CN114805502A - 一种SADS-CoVS1蛋白抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明选取猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS‑CoV(Swine Acute DiarrheaSyndrome Coronavirus)的S蛋白(Spike Glycoprotein)的S1功能区构建和表达了重组抗原；本重组抗原在蛋白的N端添加了His标签为蛋白纯化或检测用；在蛋白的C端添加了形成三聚体的多肽链，使表达的重组抗原能形成类似天然的三聚体结构和抗原构型；以及利于重组抗原定向包被金表面或酶标板表面的巯基或多肽链；本重组抗原可用于制备新型冠状病毒血清学抗体检测的检测试剂，以及制备新猪急性腹泻综合征冠状病毒S蛋白特异性抗体。

Description

一种SADS-CoVS1蛋白抗原及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种SADS-CoVS1蛋白抗原及其制备方法与应用。
背景技术
猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)是新近发现的一种冠状病毒，是一种单股正链有囊膜的RNA病毒，基因组大小约为27kb。尽管它与导致人类呼吸道疾病COVID-19的乙型冠状病毒SARS-CoV-2属于同一病毒家族，但SADS-CoV是一种导致猪胃肠道疾病的甲型冠状病毒。该病毒会引起严重的腹泻和呕吐，对仔猪尤其致命。SADS-COV也不同于人类中两种循环的普通感冒冠状病毒HCoV-229E和HCoV-NL63。此外，有研究证实人类尚未对SADS-CoV产生免疫力，而SADS-CoV广泛存在的宿主，以及它在人类细胞中的复制能力，表明SADS-CoV对人类存在潜在风险。因此，研究 SADS-CoV的分子流行病学及建立对这种新型冠状病毒的快速检测方法已成为当务之急。
通过基因重组和/或突变促进的跨物种传播是冠状病毒宿主范围扩大的基础。蝙蝠是多种不同的α-和β-冠状病毒的自然宿主，它们通过重组和/或突变带来巨大的种间传播潜力。有关基因进化、受体结合和发病机制的数据表明，人类SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV最有可能来源于蝙蝠。新鉴定的猪 SADS-CoV与蝙蝠冠状病毒HKU2的序列同源性约为95％，这也进一步强调了冠状病毒跨种传播的严重后果。
SADS-CoV S刺突蛋白(1130个氨基酸残基)是最短的冠状病毒刺突蛋白之一，它与其他已知冠状病毒刺突蛋白的氨基酸序列同源性低于28％，表明 SADS-CoV在进化中的特殊性。
SADS-CoVS蛋白是I型跨膜蛋白，由S1和S2两个亚单位组成。S1亚单位通过其受体结合域(Receptor Binding Domain，RBD)与敏感宿主细胞表面受体结合，导致S2亚单位构象改变而病毒与宿主细胞膜融合，病毒基因组得以进入细胞完成感染。因此S1亚单位抗原也可用于SADS-CoV S的疫苗研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种SADS-CoVS1蛋白抗原及其制备与应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原，所述抗原为在猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S1亚单位C端连接一段可形成三聚体的多肽片段得到。
在病毒颗粒上完整的S蛋白组装成稳定的三聚体结构，形成冠状病毒表面的刺突。由于S2亚单位是形成三聚体的结构基础，仅表达S1亚单位不能形成三聚体，可能会缺失与蛋白构象相关的抗原决定簇。由于S蛋白分子大，由1130 个氨基酸残基组成，重组表达完整的S蛋白相对比较困难。
本发明设计仅表达S1亚单位，但在S1亚单位C端连接一段可形成三聚体的多肽片段，使得表达的S1蛋白能够形成三聚体，尽可能模拟S1蛋白天然三聚体构型和保持抗原天然构型。同时为了让重组的S1亚单位蛋白能定向包被到金表面(如金纳米颗粒或传感器金膜)或塑料表面(如ELISA板)，本发明也设计了在重组S1亚单位抗原C末端添加-Cys氨基酸残基或聚苯乙烯亲和肽，使重组S1亚单位抗原在包被到金或聚苯乙烯表面后仍保持正确的抗原结构或活性。
作为本发明所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原的优选实施方式，所述S1亚单位是由猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV 的S蛋白的S1亚单位的19-532氨基酸残基序列组成，其中529-532位的PLGD 氨基酸残基被GSAS替代，所述S1亚单位的序列如SEQ ID NO:1所示。
作为本发明所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原的优选实施方式，所述抗原在N端还添加有His标签。
作为本发明所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原的优选实施方式，所述添加于N端的His标签是由6-8个His残基重复序列和其后的GGSGGS连接链序列组成。
作为本发明所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原的优选实施方式，所述添加于N端的His标签的序列如HHHHHHGGSGGS 所示。
作为本发明所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原的优选实施方式，所述可形成三聚体的多肽片段是由GGSGGS连接链和124 个氨基酸残基的多肽组成，其序列如SEQ ID NO:2所示。
