性孔相比，接种rJSTZ1712-12-S和rJSTZ1712-12-S1 后，猪血清能够中和G2型PEDV毒株，也能中和2型PRRSV病毒，细胞没有病变出现。具体中和实验结果见表8。
表8中和抗体产生总体情况
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明技术方案而作的举例，并非对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明要求的保护范围之内。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 表达G2型猪流行性腹泻病毒S/S1的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 60
gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 120
agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 180
ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 240
cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 300
gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 360
cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 420
gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 480
ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 540
acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 600
ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 660
aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 720
aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccttaat aagatgatct 780
tcttgagatc gttttggtct gcgcgtaatc tcttgctctg aaaacgaaaa aaccgccttg 840
cagggcggtt tttcgaaggt tctctgagct accaactctt tgaaccgagg taactggctt 900
ggaggagcgc agtcaccaaa acttgtcctt tcagtttagc cttaaccggc gcatgacttc 960
aagactaact cctctaaatc aattaccagt ggctgctgcc agtggtgctt ttgcatgtct 1020
ttccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg actgaacggg 1080
gggttcgtgc atacagtcca gcttggagcg aactgcctac ccggaactga gtgtcaggcg 1140
tggaatgaga caaacgcggc cataacagcg gaatgacacc ggtaaaccga aaggcaggaa 1200
caggagagcg cacgagggag ccgccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1260
ggtttcgcca ccactgattt gagcgtcaga tttcgtgatg cttgtcaggg gggcggagcc 1320
tatggaaaaa cggctttgcc gcggccctct cacttccctg ttaagtatct tcctggcatc 1380
ttccaggaaa tctccgcccc gttcgtaagc catttccgct cgccgcagtc gaacgaccga 1440
gcgtagcgag tcagtgagcg aggaagcgga atatatcctg tatcacatat tctgctgacg 1500
caccggtgca gccttttttc tcctgccaca tgaagcactt cactgacacc ctcatcagtg 1560
ccaacatagt aagccagtat acactccgct agcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg 1620
ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag ccagaaagtg agggagccac 1680
ggttgatgag agctttgttg taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca 1740
cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc 1800
gatttattca acaaagccac gttgtgtctc aaaatctctg atgttacatt gcacaagata 1860
aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg 1920
ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg 1980
atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa 2040
tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta 2100
gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc 2160
ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg 2220
cgatccccgg gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata 2280
ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc 2340
cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt 2400
tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga 2460
aagaaatgca taagcttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct 2520
cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag 2580
tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt 2640
ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata 2700
aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt aattggttgt 2760
aacactggca gagcattacg ctgacttgac gggacggcgg ctttgttgaa taaatcgaac 2820
ttttgctgag ttgaaggatc agatcacgca tcttcccgac aacgcagacc gttccgtggc 2880
aaagcaaaag ttcaaaatca ccaactggtc cacctacaac aaagctctca tcaaccgtgg 2940
ctccctcact ttctggctgg atgatggggc gattcaggcc tggtatgagt cagcaacacc 3000
ttcttcacga ggcagacctc agcgctcaaa gatgcagggg taaaagctaa ccgcatcttt 3060
accgacaagg catccggcag ttcaacagat cgggaagggc tggatttgct gaggatgaag 3120
gtggaggaag gtgatgtcat tctggtgaag aagctcgacc gtcttggccg cgacaccgcc 3180
gacatgatcc aactgataaa agagtttgat gctcagggtg tagcggttcg gtttattgac 3240
gacgggatca gtaccgacgg tgatatgggg caaatggtgg tcaccatcct gtcggctgtg 3300
gcacaggctg aacgccggag gatcccgatg tacgggccag atatacgcgt tgacattgat 3360
tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 3420
agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 3480
gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 3540
gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 3600
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 3660
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 3720
ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 3780
cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 3840
atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 3900
ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgtta attaatacat gacgtatagg 3960
tgttggctct atgccacggc atttgtattg tcaggagctg tgaccatagg cacagcccaa 4020
aacttgctgc acgggaacac cctcctgtga cagccctctt cagggggatt aggggtctgt 4080
ccctaacacc ttgcttccgg agttgcactg ctttacggtc tctccacccc tttaaccatg 4140
tctgggatac ttgatcggtg cacgtgtacc cccaatgcca gggtgtttgt ggcggagggc 4200
caggtctact gcacacgatg tctcagtgca cggtctctcc ttcctctgaa tctccaagtt 4260
cctgagcttg gggtgctggg tctattctat aggcccgaag agccactccg gtggacgttg 4320
ccacgtgcat tccccactgt cgagtgctcc cccgccgggg cctgctggct ttctgcgatc 4380
tttccgattg cacgaatgac tagtggaaac ctgaactttc aacaaagaat ggtgcgggtc 4440
gcagctgaaa tctacagagc cggccaactc acccctacag ttctaaagac tctacaagtt 4500
tatgaacggg gttgtcgctg gtaccccatt gtcgggcccg tccctggggt gggcgtttac 4560
gccaactccc tgcatgtgag tgacaaacct ttcccgggag caactcatgt gttaaccaac 4620
ttgccgctcc cgcagaggcc caaacctgag gacttttgcc cttttgagtg tgctatggct 4680
gacgtctatg acattggtcg tggcgccgtc atgtatgtgg ccggaggaaa ggtctcttgg 4740
gcccctcgtg gtgggaatga agtgaaattt gaacctgtcc ccaaggagtt gaagttggtt 4800
gcgaaccgac tccacacctc cttcccgccc catcacgtag tggacatgtc caggtttacc 4860
ttcatgaccc ctgggagtgg tgtctccatg cgggttgagt accaatacgg ctgcctcccc 4920
gctgacactg tccctgaagg aaactgctgg tggcgcttgt ttgactcgct cccaccggaa 4980
gttcagtaca aagaatttcg ccacgctaac caatttggct atcaaaccaa gcatggtgtc 5040
cctggcaagt acctacagcg gaggctgcaa gttaatggtc ttcggacagt gaccgacaca 5100
catggaccta tcgtcataca gtacttctct gttaaggaga gttggatccg ccacctgaag 5160
ttggtggaag aacccagcct ccccgggttt gaggatctcc tcagaatcag ggttgagccc 5220
aatacgtcac cactggctgg aaaggatgag aagattttcc ggtttggcag tcataagtgg 5280
tacggtgccg gaaagagagc aaggaaaaca cgctctggtg cgactactat ggtcgctcat 5340
cacgcttcgt ccgctcataa aatccggcag gccacgaagc acgagggtgc cggcgctaac 5400
