CN110129348B

CN110129348B - 高效制备口蹄疫病毒样颗粒的重组dna载体、应用和疫苗

Info

Publication number: CN110129348B
Application number: CN201910476738.8A
Authority: CN
Inventors: 许雁; 诺曼.吉利卡; 李改; 夏燕
Original assignee: Nuohua Biotechnology Wuhan Co ltd
Current assignee: Nuohua Biotechnology Wuhan Co ltd
Priority date: 2019-06-03
Filing date: 2019-06-03
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2039-06-03
Also published as: CN110129348A

Abstract

本发明涉及一种用于高效制备口蹄疫病毒样颗粒的重组DNA载体，以及利用包含该重组DNA载体的重组表达质粒载体转染宿主细胞制备的口蹄疫病毒样颗粒、其应用及疫苗。针对3C蛋白酶对宿主细胞的毒性及影响口蹄疫VLP的产量问题，本发明设计了针对3C蛋白酶基因表达起干扰作用的3CshRNA片段，明显减少了口蹄疫VLP制备过程中3C蛋白酶的表达量，同时在原始口蹄疫病毒3C蛋白酶基因的基础上进行三个位点的突变，特异性调节了3C蛋白酶的作用效果。通过对3C蛋白酶基因的改造，降低了3C蛋白酶对宿主细胞的毒性并提高了3C蛋白酶对口蹄疫病毒P1前体蛋白的有效切割性能，从而显著提高了口蹄疫病毒样颗粒的合成产量，为大规模生产和使用口蹄疫病毒样颗粒疫苗奠定了基础。

Description

高效制备口蹄疫病毒样颗粒的重组DNA载体、应用和疫苗

技术领域

本发明涉及生物工程及病毒疫苗技术领域，尤其涉及一种用于高效制备口蹄疫病毒样颗粒的重组DNA载体，以及利用包含该重组DNA载体的重组表达质粒载体转染宿主细胞制备的口蹄疫病毒样颗粒、口蹄疫病毒样颗粒的应用及疫苗。

背景技术

口蹄疫是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种，也是一种人畜共患病。该病具有流行快、传播广、发病急、危害大等流行病学特点，疫区发病率可达50%-100%，造成巨大政治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类传染病之首。

口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。其最大颗粒直径为23纳米，最小颗粒直径为7-8纳米。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个主型A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型，以及65个以上亚型。口蹄疫病毒基因组为单股正链RNA，含有8500个核苷酸。口蹄疫病毒颗粒的外壳包括4种结构蛋白（VP1-VP4）。VP1、VP2和VP3组成病毒外壳蛋白单元，VP4面向病毒颗粒的内部，与RNA紧密结合。VP1全长213个氨基酸，是病毒抗原的主要决定成分。

对口蹄疫病毒的预防，最好的措施是采用疫苗免疫。目前国际上使用的口蹄疫疫苗为全病毒灭活疫苗，需要在大量繁殖收获全病毒后，再经过化学试剂处理灭活。在生产制备抗原活病毒时，要严格防止病毒泄漏。我国最新采用反向遗传学方法制备的疫苗抗原，仍然是具备病毒遗传活性的全病毒，仍需要经化学试剂处理灭活。在生产制备及处理收获后的剩余废物等各个环节都必须严格处理控制，保证环境安全。除此之外，口蹄疫灭活疫苗的抗原都是经灭活的全病毒，一旦发生疫病疫情，很难区分家畜是感染了野生病毒还是被免疫了灭活疫苗。因此，目前亟待开发更安全有效且具标记特性的疫苗。

病毒样颗粒（VLPs）保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，免疫性强，能激发体液免疫和细胞免疫应答。由于VLPs只是一个纯粹的大分子蛋白聚合颗粒，不含病毒遗传物质，不能自主复制，因此使用时非常安全。在制备过程中采用细胞发酵罐进行动物细胞大规模悬浮培养，保证了批次间的均一性，不会造成环境污染。VLPs疫苗作为一种新型疫苗，不仅克服了传统疫苗的不足，也弥补了其它基因工程疫苗的缺憾，并具有标记疫苗特性，是目前最有发展前景、最安全的候选疫苗。

口蹄疫病毒样颗粒疫苗可用大肠杆菌表达系统来表达制备。但大肠杆菌表达系统属原核表达系统，其表达的蛋白多以未经修饰的包涵体形式存在，蛋白折叠性差。利用该系统表达制备的VLP易出现其空间构象不正确的现象。昆虫细胞-重组杆状病毒表达系统是真核表达系统，能克服原核表达系统所存在的问题。且昆虫细胞-重组杆状病毒表达系统易于筛选，安全性好，产物成本低，表达水平高，表达产物的翻译后加工与高等生物相似，可使蛋白产物保持天然结构、生物活性和免疫活性，且易于大规模生产，因此被认为是制备VLP疫苗的最佳系统。

口蹄疫病毒的3C蛋白酶能有效地剪切口蹄疫病毒P1前体蛋白，使之变为有结构功能的4个病毒外壳蛋白VP1-VP4，后者再自组装成正二十面体对称的口蹄疫病毒空外壳。因此，3C蛋白酶是制备口蹄疫病毒空外壳即口蹄疫病毒样颗粒VLP的关键元素。然而3C蛋白酶亦能破坏宿主细胞的蛋白，造成对宿主细胞的毒性，严重影响口蹄疫VLP的生成。由于VLP的纯度和含量不够，动物不能产生高水平的中和抗体，无法应用于实际的免疫预防。