作为本发明所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原的优选实施方式，所述抗原在C末端还添加半胱氨酸或聚苯乙烯亲和多肽。
作为本发明所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原的优选实施方式，抗原在C末端添加半胱氨酸的序列如SEQ ID NO:3所示；抗原在C末端添加聚苯乙烯亲和多肽的序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供任一所述新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原的载体。
本发明的有益效果：
(1)在猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白S1亚单位抗原C 末端添加三聚体多肽，使重组表达的S1亚单位抗原能形成类似天然构型的三聚体和抗原活性。
(2)在猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白S1亚单位抗原C 末端添加-Cyst氨基酸残基，使重组表达的S1亚单位抗原能定向包被到金表面，保持S1抗原的最佳活性。
(3)在猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白S1亚单位抗原C 末端添加聚苯乙烯亲和肽，使重组表达的S1亚单位抗原能定向包被到ELISA板，保持S1抗原的最佳活性。
附图说明
图1为猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S1蛋白纯化后SDS-PAGE 胶染色图片。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Samb rook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商提供说明书条件。
实施例中用到的材料如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1重组载体的构建
本发明提供一种新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白S1 亚单位抗原，本发明设计仅表达S1亚单位，但在S1亚单位C端连接一段可形成三聚体的多肽片段，使得表达的S1蛋白能够形成三聚体，尽可能模拟S1蛋白天然三聚体构型和保持抗原天然构型。
具体方式为：从Genbank数据库中下载SADS-CoV的S蛋白S1亚单位抗原(19-532氨基酸残基序列组成)，其中529-532位的PLGD氨基酸残基被GSAS 替代，构成的S1亚单位的序列如SEQ ID NO:1所示。
抗原在N端还添加有His标签，His标签是由6个His残基重复序列和其后的GGSGGS连接链序列组成，序列如HHHHHHGGSGGS。
可形成三聚体的多肽片段是由N端的His标签和124个氨基酸残基的多肽组成，其序列如SEQ ID NO:2所示。
同时为了让S蛋白S1亚单位蛋白能定向包被到金表面(如金纳米颗粒或传感器金膜)或塑料表面(如ELISA板)，本发明也设计了在S蛋白S1亚单位抗原C末端添加-Cys氨基酸残基或聚苯乙烯亲和肽(序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示)，使S蛋白S1亚单位抗原在包被到金或聚苯乙烯表面后仍保持正确的抗原结构或活性。
将上述设计好的SADS-CoV的S蛋白S1亚单位抗原进行后续真核表达质粒的构建，才能有效表达S蛋白S1亚单位抗原；质粒构建由金唯智生物科技有限公司完成，得到pCMV-S1，其中，基因位于NheI和Xho酶切位点之间，穿梭载体为pCMV-BM。
重组质粒pCMV-S1用Bac-to-Bac系统转座包装获得重组杆状病毒以期大规模、方便可持续的蛋白表达。
(1)取一管新的含100μL大肠杆菌DH10Bac感受态细胞置于冰上静置解冻，待菌体融化后迅速加入1μL浓度为100ng/mL的pCMV-S质粒，冰上静置30min；
(2)42℃热水浴热激45s，迅速置于冰上，静置3min；
(3)加入LB液体培养基900μL，于37℃、220rpm振荡培养4h活化；
(4)取120μL活化后的菌液涂布于含有卡那霉素、庆大霉素和四环素三种抗性的蓝白斑筛选培养平板上，37℃倒置培养72h；
(5)观察平板并挑取边缘整齐菌落较大的白色单克隆菌落，加入5mL含有三抗的LB液体培养基，37℃、220rpm过夜振荡培养至浑浊并取部分菌液用M13 通用引物进行PCR检测，回收阳性PCR产物进行测序；
(6)选取PCR阳性且测序结果与目的基因序列一致的菌液样品进行后续实验；
(7)将5mL菌液室温5000×g离心10min使细菌沉淀，弃上清，倒置于干净滤纸上使液体尽量去除干净，加入250μL Solution I/RNase A(Omega质粒抽提试剂盒)，吹打使沉淀重悬，充分混匀，转移至新的2mL EP管中；
(8)加入250μL Solution II，轻轻颠倒旋转数次混匀，室温静置5min；
(9)加入350μL Solution III，轻轻颠倒数次混匀产生白色沉淀后，13000rpm 离心10min；
(10)吸取上清于新1.5mL EP管中，最大转速离心5min，
(11)放另一新的1.5mL EP管于冰上，加入750μL异丙醇，之后加入750μL 离心后上清，上下颠倒混匀，冰上静置30min；
(12)14000×g离心15min，弃上清；
(13)加入500μL 80％预冷乙醇，14000×g离心30min；