aaggctgagc atctcaagcg ctactctccg cctgccgaag ggaactgtgg ttggcactgc 5460
atttccgcca tcgccaaccg gatggtgaat tccaactttg agaccaccct tcctgaaaga 5520
gtaaggcctt cagatgactg ggccactgac gaggatcttg tgaataccat ccaaatcctc 5580
aggctccctg cggccttgga caggaacggc gcttgcggta gcgccaagta cgtgcttaaa 5640
ctggagggtg agcattggac tgtctctgtg atccctggga tgtcccctac tttgctcccc 5700
cttgaatgtg ttcagggttg ttgtggacat aagggcggtc ttgtttcccc ggatgcggtc 5760
gaaatttccg gatttgatcc tgcctgcctt gaccgactgg ctaaggtaat gcacttgcct 5820
agcagtacca tcccagccgc tctggccgaa ttgtccgacg actccaaccg tccggtttcc 5880
ccggccgcta ctacgtggac tgtttcgcaa ttctatgctc gtcatagagg aggagatcat 5940
catgaccagg tgtgcttagg gaaaatcatc agcctttgtc aagttattga ggactgctgc 6000
tgccatcaga ataaaaccaa ccgggctact ccggaagagg tcgcggcaaa gattgatcag 6060
tacctccgtg acgcaacaag tcttgaggaa tgcttggcca aacttgagag agtttccccg 6120
ccgagcgcag cggacacctc ctttgattgg aatgttgtgc ttcctggggt tgaggcgacg 6180
aatcagacaa ccgaacaacc tcacgtcaac tcatgctgca ccccggtccc tcccgtgact 6240
caagagcctt tgggcgagga ctcggtccct ctgaccgcct tctcactgtc caattgctat 6300
taccctgcac aaggtgacga ggttcatcac cgtgagaggt taaattccgc actctctaag 6360
ttggaagagg ttgtcctgga agaatatggg ctcatgtcca ctggacttgg cccgcgaccc 6420
gtgctgccga gcgggctcga cgagcttaaa gaccagatgg aggaggatct gctagaacta 6480
gccaacaccc aggcgacttc agaaatgatg gcctgggcgg ctgagcaggt cgatttaaaa 6540
gcttgggtca aaagctaccc gcggtggaca ccaccacccc ctccaccaag agttcaacct 6600
cgaagaacaa agtctgtcaa aagtttgcca gaggacaagc ctgtccctgc tccgcgcagg 6660
aaggtcagat ccgattgcgg cagcccggtt ttgatgggcg acaatgtccc taacggttcg 6720
gaagaaactg tcggtggtct cctcaatttt ccgacaccat ccgagccgat gacacctatg 6780
agtgagcccg tacttgtgcc cgcgtcgcga cgtgtcccca agctgatgac acctttgagt 6840
gggtcggcac cagttcctgc accgcgtaga actgtgacaa caacgctgac gcaccaggat 6900
gagcctctgg atttgtctgc gtcctcacaa acggaatatg aggcttcccc cctaacacca 6960
tcgcagaaca tgggcatcct ggaggcgggg gggcaagaag ctgagggagt cctgagtgaa 7020
atctcggata tactaaatga caccaaccct gcacctgtgt catcaagcag ctccctgggt 7080
tcagtggcca ccgaggatgt tccacgcatc ctcgggaaaa taggagacac tgacgagctg 7140
cttgaccggg gtccctcggc accctccaag ggagaaccgg tctgtgacca acctgccaaa 7200
gatccccgga tgtcgccgcg ggagtctgac gagagcataa tagttccgcc cgcagataca 7260
ggtggtgtcg gctcattcac tgatttgccg tcttcagatg gtgtggatgt ggacgggggg 7320
gggccgttaa gaacggtaaa aacaaaagca gaaaggctct tagatcaact gagctgccag 7380
gtttttagcc tcgtttccca tctccctatt ttcttctcac acctcttcaa atctgacagt 7440
ggttattctc cgggtgattg gggttttgca gcttttactc tattttgcct ctttttatgt 7500
tacagttacc cattcttcgg ttttgctccc ctcttgggtg tattttctgg gtcttctcgg 7560
cgtgtgcgaa tgggggtttt tggctgctgg ttggcttttg ctgttggtct gttcaagcct 7620
gtgtccgacc cagtcggcac tgcttgtgag tttgactcgc cagagtgtag gaacgtcctt 7680
cattcttttg agcttctcaa accttgggac cctgtccgca gccttgttgt gggccccgtc 7740
ggtctcggcc ttgccattct tggcaggtta ctgggcgggg cacgctacat ctggcacttt 7800
ttgcttaggc ttggcattgt tgcagactgt gtcttggctg gagcttatgt gctttctcaa 7860
ggtaggtgta aaaagtgctg gggatcttgt gtaagaactg ctcctaatga gatcgccttc 7920
aacgtgttcc cttttacacg tgcgaccagg tcgtcactca tcgacctgtg cgatcggttt 7980
tgcgcaccaa aaggcatgga ccccattttt ctcgccactg ggtggcgtgg gtgctggacc 8040
ggccggagtc ccattgagca accttctgaa aaacccatcg cgttcgccca gctggatgag 8100