鉴于此，本发明提供一种既能降低对整体宿主细胞毒性、又不影响口蹄疫病毒样颗粒合成产量的技术方案，从而高效制备口蹄疫病毒样颗粒及疫苗。

发明内容

为了克服现有技术的上述不足，本发明提供了一种用于高效制备口蹄疫病毒样颗粒的重组DNA载体，以及通过包含该重组DNA载体的重组表达质粒载体转染宿主细胞制备的口蹄疫病毒样颗粒、口蹄疫病毒样颗粒的应用及疫苗。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的是提供一种制备口蹄疫病毒样颗粒的重组DNA载体，所述重组DNA载体包含以下3个转录盒：

（1）带有口蹄疫病毒P1前体蛋白DNA的基因转录盒；

（2）带有突变修饰后的口蹄疫病毒3C蛋白酶DNA的基因转录盒；

（3）可降低3C蛋白酶基因表达的短发夹shRNA转录盒。

优选地，所述P1前体蛋白选自口蹄疫病毒A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型中的任一种P1前体蛋白，所述P1前体蛋白DNA的基因序列包含对应P1前体蛋白所有的基因序列；所述的P1前体蛋白的DNA是由人工合成的P0基因DNA、VP1基因DNA和VP3基因DNA组成。

优选地，所述突变修饰后的口蹄疫病毒3C蛋白酶是在原始口蹄疫病毒3C蛋白酶的基础上进行第95位、第127位和第142位位点突变获得的。

优选地，所述shRNA转录盒包括：

（1）人源U6启动子；

（2）与3C蛋白酶同源的shRNA核酸序列；

（3）转录终止信号；

其中，与3C蛋白酶同源的shRNA核酸序列包括19个正义核苷酸、构成发夹圈的6个核苷酸及与正义核苷酸对应的19个反义核苷酸；转录终止信号为5个胸腺嘧啶组成的寡核苷酸；所述人源U6启动子及与3C蛋白酶同源的shRNA核酸序列为SEQ ID No.3所示序列。

本发明的第二个目的是提供一种高效制备口蹄疫病毒样颗粒的方法，所述方法为：将包含有上述任一项所述重组DNA载体的重组表达质粒载体转染宿主细胞，回收所述宿主细胞后提取口蹄疫病毒样颗粒。

优选地，该方法包括如下步骤：

（1）对3C蛋白酶第95位、第127和第142位氨基酸进行定点突变，获取突变修饰后的口蹄疫病毒3C蛋白酶DNA；

（2）合成带有两端酶切位点的完整shRNA转录盒；

（3）将经过密码子优化的口蹄疫病毒P1前体蛋白DNA、shRNA转录盒、突变修饰后的口蹄疫病毒3C蛋白酶DNA分别克隆至质粒载体，获得口蹄疫病毒样颗粒蛋白的重组表达质粒载体；

（4）将所述口蹄疫病毒样颗粒蛋白的重组表达质粒载体转染宿主细胞，回收宿主细胞后提取口蹄疫病毒样颗粒。

进一步优选地，所述质粒载体选自杆状病毒质粒、哺乳细胞表达系统质粒、细菌表达系统质粒、酵母表达系统质粒中的任一种。

进一步优选地，所述宿主细胞选自昆虫细胞，哺乳细胞、大肠杆菌细胞，酵母细胞中的任一种。

本发明的第三个目的是提供通过上述任一项所述的高效制备口蹄疫病毒样颗粒的方法制备得到的口蹄疫病毒样颗粒。

本发明的第四个目的是提供一种用于预防口蹄疫病毒感染的疫苗，所述疫苗包括上述的口蹄疫病毒样颗粒。

优选地，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂选自水包油包水的白油佐剂、角鲨烯佐剂、植物油佐剂、纳米颗粒佐剂、弗氏佐剂。

本发明的第五个目的是提供上述的口蹄疫病毒样颗粒在制备口蹄疫病毒抗体检测制剂或口蹄疫病毒疫病监测制剂中的应用，所述制剂包含ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、化学发光检测盒或荧光发光检测盒中的任一种。

病毒样颗粒是不含病毒核酸的空壳结构，具有很强的免疫原性生物学活性和安全性。由于口蹄疫病毒的3C蛋白酶能有效地剪切口蹄疫病毒P1前体蛋白，使之变为有结构功能的4个病毒外壳蛋白VP1-VP4，后者再自组装成有十二个五面体的口蹄疫病毒空外壳。因此，3C蛋白酶是制备口蹄疫病毒空外壳即口蹄疫病毒样颗粒VLP的关键元素。然而3C蛋白酶亦能破坏宿主细胞的蛋白，造成对宿主细胞的毒性，从而严重影响口蹄疫VLP的生产量。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

（1）针对3C蛋白酶对宿主细胞的毒性及影响口蹄疫VLP的产量问题，本发明应用短发卡RNA对目标基因表达的干扰作用，设计了针对3C蛋白酶基因表达起干扰作用的3C短发卡RNA片段，明显减少了口蹄疫VLP制备过程中3C蛋白酶的表达量；同时在此基础上，采用PCR方法在原始口蹄疫病毒3C蛋白酶的基础上进行第95位、第127位和第142位位点突变，特异性调节了3C蛋白酶的作用效果。通过对3C蛋白酶这一系列的改造，降低了3C蛋白酶对宿主细胞的毒性并提高了3C蛋白酶对口蹄疫病毒P1前体蛋白的有效切割，从而非常显著地提高了口蹄疫病毒样颗粒的生成制备，为大规模生产和使用口蹄疫病毒样颗粒疫苗奠定了坚实基础。