(14)于超净工作台中弃乙醇，敞开盖子静置10min，以使酒精挥发；
(15)加入40μL Sterilized Elution Buffer(灭菌洗脱缓冲液)，盖上盖子使DNA溶解，即得所需rBacmid，轻弹管壁使其混匀，4℃保存并迅速使用。
重组杆状病毒BCMV-S的包装与扩增：
(1)培养悬浮昆虫细胞SF9至细胞密度达到2×106个细胞/mL，细胞存活率在 95％以上后，转移至六孔板中，使得SF9细胞量为2×106个细胞/孔，加入SFM 培养基(无血清培养基)使得培养基体积为2mL/孔；28℃培养箱静置培养2h使得细胞贴壁；
(2)取3μL实施例1中得到的pCMV-S1质粒与5μL转染试剂Ⅱ Reagent(Gibco,USA)加到同一管90μL的转染培养基中，轻轻吹打混匀，室温静置孵育30min；
(3)待孵育时间将结束前取出六孔板，弃去原培养基，用PBS洗2遍；
(4)待pCMV-S1质粒与转染试剂孵育完成后向混合物中加入900μL SFM培养基，轻轻吹打混匀，加到洗过的SF9昆虫细胞中，细胞放28℃细胞培养箱静置培养，5h后补加SFM培养基至总体积为2mL/孔，28℃静置培养7d，期间观察病变情况；
(5)7d后用荧光显微镜观察SF9细胞，看到细胞上有绿色荧光则表明转染成功，收孔内上清得到包装好的杆状病毒BCMV-S1，即为P0代；
(6)用P0代杆状病毒以体积比1：100的比例接种细胞密度达到2×106个细胞/mL、细胞存活率在95％以上的SF9悬浮细胞，3d后得到P1代，连续3次培养得到P3代杆状病毒BCMV-S1-P3，用96孔板静置培养SF9细胞使其贴壁来检测杆状病毒效价，以绿色荧光为指标，观察得到的杆状病毒的TCID50。
实施例2蛋白的表达与纯化
猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S1蛋白在人胚肾293F细胞中表达。
培养293F悬浮细胞至细胞密度达到2×106个细胞/mL，细胞存活率在95％以上。用得到的杆状病毒BCMV-S1-P3以MOI＝20接种293F细胞，8h后以1： 200的体积比例加入2M丁酸钠，使得其终浓度为10mM，3d后收样检测。取 1mL细胞液，8000rpm离心5min收培养基上清、细胞，细胞用1％(v/v)的Triton X-100溶液冰上裂解30min后3000rpm离心5min取细胞上清，沉淀用PBS 洗2遍后用PBS重悬。按照Western Blot方法检测蛋白是否表达，以空白对照组和实验组的培养基上清、细胞上清与细胞沉淀为样品进行电泳转膜，HRP标记的羊抗人IgG为孵育抗体进行孵育，再进行显色观察结果。
(1)取40μL待检样品，加入10μL 5×Protein Loading Buffer(5倍浓度的蛋白上样缓冲液)，沸水浴10min；
(2)室温静置冷却5min，瞬离使液体聚在管底；
(3)取一块10％的SurePAGETM凝胶，按照正确方式装在电泳槽中，加入适量蛋白电泳缓冲液，拔出梳子，依次向孔中加入处理好的样品和Protein Marker，未加样的孔加入1×Protein Loading Buffer补足，10μL/孔，正确装好整个设备；译
(4)开始电泳，电压和时间按照120V、75min设置，待蓝色染料将要跑出凝胶底部时停止电泳；
(5)提前准备转膜用品，剪取合适大小的PVDF膜和2张厚滤纸，PVDF膜用预冷过的甲醇浸润1min后，立刻取出放进干净的预冷转膜液中浸泡，滤纸直接用预冷的转膜液浸泡，浸泡平衡时间在20min；
(6)取出电泳结束的凝胶，切除多余部分，放入转膜液中浸泡平衡15min，从下到上依次按滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序叠成“三明治”模型，中间每铺一层都加入转膜液并赶去气泡以免影响转膜结果；
(7)恒流300mA 100min湿转转膜；
(8)准备TBST稀释的5％脱脂奶粉作为封闭液，待转膜结束后取出膜放入装有封闭液的小盒中浸泡，室温摇床上封闭2h；
(9)弃去封闭液，加入适量TBST在摇床上慢摇洗涤3次，5min/次；
(10)弃去TBST，加入用TBST按体积比1：2000稀释的HRP标记羊抗人IgG，室温摇床孵育1h；
(11)弃去液体，加入适量TBST在摇床上慢摇洗涤3次，5min/次；
(12)按照说明书配置底物显色液(SuperSignalTM West Pico PLUSChemiluminescent Substrate)，将洗涤好的PVDF膜平铺在成像仪样品板上，在膜上均匀滴加显色液，调整好合适的参数观察并拍照记录。
按照(1)-(4)进行实验；取出凝胶放进小盒中，加入考马斯亮蓝染液，室温摇床上慢摇染色30min；回收考马斯亮蓝染液，先用单蒸水将凝胶及小盒中残余的染液洗去，再加入脱色液，室温摇床上慢摇脱色，每隔1h观察，若脱色液变较蓝即换新的脱色液直至凝胶脱色至可以清晰观察目的条带，背景蓝色基本褪去，用凝胶成像仪观察拍照。
猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S1蛋白纯化后SDS-PAGE胶染色图如图1所示。
S1蛋白免疫原性鉴定：
为进一步确定是S1蛋白的免疫原性，以纯化后的蛋白为样品，SADS-CoV 阳性猪血清和阴性猪血清为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG为二抗进行Western Blot检测。
(1)按照上述步骤(1)-(9)进行实验；
(2)弃去TBST，加入用PBST按体积比1：200稀释的SADS-CoV阴、阳性猪血清(实验室保存，已用Western blot鉴定SADS-CoV阴阳性)5mL，室温摇床孵育1h；
(3)弃去液体，TBST摇床上慢摇洗涤3次，5min/次；
