CN107034226A

CN107034226A - 一种可溶性重组蛋白及其表达纯化方法和用途

Info

Publication number: CN107034226A
Application number: CN201710160147.0A
Authority: CN
Inventors: 樊惠英; 刘洁; 谢永生
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2017-08-11

Abstract

本发明提供了一种可溶性重组蛋白，所述可溶性重组蛋白是将猪圆环病毒II型衣壳蛋白的基因进行原核表达得到的可溶性重组蛋白，所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明将Cap蛋白进行原核表达，其中表达Cap蛋白的基因经密码子优化，能显著提高其在大肠杆菌中的可溶性表达。本发明采用两步梯度盐析沉淀法纯化目的蛋白，不仅操作简便，纯度大幅提高，生产成本低廉，而且获得的蛋白免疫原性好，适于大规模工业生产。本发明所述PCV2病毒样颗粒疫苗不带病毒核酸，具良好安全性，制备的PCV2病毒样颗粒疫苗对实验动物没有致病性，且免疫动物后，产生猪圆环病毒抗体速度快、水平高且持续时间长。

Description

一种可溶性重组蛋白及其表达纯化方法和用途

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白，具体涉及一种可溶性重组蛋白及其表达纯化方法和用途。

背景技术

猪圆环病毒II型(Porcine circovirus 2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，自1991年在加拿大猪群中首次报道PMWS以来，该病已世界流行。而目前疫苗免疫接种是防控PCV2感染的有效手段。国内外已经商品化的疫苗主要有全病毒灭活苗和亚单位疫苗两种，全病毒灭活苗，虽已有生产，但因体外培养增值能力不强，病毒滴度低，有时需要浓缩才能达到要求，且存在生产中批间质量难统一等问题。相比之下，亚单位疫苗具有较好的安全性，并且免疫原性高，但同时存在表达量低且生产成本很高，难以在生产中使用该疫苗。因此寻找新的技术策略，提高亚单位疫苗的表达量是研制疫苗的关键。

圆环病毒(PCV)是目前发现的最小的动物病毒。研究表明PCV2含11个开放阅读框(ORFs)，其中ORF2基因编码病毒衣壳，唯一的结构蛋白Cap蛋白，也是主要免疫原性蛋白。PCV2Cap蛋白具有在体外自我组装成病毒样颗粒的特点。该病毒样颗粒(Virus LikeParticles，VLP)的形态、大小、结构及表面抗原和多肽表位与天然的病毒粒子相同或相似，可通过与病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫应答，具有良好的免疫原性，且无毒副作用。目前，已有部分VLPs疫苗上市，如流感VLPs疫苗、乙肝VLPs疫苗、乳头瘤VLPs疫苗等，说明该类疫苗有巨大的潜力。

而大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统，具有产量高、生长速度快、操作简单、成本低的优点，同时结合高密度发酵技术能有效提高重组大肠杆菌的菌体密度，增加重组蛋白的表达量，是非常经济高效的生产工艺。但大肠杆菌的高密度发酵表达的蛋白杂蛋白多，仍需进一步纯化来获得目的蛋白。目前蛋白质的纯化主要依据相关蛋白质的理化及生物学性质不同将其与杂蛋白区分开来，对于Cap蛋白的纯化，盐析法、层析法(包括离子交换层析、疏水层析、反向层析、亲和层析)以及两种及以上方法结合应用较多。但层析法所用原料较贵且纯化量小，耗费人力物力较多，大大增加了制备成本，不适用于工业生产。本发明在此基础上使用大肠杆菌表达系统pET28a表达Cap蛋白，并通过高密度发酵技术大量培养表达目的蛋白，同时利用两步梯度盐析沉淀法获得纯度较高，免疫原性好的Cap蛋白，实现了表达量高、纯化工艺简便、成本低廉等一系列优点，具有突出的推广前景。

发明内容

本发明的主要目的在于解决现有PCV2病毒样颗粒疫苗制备工艺复杂且成本高，处理量小，免疫原性差，不适于大规模生产等技术问题，由此本发明提供了一种可溶性重组蛋白，本发明还提供了所述可溶性重组蛋白的表达方法和纯化方法，本发明还提供了所述可溶性重组蛋白在制备PCV2病毒样颗粒疫苗的用途。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种可溶性重组蛋白，所述可溶性重组蛋白是将猪圆环病毒II型衣壳蛋白的基因进行原核表达得到的可溶性重组蛋白，所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2。所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白的基因是使用大肠杆菌通用密码子翻译截短Cap蛋白氨基酸序列合成的基因，同时在该基因两端分别添加5’BamHI和3’HindIII酶切位点，序列如SEQ IDNO:3。