aagaggatta cggctagaac tgtggtcgct cagccttatg atcccaacca ggccgtaaag 8160
tgcttgcggg tattacaggc gggtggggcg atggtggccg aggcagtccc aaaagtggtc 8220
aaagtttccg ctattccatt ccgagctcct ttctttcccg ctggagtgaa agttgatcct 8280
gattgcagaa tcgtggttga tcccgatact tttactacag ccctccggtc tggctattcc 8340
accgcgaacc tcgtccttgg tacgggggac tttgcccagc tgaatggact aaagatcagg 8400
caaatttcca agccttcagg gggaggccca cacctcattg ctgccttgca tgttgcctgc 8460
tcgatggcgt tacacatgct tgctggtgtt tatgtaactg cagtggggtc ctgcggtgcc 8520
ggtaccaacg atccgtggtg cactaacccg tttgctgtcc ctggctatgg acctggctct 8580
ctttgcacgt ctagattgtg catctcccaa cacggcctca ccttgccctt gacagcactt 8640
gtggcgggat tcggccttca agagattgcc ttggtcgttt tgatctttgt ctccatcgga 8700
ggcatggctc ataggttgag ttgtaaggct gacatgttgt gcatcttact cgcaatcgct 8760
agttatgttt gggtacctct tacctggttg ctttgtgtgt ttccttgttg gttgcgctgg 8820
ttctctttgc accccctcac catcctgtgg ttggtgtttt tcttgatttc tgtaaatata 8880
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cagaaaagct gttaagcagg gagtggtaaa ccttgttaaa tatgccaaat aacaacggca 22620
agcagcaaaa gaaaaagaag gggaatggcc agccagtcaa tcagctgtgc caaatgctgg 22680
gtaagatcat cgcccaacaa aaccagtcca gaggcaaggg accggggaag aaaaatagga 22740
agaaaaaccc ggggaagccc catttccctc tagcgactga agatgacgtc aggcatcact 22800
ttacccctag tgagcggcaa ttgtgtctgt cgtcgatcca gactgccttc aatcagggtg 22860
ctggaacttg tgccctgtca gattcaggga ggataagtta cactgtggag tttagtttgc 22920
cgacgcaaca tactgtgcgt ctgatccgcg ccacagcatc accctcagca tgatgggctg 22980
gcattctttg gcacctcagt gttagaattg ggagaatgtg tggtgaatgg cactgattga 23040
cactgtgcct ctaagtcacc tattcaatta gggcgaccgt gtgggggtaa agtttaattg 23100
gcgagaacca tgcggccgta attaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaggccgg catggtccca 23160
gcctcctcgc tggcgccggc tgggcaacat tccgagggga ccgtcccctc ggtaatggcg 23220
aatgggacgc ggccgcgcca ccgtctagag cgcacgaatg agggccgaca ggaagcaaag 23280
ctgaaaggaa tcaaatttgg ccgcaggcgt accgtggaca ggaacgtcgt gctgacgctt 23340
catcagaagg gcactggtgc aacggaaatt gctcatcagc tcagtattgc ccgctccacg 23400
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tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 23520
cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 23580
cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 23640
tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 23700
tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 23760
atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 23820
gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg t 23861
<210> 2
<211> 22079
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 120
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tcttgagatc gttttggtct gcgcgtaatc tcttgctctg aaaacgaaaa aaccgccttg 840
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gatttattca acaaagccac gttgtgtctc aaaatctctg atgttacatt gcacaagata 1860
aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg 1920
ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg 1980
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gctgccacga cttactggtc acgcagtccg gcgcggtgac taagagaggt ggcctgtcgt 12540
ctggcgaccc gattacctct gtgtcaaaca ccatttacag cttagtgata tatgcacagc 12600
acatggtgct cagttacttc aaaagtgctc accctcatgg ccttctgttt ctgcaagacc 12660