(4)弃去TBST，加入用PBST按体积比1：2000稀释的HRP标记羊抗猪IgG 5mL，室温摇床孵育1h；
(5)弃去液体，TBST摇床上慢摇洗涤3次，5min/次；
(6)按照说明书配置底物显色液，将洗涤好的PVDF膜平铺在成像仪样品板上，在膜上均匀滴加显色液，调整好合适的参数观察并拍照记录。
结果：
纯化后的S1蛋白在293F细胞上清中有表达，条带清晰可见，同时可以被 SADS-CoV阳性猪血清识别而不被阴性猪血清识别，具有良好的免疫原性；同时纯化后的S1蛋白浓度较高且杂质少。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 一种SADS-CoVS1蛋白抗原及其制备方法与应用
<120> 广州优迪生物科技股份有限公司
<130> 2022-04-14
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 513
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Glu Ser Val Asp Phe Asn Leu Phe Asn Thr Ile Phe Ser Thr His Arg
1 5 10 15
Gly Leu Ser Asn Thr Thr Ser Val Ile Thr Gly Ala Tyr Pro Ser Thr
20 25 30
Asn Lys Ser Asp Trp Ser Cys Asn Thr Arg Thr Gly His Leu Ser Gly
35 40 45
Ser Gly Phe Gly Ile Gly Leu Tyr Val Gln Thr Pro Arg Glu Gln Tyr
50 55 60
Gln Tyr Asp Gly Ser Gly Ala Gly Gly Tyr Thr Ile Ala Val Ser Pro
65 70 75 80
Ile His Val Thr Asn Leu Thr Trp Glu Leu Trp Ile His Arg Lys Trp
85 90 95
Gly Val Asn Ser Val Val Thr Val Arg Leu Cys Arg Trp Trp Gln Phe
100 105 110
Met Ser Phe Asn Ser Thr Ser His Ala Ala Asp Ala Gly Pro Thr Asn
115 120 125
Ala Phe Glu Cys Leu Ile Asn Gly Ser Tyr Pro Thr His Arg Asn Thr
130 135 140
Gly Tyr Met Phe Gly Val Thr Trp Tyr Asn Asp Leu Val Arg Ile Val
145 150 155 160
Phe Pro Pro Thr Val Leu Glu Met Gln Leu Asp Gly Leu Gln Trp Glu
165 170 175
Arg Val Gln Phe Asn Ser Pro Val Asn Ala Gly His Ala Thr Arg Phe
180 185 190
Asn Val Val Lys Asp Ile Ser Thr Val Leu Val Glu Thr Asn Ser Gly
195 200 205
Gly Ser Val Phe Arg Tyr Ser Tyr Cys Ala Asp Gly Phe Val Asn Gly
210 215 220
Leu Gln Cys Lys Leu Arg Leu Phe Asp Ile Pro Pro Gly Val Tyr Ser
225 230 235 240
Asn Ser Glu Val Glu Tyr Pro Thr Ala Leu Tyr Thr Val Val His Asn
245 250 255
Met Ser Ala Cys Pro Glu Arg Pro Asp Ser Tyr Cys Gly Ser Asn Ser
260 265 270
Cys Pro Phe Lys Arg Ala Val Phe Ser Asn Cys Ile Val Asn Tyr Thr
275 280 285
Thr Trp Val Asn Pro Asp Gln Arg Asp Phe Gln His Leu Ile Leu Pro
290 295 300
Asn Gly Lys Phe Asn Pro Phe Thr Glu Cys Asn Gly Leu Asn Arg Ile
305 310 315 320
Val Asp Gly Cys Val Pro Gly Phe Val Leu Arg Val Gly Arg Gly Lys
325 330 335
Ala Val Asn Arg Thr Ile Val Thr Pro Tyr Leu Lys Pro Tyr Glu Cys
340 345 350
Phe Gly Trp Ser Trp Asn Asp Lys Gln Asp Ser Ile Tyr Asp Trp Trp
355 360 365
Ile Ala Asp Phe Val Ser Thr Gly Ala Phe Val Cys Glu Ser Asn Pro
370 375 380
Glu Ala Pro Lys Thr Gly Val Cys Val Thr Tyr Thr Val Glu Lys Val
385 390 395 400
Thr Phe Gln Gly Val Leu Tyr Glu Ser Asn Phe Thr Phe Ala Gln Tyr
405 410 415
Tyr Asn Leu Leu Tyr Val Gly Ser Gln Leu Arg Tyr Val Arg Ile Leu