本发明提供了一种载体，所述载体表达上述所述的可溶性重组蛋白。

本发明提供了一种宿主细胞，所述含有上述所述的载体。

本发明提供了一种上述所述的可溶性重组蛋白的表达方法，所述表达方法是将猪圆环病毒II型衣壳蛋白的基因进行原核表达，所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述原核表达的载体是pET-28a载体。

优选地，所述原核表达中采用IPTG诱导表达，IPTG的终浓度为1mmol/L，诱导培养温度为30℃。

本发明提供了一种上述所述的可溶性重组蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：

(1)将表达所述可溶性重组蛋白的菌体破碎，分离收集上清液；

(2)采用两步梯度盐析沉淀法纯化所述可溶性重组蛋白。

优选地，所述步骤(1)中菌体为大肠杆菌菌体。

优选地，所述步骤(2)具体包括以下步骤：

①将硫酸铵晶体粉末缓慢加入到所述步骤(1)中的上清液中，边加边搅拌以使硫酸铵缓慢溶解，使硫酸铵浓度达10％；

②于摇床上16℃，100rpm/min振摇4h；后于4℃沉淀12h以上，在10000-12000rpm/min下离心10min，弃沉淀留上清；

③将硫酸铵晶体粉末缓慢加入到所述步骤②收集的上清中，边加边搅拌以使硫酸铵缓慢溶解，使硫酸铵浓度达35％；

④于摇床上16℃，100rpm/min振摇4h；后于4℃沉淀12h以上，在10000-12000rpm/min下离心10min，留沉淀弃上清；

⑤收集沉淀，即得所述可溶性重组蛋白。

本发明提供了上述所述的可溶性重组蛋白在制备PCV2病毒样颗粒疫苗中的用途。

本发明提供了一种PCV2病毒样颗粒疫苗，所述PCV2类病毒颗粒疫苗包括上述所述的可溶性重组蛋白。

进一步地，所述PCV2病毒样颗粒疫苗还包括佐剂。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

首先，本发明所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白的基因基于使用大肠杆菌通用密码子将氨基酸序列翻译为核苷酸序列而获得，继而得到目的蛋白可溶的重组表达菌株，同时结合高密度发酵罐培养大量表达蛋白，其中上清中目的蛋白约占总蛋白的36.6％。

一方面，使用本发明提供的纯化方法制备蛋白，不仅操作简便，纯度大幅提高，生产成本低廉，而且获得的蛋白免疫原性好，适于大规模工业生产。

又一方面，应用上述方法制备的病毒样颗粒疫苗不带病毒核酸，具良好安全性，制备的病毒样颗粒疫苗对实验动物没有致病性，且免疫动物后，产生猪圆环病毒抗体速度快、水平高且持续时间长。

附图说明

图1为本发明实施例2中大肠杆菌表达的目的蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，M泳道是蛋白marker；1泳道是空载体对照；2泳道为pET-28a-Cap-gene菌株可溶性的表达(菌体破碎后的上清)；3泳道则是pET-28a-Cap-gene菌株的非可溶性表达(菌体破碎后的沉淀)。左侧数字为marker大小，单位为KDa，图中箭头所指为融合表达的目的蛋白。

图2为本发明实施例2中上清中目的蛋白纯化前后比较(考马斯亮蓝染色)，图中M泳道是蛋白marker；1泳道是未纯化的蛋白(菌体破碎后的上清)；2泳道为纯化后蛋白(纯化后的菌体破碎的上清)；

图3为本发明实施例2中上清中目的蛋白纯化前后比较(Western blot),图中M泳道是蛋白marker；1泳道是未纯化的蛋白(菌体破碎后的上清)；2泳道为纯化后蛋白(纯化后的菌体破碎的上清)；

图4为本发明实施例4中本发明所述PCV2病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后不同时间血清中抗体水平。其中1、横坐标代表不同组别；2、纵坐标代表以450nm/630nm双波长检测的样品吸光度；3、1W、2W、3W、4W、5W分别代表一免后1、2、3、4、5周。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例中Cap蛋白即为本发明所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白。

实施例1：本发明所述可溶性重组蛋白表达载体的构建

1.1Cap蛋白基因的获得

以NCBI数据库中的PCV2流行毒株的序列为基础，经比对后，选出一株流行毒株的Cap蛋白氨基酸序列，该氨基酸序列与其余流行毒株对应序列相同或相似度很高，氨基酸如SEQ ID NO:1所示。在保证此株Cap蛋白的氨基酸不变的前提下，使用大肠杆菌通用密码子将氨基酸序列翻译为核苷酸序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，使其适合在大肠杆菌中表达，然后委托金唯智公司进行基因合成，基因合成时两端加入酶切位点，加入酶切位点后的核苷酸序列如SEQ ID NO:3，合成后的基因命名为Cap-gene。