（2）本发明用表达口蹄疫病毒样颗粒的重组表达质粒载体转染宿主细胞，回收并裂解宿主细胞，获得口蹄疫病毒样颗粒，该方法表达水平高，安全性好，表达产物可保持天然结构、生物活性和免疫活性，且易于大规模生产和纯化口蹄疫病毒样颗粒。

（3）本发明的方法制备的口蹄疫疫苗作为一种新型疫苗，不含病毒遗传物质，不能自主复制，安全性高；弥补了其它基因工程疫苗的缺憾，并具有标记疫苗特性；在制备过程中采用细胞发酵罐进行动物细胞大规模悬浮培养，保证了批次间的均一性，不会造成环境污染。

附图说明

图1为实施例3提供的A型口蹄疫病毒样颗粒pFastBac-P1-Δ3C-shRNA重组质粒结构示意图。

图2为实施例4提供的用PCR检测口蹄疫病毒样颗粒蛋白重组杆状病毒DNA的凝胶电泳图。

其中：P1-DNA：2268 bp；Δ3C-DNA：648 bp；U6+shRNA：309 bp。

图3为实施例5提供的Western Blots检测用P1-Δ3C-shRNA重组杆状病毒表达的VP1蛋白的结果图。

其中：图3A表明，由含95 和127二个位点突变的3C蛋白酶切割P1蛋白,可见两条蛋白带，VP3-VP1及VP1；

图3B，由含有95、127和142三个位点突变的3C蛋白酶切割P1蛋白，只见一条VP1蛋白带。

图4为实施例5提供的Western Blots检测用P1-Δ3C-shRNA重组杆状病毒表达的Δ3C蛋白酶蛋白的结果图。

图5为实施例6提供的Western Blots检测结果，显示用P1-Δ3C-shRNA重组杆状病毒表达的3C蛋白酶含量明显少于用P1-Δ3C的重组杆状病毒表达的3C蛋白酶含量。

图6为实施例7提供的由大肠杆菌培养表达的VP1-6xHis蛋白经纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳图。

图7为实施例7提供的由大肠杆菌培养表达的VP1-6xHis蛋白经纯化后的WesternBlots检测图。

图8为实验例7提供的Western Blots检测结果，显示不同位点突变的P1-Δ3C-shRNA重组杆状病毒及未经修饰的P1-3C重组杆状病毒所表达的VP1蛋白量的不同。

其中：加样槽1和2表示两个不同的阴性对照样品；加样槽3表示P1-3C样品，3C基因未做任何点突变；加样槽4和5表示P1-Δ3C-shRNA，含有127一个位点突变的3C基因，在不同时间制备的两个样品；加样槽6表示P1-Δ3C-shRNA，含有95 和127二个位点突变的3C基因；加样槽7和8表示P1-Δ3C-shRNA，含有95、127和142三个位点突变的3C基因，在不同时间制备的两个样品；加样槽9表示细菌表达并纯化的VP1-6xHis蛋白作为阳性对照样品。

图9为实施例8提供的蔗糖不连续密度梯度超速离心纯化含有口蹄疫病毒样颗粒的细胞裂解上清液所形成的两条明显条带图。

图10为实施例8提供的口蹄疫病毒样颗粒电镜图。其中：图10A为实施例8提供的口蹄疫病毒样颗粒电镜照片；图10B为图10A中的小方框放大图。

图11 为实验例9提供的ELISA检测口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫大白兔的血清抗体滴度。

图12为实验例10提供的ELISA检测口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫实验小鼠后的抗体滴度。

其中图12A中用弗氏佐剂乳化口蹄疫病毒样颗粒所制备的疫苗免疫实验小鼠。

图12B中用赛比科201佐剂乳化口蹄疫病毒样颗粒所制备的疫苗免疫实验小鼠。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

实施例1：用PCR方法对3C蛋白酶实施定点突变

口蹄疫病毒的3C蛋白酶能有效地剪切口蹄疫病毒P1前体蛋白，使之变为有结构功能的4个病毒外壳蛋白VP1-VP4，后者再自组装成有十二个五面体的口蹄疫病毒空外壳。因此，3C蛋白酶是制备口蹄疫病毒空外壳即口蹄疫病毒样颗粒VLP的关键元素。然而3C蛋白酶亦能破坏宿主细胞的蛋白，造成对宿主细胞的毒性，从而严重影响口蹄疫VLP的生产量。为了解决这个难题，本实施例采用PCR方法对3C蛋白酶基因进行三个位点上的定点突变。突变位点是3C蛋白酶的第95位、第127和第142位氨基酸。具体操作如下：

1、人工合成带有点突变的PCR引物

针对三个突变位点，共合成了8条PCR引物，它们的DNA序列如下：

SEQ ID No.4，3C-F： TTCAACCCAACACAATATATTATAG

SEQ ID No.5，3C-R： CATAGCGCGGGTTCCTTCCGG

SEQ ID No.6，3C-95-F：GTGCTCCACCGTGGGAATAAGGTGCGTGACATCACGAAGSEQ IDNo.7，3C-95-R：CTTCGTGATGTCACGCACCTTATTCCCACGGTGGAGCACSEQ ID No.8，3C-127-F：GACGTTGGGAGACCGATCTTCTCTGGTGAGG