420 425 430
Gly Lys Val Tyr Glu Val Ser Ser Cys Phe Glu Ala Ser Tyr Asp Val
435 440 445
Leu Tyr Arg Asn Asn Gln Ser Phe Gly Leu Leu Tyr Arg Ser Phe Asp
450 455 460
Cys Asn Gln Leu His Ile Lys Ser Ala Arg Phe Val Asp Arg Leu Leu
465 470 475 480
Pro Ser His Asn Gly Thr Ala Thr Val Leu Gly Cys Leu Phe Asn Ala
485 490 495
Ser Tyr Ala Pro Asn Asp Thr Met Val Asn Cys Thr Asn Gly Ser Ala
500 505 510
Ser
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Ser Val Asp Phe Asn Leu Phe Asn Thr
1 5 10 15
Ile Phe Ser Thr His Arg Gly Leu Ser Asn Thr Thr Ser Val Ile Thr
20 25 30
Gly Ala Tyr Pro Ser Thr Asn Lys Ser Asp Trp Ser Cys Asn Thr Arg
35 40 45
Thr Gly His Leu Ser Gly Ser Gly Phe Gly Ile Gly Leu Tyr Val Gln
50 55 60
Thr Pro Arg Glu Gln Tyr Gln Tyr Asp Gly Ser Gly Ala Gly Gly Tyr
65 70 75 80
Thr Ile Ala Val Ser Pro Ile His Val Thr Asn Leu Thr Trp Glu Leu
85 90 95
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100 105 110
Cys Arg Trp Trp Gln Phe Met Ser Phe Asn Ser Thr Ser His Ala Ala
115 120 125
Asp Ala Gly Pro Thr Asn Ala Phe Glu Cys Leu Ile Asn Gly Ser Tyr
130 135 140
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Gly His Ala Thr Arg Phe Asn Val Val Lys Asp Ile Ser Thr Val Leu
195 200 205
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210 215 220
Asp Gly Phe Val Asn Gly Leu Gln Cys Lys Leu Arg Leu Phe Asp Ile
225 230 235 240
Pro Pro Gly Val Tyr Ser Asn Ser Glu Val Glu Tyr Pro Thr Ala Leu
245 250 255
Tyr Thr Val Val His Asn Met Ser Ala Cys Pro Glu Arg Pro Asp Ser
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Arg Val Gly Arg Gly Lys Ala Val Asn Arg Thr Ile Val Thr Pro Tyr
340 345 350
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355 360 365
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435 440 445
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450 455 460
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515
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
His His His His His His Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Ser Val Asp
1 5 10 15
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165 170 175
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Thr Ile Val Thr Pro Tyr Leu Lys Pro Tyr Glu Cys Phe Gly Trp Ser
355 360 365
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370 375 380
Val Ser Thr Gly Ala Phe Val Cys Glu Ser Asn Pro Glu Ala Pro Lys
385 390 395 400
Thr Gly Val Cys Val Thr Tyr Thr Val Glu Lys Val Thr Phe Gln Gly
405 410 415