agctgaagtt tgaggacatg ctcaaggttc aacccctgac cgtctattcg gacgaccttg 12720
tgctgtatgc cgagtctccc tccatgccaa actaccactg gtgggttgaa catctgaacc 12780
ttatgctggg tttccagacg gacccaaaga agacaaccat cacagactca ccatcattcc 12840
taggttgcag gataataaat gggcgccagc tggtccctaa ccgtgacagg atcctcgcgg 12900
ccctcgccta ccacatgaag gcgagcaatg tttctgaata ctacgcctcg gcggctgcaa 12960
tactcatgga cagctgtgct tgtttggagt atgatcctga atggtttgaa gagctcgtgg 13020
ttgggatagc gcagtgcgcc cgcaaggacg gctacagctt tcctggccca ccgttcttct 13080
tgtccatgtg ggaaaaactc aggtccaatc atgaggggaa gaagtccaga atgtgcgggt 13140
actgcggggc cccggctccg tacgccactg cctgtggtct cgatgtctgt gtttaccaca 13200
cccacttcca ccagcattgt cctgttataa tctggtgtgg ccacccggcg ggttctggtt 13260
cttgtagtga gtgcgaaccc cccctaggaa aaggcacaag ccctctagat gaggtgttag 13320
aacaagttcc gtacaagcct ccgcggactg tgatcatgca tgtggagcag ggtctcaccc 13380
ctcttgaccc aggtagatac cagactcgcc gcggattggt ctccgttagg cgtggcatca 13440
ggggaaatga agtcgaccta ccagacggtg attacgccag taccgccttg ctccctactt 13500
gtaaagagat caacatggtc gctgtcgcct ctaacgtgtt gcgcagcagg tttatcatcg 13560
gcccacccgg tgctgggaaa acacactggc ttcttcaaca agtccaggat ggtgatgtca 13620
tttacacgcc aactcaccag accatgctcg acatgattag ggctttgggg acgtgccggt 13680
tcaacgttcc agcaggtaca acgctgcaat tccctgcccc ctcccgtacc ggcccatggg 13740
ttcgcatctt ggccggcggt tggtgtcctg gcaagaactc cttcctggat gaagcggcgt 13800
attgcaatca ccttgacgtc ttgaggcttc tcagtaaaac aactctcact tgcctagggg 13860
acttcaaaca actccaccct gtgggttttg actcccattg ctatgtattt gacatcatgc 13920
ctcagaccca attaaagacc atctggaggt tcgggcagaa tatctgtgat gccattcaac 13980
cagattacag ggacaaactt atggccatgg tcaacacgac ccgtgtgacc tacgtggaaa 14040
aacctgtcag gtacgggcaa gtcctcaccc cctaccacag ggaccgagag gacggcgcca 14100
ttactatcga ctccagtcaa ggcgccacat ttgatgtggt tacactgcat ttgcccacta 14160
aagattcact caacaggcaa agagctcttg ttgctatcac cagggcaagg catgctatct 14220
tcgtgtatga cccacacagg caattgcaga gcatgtttga tcttcccgcg agaggcacac 14280
ccgtcaacct cgcagtgcac cgtgacgaac agctgatcgt attagacaga aacaacagag 14340
aaatcacggt tgctcaggct ctaggcaatg gagataaatt cagggccaca gataagcgcg 14400
ttgtagattc tctccgcgct atttgcgcag acctggaagg gtcgagctcc ccgctcccca 14460
aggtcgcgca taacttggga ttccatttct cacctgattt gactcagttt gctaaactcc 14520
cggcagaact tgcaccccac tggcccgtgg tgacaaccca gaacaatgaa aggtggccag 14580
atcggctggt agccagcctc cgccctatcc ataaatatag ccgcgcgtgc attggtgccg 14640
gctatatggt gggcccctcg gtgtttttag gcacccctgg ggttgtgtca tactatctca 14700
caaaatttgt tagaggcgag gctcaagtgc ttccggagac agtcttcagc accggccgaa 14760
ttgaggtaga ttgtcgagag tatcttgatg atcgggagcg agaagttgct gagtccctcc 14820
cacatgcctt catcggcgat gtcaaaggta ccaccgttgg gggatgtcat cacgttacct 14880
ccaaatacct tccgcgcttc cttcccaagg aatcagttgc ggtggtcggg gtttcgagcc 14940
ccgggaaagc cgcgaaagca gtttgcacat tgacggatgt gtacctccca gaccttgaag 15000
cgtacctcca cccagagacc cagtccaggt gctggaaagt gatgttggac tttaaggagg 15060
ttcgactgat ggtatggaaa gacaagacgg cctattttca acttgaaggc cgccatttta 15120
cctggtatca acttgcaagc tacgcctcat acatccgagt tcctgttaat tctactgtgt 15180
acttggaccc ctgcatgggc cctgctcttt gcaacaggag ggttgtcggg tccacccatt 15240
ggggagctga cctcgcagtc accccttatg attacggtgc caaaattatt ctgtctagtg 15300