1.2重组表达载体质粒的构建

将Cap-gene用BamHI和HindIII两种限制性内切酶进行双酶切，然后回收纯化。pET-28a也进行与Cap-gene同样的处理。将处理好的pET-28a和Cap-gene在16℃连接12h，之后将连接产物转化到E.coli DH5ɑ感受态细胞，涂布含硫酸卡纳霉素的LB平板，37℃培养12-16h。挑取平板上的单菌落，在含硫酸卡纳霉素的液体LB培养基培养4h左右，然后进行菌液PCR鉴定和送金唯智测序。将测序正确的菌液1:1000加入到新鲜的含硫酸卡纳霉素的LB中，培养过夜，之后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为pET-28a-Cap-gene。

1.3重组表达菌株的构建

pET-28a-Cap-gene重组质粒转化大肠杆菌BL-21(DE3),同样涂布到含硫酸卡纳霉素的LB平板，37℃培养12-16h，获得重组表达菌株pET-28a-Cap-gene菌株。

实施例2：本发明所述可溶性重组蛋白的表达、纯化

2.1可溶性重组蛋白的大量表达

⑴从-20℃中取出带有重组质粒pET-28a-Cap-gene的大肠杆菌菌种，1:1000接入硫酸卡纳霉素抗性的LB液体培养基中37℃,220rpm摇床上过夜培养(12-14h)。

⑵校正5L发酵罐PH电极，配制2.5L培养基装入罐中，121℃灭菌20min，冷却后连接自动控制系统，校正溶氧，调节通气及初始转速。

⑶10％种子液接入发酵罐，温度37℃，手动调节搅拌速度及通气量，控制溶氧在30％-60％之间。

⑷当溶氧开始迅速上升时按流加补料方式加入补料培养基，流加速度5ml/min。

⑸培养至菌体浓度OD₆₀₀达到50左右时，按1mmol/L浓度加入诱导剂IPTG，并将温度调至30℃诱导培养7h，使终浓度OD₆₀₀大约至60时下罐，离心收集菌体，菌体湿重约为90g/L。样品处理过后进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示，从图1可以看出，与泳道1的空载体pET-28a相比，2、3泳道约27kDa处明显多出一条蛋白条带，与预期相符，表明Cap蛋白能成功表达，且大部分存于上清中，为可溶性蛋白。

2.2两步梯度盐析沉淀法纯化可溶性重组蛋白

将诱导完成的菌液按下述步骤处理:

⑴8000rpm离心8min，收集菌体，然后按照1:1比例加入PBS重悬菌体。

⑵重悬后的菌体利用超声破碎仪破碎，具体破碎条件：功率200W，工作时间/间歇时间＝4sec/6sec，超声次数根据菌液的多少决定(一般在光下可看到菌体呈清亮状态)。

⑶将破碎完成的菌液离心，4℃、11000-12000rpm、15min，收集上清待用。

⑷可溶性重组蛋白的纯化按以下步骤进行：

①称取定量磨细的硫酸铵晶体粉末往上述破碎上清液中缓慢加入，边加边搅拌以使硫酸铵缓慢溶解，使硫酸铵浓度达10％，此浓度能将溶解度小的杂蛋白沉淀而不影响Cap蛋白溶解。

②于摇床上16℃，100rpm/min振摇4h；后于4℃沉淀过夜(12h以上)，10000-12000rpm/min，离心10min，弃沉淀留上清。

③同样称取定量磨细的硫酸铵晶体粉末往步骤②收集的上清中缓慢加入，边加边搅拌以使硫酸铵缓慢溶解，使硫酸铵浓度达35％，此浓度下能将大部分Cap蛋白沉淀析出从而与其他杂蛋白分离。

④于摇床上16℃，100rpm/min振摇4h；后于4℃沉淀过夜(12h以上)，10000-12000rpm/min，离心10min,留沉淀弃上清。

⑤收集沉淀，按破碎液浓缩5倍比例加入PBS重悬，-20℃保存待用。

⑸SDS-PAGE电泳检测、western-blot，检测结果如图2和图3所示，由图2可看出，相比未纯化蛋白(泳道1)，通过本研究盐析纯化方法后蛋白纯度大大提高，纯度达85％(泳道2)，同时通过Werstern-blot进一步确认Cap蛋白能与PCV2单克隆抗体特异性识别，具有较好免疫原性。

实施例3：本发明所述PCV2病毒样颗粒疫苗的制备

首先使用BCA试剂盒测定上述纯化好的可溶性重组蛋白，将可溶性重组蛋白浓度调至1mg/ml，然后按照1:1的体积比例将蛋白与法国赛比克公司提供的201佐剂混合，接着进行超声乳化。经检测粘度和稳定性合格后置于4℃保存。