SEQ ID No.9，3C-127-R：CCTCACCAGAGAAGATCGGTCTCCCAACGTC

SEQ ID No.10，3C-142-F：CTACAAAGACATTGTAGTGTTGATGGACGGAGACACCATGSEQ IDNo.11，3C-142-R：CATGGTGTCTCCGTCCATCAACACTACAATGTCTTTGTAG

2、第一轮PCR反应

以3C蛋白酶基因DNA为模板，在第一个PCR反应小管里加入PCR引物3C-F和3C-95-R，第二小管中加入PCR引物3C-R和3C-95-F，分别合成出带有95位点突变的DNA片段。DNA凝胶电泳分离并纯化新合成的两条DNA片段。PCR反应条件为：95℃ 2分钟；95℃ 55秒，52℃45秒，72℃ 60秒，共25个PCR循环反应。

3、第二轮PCR反应

用第一轮PCR反应获得的纯化好的两条DNA片段为模板，加在一个PCR反应小管内，不加任何引物，做5个PCR循环反应后终止反应；接着加入PCR引物3C-F和3C-R进行完整的30个PCR循环反应，获得带有95位点突变的3C蛋白酶突变基因。PCR反应条件为：95℃ 2分钟；95℃ 55秒，54℃ 50秒，72℃ 120秒，共30个PCR循环反应。

4、第三轮和第四轮PCR反应

第三轮PCR反应同上述第一轮PCR反应，只是将第三轮反应的DNA模板改为带有95位点突变的3C蛋白酶突变基因。PCR引物改为3C-F和3C-127-R，以及3C-R和3C-127-F。

第四轮PCR反应同上述第二轮PCR反应，只是第四轮PCR反应是以第三轮PCR反应获得的纯化好的两条DNA片段为模板，以3C-F和3C-R为引物，最终获得带有95位点和127位点双突变的3C蛋白酶突变基因。

5、第五轮和第六轮PCR反应

第五轮PCR反应同上述第一轮PCR反应，只是将第五轮反应的DNA模板改为带有95位点和127位点双突变的3C蛋白酶突变基因，PCR引物改为3C-F和3C-142-R，以及3C-R和3C-142-F。

第六轮PCR反应同上述第二轮PCR反应，只是将六轮PCR反应是以第五轮PCR反应获得的纯化好的两条DNA片段为模板，以3C-F和3C-R为引物，最终获得带有95位点、127位点及142位点三突变的3C蛋白酶突变基因。将新制备的3C蛋白酶突变基因进行DNA测序，确定了三个位点的突变准确无误。所述突变是根据SEQ ID NO.1所示序列，通过引物SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引入口蹄疫病毒3C蛋白酶的R95K突变、通过引物SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9引入口蹄疫病毒3C蛋白酶的L127P突变、通过引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11引入口蹄疫病毒3C蛋白酶的C142L突变。

实施例2：人工合成带有两端酶切位点的完整shRNA转录盒

为了方便重组质粒的构建，将人工合成的shRNA转录盒序列两端分别设计了酶切位点PmeI和AvrII，与所用质粒的酶切位点相对应。shRNA转录盒中各组成元素以串联方式联结在一起，其顺序依次为：人源U6启动子、与3C蛋白酶同源的shRNA核酸序列及由5个T组成的转录终止信号。其中，与3C蛋白酶同源的shRNA核酸序列包括19个正义核苷酸、构成发夹圈的6个核苷酸及与正义核苷酸对应的19个反义核苷酸；转录终止信号为5个T（胸腺嘧啶）组成的寡核苷酸。人源U6启动子与3C蛋白酶shRNA核酸序列见SEQ ID No.3。

实施例3：口蹄疫病毒样颗粒蛋白重组表达质粒的构建

构建口蹄疫病毒样颗粒DNA重组质粒，可以采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统的质粒、哺乳细胞表达系统的质粒、细菌表达系统的质粒以及酵母表达系统的质粒等。本实施例中发明人选用昆虫细胞-杆状病毒表达系统的质粒为例，对质粒构建、蛋白表达及病毒样颗粒形成的一整套方法和步骤进行详细阐述。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下，根据本发明的方法和原理所获得的各表达系统的重组质粒等，都属于本发明保护的范围。

口蹄疫病毒有多达七种不同的血清主型，为方便阐述，本实施例中发明人只选择了A型口蹄疫病毒为实施例表述对象。根据A型口蹄疫病毒P1前体蛋白的DNA序列，结合抗原分析和密码子优化，人工合成了P1前体蛋白基因。

在构建重组A型口蹄疫病毒样颗粒蛋白表达质粒之前，需要先构建重组杆状病毒穿梭质粒，具体构建步骤简述如下：

1、将人工合成的P1前体蛋白基因、人工合成的shRNA转录盒和实施例1中制备的三个带有不同位点突变的3C蛋白酶基因DNA片段，分别用限制性内切酶NotI和HindIII进行酶切反应，用凝胶电泳收集纯化酶切后的各个DNA片段待用。

2、用上述同样的限制性内切酶及方法步骤处理pFastBac质粒载体，然后用T4联接酶将P1前体蛋白基因的DNA片段联接到pFastBac质粒载体上，并转化到DH5α感受态细菌的细胞中。

3、采用菌落蓝白斑筛选法，挑选白色菌落，PCR反应筛选出阳性菌落。

4、37℃摇床培养所选阳性菌落细菌，进行DNA质粒抽提，获得带有P1前体蛋白基因的重组杆状病毒质粒。

重复上述实验步骤，将人工合成的shRNA转录盒以及带有不同位点突变的3C蛋白酶基因分别插入，最终获得pFastBac-P1-Δ3C-shRNA重组杆状病毒穿梭质粒。其中，P1蛋白基因由PH启动子调控，突变的3C蛋白酶基因由P10启动子调控，shRNA转录盒则由U6启动子调控。