cataccatgg tgaaatgcct ccaggttaca aaattctggc gtgcgcggag ttctcgcttg 15360
atgatccagt aaggtacaaa cacacctggg gatttgaatc ggatacagcg tatctgtacg 15420
agtttactgg aaatggtgag gactgggagg attacaatga tgcgtttcgg gcgcgccaga 15480
aagggaaaat ttataaagct aatgccacca gcatgaggtt tcattttccc ccgggccctg 15540
tcattgaacc aactttaggc ctgaattgaa ggtaccgcca ccatgaagtc tttaacctac 15600
ttctggttgt tcttaccagt actttcaaca tttagcctac cacaagatgt caccaggtgc 15660
tcagctaaca ctaattttag gcggttcttc tcaaaattta atgttcaggc gcctgcagtt 15720
gttgtactgg gcggttatct acctataggt gaaaaccagg gtgtcaattc aacttggtac 15780
tgtgctggtc gacatccaac tgctagtggc gttcatggta tctttgttag ccatatcaga 15840
ggtggtcatg gctttgagat tggcatttcg caagagcctt ttgaccctag tggttaccag 15900
ctttatttac ataaggctac taacggtaac actaatgcta ctgcgcgact gcgcatttgc 15960
cagtttccta gcattaaaac attgggcccc actgctaata atgatgttac aacaggtcgt 16020
aactgcctat ttaacaaagc catcccagct catatgagtg aacatagtgt tgtcggcata 16080
acatgggata atgatcgtgt cactgtcttt tctgacaaga tctatcattt ttattttaaa 16140
aatgattggt cccgtgttgc gacaaattgt tacaacagtg gaggttgtgc tatgcaatat 16200
gtttacgaac ccacttacta cacacttaat gttactagtg ctggtgagga tggtatttct 16260
tatcaactct gtacagctaa ttgcattggt tatgctgcca atgtatttgc tactgagccc 16320
aatggccaca taccagaagg ttttagtttt aataattggt ttcttttgtc caatgattcc 16380
actttggtgc atggtaaggt ggtttccaac caaccattgt tggtcaattg tcttttggcc 16440
attcctaaga tttatggact aggccaattt ttctccttta ataaaacgat cgatggtgtt 16500
tgtaatggag ctgctgtgca gcgtgcacca gaggctctga ggtttaatat taatgacacc 16560
tctgtcattc ttgctgaagg ctcaattgta cttcatactg ctttaggaac aaatttttct 16620
tttgtttgca gtaattcctc aaatcctcat ttagccacct tcgccatacc tttgggtgct 16680
acccaagtac cctattattg ttttcttaaa gtggatattt acaattccac tgtttataaa 16740
ttcttggctg ttttacctcc caccgtcagg gaaattgtca tcaccaagta tggtgatgtt 16800
tatgttaatg ggtttggcta cttgcatctc ggtttattgg atgctgtcac aattaacttc 16860
actggtcatg gcattgacga tgacgtttct ggtttttgga ccatagcatc gactaatttt 16920
gttgatgcac tcatcgaagt tcaaggaact gccattcagc gtattcttta ttgtgatgat 16980
cctgttagcc aactcaagtg ttctcaggtt gctttcgacc ttgacgacgg tttttaccct 17040
atttcttcta gaaatcttct gagtcatgaa cagccaactt cttttgttac tttgccatca 17100
tttaatgatc attcttttgt taacattact gtctctgcgt cttttggtgg tcctagtggt 17160
gccaacctta ttgcatctga cactactatc aatgggttta gttctttctg tgttgacact 17220
agacaattta ccatttcact gttttataac gttacaaaca gttatggtta tgtgtctaaa 17280
tcacaggaca gtaattgccc tttcaccttg caatctgtta atgattattt gtcttttagc 17340
aaattttgtg tttccaccag ccttttggct agtgcctgta ccatagatct ttttggttac 17400
cctgattttg gtagtgttgt taagtttacg tccctttact ttcaattcac aaagggtgag 17460
ttgattactg gcacgcctaa accacttgaa ggtgtcacgg acgtttcttt tatgactctg 17520
gatgtgtgta ccaagtatac tatctatggc tttaaaggtg agggtatcat tacccttaca 17580
aattctagct ttttggcagg tgtttattac acatctgatt ctggacagtt gttagccttt 17640
aagaatgtca ctagtggtgc tgtttattct gttacgccat gttctttttc agagcaggct 17700
gcatatgttg atgatgatat agtgggtgtt atttctagtt tgtctaattc cacttttaac 17760
agtactaggg agttgcctgg tttcttctac cattctaatg atggctctaa ttgtacagag 17820
cctgtgttgg tgtatagtaa cataggtgtt tgtaaatctg gcagtattgg ccacgttcca 17880
tcacagtctg gccaagttaa gattgcaccc acggttactg ggaatattag tattcccacc 17940
aactttagta tgagtatttg atcattccgc ggcaacccct ttaaccagag tttcagcgga 18000