Val Leu Tyr Glu Ser Asn Phe Thr Phe Ala Gln Tyr Tyr Asn Leu Leu
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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Ser Thr Phe Leu Cys
625
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
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Phe Asn Leu Phe Asn Thr Ile Phe Ser Thr His Arg Gly Leu Ser Asn
20 25 30
Thr Thr Ser Val Ile Thr Gly Ala Tyr Pro Ser Thr Asn Lys Ser Asp
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Trp Ser Cys Asn Thr Arg Thr Gly His Leu Ser Gly Ser Gly Phe Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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195 200 205
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225 230 235 240
Leu Arg Leu Phe Asp Ile Pro Pro Gly Val Tyr Ser Asn Ser Glu Val
245 250 255
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260 265 270
Pro Glu Arg Pro Asp Ser Tyr Cys Gly Ser Asn Ser Cys Pro Phe Lys
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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Ser Gly Ala Ile Thr Ile Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro
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Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu
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625 630 635 640
Gly Ala Ser Ala Trp Val Arg Trp Gly Arg Val Trp Gly
645 650

Claims (9)

1.一种新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原，其特征在于：所述抗原为在猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S1亚单位C端连接一段可形成三聚体的多肽片段得到。
2.根据权利要求1所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原，其特征在于：所述S1亚单位是由猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白的S1亚单位的19-532氨基酸残基序列组成，其中529-532位的PLGD氨基酸残基被GSAS替代，所述S1亚单位的序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原，其特征在于：所述抗原在N端还添加有His标签。
4.根据权利要求3所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原，其特征在于：所述添加于N端的His标签是由6-8个His残基重复序列和其后的GGSGGS连接链序列组成。
5.根据权利要求4所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原，其特征在于：所述添加于N端的His标签的序列如HHHHHHGGSGGS所示。
6.根据权利要求1所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原，其特征在于：所述可形成三聚体的多肽片段是GGSGGS连接链和124个氨基酸残基的多肽组成，其序列如SEQ ID NO:2所示。
7.根据权利要求1所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原，其特征在于：所述抗原在C末端还添加半胱氨酸或聚苯乙烯亲和多肽。
8.根据权利要求1所述的新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原，其特征在于：抗原在C末端添加半胱氨酸的序列如SEQ ID NO:3所示；抗原在C末端添加聚苯乙烯亲和多肽的序列如SEQ ID NO:4所示。
9.表达权利要求1-8任一所述新型猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV的S蛋白抗原的载体。
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