用以上所述重组杆状病毒穿梭质粒转化DH10Bac感受态细胞，采用菌落蓝白斑筛选法，挑选白色菌落，PCR反应确定出阳性菌落。37℃摇床培养所选阳性菌落细菌，进行DNA质粒抽提，获得重组A型口蹄疫病毒样颗粒蛋白表达质粒Bacmid，简化结构图见图1所示。

实施例4 口蹄疫病毒样颗粒蛋白重组杆状病毒的制备及检测其DNA 所携带的外源目的基因及shRNA片段

将实施例3所述制备好的口蹄疫病毒样颗粒蛋白表达质粒Bacmid转染昆虫细胞，获得口蹄疫病毒颗粒样蛋白重组杆状病毒。操作方法如下：

在一个6孔细胞培养板中铺上昆虫细胞sf-9，用脂质转染法将获得的口蹄疫病毒样颗粒蛋白表达质粒Bacmid转染入铺盘的昆虫细胞中，将此6孔细胞培养板放入一湿盒中，27℃静置培养5-6天后，可见转染的昆虫细胞变大变圆并漂浮起来，预示重组杆状病毒已经形成。离心收获细胞培养上清液，其中含有表达口蹄疫病毒样颗粒蛋白的重组杆状病毒（P1-Δ3C-shRNA），将此细胞上清液放入4℃或液氮中保存。

为了检测所制备的重组杆状病毒是否符合要求，需要对其DNA进行所携带的外源目的基因及shRNA片段的检测。实验方法是：加入含有SDS的裂解液至细胞上清液中裂解重组杆状病毒，用氯仿抽提、乙醇沉淀获得重组杆状病毒DNA；分别以此DNA做模板，各自加入对应的P1前体蛋白基因、3C蛋白酶基因及shRNA 片段的不同PCR引物，进行PCR扩增反应；

其中，

SEQ ID No.12：P1基因上游引物序列：ATGGGAGCCGGGCAATCCAG

SEQ ID No.13：P1基因下游引物序列：TTAGGGCCCGGGGTTGGACTC

SEQ ID No.14：3C蛋白酶基因上游引物序列：ATGGAGAGTGGTGCCCCACCG

SEQ ID No.15：3C蛋白酶基因下游引物序列是：TTACTCGTGGTGTGGTTCGG

SEQ ID No.16：shRNA片段上游引物序列是：CCCCTTCACCGAGGGCCTATTTC

SEQ ID No.17：shRNA片段下游引物序列是：AAAAGACAGTGACTACAGAG

PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图2所示，从图中可以看出，PCR扩增出来的DNA目的条带长度与目的基因的大小一致，shRNA片段的PCR条带亦与设计相符，说明制备的重组杆状病毒带有构建正确的表达载体。

实施例5 口蹄疫病毒样颗粒蛋白的表达及检测

由实施例4获得口蹄疫病毒样颗粒重组杆状病毒为第一代毒种，称为P1代。用P1代毒种感染昆虫细胞进行毒种放大，获得第二代重组杆状病毒毒种，称为P2代。再用P2代毒种进行放大，获得P3代。以P3代作为生产毒种来制备口蹄疫病毒样颗粒。将生长状态良好的Sf-9细胞接种到摇瓶中，待细胞成长至对数生长期时，稀释细胞浓度至每毫升3.0×10⁶个细胞。将P3代毒种按MOI 为0.1比率，接种毒种到细胞摇瓶中，3-4天后收获细胞，离心弃上清液，保留细胞沉淀。

用Western Blot检测收获的沉淀细胞中是否含有口蹄疫病毒的外壳蛋白以及表达的3C蛋白酶蛋白。具体操作简述如下：首先制备细胞裂解上清液，用100mL的细胞裂解液（0.1% Triton X-100）悬浮细胞沉淀，放入-80℃冰柜中完全速冻。随后取出，放入37℃水浴箱中迅速解冻。如此反复操作三遍，使细胞破裂，用台式离心机13000rpm离心10分钟。保留细胞裂解上清液，弃细胞碎片沉淀。取10mL细胞裂解上清液，加入10mL电泳上样液混合，95℃加热变性5分钟，点样进行SDS-PAGE电泳，然后做Western Blot的印膜转印。分别以抗VP1兔源多抗和抗3C蛋白酶的兔源多抗作为一抗进行孵育，再用羊抗兔的二抗孵育。用ECL化学发光试剂曝光胶片，显影后可见各自胶片上清晰的蛋白条带。图3所示为用抗VP1兔源多抗所做的Western Blot结果。其中图3A，由含有95 和127二个位点突变的3C蛋白酶切割P1蛋白，可见两条蛋白带，VP3-VP1及VP1；图3B，由含有95、127和142三个位点突变的3C蛋白酶切割P1蛋白，只有一条VP1蛋白带。说明细胞裂解上清液样品与VP1抗体有特异性反应，重组杆状病毒能够正确表达P1前体蛋白，且P1前体蛋白经一同表达的3C蛋白酶剪切修饰后，可以检测到VP3-VP1和VP1蛋白片段存在。图4所示为用抗3C蛋白酶兔源多抗所做的WesternBlot结果。说明细胞裂解上清液样品与3C蛋白酶抗体有特异性反应，重组杆状病毒能够正确表达3C蛋白酶蛋白。