acgatgaaat ggggtctatg caaagcctct ttgacaaaat tggccaactt tttgtggatg 18060
ctttcacgga atttctggtg tccattgttg atatcatcat atttttggcc attttgtttg 18120
gcttcacaat cgccggttgg ctggtggtct tatgcatcag actggtttgc tccgcggtac 18180
tccgtgcgcg ctctaccgtt caccctgagc aattacagaa gatcttatga ggcctttctt 18240
tctcagtgtc aggtagacat tcccacctgg ggcgtcaaac accctttggg ggtgctttgg 18300
caccataagg tgtcaaccct gattgatgaa atggtgtcgc gtcgaatgta ccgcgtcatg 18360
gaaaaagcag ggcaggctgc ctggaaacag gtggtgagcg aggctacatt gtctcgcatt 18420
agtggtttgg atgtggtggc tcattttcaa catcttgccg ctattgaagc cgagacttgt 18480
aaatatttgg cttcccggct acccatgctg cacaacctgc gcttgacagg gtcaaatgta 18540
accatagtgt ataatagtac tttggatcag gtgtttgcca ttttcccaac ccctggttcc 18600
cggccaaagc ttcatgattt tcagcaatgg ctaatagctg tacattcctc catattttcc 18660
tccgttgcag cttcttgtac tctttttgtt gtgctgtggt tgcgaattcc aatgctacgt 18720
tctgtttttg gtttccgctg gttaggggca acttttcttt tgaactcatg gtgaattaca 18780
cggtatgccc gctttgccca acccggcagg cagccgccga gatccttgaa cccggcaagt 18840
ctttttggtg caggataggg catgaccgat gtagtgagaa cgatcatgac gaactagggt 18900
tcatggttcc gcctggcctc tccagcgaag gccacttgac cagtgtttac gcctggttgg 18960
cgttcctgtc cttcagctac acggcccagt tccatcccga gatatttggg atagggaatg 19020
tgagtcaagt ttatgttgac atcaagcacc aactcatctg cgctgttcat gacggggata 19080
acgccacctt gcctcgccat gacaatattt cagccgtatt tcagacctac taccaacacc 19140
aggtcgacgg cggcaattgg tttcacctgg aatggctacg ccctttcttt tcctcttggt 19200
tggttttaaa tgtttcgtgg tttctcaggc gttcgcctgc aagccatgtt tcagttcgag 19260
tctttcggac atcaaaacca acaccaccgc agcatcaggc ttcgttgtcc tccaggacat 19320
cagctgcctt aggcatggcg actcgtcctc tccgacgatt cgcaaaagtt ctcagtgccg 19380
cacggcgata gggacgcccg tgtacatcac catcactgcc aatgtcacag atgaaaatta 19440
tctacattct tctgatctcc tcatgctttc ttcttgcctt ttctatgctt ccgagatgag 19500
tgaaaaggga ttcaaagtgg tgtttggcaa tgtgtcaggc atcgtggctg tgtgcgtcaa 19560
ctttaccagc tacgtccaac acgtcaagga gtttacccaa cgctccttag tggtcgatca 19620
tgtgcgactg cttcatttca tgacacctga gaccatgagg tgggcaaccg ttttagcctg 19680
tctttttgcc atcctactgg caatttgaat gttcaagtat gttggggaag tgcttgaccg 19740
cgtgctgttg ctcgcgattg ctttttttgt ggtgtatcgt gccgtcctat cttgctgtgc 19800
tcgtcaacgc cagcaacaac aacagctctc atattcagtt gatttataac ttaacgctat 19860
gtgagctgaa tggcacagat tggctggcac aaaaatttga ctgggcagtg gagacttttg 19920
tcatcttccc cgtgttgact cacattgttt cctatggggc actcaccacc agccatttcc 19980
ttgacacagt tggtctggcc actgtgtcca ccgccggata ttatcacggg cggtatgtct 20040
tgagtagcat ttacgcagtc tgtgctctgg ctgcgctgat ttgctttgtc attaggcttg 20100
cgaagaactg catgtcctgg cgctactctt gtaccagata taccaacttc cttctggaca 20160
ctaagggcaa actctatcgt tggcggtcgc ccgtcattgt ggagaaaggg ggtaaggttg 20220
aggtcgaagg tcacctgatc gacctcaaga gagttgtgct tgatggttcc gcggcaaccc 20280
ctttaaccag agtttcagcg gaacgatggg gtcgtctcta gacgacttct gcaatgatag 20340
cacagctcca cagaaggtgc ttttggcgtt ttccattacc tacacgccag tgatgatata 20400
tgctctaaag gtaagtcgcg gccgactgct agggcttctg caccttttga tctttctgaa 20460
ttgtgctttt accttcgggt acatgacatt cgtgcacttt gagagcacaa atagggtcgc 20520
gctcactatg ggagcagtag ttgcacttct ttggggagtg tactcagcca tagaaacctg 20580
gaaattcatc acctccagat gccgtttgtg cttgctaggc cgcaagtaca ttctggcccc 20640