实施例4本发明所述PCV2病毒样颗粒疫苗的小鼠免疫试验

将30只6周龄经抗原抗体检测双阴性的Bal/bc小鼠随机分为3组，每组10只。各组均采用皮下注射的方式免疫，免疫一次。

第一组：每只小鼠免疫200ul灭菌后的PBS。

第二组：每只小鼠免疫200ul参考疫苗(青岛易邦生物工程有限公司猪圆环病毒2型亚单位疫苗)。

第三组：每只小鼠免疫200ul由201佐剂乳化的本发明所述可溶性重组蛋白。

每周对每只小鼠进行眼眶静脉采血，析出的血清使用猪圆环病毒ELISA检测试剂盒进行抗体检测。检测结果见图4。

结果显示：本发明所述PCV2病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后能快速产生针对猪圆环病毒的抗体，且与商品化的亚单位疫苗(参考疫苗)相比产生抗体更加迅速、水平更高。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种可溶性重组蛋白及其表达纯化方法和用途

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 194

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val

1 5 10 15

Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg

20 25 30

Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu

35 40 45

Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe

50 55 60

Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr

65 70 75 80

Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr

85 90 95

Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro

100 105 110

Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg

115 120 125

Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu

130 135 140

Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala

145 150 155 160

Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met

165 170 175

Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro

180 185 190

Lys

<210> 2

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacggcatct tcaacacccg tctgagccgc accatcggct ataccgtgaa gaaggccacc 60

gtgcgcaccc cgagttggaa cgtggacatg atgcgcttca acatcaacga ctttctgccg 120

cctggcggcg gcagtaatcc tctgaccgtg ccgttcgagt attaccgcat ccgtaaggtg 180

aaggtggagt tttggccgtg cagccctatt acccaaggcg accgtggcgt tggcagtaca 240

gccgtgatcc tggatgacaa cttcgtgacc aaggccaacg ccctgaccta cgacccgtac 300

gtgaactaca gcagtcgcca caccatcacc caaccgttca gctaccacag tcgctacttc 360

accccgaagc ctgtgctgga tcgcaccatc gactacttcc agccgaacaa caagcgcaac 420

cagctgtggc tgcgtttaca gaccaccggc aatgttgacc acgtgggtct gggtaccgcc 480

ttggagaaca gcatctacga tcaggactac aacatccgca tcaccatgta cgtgcagttc 540

cgcgagttca acctgaaaga cccgccgctg aaccctaag 579

<210> 3

<211> 591

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggatccaacg gcatcttcaa cacccgtctg agccgcacca tcggctatac cgtgaagaag 60

gccaccgtgc gcaccccgag ttggaacgtg gacatgatgc gcttcaacat caacgacttt 120

ctgccgcctg gcggcggcag taatcctctg accgtgccgt tcgagtatta ccgcatccgt 180

aaggtgaagg tggagttttg gccgtgcagc cctattaccc aaggcgaccg tggcgttggc 240

agtacagccg tgatcctgga tgacaacttc gtgaccaagg ccaacgccct gacctacgac 300

ccgtacgtga actacagcag tcgccacacc atcacccaac cgttcagcta ccacagtcgc 360

tacttcaccc cgaagcctgt gctggatcgc accatcgact acttccagcc gaacaacaag 420

cgcaaccagc tgtggctgcg tttacagacc accggcaatg ttgaccacgt gggtctgggt 480

accgccttgg agaacagcat ctacgatcag gactacaaca tccgcatcac catgtacgtg 540

cagttccgcg agttcaacct gaaagacccg ccgctgaacc ctaagaagct t 591

Claims

1.一种可溶性重组蛋白，其特征在于，所述可溶性重组蛋白是将猪圆环病毒II型衣壳蛋白的基因进行原核表达得到的可溶性重组蛋白，所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的可溶性重组蛋白，其特征在于，所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2。

3.一种载体，其特征在于，所述载体表达如权利要求1-2任一所述的可溶性重组蛋白。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述含有如权利要求3所述的载体。

5.一种如权利要求1所述的可溶性重组蛋白的表达方法，其特征在于，所述表达方法是将猪圆环病毒II型衣壳蛋白的基因进行原核表达，所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

6.如权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述原核表达的载体是pET-28a载体。

7.如权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述原核表达中采用IPTG诱导表达，IPTG的终浓度为1mmol/L，诱导培养温度为30℃。

8.一种如权利要求1所述的可溶性重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：

(2)采用两步梯度盐析沉淀法纯化所述可溶性重组蛋白。

9.如权利要求1-2任一所述的可溶性重组蛋白在制备PCV2病毒样颗粒疫苗中的用途。

10.一种PCV2病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述PCV2类病毒颗粒疫苗包括如权利要求1-2任一所述的可溶性重组蛋白。