实施例6 shRNA在昆虫细胞中的复制合成能有效减少3C蛋白酶的表达量

shRNA（短发卡RNA）通过与目标基因相应的mRNA结合，诱导后者被降解，或抑制结合的mRNA的翻译功能，从而导致目标基因蛋白表达水平降低，减少目标蛋白的生成量。为了证明所设计的与3C蛋白酶基因相匹配的shRNA能有效减少3C蛋白酶的表达量，设计制备了不含shRNA片段的重组杆状病毒表达质粒Bacmid，并获得了不含shRNA片段的重组杆状病毒（P1- Δ3C）。按照实施例4及实施5所述方法同等条件下严格操作，获得了两种细胞沉淀裂解上清液样品。上样做Western Blot电泳及转膜，用抗3C蛋白酶的兔源多抗作为一抗进行孵育，再用羊抗兔的二抗孵育，用ECL化学发光试剂曝光胶片。图5结果清楚显示，不含shRNA片段的重组杆状病毒（P1- Δ3C）所表达的3C蛋白酶含量明显高于含有shRNA片段的重组杆状病毒（P1-Δ3C-shRNA）所表达的3C蛋白酶。说明shRNA的作用的确有效减少了3C蛋白酶的表达量。

实施例7

本发明的技术方案中通过对3C蛋白酶基因设计定点突变和设计3C短发卡RNA片段，从而对3C蛋白酶含量及其特异功能产生有效控制，减少了其对宿主昆虫细胞的毒性，增加了口蹄疫病毒样颗粒的合成。本实施例将对此结论进行验证。

为了便于研究对照，本发明构建了在E.coli工程细菌中表达VP1蛋白的表达质粒pET-VP1-6xHis，在VP1基因的末端加上了6xHis序列是为了便于纯化。表达的VP1-6xHis蛋白，经尿素变性、透析复性及组氨酸亲和琼脂糖凝胶纯化后，进行SDS凝胶电泳及考马斯亮蓝染色。图6显示了表达及纯化后的VP1-6xHis蛋白条带。用Western Blot及抗VP1蛋白的兔源多抗做一抗，羊抗兔的二抗孵育，获得与预期一致的清晰条带（见图7）。因此，表达并纯化的VP1-6xHis蛋白可用于做Western Blots检测样品中的阳性对照蛋白。

3C蛋白酶的表达可对宿主细胞产生毒性，明显地影响宿主细胞的生长和存活。但3C蛋白酶又是合成口蹄疫病毒样颗粒的重要元素，不可或缺。因此，对3C蛋白酶表达含量的有效控制以及对3C蛋白酶特效活力的调节，将直接影响到口蹄疫病毒样颗粒的产量。为了进行比较，本实施例采用含有未经任何修饰的3C蛋白酶亦不带shRNA片段的重组杆状病毒（P1-3C），与带有修饰元素的三种重组杆状病毒，即3C蛋白酶第95位核苷酸突变的P1-Δ3C（95）-shRNA重组杆状病毒，3C蛋白酶第95和第127二位核苷酸突变的P1-Δ3C（95，127）-shRNA重组杆状病毒以及3C蛋白酶第95、第127和142三位核苷酸突变的P1-Δ3C（95，127，142）-shRNA重组杆状病毒，在完全相同的条件下感染昆虫细胞，用Western Blots检测各样品中P1前体蛋白剪切处理程度。具体操作如下：取相同体积的各样品细胞沉淀，按实施例5所述方法裂解细胞沉淀，获得细胞裂解上清液。各取10mL样品上清液，分别加入10mL电泳上样液混合，95℃加热变性5分钟，点样进行SDS-PAGE电泳，然后做Western Blot的印膜转印。用抗VP1蛋白的兔源多抗作为一抗进行孵育，再用羊抗兔的二抗孵育，ECL化学发光试剂曝光胶片。如图8所示，其中：加样槽1和2为两个不同的阴性对照样品；加样槽3为P1-3C样品，3C基因未做任何点突变；加样槽4和5为P1-Δ3C-shRNA，含有127一个位点突变的3C基因，在不同时间制备的两个样品；加样槽6为P1-Δ3C-shRNA，含有95 和127二个位点突变的3C基因；加样槽7和8为P1-Δ3C-shRNA，含有95、127和142三个位点突变的3C基因，在不同时间制备的两个样品；加样槽9为细菌表达并纯化的VP1-6xHis蛋白作为阳性对照样品。图8结果显示，用带有修饰元素的重组杆状病毒感染的昆虫细胞，其VP1蛋白的含量明显多于未经任何修饰的重组杆状病毒（P1-3C）感染的昆虫细胞中VP1蛋白的含量。并且，3C蛋白酶三个位点核苷酸的突变效果明显好于只有一个或二个位点的突变效果。3C蛋白酶三个位点核苷酸的突变使VP3-VP1蛋白条带消失了，留下更多的VP1蛋白，说明有更多的口蹄疫病毒样颗粒被合成。

实施例8 口蹄疫病毒样颗粒的纯化及电镜观察

采用蔗糖不连续密度梯度超速离心纯化口蹄疫病毒样颗粒，具体操作简述如下：首先配制蔗糖溶液，重量百分比浓度分别配成20%、45%及60%，小心装入超速离心管中制成蔗糖不连续密度梯度。按实施例5所述方法制备10ml细胞裂解上清液样品，小心加入到制好了的蔗糖不连续密度梯度的顶层，用水平转头进行超速离心，4℃，100000xg，时间1小时。在0%（即细胞裂解上清液）与20%交界处以及20%与45%交界处各有一条带（见图9）。收集此两条带，分别用电镜进行观察分析。