tgcccaccac gtcgaaagtg ccgcgggctt tcatccgatt gcggcaaatg ataaccacgc 20700
atttgtcgtc cggcgtcccg gctccactac ggtcaacggc acattggtgc ccgggttgaa 20760
aagcctcgtg ttgggtggca gaaaagctgt taagcaggga gtggtaaacc ttgttaaata 20820
tgccaaataa caacggcaag cagcaaaaga aaaagaaggg gaatggccag ccagtcaatc 20880
agctgtgcca aatgctgggt aagatcatcg cccaacaaaa ccagtccaga ggcaagggac 20940
cggggaagaa aaataggaag aaaaacccgg ggaagcccca tttccctcta gcgactgaag 21000
atgacgtcag gcatcacttt acccctagtg agcggcaatt gtgtctgtcg tcgatccaga 21060
ctgccttcaa tcagggtgct ggaacttgtg ccctgtcaga ttcagggagg ataagttaca 21120
ctgtggagtt tagtttgccg acgcaacata ctgtgcgtct gatccgcgcc acagcatcac 21180
cctcagcatg atgggctggc attctttggc acctcagtgt tagaattggg agaatgtgtg 21240
gtgaatggca ctgattgaca ctgtgcctct aagtcaccta ttcaattagg gcgaccgtgt 21300
gggggtaaag tttaattggc gagaaccatg cggccgtaat taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 21360
aaggccggca tggtcccagc ctcctcgctg gcgccggctg ggcaacattc cgaggggacc 21420
gtcccctcgg taatggcgaa tgggacgcgg ccgcgccacc gtctagagcg cacgaatgag 21480
ggccgacagg aagcaaagct gaaaggaatc aaatttggcc gcaggcgtac cgtggacagg 21540
aacgtcgtgc tgacgcttca tcagaagggc actggtgcaa cggaaattgc tcatcagctc 21600
agtattgccc gctccacggt ttataaaatt cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc 21660
tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc 21720
ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 21780
cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 21840
gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 21900
ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 21960
tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 22020
aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgt 22079
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctttaggcct gaattgaagg taccgccacc atgaagtctt taacctactt ctggttgt 58
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggggttgcc gcggaatgat catcactgca cgtggacctt ttc 43
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggggttgcc gcggaatgat catcaaatac tcatactaaa gttggtggga atact 55

Claims (7)

1. 一种重组载体，用于构建表达G2型猪流行性腹泻病毒S蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 一种重组载体，用于构建表达G2型猪流行性腹泻病毒S1蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.表达G2型猪流行性腹泻病毒S或S1蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，其特征在于，所述嵌合病毒系利用如权利要求1或2所述重组载体所拯救构建。
4.权利要求3所述表达G2型猪流行性腹泻病毒S或S1蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒的构建方法，其特征在于，所述方法如下：
以HP-PRRSV天然弱毒株感染性克隆rJSTZ1712-12为活病毒载体，利用同源重组或者双酶切连接方法在其ORF1b和ORF2a基因之间插入G2型PEDV流行株XJ1904-34的S或S1基因序列，构建拯救表达G2型PEDV流行株S或S1蛋白的PRRSV嵌合病毒。
5. 根据权利要求4所述表达G2型猪流行性腹泻病毒S或S1蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒的构建方法，其特征在于，所述HP-PRRSV天然弱毒株感染性克隆rJSTZ1712-12载体，包含HP-PRRSV JSTZ1712-12分离株基因组全长cDNA序列，该全长cDNA序列的5’端加有巨细胞病毒真核启动子序列，3’端Poly(A)尾下游加有丁肝炎病毒核酶序列以及牛生长激素多聚腺苷酸信号转录终止序列；所述rJSTZ1712-12载体是以pACYC177低拷贝载体为框架，在pACYC177载体上插入四个单一限制性酶切位点PacI , AflII , AscI和NotI，用于构建天然弱毒株JSTZ1712-12的感染性克隆。
6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
1）PEDV-S和PEDV-S1基因扩增；
2）rJSTZ1712-12-S或rJSTZ1712-12-S1重组质粒的构建；
3）rJSTZ1712-12-S或rJSTZ1712-12-S1嵌合病毒拯救。
7.权利要求3所述嵌合病毒在制备猪流行性腹泻-猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗中的应用。
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