电镜拍片实验操作如下：将少量纯化浓缩后的两条带的样品分别固定处理后，置于铜网上，加2%磷钨酸钠溶液进行负染。电子显微镜下观察并拍片。图10A为0%与20%交界处条带样品的电镜图片，图10B为图10A中的小方框放大图。从图片上可以清晰看到大量的口蹄疫病毒样颗粒。电镜观察20%与45%交界处条带样品，没有发现明显的病毒样颗粒，只能看到一些杆状病毒或细胞内含物碎片等。

实施例9 口蹄疫病毒样颗粒疫苗的制备及对大白兔的免疫实验

首先制备口蹄疫病毒样颗粒疫苗，制备方法如下：将纯化好的口蹄疫病毒样颗粒溶液与赛彼科佐剂（MONTANIDETMISA 201 VG）按1：1（体积比）比率混匀，用乳化机乳化成乳白色液体。取1ml乳液经5000rpm离心15分钟，不出现分层为乳化达标，疫苗制备完毕。将此疫苗用于免疫实验大白兔和小鼠。

大白兔免疫试验步骤如下：取背景干净的实验用日本大耳白兔（1.5公斤左右）5只，每只兔子在免疫前各取血10ml，作为阴性对照使用。第一次免疫，每只兔子背部皮下多点注射1000ul的口蹄疫病毒样颗粒疫苗。一免后第28天加强注射一针并于二免后第10天采集血清，检测抗体滴度。

为了便于用酶联免疫吸附实验（ELISA）间接法检测免疫兔子的血清抗体效价，用实施例7在E.coli工程细菌中表达并加以纯化的VP1-6xHis蛋白用于做ELISA检测抗原。

酶联免疫吸附间接法（ELISA）检测免疫兔子的血清抗体效价，具体操作方法如下：10ml的包被液中加入10ul纯化好的VP1-6xHis蛋白，混匀。ELISA板中每孔加入100ul，保鲜膜包好4℃过夜；第二天早上倒掉板中液体，加入PBS-T溶液200ul/孔洗2-3次，拍干。加封闭液200ul/孔，保鲜膜包好，37℃反应2h。用PBS-T溶液200ul/孔洗3次，拍干；在酶标板上做好对应标记，用PBS按1：1000稀释采集的各实验大白兔抗体血清以及空白对照血清，混匀后在酶标板的第一排加入200ul，后边所有各排孔内先各加入100ul的PBS，之后从第一排吸取100ul稀释血清加入第二排，以此类推进行倍比稀释。最后一排不加倍比稀释血清，做为板孔的底色空白对照。加完后封好，37℃孵育1小时。倒掉反应液，加PBS-T 200ul/孔，洗涤3次，拍干；用PBS 1：5000稀释含偶联辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP）的羊抗兔二抗100ul/孔，37℃孵育45分钟；倒掉反应液，用PBS-T 200ul/孔洗涤3次，拍干；加入配好的TMB 100ul/孔，显色10-15 分钟，加入终止液50ul/孔，用酶标仪取波长450测定每孔OD值。根据空白对照孔的平均OD值，用常规cutoff公式（空白孔平均值+3x 标准差SD），计算出cutoff为0.3469，以此判定血清检测结果的抗体滴度，结果如图11所示。

实施例10 口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫小鼠及抗体检测

用实施例9所述制备的口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫实验小鼠，免疫实验步骤如下：将20只6-8周龄的昆明小鼠分成2组，第一组8只，用弗氏佐剂乳化的口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫。第二组8只，用赛比科201佐剂乳化的口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫。每只试验小鼠背部皮下多点注射总剂量为300ul的口蹄疫病毒样颗粒疫苗。第三组4只，用于实验平行的阴性对照。一免后第28天加强注射一针，并于此二免后第24天采集血清，检测抗体滴度。

酶联免疫吸附间接法（ELISA）检测免疫小鼠的血清抗体效价，具体操作按实施例9所述方法执行，用酶标仪取波长450测定每孔OD值。根据空白对照孔的平均OD值，用常规cutoff公式（空白孔平均值+3x 标准差SD），计算出cutoff值，以此判定血清检测结果的抗体滴度。图12A为用弗氏佐剂乳化口蹄疫病毒样颗粒所制备的疫苗免疫实验小鼠的抗体滴度示意图。图12B为用赛比科201佐剂乳化口蹄疫病毒样颗粒所制备的疫苗免疫实验小鼠的抗体滴度示意图。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 诺华生物科技（武汉）有限责任公司

<120> 高效制备口蹄疫病毒样颗粒的重组DNA载体、应用和疫苗

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagagtg gtgccccacc gactgacttg caaaagatgg tcatgggcaa caccaagcct 60

gttgagctca tcctcgacgg caagacggta gccatctgct gcgctaccgg agtctttggt 120

actgcctacc tcgtgcctcg tcaccttttc gcagagaagt acgacaagat catgctggac 180

ggcagagcca tgacagacag tgactacaga gtgtttgagt ttgagattaa agtaaaagga 240

cagaacatgc tctcagacgc cgcactcatg gtgctccacc gtgggaatcg cgtgcgtgac 300

atcacgaagc acttccgtga tgtagccaag atgaagaaag gaacccccgt cgttggtgtg 360

attaacaacg ccgacgttgg gagactgatc ttctctggtg aggccctaac ctacaaagac 420

attgtagtgt gcatggacgg agacaccatg cctgggcttt ttgcttacaa ggccgtcacc 480

agggcgggct actgtggagg agccgttctc gcgaaggacg gagccgagac tttcatcgtc 540

ggcactcact ccgcaggcgg caacggagtt ggatactgct cgtgcgtttc caggtccatg 600

ctgctcaaga tgaaggctca catcgacccc gaaccacacc acgagtaa 648

<210> 2

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Ser Gly Ala Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly

1 5 10 15

Asn Thr Lys Pro Val Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile

20 25 30

Cys Cys Ala Thr Gly Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His

35 40 45

Leu Phe Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met

50 55 60

Thr Asp Ser Asp Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly

65 70 75 80

Gln Asn Met Leu Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn

85 90 95

Arg Val Arg Asp Ile Thr Lys His Phe Arg Asp Val Ala Lys Met Lys

100 105 110

Lys Gly Thr Pro Val Val Gly Val Ile Asn Asn Ala Asp Val Gly Arg

115 120 125

Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp Ile Val Val Cys

130 135 140

Met Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala Tyr Lys Ala Val Thr

145 150 155 160

Arg Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Glu

165 170 175

Thr Phe Ile Val Gly Thr His Ser Ala Gly Gly Asn Gly Val Gly Tyr

180 185 190

Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser Met Leu Leu Lys Met Lys Ala His Ile

195 200 205

Asp Pro Glu Pro His His Glu

210 215

<210> 3

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccccttcacc gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 60

tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 120

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 180

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 240

gtggaaagga cgaaacaccg ggacagtgac tacagagtgt ctcgagacac tctgtagtca 300

ctgtctttt 309

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcaacccaa cacaatatat tatag 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catagcgcgg gttccttccg g 21

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtgctccacc gtgggaataa ggtgcgtgac atcacgaag 39

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cttcgtgatg tcacgcacct tattcccacg gtggagcac 39

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacgttggga gaccgatctt ctctggtgag g 31

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctcaccaga gaagatcggt ctcccaacgt c 31

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctacaaagac attgtagtgt tgatggacgg agacaccatg 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

catggtgtct ccgtccatca acactacaat gtctttgtag 40

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgggagccg ggcaatccag 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttagggcccg gggttggact c 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggagagtg gtgccccacc g 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttactcgtgg tgtggttcgg 20

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccccttcacc gagggcctat ttc 23

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aaaagacagt gactacagag 20

Claims

1.一种制备口蹄疫病毒样颗粒的重组DNA载体，其特征在于，所述重组DNA载体包含以下3个转录盒：

(1)带有口蹄疫病毒P1前体蛋白DNA的基因转录盒；

(2)带有突变修饰后的口蹄疫病毒3C蛋白酶DNA的基因转录盒；

(3)可降低3C蛋白酶基因表达的短发夹shRNA转录盒;

所述突变修饰后的口蹄疫病毒3C蛋白酶是在原始口蹄疫病毒3C蛋白酶的基础上进行第95位、第127位和第142位位点突变获得的；

所述突变修饰是根据SEQ ID NO.1所示序列，通过引物SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引入口蹄疫病毒3C蛋白酶的R95K突变、通过引物SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9引入口蹄疫病毒3C蛋白酶的L127P突变、通过引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11引入口蹄疫病毒3C蛋白酶的C142L突变；

所述shRNA转录盒包括：

(a)人源U6启动子；

(b)与3C蛋白酶同源的shRNA核酸序列；

(c)转录终止信号；

2.根据权利要求1所述的一种制备口蹄疫病毒样颗粒的重组DNA载体，其特征在于，所述P1前体蛋白选自口蹄疫病毒A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型中的任一种P1前体蛋白，所述P1前体蛋白DNA的基因序列包含对应P1前体蛋白所有的基因序列；所述的P1前体蛋白的DNA是由人工合成的P0基因DNA、VP1基因DNA和VP3基因DNA组成。

3.一种高效制备口蹄疫病毒样颗粒的方法，其特征在于，所述方法为：将包含有权利要求1-2任一项所述重组DNA载体的重组表达质粒载体转染宿主细胞，回收所述宿主细胞后提取口蹄疫病毒样颗粒。

4.根据权利要求3所述的一种高效制备口蹄疫病毒样颗粒的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)对3C蛋白酶第95位、第127和第142位氨基酸进行定点突变，获取突变修饰后的口蹄疫病毒3C蛋白酶DNA；

(2)合成带有两端酶切位点的完整shRNA转录盒；

(3)将经过密码子优化的口蹄疫病毒P1前体蛋白DNA、shRNA转录盒、突变修饰后的口蹄疫病毒3C蛋白酶DNA分别克隆至质粒载体，获得口蹄疫病毒样颗粒蛋白的重组表达质粒载体；

(4)将所述口蹄疫病毒样颗粒蛋白的重组表达质粒载体转染宿主细胞，回收宿主细胞后提取口蹄疫病毒样颗粒。

5.根据权利要求4所述的一种高效制备口蹄疫病毒样颗粒的方法，其特征在于，所述质粒载体选自杆状病毒质粒、哺乳细胞表达系统质粒、细菌表达系统质粒、酵母表达系统质粒中的任一种。

6.根据权利要求4所述的一种高效制备口蹄疫病毒样颗粒的方法，其特征在于，所述宿主细胞选自昆虫细胞，哺乳细胞、大肠杆菌细胞，酵母细胞中的任一种。